Nghiên cứu thành phần hoá học cây lược vàng (callisia fragrans)

Lược vàng có tác dụng chữa bệnh diệu kỳ là do trong nhựa cây có sự kết hợp hiếm thấy các hoạt chất sinh học với mật độ rất đậm đặc thuộc các nhóm phitosteroit và flavonoit.. Một số công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -

(CALLLISIA FRAGRANS) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội - 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

********* ♦*********

LÊ V ĂN SANG

VÀNG (CALLISIA FRAGRANS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHÀNH : CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS TRẦN THU HƯƠNG

PGS.TS Trần Thu Hương, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ để em hoàn thành luận văn này

GS.TS Châu Văn Minh, PGS.TS Phan Văn Kiệm, cùng các cô chú, các anh chị phòng Hóa Hữu cơ, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy các cô phòng Hóa học hữu cơ–trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Hà Nội, ngày tháng năm 2009

………

Lê Văn Sang

M ỤC LỤC

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 3

DANH M ỤC CÁC BẢNG, HÌNH 4

L ỜI MỞ ĐẦU 7

NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN Error! Bookmark not defined Chương I: TỔNG QUAN 9

I.1 Giới thiệu về cây Lược vàng (Callisia fragrans) 9

I.2 M ột số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Lược vàng 10

I.3 Sơ lược về các lớp chất có trong cây Lược vàng 12

I.3.1 Một số đặc điểm về sterol 12

I.3.2 T ổng quan về lớp chất Flavonoit 23

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

II.1 Đối tượng nghiên cứu 34

II.2 Phương pháp nghiên cứu 34

II.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp chiết 34

II.2.2 Định tính lớp chất flavonoit Error! Bookmark not defined II.2.3 Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 37

Chương III: THỰC NGHIỆM 45

III.1 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất 45

III.2 Chiết tách và phân lập các hợp chất 45

III.3 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất 48

III.3.1 Hợp chất CF1 48

III.3.2 Hợp chất CF2 49

III.3.3 Hợp chất CF3 49

Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

IV.1 Xác định cấu trúc của hợp chất CF1 50

IV.2 Xác định cấu trúc của hợp chất CF2 59

IV.3 Xác định cấu trúc của hợp chất CF3 66

IV.4 Hoạt tính sinh học của isoorientin 72

K ẾT LUẬN 75 TÀI LI ỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy)

CC Sắc ký cột dưới trọng lực dung môi (Column Chromatography)2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimensional

NMR)DEPT Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass

Spectra)HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy) HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence )

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spetroscopy)

Me Nhóm Metyl

Mp Nhiệt độ nóng chảy (Melting point)

[α]D Độ quay cực (Specific Optical Rotation)

MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TLTK Tài liệu tham khảo

δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (ppm)

DANH M ỤC CÁC HÌNH, BẢNG

Hình 1 Cây Lược vàng (Callisia Fragrans)

Hình 26 Cấu trúc hoá học của CF3

71

L ỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm 3/4 diện tích là rừng Cho đến nay, với số liệu chưa đầy đủ đã phát hiện trên 12.000 loài thực

vật có hoa (có mạch), dự kiến còn có thể lên đến hàng trăm ngàn loài

Riêng đối với cây thuốc, theo số liệu điều tra của Viện Dược liệu đối với

17 tỉnh và thành phố của miền Bắc và miền Nam từ năm (1961-1974) và từ (1976-1985) thu gần 2000 loài thuộc 236 họ thực vật Đối với các cây có tinh dầu, theo tài liệu chưa đầy đủ cho thấy có trên 523 loài (species) của 104 họ (families) phân bố rộng trong ngành Hạt trần (506) và lớp Hai lá mầm của ngành Hạt kín (445) Qua đó cho thấy nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú mà trong chúng còn chứa biết bao nhiêu điều lý thú, biết bao nhiêu tác dụng tiềm ẩn mà cho đến nay chúng ta còn chưa biết hết Do đó việc nghiên cứu các vấn đề về cây cỏ, về các hợp chất thiên nhiên luôn là đề tài

hấp dẫn, mới mẻ và phong phú

Lược vàng, còn gọi là Lan vòi, có tên khoa học là Callisia fragrans

(Lindl) Woods, thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) Loài này có mặt ở Nga hơn 100 năm trước, xuất xứ từ Trung và Nam Mỹ Lược vàng có tác dụng chữa bệnh diệu kỳ là do trong nhựa cây có sự kết hợp hiếm thấy các hoạt chất sinh học với mật độ rất đậm đặc thuộc các nhóm phitosteroit và flavonoit Ngoài ra, Lược vàng còn chứa nhiều vitamin và các vi tố rất quan trọng đối với cơ thể người như đồng, crom, niken, sắt

