The summary of the medical Dotoral thesis: Studying polymorphism of TNF-α-308 G>A and TGF-β1-509C>T in hepatocellular carcinoma patients with HBsAg positive

Determining the frequency of genotype and allele of TNF-α – 308 and TGF-β1-509 in HCC patients with HBsAg (+). Analysing the association of TNF-α-308, TGF-β1-509 polymorphism with risk of HCC and some clinical and subclinical characteristics of HCC patients.

1 National Library

2 Vietname Military Medical University’s library

3

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the common malignant tumors  globally  with   the  main   cause   is   chronic   hepatitis  B   virus (HBV)   infection   This   cancer   has   a   poor   prognosis   with   a   short survival time, due to limited early diagnosis. 

The   host's   single   nucleotide   polymorphism   (SNP)   plays   an important role in determining the body's immune response to HBV infection, affecting HCC formation

Research   on   gene   polymorphism   helps   stratify   risk   subjects, improve early detection and treatment results. Recently, many studies 

in the world have shown the influence of TNF­ ­308 G> Aα  and TGF  –  1­509C>Tβ  is associated with an increased HCC risk. The carriers 

of A allele of TNF­   ­ 308 G>Aα , T alleles of TGF –  1­509 C>Tβ  

increase the risk of HCC higher than the other carriers of alleles.The polymorphisms influence HCC progression in controlling the concentration of the corresponding cytokines. In the microbiological environment,   these   cytokines   interact,   support   and   enhance   the effects of each other

Vietnam is a country, located in the epidemic zone of hepatitis B virus,   having   a   high   incidence   of   HCC   with   extremely   serious consequences

Therefore,   the   thesis   "Studying   polymorphism   of   TNF­ ­308α   G>A and TGF­ 1­509C>T in hepatocellular carcinoma patientsβ   with HBsAg positive" was conducted with two objectives.

1 Determining the frequency of genotype and allele of TNF­α  – 308 and TGF­ 1­509β  in HCC patients with HBsAg (+)

2   Analysing   the   association   of  TNF­ ­308,   TGF­ 1­509α β  

polymorphism with risk of HCC and some clinical and subclinical characteristics of  HCC patients. 

­    This  is  the  first   scientific  study  in  Vietnam   researching  on 

frequency   of  genotype,   allele   of  TNF­ ­308   G>A,   TGF­   1­509α β   C>T  in healthy people, chronic hepatitis B and HCC with HBsAg 

(+)

* TNF­  – 308 G>Aα

+ The AA genotype only appeared in HCC group, which was 0.98%, the frequency of alleles of A TNF­   ­ 308 G>A was low inα  healthy people, 5.4%, which was similar to Asian population

+  The  frequency  of   allele  A   in  the   healthy  group,   chronic hepatitis   B   and   HCC   was   5.4%,   5.83%   and   13.2%,   respectively. There was differences in the frequency of genotypes GG, GA and A allele among HCC groups compared to healthy, chronic hepatitis B groups

* TGF– 1­ 509 C>Tβ

+ The frequency of T allele in the healthy group, HBV and HCC   was   52.9%;   61.67%   and   63.24%,   respectively   There   was difference in the frequency of T allele in HCC and healthy groups

­  The study showed that A allele, genotype containing allele A of 

TNF­  ­308α  increased the risk of HCC compared with G allele and genotype containing allele G. Alen T, genotype containing allele T of 

TGF­ 1­509β  increased the risk of HCC compared with C allele and genotype   contain   C   allele   Two   polymorphisms   interacted synergistically with each other increasing the risk of HCC

* The doctoral thesis arrangement: This thesis contains 113 pages (without references and appendixes): Introduction: 02 pages, Chapter 1 Overview: 31 pages, Chapter 2: Subjects and methods: 17 pages, Chapter 3 Results: 30 pages, Chapter 4 Discussion: 30 pages, Conclusion: 02 pages, Recommendations: 01 page. It includes 46 tables, 23 figures, and 125 references (14 Vietnamese references and 

111 English references)

1.1 Overview of hepatocelular carcinoma 

Hepatocelular   carcinoma   is   the   sixth   most   common   cancer among   the   10   common   cancers   worldwide  Located   in   Southeast Asia,  high epidemic area, Vietnam has a high incidence of HCC. Corresponding to the high prevalence and mortality rates of HCC, the status of HBV infection is also worrisome. According to Robert G et 

al (2011), Vietnam is one of the countries which has the highest HBV infection rate in the world with nearly 12% of people having HBsAg (+),   about   10   million   people   living   with   chronic   HBV.  In   2018, GLOBOCAN had notified the ASRI  (age specific standard index) of HCC in Vietnam for both sexes is 23,2, ranked fourth globally. HCC is closely related to HBV infection. However, the reality is that not all patients infected with HBV will develop HCC. Therefore, both HBV and patients play important role, they interact with each other to cause the final disease

1.2 Single nucleotide polymorphism (SNP) 

The human genome, largely preserved during evolution, at least 99.5% of genes between any two individuals will be identical, so the difference is only 0.1% ­ 0.5%  This is the key to creating each individual is unique due to different characteristics (shape, inherited disease   )  Many factors in the genome contribute to 0.1% of the difference, of which SNP (single­polymorphism) plays an important role. SNP is defined as a single base change on a DNA sequence, this change accounts for a proportion of ≥ 1% in the large community and continue to be inherited for the next generation. SNP can be located 

in different regions of the gene, in the promoter region, it plays an important   role in controlling  the  start  and  level  of  transcriptional activity of the gene

TNF­  α– 308 G>A gene

TNF­α gene (Tumor necrosis factor ­ alpha) is located in locus  21.3 of the short arm chromosome 6 (6p21.3). TNF­α gene has many 

polymorphism, especially the polymorphism at ­308 in the promoter region plays an important role. This SNP has 2 types of alleles: the allele   G,   the   other   rarer   type,   the   allele   A   The   frequency   of 

genotypes   and   alleles   of  TNF­   308G>Aα   polymorphisms   varied among different populations

TGF­ 1­ 509C>T geneβ

TGF­ 1β   gene (Transforming Growth Factor, Beta 1) is located 

on  the  long  arm   of   chromosome  19  (19q13.1­13.3)   Many  single 

polymorphisms have been identified in the  TGF­ 1β   gene, of which SNP at the C­509T site at the promoter region has important role. It 

TNF­α ­308 G/A gene 

Teixeira A.C. et al (2013) studied the association of TNF­  ­308α   G/A polymorphism with HCC risk in Brazil in 120 HCC patients and 

202 healthy people. The result had shown there was an increased 

HCC   risk   in   people   carriers   A   allele,   GA   gene   of  TNF– ­308α  

compared to people carriers G allele, GG gene with (OR = 1,82; 95%CI = 1,07­3,08; p = 0.0351), and (OR = 2,51; 95%CI = 1,39­4,51; p = 0,0031). 

Tsai J. F. et al (2017) studied the effect of TNF­   ­ 308 G>Aα  on HCC risk related to HBV in 200 HCC infected with HBV patients and 200 cirrhosis with HBV infected patients, concluded that GA 

OR = 2,34; 95% CI (1,29 – 4,25); p = 0,004

TGF­ 1­509C>T β gene

Ma J. (2015) studied 393 patients with hepatitis C found that the risk of HCC was higher in patients with TT gene than CC gene with 

OR = 1,820, p = 0.03. Patients carrier T allele compared with C allele increased the risk of HCC with OR= 1,383, p = 0.028

Combination TNF ­308G>A, TGF­ 1­509C>T α β

HCC, complex disease, is affected by many factors, of which the role of a gene is very important, but in fact, no single polymorphism can  fully  explain  the   complex  mechanisms  of   disease,   each  SNP plays only a very small role in the development of disease. Therefore, the new trend is studying the combination of genotypes and alleles of different   SNPs   with   the   risk   of   disease,   help   stratify   This   helps increase the value of early detection and improve the effectiveness of disease treatment

Bei C.H. (2014) evaluated the effect of 6 SNP include IL­2, IFN­ , IL­1 , IL­6 and IL10 genes with risk of HCC in China in 720γ β  HCC patients and 784 healthy people, had concluded that although not a single SNP increased the risk of HCC, but  combination of 6 SNP had increased HCC risk with OR = 1,821; 95%CI = 1,078 ­ 3,075. The authors said that interactions between SNPs increase the 

risk of HCC. El Din N.G. (2017) assessed the effects of TNF­  ­308α   and TGF – 1­509β  on cirrhosis progression due to HCV showed that 

combination of TNF­ ­ 308α  AA and TGF­ 1­509β  TT compared with 

TNF  (GG) +  TGF  (CC) increases risk of cirrhosis with OR = 6,4; 