Mặc dù cây Lược vàng đã được sử dụng rất rộng rãi ở Nga và Việt Nam trong việc hỗ trợ và chữa trị nhiều bệnh nan y như ung thư, bỏng, viêm nhiễm, lao phổi, bệnh tim mạch… tuy nhiên, các nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây này lại chưa nhiều Vì vậy, để góp phần tạo

cơ sở cho việc sử dụng cây Lược vàng trong việc làm thuốc một cách có hiệu quả và an toàn đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của nhân dân, chúng tôi thực hiện

một số nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Lược vàng

Nhiệm vụ của luận văn bao gồm:

1 Phân lập một số thành phần hóa học từ cây Lược vàng (Callisia fragrans)

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

3 Khảo sát một số hoạt tính sinh học của cây Lược vàng

C HƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1 Giới thiệu về cây Lược vàng (Callisia fragrans)

Lược vàng (Callisia fragrans) là cây thân thảo một lá mầm, còn gọi là

họ Thài lài (Commelinaceae) Vị trí phân loại của nó trong hệ thống phát sinh chủng loại, được xếp theo các bậc phân loại từ cao xuống thấp như sau: Giới: Thực vật-Plantae

Ngành: Ngọc lan-Magnoliophyta (Hạt kín-Angiospermatophyta)

Lớp: Hành-Liliopsida (Một lá mầm-Monocotyledonae)

Bộ: Rau trai (Thài lài)-Commelinales

Họ: Rau trai (Thài lài)-Commelinaceae

Chi (Giống): Callisia (Spironema)

Loài: Callisia (Spironema) fragrans (Lindl.) Wood

Hình 1 Cây Lược vàng (Callisia fragrans) Lược vàng là loài cây thân thảo đa niên, thân ngắn, tích trữ nhiều nước, thích nghi theo hướng chịu hạn, có nhiều cầu sinh dưỡng, gọi theo kiểu dân dã

là vòi Lá màu xanh lục sáng, hình ngọn giáo, dài 8-12 cm, rộng 4-5 cm, mép hơi gợn sóng, mọc xoắn ốc, tạo thành cái loa hình hoa thị trông tựa một cái phểu ở đỉnh Lá có thể thay đổi một ít hình dạng và màu sắc khi ở các môi

trường khác nhau Trong điều kiện chiếu sáng toàn phần, cường độ ánh sáng mạnh, ẩm độ không khí và ẩm độ đất thấp thì lá ngắn lại, mép gợn sóng nhiều hơn và có đường viền màu tím, lá cũng mọc chặt hơn Hoa mọc thành từng cặp xim trên một trục dài 40-50 cm, mỗi cặp xim được ôm bởi 3 lá bắc dài 1-1,5 cm; đài trắng-trong suốt, khô xác, hình trâm, dài 5-6mm; tràng trắng trong, bóng nhẵn, mỏng, rũ vào buổi trưa, hình trứng hẹp, dài 6 mm; nhị 6mm Cây chỉ ra hoa trong điều kiện sinh thái tối ưu, đặc biệt là ở nơi có che bóng một phần Trong điều kiện khô hạn, thời gian chiếu sáng trong ngày dài, cường độ ánh sáng cao, cây không ra hoa (Wagner et al., 1999).

I.2 M ột số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

cây Lược vàng (Callisia fragrans)

Các nhà khoa học Mỹ đã xác định được các lipit trung tính bao gồm cả glycolipit, phospholipit và thành phần axit béo của chúng Đồng thời cũng đã xác định được hàm lượng axit ascorbic, các axit hữu cơ khác, diệp lục tố (clorophyl) và sắc tố carotenoit trong các cơ quan khác nhau của Lược vàng [10]

Một số công trình khoa học ở Mỹ và Canada đã công bố kết quả nghiên cứu các hoạt chất sinh học trong cây Lược vàng, bao gồm nhóm flavonit, steroit, các vitamin C, B2 (riboflavin), B3 (axit nicotinic), B5 (axit panto-thenic) và các vi khoáng như đồng, sắt, nicken… Trong số đó, nhóm flavonoit

có tác dụng trị bệnh cao hơn cả Nhóm flavonoit có trong cây Lược vàng bao gồm hoạt chất quercetin và kaempferol Đây là hai hoạt chất đã được phát hiện ở nhiều loài thực vật khác nhau, đã được nghiên cứu tác dụng dược học

từ lâu Dựa vào tính chất hóa học và công dụng của chúng, khi chỉ cần phát hiện nó trong cây Lược vàng, nhiều người cũng khẳng định cây Lược vàng có khả năng điều trị những bệnh mà quercetin và kaempferol có được

Mặc dù chưa nghiên cứu cụ thể hàm lượng, cũng chưa thử nghiệm y học trên cơ thể người đối với thân và lá của cây Lược vàng