95%CI = 1,490 – 27,641; p = 0,013. The results showed  that these 

was a synergistic effect of 2 genes because  TNF­α  alone increased  the   risk   of   cirrhosis   by   2.8   times,  TGF­ 1β   increased   the   risk   of cirrhosis by 2.9 times

1.4. Studies TNF ­308G>A and TGF­ 1­509C>T in Vietnamα β

studies on TNF­  ­ 308α  and TGF­ ­ 509β  in HCC patients. In 2012, Dunstan studied in 2350 healthy Vietnamese people, genetic analysis was conducted in England. The result showed that the percentage of 

A allele TNF­  ­ 308α  was 7%. Tran Dinh Tri (2017) studied the gene 

TNF­  ­ 308 G>Aα  in patients with stomach cancer showed that the percentage of allele A was 17.1%. Such research results have been 

noted   that   the   percentage   of   A   allele   of  TNF­   ­   308α   in   the Vietnamese population is low, similar to other Asian countries

The   polymorphism  TGF­ 1­   509   C>Tβ   has   been   extensively studied in the world with certain roles in many diseases. However, in the  Vietnamese  population,   although   we   have  tried  to   search,   no studies on this polymorphism have been published

CHAPTER 2: SUBJECTS AND METHODS

2.1. Subjects

The study included 102 HCC infected with HBV patients, 60 chronic hepatitis B patients, 102 healthy people

2.1.1. Study group 

 Inclusion criteria:

­ Diagnosis of HCC was base on the guidance of the Ministry of Health of Vietnam in 2012, has 1 of the following 2 criteria+ Anatomical or histopathological evidence of histology+ Typical image on contrast CT scan or contrast MRI with 

2.2.4.3. Analysis TNF­  ­ 308 and TGF­ 1 ­509 polymorphism α βSequencing 2 genes directly by ABI PRISM 3500 system. The sequence of reference for 2 genes was taken from Genbank database

2.2.5.3  Correlation between TNF­ ­308, TGF­ 1­509 with HCCα β   risk and clinical, subclinical characteristics of HCC patients

­  Compare the frequency of genotypes and alleles TNF­  ­ 308α   G> A, TGF­  1 ­ 509 C> Tβ  among research groups

­  Calculating the risk of HCC in different genotypes and alleles of 

TNF­  ­ 308 G> A, TGF­  1­509 C> Tα β , combining 2 genes. We classify good genes with protective effects, bad genes with increasing the risk of HCC:

+ Genotypic combination type: good combination ­ both good genes in the homozygous form, medium combination ­ one good gene in the homozygous form, bad combination ­ no good gene in the  homozygous form

­   The   relationship   between   genotypes   of   each   polymorphism, combining two polymorphisms with clinical symptoms, subclinical and HCC stage

2.2.6. Data processing: the collected data were processed according 

to the medical statistics using SPSS 20.0 statistical software

2.3. TIME AND LOCATION OF RESEARCH

Research time: October 2016­October 2017. Research locations: Bach   Mai   Hospital,   Hanoi   Medical   University,   Military   Medical Hospital 103

2.4. RESEARCH ETHICS

The subjects were fully explained and were willing to participate 

in the research. The implementation processes were trictly complied with the regulation of the Ministry of Health of Vietnam

Determination of genotype and allele frequency

Analysis of genotypic and allele relationship of TNF­  ­ 308,α  

TGF­ 1 ­509β , combining 2 polymorphisms with HCC risk and clinical and subclinical symptoms of HCC patients

Most liver tumors in the right lobe (74,5,%), average size of total tumor: 10,80 ± 12,02 cm,  size tumor <5 cm (29,4%), size tumor 

>   10   cm   was   high   percentage   (37.3%),   portal   vein   thrombosis (22.5%), other metastases (19.6%). Subclinical indicators fluctuate, 

FP < 400 ng/ml (52.9%), HBV­DNA ≥ 104 (66.7%)

α

The   majority   of   patients   were   in   stage   Okuda   II   (58.8%), Barcelona   B   (35.2%),   Barcelona   C   (36.3%)   The  rate  of   patients detected at an early stage, was low rate such as Okuda I (36.3%), Barcelona A (27.5%)

­ There was a significant difference in the frequency of GG, GA genotypes and alleles in HCC group compared to healthy group

­ A allele was significantly associated with increased risk HCC, compared to G allele, OR= 2,676; 95% CI (1,290 – 5,555); p = 0,006.

­ A allele was significantly associated with increased risk HCC, compared to G allele, OR =2,593; 95% CI (1,389 – 4,842); p = 0,002

­ A allele was significantly associated with increased risk HCC, compared to G allele, OR = 2,462; 95% CI (1,038­5,843); p = 0,036.

4.3. TGF­ 1­509 C>T β polymorphism and HCC risk

4.3.1. Frequency of genotypes, alleles of TGF­ 1­509 C>T β

­  CT   genotype  predominates   in  all   groups   T   allele   in  HCC patients   (63,24%),   chronic   hepatitis   B   (61,67%),  healthy   people (52,94%)

Tables 3.22 and 3.23 genotypes and alleles of  TGF­ 1­509β   did not affect   the  risk  of   HCC,   when   using  control   groups  were  without HCC, chronic hepatitis B

4.3.2.2 TGF­ 1­509 C>T polymorphism and clinical, subclinical,β   and stage of HCC

Tables 3.24, 3.25, 3.26, 3.27 and 3.28 showed that there was no 

difference   between  TGF­ 1­509C>Tβ   polymorphism   with   some clinical   and   subclinical   characteristics   such   as   age,   tumor characteristics, platelets,  FP, HBV DNA, portal venous thrombosis,α  metastasis, HCC stage

4.4   Combination  of  TNF­ ­308   G>A,   TGF­ 1­509   C>Tα β  

polymorphisms

We see  GG genotype of  TNF­ ­308 G>Aα   and CC genotype of 

TGF­ 1­509 C>Tβ   appeared significantly more in the without HCC group than the  HCC  group   The  genotype containing allele  A  of 

TNF­α  ­  308  and   genotype   containing   allele   T   of  TGF­ 1­509β  

increased the risk of HCC compared to the remaining genotypes. Therefore, we consider GG to be a good genotype compared to AA and  CC  as   a   good   genotype   compared   to  TT,   we   divide   the appearance of two genes as follows:

­ Moderate combination: having 1 gene GG or CC in homozygous 

­ Bad combination: neither GG gene nor CC gene in homozygous 

4.4.1. TNF­ –308G>A, TGF­ 1­509C>T polymorphism and HCCα β   risk  

When using control group was chronic hepatitis B patient, we did not see an association for HCC risk with polymorphisms

4.4.2. The relation between combination of polymorphisms and  some clinical, subclinical characteristics of HCC patients

no   effect   of   combining   2   polymorphisms   with   some   clinical, subclinical characteristics: age, tumor characteristics, platelets,  FP,α  HBV DNA, thrombosis portal vein, metastases, HCC stage

CHAPTER 4: DISCUSSION

4.1. Clinical and subclinical characteristics of HCC patientsHCC patients had an average age of 57.4 ± 9.7. The youngest is 

37 years old, the oldest is 80 years old. The majority of patients aged 51­70 years old were 67.2%. Male / female ratio: 11.8 /1

At   the   time   of   diagnosis,   the   percentage   of   patient   without symptoms was 13,7%. The average size of total tumor: 10,80 ± 12,02 

cm,   size   tumor   <5   cm   (29,4%),   size   tumor   >   10   cm   was   high percentage (37.3%), portal vein thrombosis (22.5%), other metastases (19.6%). Subclinical indicators fluctuate,  FP < 400 ng/ml (52.9%),α  HBV­DNA ≥ 104 (66.7%)

The   majority   of   patients   were   in   stage   Okuda   II   (58.8%), Barcelona   B   (35.2%),   Barcelona   C   (36.3%)   The  rate  of   patients detected at an early stage was low rate such as Okuda I (36.3%), Barcelona A (27.5%)

As we know chronic HBV infection is the most important risk factor for HCC, our study subjects were HCC patients with HBsAg (+),   but   at   the   time   of   diagnosis   only   49%  HCC  patients   knew themselves have been infected with HBV before. 

The   above   analysis   reflects   objectively   and   accurately   the situation of HCC management in Vietnam is still weak. This result is due   to   people's   ignorance   and   the   lack   of   necessary   screening programs for high­risk subjects such as people infected HBV  Our conclusions   are   similar   to   Robert   G.  (2012),  when   studying   the situation of liver disease in Vietnam. The above results show that the majority of patients with HCC are diagnosed late. This is indeed a barrier to treatment, leading to poor prognosis