Quercetin có công thức phân tử là C15H10O7, khối lượng phân tử

302,236g/mol, điểm nóng chảy 316oC Kaempferol có công thức phân tử là

C15H10O6 (chỉ khác quercetin 1 phân tử oxy), khối lượng phân tử là 286,23

g/mol, điểm nóng chảy là 276-278oC [10, 33, 43]

Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ (The American Cancer Society), quercetin có

khả năng chống bệnh phổ rộng (lây nhiễm, viêm khớp, hen phế quản, dị ứng

da và những bệnh màng nhầy, tim mạch, đái tháo đường), bao gồm cả ung

thư Đã có những thí nghiệm trên tế bào ở phòng thí nghiệm về các chuyển

chất khác nhau của quercetin bao gồm chuyển chất chặn đứng ung thư, nhưng

những nghiên cứu này chưa tiến hành trên cơ thể động vật và người [10]

Trong enzym học (enzymology), các nghiên cứu đã cho thấy quercetin

hiện hữu dưới nhiều dạng quercetin 2,3-dioxygenase, quercetin

3-O-methyltransferase, quercetin-3-sulfate 3'-sulfotransferase, quercetin-3-sulfate

4'-sulfotransferase, quercetin-3,3'-bissulfate 7-sulfotransferase Tùy loài thực

vật, tùy môi trường sống, tuổi sinh trưởng…sự hiện hữu đó không giống

nhau Điều này cho thấy rằng, những thông tin cho rằng cây Lược vàng trị

được ung thư có thể xuất phát từ một sự quy nạp thiếu logic Chẳng hạn như,

theo UCLA (University of California, Los Angeles) khi nghiên cứu bệnh ung

thư thấy rằng, thức ăn chưa nhiều flavonoit có thể có khả năng ngăn chặn sự

phát triển ung thư phổi Từ đó có người hiểu rất chung rằng trong cây Lược

vàng cũng có flavonoit nên trị được ung thư [38]

Cũng theo Hiệp hội Ung thư Mỹ (The American Cancer Society),

kaempferol có tác dụng tăng cường tính thấm, lợi tiểu, được dùng điều trị các

bệnh đường tiết niệu, dị ứng

Ngoài ra, cũng theo các tài liệu trên, Lược vàng còn chứa beta-sitostirola,

có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, làm sạch và săn chắc thành mạch máu, được dùng điều trị chứng xơ vữa động mạch, bệnh rối loạn biến dưỡng, hệ nội tiết, viêm tiền liệt tuyến

Ở Việt Nam, vừa qua với chức năng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, một số nhà khoa học đầu ngành Dược học (Ts Nguyễn Minh Khởi, Ts Nguyễn Duy Thuần, Ts Trịnh Thị Điệp, Ts Trần Công Khánh…) và Viện Dược liệu, thuộc

Bộ Y Tế, đã tiến hành nghiên cứu thành phần các hoạt chất của cây và chỉ ra rằng với liều 50 g lá tươi/kg thể trọng, Lược vàng không có tác dụng chống

viêm nhưng có khả năng kháng khuẩn yếu trên chủng Staphylococcus aureus

I.3 Sơ lược về các lớp chất có trong cây Lược vàng

Qua việc nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lược vàng chúng tôi đã xác định được trong lá và thân có chứa các lớp chất: flavonoit, phytosterol, carotenoit, các axit béo…Sau đây là một số đặc điểm về các lớp chất sterol và flavonoit

I.3.1 Tổng quan về lớp chất sterol

Sterol thuộc lớp chất steroit, tham gia cấu tạo màng của hầu hết các tế bào eukaryote Vi khuẩn không thể tự tổng hợp sterol Tuy vậy, một số vi khuẩn có thể kết hợp sterol từ môi trường ngoài vào màng của chúng Ngoài vai trò tham gia cấu tạo màng, sterol còn đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp nên nhiều chất có vai trò sinh học quan trọng khác Ví dụ: các steroit hormone

là những tín hiệu sinh học điều khiển sự biểu hiện gene, các axit mật là các dẫn xuất phân cực của cholesterol hoạt động như là những chất tẩy (detergent) trong ruột và nhũ tương hóa mỡ của thức ăn, từ đó làm cho chúng có thể tiếp cận được với enzyme lipase của đường tiêu hóa

Sterol phân bố rộng-chúng thường có mặt song song với các ancaloit hoặc saponin steroit-có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất

ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các este, một số ít ở dạng glicozit

a) Cấu tạo hóa học

Các sterol là ancol bậc 2 nhiều vòng có nhân xiclopentano pehydro phenandren: Người ta gặp chúng ở dưới dạng este hoặc kết hợp với các đường

ở dạng heterozit

Nhân steroit:

• Xiclopentano

pehidrophenandren

• A, B, C: Nhân của phenandren

đã được hydro hóa

• D: xiclopentan

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12 13

16 17

Các sterol có một nhóm hidroxi ở C-3, nhóm này có thể là α hoặc β đối với nhóm metyl góc ở C-10, do đó có các công thức cấu hình sau:

H

5β-Cholestan-3β-ol

5β-Cholestan-3α-ol

b) Phân loại

Sterol được phân loại thành bốn nhóm:

 Nhóm sterol động vật (zoosterol): cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol, coprosterol, cerebrosterol, latho-sterol

 Nhóm sterol của động vật biển không xương sống: spongesterol, clionasterol, 24-metylencholesterol, fucosterol

 Nhóm sterol nấm men: ergosterol, zymosterol, acosterol, sterol

feco- Nhóm sterol thực vật (phytosterol): Sistosterol (có các đồng phân α, β, γ), stigmasterol, α-Spinasterol, Brassicasterol Các sterol thực vật có trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt có dầu

c) Sinh tổng hợp Sterol

Từ sterol có thể tổng hợp được rất nhiều hợp chất steroit hoạt động hóa sinh học Con đường sinh tổng hợp sterol được trình bày ở sơ đồ 1

Sơ đồ 1 : Con đường sinh tổng hợp của sterol

Sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp sterol bao gồm:

Androstenedion là một androgenic steroit được tạo ra ở trong tinh hoàn,

vỏ tuyến thượng thận và buồng trứng Androstenedion là cấu trúc của estron trong quá trình chuyển hóa thành testosteron và các androgen khác Androstenedion được sử dụng như là một dạng thuốc kích thích

trưởng và hoạt động bình thường của các tuyến sinh dục đặc trưng

Estrogen là một loại hoocmon giới tính nữ, ở phụ nữ bình thường không

có thai, estrogen được bài tiết chủ yếu ở buồng trứng, chỉ một lượng rất nhỏ

do tuyến vỏ thượng thận bài tiết Khi có thai, rau thai bài tiết ra một lượng lớn estrogen Ở rau thai, estrogen do các tế bào lá nuôi bài tiết, nồng độ tăng dần, vào cuối thời kì có thai nồng độ có thể gấp 30 lần so bình thường Hầu hết là estron (hoạt tính yếu nhất), được tổng hợp từ androgen tuyến thượng thận của

mẹ và rau thai Tế bào lá nuôi chỉ là bước chuyển hóa trung gian androgen thành estrogen Estrogen có tác dụng làm xuất hiện và bảo tồn đặc tính sinh dục nữ thứ phát kể từ tuổi dậy thì bao gồm phát triển các cơ quan sinh dục, phát triển lớp mỡ dưới da, giọng nói trong, dáng mềm mại, ngoài ra estrogen còn có tác dụng làm tăng quá trình tổng hợp các protein ở gan, quá trình lưu thông máu, duy trì hàm lượng nước và muối ở trong máu, giảm nguy cơ ung thư vú

 Progesteron

O

OH O

Progesteron là một hoocmon steroit được tạo ra ở tuyến thượng thận, vỏ não, bộ phận sinh dục Ở phụ nữ có thai, rau thai bài tiết một lượng đáng kể (0,25 mg/ngày) progesteron cho tới cuối thời kì có thai Progesteron có tác dụng làm giảm co bóp cơ tử cung, ngăn cản việc đẩy trứng đã thụ tinh ra ngoài và tạo môi trường ổn định cho bào thai phát triển nồng độ progesteron cao có thể làm tăng tái hấp thu ion Na+, Cl- và nước ở ống lượn xạ; làm phát triển tế bào màng rụng nội mạc ở tử cung; giảm co bóp cơ tử cung khi có thai,

do đó ngăn cản sảy thai

 Corticosteron và cortisol

O

OH O

HO

Corticosteron

O

OH O

Cortisol

Corticosteron và cortisol là hoocmon tuyến thượng thận Chúng có tác dụng tăng tạo glycogen ở gan, thúc đẩy tạo đường mới do dị hóa protein; ức chế sử dụng glucose ở tế bào, tăng hấp thu glucose tại ruột, gây tăng đường

protein sinh aminoaxit, tăng đào thải nitơ theo nước tiểu; ở gan , tăng đồng hóa và thu nhận aminoaxit

 Aldosteron

O

O HO

HO

O

Aldosteron là hoocmon tuyến thượng thận, nó có tác dụng làm tăng tái hấp thu Na+ ở ống lượn xa, đoạn lên quai Henles và ống góp, đồng thời còn trao đổi K+ ở ống lượn xa do đó làm tăng thể tích và áp suất máu trong cơ thể Aldosteron đóng vai trò như là một enzym kích thích quá trình sản sinh andosteron từ vỏ thượng thận

11 12 13

16 17 18

19

HO

27 20

22

23

24 25

Cholesterol là sterol được biết đến đầu tiên Nó là thành phần chính của sỏi mật và đã được phân lập từ nguồn này bởi Conradi vào năm 1775 Tên gọi cũng có nguồn gốc từ nguồn này (Tên Hy lạp cholesterin = mật rắn) (Sơvron, 1815) Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào, nó giúp tính

lỏng của màng ổn định trong khoảng dao động nhiệt độ rộng hơn Nhóm hydroxyl trên phân tử tương tác với đầu phosphat của màng còn gốc steroit và chuỗi hydrocarbon gắn sâu vào màng Nó là tiền chất chính để tổng hợp vitamin D, nhiều loại hormone steroit, bao gồm cortisol, cortisone, và aldosterone ở tuyến thượng thận, và các hormone sinh dục progesterone, estrogen, và testosterone Các nghiên cứu gần đây cho thấy cholesterol có vai trò quan trọng đối với các synapse ở não cũng như hệ miễn dịch, bao gồm việc chống ung thư

Ngày nay người ta dùng β-stitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng động mạch, làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ cholesterol ở ruột bằng cách tạo ra một phức chất không tan, mặt khác nó còn

có tác dụng trị xơ vữa động mạch nhờ có đặc tính chống ôxy hóa

đã được xác định bởi sự thủy phân ozonit, mà isopropyl-metylaxetandehyt (2,3-dimetylbutanal) đã được phân lập như là một sản phẩm phân cắt Bằng cách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D2 có tác dụng trị còi xương

d) Stigmasterol

HO

Stigmasterol còn được gọi là (22)-24(S)-24-etylcholesta-5,22-dien-3β-ol,

C29H47OH, xuất hiện trong đậu nành và chỉ phân biệt với cholesterol bởi mạch nhánh của nó Giống như ergosterol nó có một nối đôi giữa các nguyên tử

cacbon 22 và 23 Trong khi ergosterol có một nhóm thế metyl ở C-24, ở stigmasterol có một nhóm etyl Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol là etyl-isopropyl-axetandehyt (2-etyl-3-metylbutanal)

Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hocmon và chúng ta đã nói đến việc sử dụng với khối lượng lớn Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin, diosgeny) được dùng để bán tổng hợp các hoocmon sinh dục và vỏ thượng thận

Tiến hành: Cho 0,01g phần chiết cần thử vào 2ml dung dịch NaOH 10%

và đun cách thủy đến khô Hòa tan cặn trong 3ml CHCl3, lấy dịch CHCl3 để thử Lấy 1ml dung dịch thêm một giọt thuốc thử Liebermann- Burchadt (1 giọt anhydrit axetic +1 ml CHCl3, để lạnh đến, sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc) Sau một thời gian có màu xanh là dương tính

b) Phản ứng salkowski

Phản ứng của một lượng mẫu thử trong dung môi thích hợp với axit sunfuric đặc, tạo nên hai pha, với một màu đỏ hoặc vàng, cho thấy sự có mặt của các sterol được metyl hóa

Tiến hành: Hòa tan 1-2 mg phần chiết cần thử vào 1ml CHCl3 và thêm 1ml H2SO4 đặc

I.3.2 T ổng quan về lớp chất Flavonoit

1 Giới thiệu chung

Flavonoit là những chất màu thực vật, chúng là hợp chất được cấu tạo gồm hai vòng benzen A và B được kết nối bởi dị vòng C với khung cacbon

6

7

2' 3' 4'

5' 6'

Flavan (2- phenyl chroman)

Sự biến đổi trạng thái oxy hoá của phần C-3 sẽ xác định các phân lớp, trong đó có các nhóm: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, isoflavonoit, chalcon, dihydrochalcon, auron, anthocyanidin, catechin, leucoanthocyanidin,

Flavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các nhóm hydroxyl liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất rất khác nhau

Quercetin là flavon phổ biến rộng rãi nhất, tiếp đến là một số flavon cũng thường thấy khá nhiều trong quá trình phân lập hoá thực vật như primuletin, fisetin

OH O

OH

OH OH

Quercetin

OH O

OH OH

Fisetin

O O

O O

O

OH [OH]

O O

OH

Gl O

Prunin

2.3 Flavanonol

Các flavanonol còn gọi là flavanon-3-ol hay dihydroflavonol; flavanonol

có cấu trúc giống flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxyl ở vị trí C-3

Các hợp chất thuộc nhóm này phần lớn ở dạng aglycon, một số ít ở dạng glycosit Flavanonol có hai nguyên tử cacbon bất đối là C-2 và C-3 nên chúng

có tính quang hoạt Các hợp chất flavanonol thường gặp là aromadnedrin, fustin và taxifolin

OH O

OH

OH OH

A

B

Isoflavon

O12 3 4 5

6 7 8

1' 2' 3' 4' 5' 6'

6 7 8

1' 2' 3' 4' 5' 6'

A

B

Isoflavanon

2.5 Chalcon

Chalcon khác với các loại flavonoit khác là gồm hai vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố được đánh bắt đầu từ vòng B

O

1 2 3 4 5 6

1' 2'

4' 5' 6'

3'

Chalcon

Các hợp chất chalcon thường ít gặp trong tự nhiên Chalcon có thể bị đồng phân hoá thành flavanon khi đun nóng với axit clohydric (HCl)

O

O HC

OH

OH GluO

Sunphurein

2.7 Anthocyanin

Hầu hết các màu sắc như xanh lơ, tía, tím và những màu đã có sẵn trong nhựa tế bào hoa, quả, lá, thân là do các chất màu anthocyanin ở thể hoà tan Những chất màu không có phần đường gọi là anthocyanidin Cấu trúc chung thông thường của các anthocyanidin là ion flavilyum (2-phenyl-benzo-pyrylium)

OH

Pelargonidin

OH OH

HO O +

OH OH

OH

Delfinidin

OH OH

OH OH

Cyanidin

2.8 Catechin

Catechin là các dẫn xuất flavan-3-ol, do có hai trung tâm bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang Ví dụ như các cặp catechin và epicatechin, trong đó chỉ có (+)-catechin và (−)-epicatechin là xuất hiện trong thiên nhiên

OH OH

OH OH

(+)-catechin

OH OH

OH OH

(−)-epicatechin

OH OH

OH OH

(−)-catechin

OH OH

OH OH

(+)-epicatechin

2.9 Leucoanthocyanidin

Leucoanthocyanidin là những flavan-3,4-diol Chúng là những hợp chất màu nhưng khi gặp axit biến thành hồng hoặc đỏ, được phân bố rộng rãi trong các loài thực vật Trong đó melacacidin và leucopelargonidin là hai hợp chất đặc trưng và được chú ý nhiều nhất

OH

H HO

OH H

OH OH

Melacacidin

H HO

OH H

O O

O C

OMe OMe O

6

7

8

1' 2' 3' 4' 5' 6'

Khung 4-ary chroman

O

O

O O

MeO

Calaphylolit

3 Tác dụng sinh học của flavonoit

Flavonoit là nhóm chất phổ biến trong thực vật, thường có trong các loại rau quả dùng hàng ngày Flavonoit là một lớp chất lớn trong dược liệu, phần lớn chúng có màu vàng, ngoài ra còn có các chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu Flavonoit có mặt trong hầu hết các bộ phận của loài thực vật bậc cao, đặc biệt là hoa, tạo cho hoa màu sắc quyến rũ để thu hút các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây Trong cây, flavonoit giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn axit ascorbic trong tế bào và ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, vi rut, côn trùng…), một số còn có tác dụng điều hoà sinh trưởng của cây

Flavonoit là nhóm chất có nhiều tác dụng sinh học, những flavonoit có hoạt tính sinh học được gọi là các bioflavonoit Chúng có các vai trò như là chất chống oxy hoá, có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn cản xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ, flavonoit làm bền thành mạch, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavon, flavonol, flavanol có tác dụng lợi tiểu

Dân ta đã có kinh nghiệm sử dụng những dược liệu giàu flavonoit để giữ gìn sức khoẻ hàng ngày bằng cách dùng đơn giản là trà thuốc: thuốc sắc như nước chè, trà actiso…vừa rẻ tiền lại hiệu quả Những dược liệu có hàm lượng flavonoit cao đã được khai thác và chiết xuất lấy flavonoit để phục vụ cho nền công nghiệp dược: hoa hoè, vỏ cam, núc nác, hoàng cầm, lá xoài…và một số flavonoit đã được nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: thuốc viên, thuốc

nước…rất thuận tiện cho sử dụng [5, 17, 30, 45]

4 Hệ thống các chất chống oxy hóa

Những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụng độc hại của các dạng oxy hoạt động đều được gọi là chất chống oxy hóa

4.1 Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzym

Các chất chống oxy hóa chủ yếu trong tế bào của cơ thể người gồm những enzym SOD-superoxit dismutaza, catalaza và GSHPO-glutathion pero-xidaza [31, 39]

Enzym SOD có mặt trong tất cả các tế bào có chuyển hoá oxy Chức năng của enzym này là xúc tác quá trình phân huỷ superoxit [11]

2 2

2 2

Catalase là một chất chống oxy hoá vì nó xúc tác phản ứng phân huỷ

H2O2 Tuy nhiên catalaza không phân huỷ được các peroxit hữu cơ và cả

H2O2khi ở nồng độ thấp [24, 26]

2H O 2H O + O

SOD

Glutathione peroxidaza (GSHPO) là enzym xúc tác cho phản ứng loại

bỏ các H2O2 hữu cơ và vô cơ H2O2 khi mới tạo ra với nồng độ thấp, xảy ra phản ứng của glutathion (GSH) với H2O2 nhờ enzym GSHPO xúc tác:

2GSH + LOOH GSSG + LOH + H2O Enzym GSHPO có ở ti thể, nạp thể và bào tương, nó chứa selen trong trung tâm hoạt động Vì vậy hàm lượng selen trong cơ thể liên quan chặt chẽ với hoạt độ của enzym này Enzym không chỉ phân hủy H2O2 mà cả các peroxit hữu cơ khác Như vậy khả năng loại bỏ các peroxit phụ thuộc vào hoạt

độ của enzym GSHPO và nồng độ của glutathion [8, 41]

4.2 Hệ thống các chất chống oxy hoá có bản chất không phải enzym

Có rất nhiều chất hoá học có khả năng chống oxy hoá thể hiện qua phản ứng thu dọn các gốc peroxit, oxy đơn bội, các gốc tự do khác, hoặc gián tiếp ngăn chặn quá trình oxy hoá sinh học Chúng có thể có sẵn trong cơ thể hoặc được bổ sung từ bên ngoài Những nhóm chính là nhóm các chất polyphenol, các thiol, nhóm các phối tử của Fe (hay Cu), muối selen và phức của Se4+, nhóm các chất chứa nhiều nối đôi liên hợp [15, 16, 22]

- Nhóm các polyphenol

Thuộc nhóm này có vitamin A, vitamin E, coenzym Q10, vitamin C, bioflavonoit + Dạng khử của chúng có thể phản ứng với các gốc tự do, tạo dạng oxy hoá (quinon)

OH

OH + 2R.

O

O + 2RH

+ Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và có khả năng phản ứng với hai gốc tự do khác Tuy nhiên sự chuyển dạng theo khuynh hướng này tương đối yếu

GSHPO

+ Các polyphenol (dạng ortho) có khả năng tạo phức (chelat hoá) với ion sắt (hoặc đồng) và như vậy có thể làm mất khả năng xúc tác của những ion này để tạo phản ứng Fenton

Các vitamin E, A có chức phenol ở vị trí para nên không thể hiện khả

năng tạo phức chelat này

Tuy cùng có tác dụng chống oxy hoá, song các polyphenol có những tính chất vật lý và hoá học khác nhau nên tính chất sinh học của chúng cũng rất khác nhau

- Vitamin E: là chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit và phân bố khắp

nơi trong tế bào, nó được coi như là chất bảo vệ của các màng sinh học do khả năng ngăn cản quá trình peroxy hoá các axit béo chưa bão hoà của màng Vì tính chất ưa lipit nên vitamin E có thể liên kết mật thiết với phần hydrocacbon của các axit béo chưa bão hoà nối đôi, do đó có thể tiếp cận gần vị trí của quá trình peroxy hoá và dập tắt chuỗi phản ứng

Một điều đáng chú ý là vitamin E chỉ phát huy tác dụng khi cơ thể đủ selen Selen có tác dụng hoạt hoá vitamin E Hoạt tính chống oxy hoá của vitamin E có liên quan mật thiết với những chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit ở huyết tương và hồng cầu người trưởng thành [19]

- Vitamin C: Một trong những tác nhân chống oxy hoá của vitamin C là

đưa vitamin E từ dạng oxy hoá về dạng khử:

Vit E (ox) + Vit C (kh) → Vit E (kh) + Vit C (ox) Hằng số tốc độ phản ứng khá lớn K=1,55.106 M-1giây -1 Cơ chế này giải thích cho sự ít thiếu hụt vitamin E ở người

Vitamin C còn có những tính chất chống oxy hoá khác ở môi trường nước như loại hydro peroxit Nhưng tính chất này chỉ thể hiện nếu không có mặt của ion sắt Nếu có mặt ion sắt (như uống thuốc sắt liều cao, vỡ hồng cầu gây tổn thương cơ) thì vitamin C sẽ có tính oxy hoá mạnh Do đó, trong thực nghiệm người ta dùng hỗn hợp ion sắt và vitamin C làm nguồn sinh gốc tự do [35, 37, 40]

- Các flavonoit: flavonoit là một chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất là polyphenol Những flavonoit có hoạt tính sinh học được gọi là bioflavonoit Khi đưa flavonoit vào cơ thể, chúng sẽ triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự

do mới bền vững hơn, không tham gia vào phản ứng dây truyền gốc và được coi là những "cái bẫy" để loại trừ các gốc tự do độc hại [17]

C HƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

các hợp chất thiên nhiên, VAST

II.1.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật

Mẫu cây Lược vàng được phơi khô trong không khí, rồi đem sấy ở khoảng 400 C, sau đó được xay nhỏ kích thước bằng hạt đậu tương Mẫu cây được chiết trong dung môi metanol và nước

Chiết mẫu bằng phương pháp chiết siêu âm: cho mẫu lược vàng vào bình thủy tinh khoảng 2/3 bình rồi sau đó cho dung môi đến ngập mẫu, đưa bình thủy tinh vào trong máy siêu âm bên trong có chứa nước sao cho lượng nước trong máy siêu âm phải ngập mẫu trong bình Chiết siêu âm trong khoảng 30-

45 phút sau đó cho dịch chiết ra bình nón Làm như vậy khoảng 5-7 lần, ta sẽ thu được phần dịch chiết MeOH và nước

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp chiết

II.2.1.1 Đặc điểm chung của quá trình chiết

Chiết là quá trình tách và phân ly các hợp chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với

nó

II.2.1.2 Cơ sở của quá trình chiết pha lỏng

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai pha lỏng không hoà lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst: KA= CA/ CB

KA là hằng số phân bố

CA, CB là nồng độ các chất hoà tan trong chất lỏng A, chất lỏng B không tan lẫn vào nhau

II.2.1.3 Quá trình chiết thực vật

a) Chọn dung môi chiết

Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau, dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các đặc điểm là cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại

bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này cần được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Một số chất dẻo lẫn trong dung môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcytrat, tributylphosphat- do trong quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Cloroform, etanol và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng

tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn các thành phần có trong tế bào Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào

Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất

này sẽ bị hoà tan đồng thời Thường thì dung môi cồn trong nước dường như

có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 450C, với các hợp chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

b) P hương pháp chiết suất: Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc

chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách chiết

Phương pháp cổ điển chiết xuất một dược liệu để nghiên cứu thăm dò là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để chiết phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu

Cách chiết thông dụng là chiết nóng bằng máy chiết liên tục (Soxhlet) hoặc chiết hồi lưu Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi, cần làm khô dược liệu rồi mới tiếp tục chiết với loại dung môi tiếp theo Mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể

dự đoán được sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết

- Trong phân đoạn chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các hydrocacbon béo

hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như chất béo, caroten, các sterol, các chất màu thực vật, clorophyl

- Trong dịch chiết cloroform sẽ có mặt secquitecpen, ditecpen, cumarin, quinon, các aglycon do glycozit thủy phân tạo ra, một số ancaloit bazơ yếu

- Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ancaloit, flavonoit, các hợp

chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin

- Trong dịch chiết nước sẽ có mặt các glucozit, tanin, các đường, các hợp

chất hydratcacbon phân tử vừa như pectin, nhầy, gôm, các protein thực vật và các muối vô cơ

- Khi chiết lấy toàn bộ thành phần dược liệu thì dung môi thích hợp nhất

là cồn (metanol hoặc etanol) 80% Metanol được xem là dung môi đa năng,

nó hòa tan được các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo cầu nối hydro với các nhóm phân cực khác

Dịch cồn đem bốc hơi dung môi sẽ được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu

Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng một dãy dung môi không hòa tan lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh Ví dụ dãy dung môi: ete dầu hỏa, ete, cloroform, etylaxetat, butanol

Hòa tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết, lần lượt chiết bắt đầu là ete dầu hỏa đến ete, cloroform, etylaxetat và cuối cùng là butanol Dịch chiết mỗi phân đoạn đem cất thu hồi dung môi và phân tích riêng

Cách chi ết: Có hai cách chiết xuất: chiết ở nhiệt độ thường và chiết

nóng Mỗi cách chiết có dung môi và thiết bị riêng

- Hai cách chiết thông thường ở nhiệt độ thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn Phương pháp ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết được nhiều

hoạt chất và ít tốn dung môi

- Chiết nóng: Nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu Nếu dung môi là nước thì sắc hoặc hãm phân đoạn

Dụng cụ chiết liên tục là bình Soxhlet Nếu chiết nóng hồi lưu thì nên chiết phân đoạn ít nhất là 2 lần để chiết hết hoạt chất

II.2.2 Các p hương pháp phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

II.2.2.1 Các phương pháp sắc ký để phân lập các chất từ dịch chiết

* Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký:

Sắc ký là phương pháp tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Sắc ký gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tùy vào tính chất của

chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, độ phân cực ) Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến các lớp pha tĩnh khác sẽ xảy

ra việc lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả các hợp chất

có ái lực lớn hơn đối với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc

ký so với các chất có ái lực yếu hơn đối với pha tĩnh này Nhờ đặc điểm này

mà ta có thể tách các chất ra khỏi nhau qua quá trình sắc ký

* Cơ sở của phương pháp sắc ký:

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = nα bC/(1 + bC)

Trong đó:

n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

nα - Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào

đó

b - Hằng số

C - Nồng độ của chất bị hấp phụ

* Phân loại các phương pháp sắc ký:

Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hay rắn Theo trạng thái tập hợp của pha động chia sắc ký thành hai nhóm lớn là: sắc ký khí và sắc

ký lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký lại được chia thành nhiều cách khác nhau