Nghiên cứu sàng lọc các thuốc bảo vệ thực vật trong mẫu nước tưới và mẫu rau trên thiết bị sắc kí lỏng khối phổ phân giải cao LC HRMS

Đáng chú ý, sự phát triển không ngừng của khoa học kĩ thuật ngày nay đã đưa đến sử dụng khối phổ phân giải cao độ phân giải > 10000- FWHM cho ưu thế tuyệt vời về độ chính xác khối < 5 pp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

LÊ MINH THÙY

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG MẪU NƯỚC TƯỚI VÀ MẪU RAU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ PHÂN GIẢI CAO (LC/HRMS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

LÊ MINH THÙY

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG MẪU NƯỚC TƯỚI VÀ MẪU RAU TRÊN THIẾT BỊ SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ PHÂN GIẢI CAO (LC/HRMS)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 8440112.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trần Mạnh Trí

TS Vũ Đức Nam

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2018.331

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần

Mạnh Trí- Giảng viên Khoa Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội,

TS Vũ Đức Nam- Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ- Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Em cũng

trân trọng cảm ơn TS Chu Đình Bính- Viện Kỹ thuật Hóa học- Trường Đại học Bách

khoa Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong thời gian thực hiện luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hóa Hữu cơ cũng như bộ môn Hóa Phân tích đã giúp em tiếp cận những kiến thức quý báu, tạo nền tảng cho em được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo, các đồng nghiệp tại Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật 2

1.1.1 Giới thiệu chung về hóa chất bảo vệ thực vật 2

1.1.2 Các dạng hóa chất bảo vệ thực vật được sản xuất trên thị trường 3

1.1.3 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 3

1.1.3.1 Nhóm cơ clo (Clo hữu cơ) 4

1.1.3.2 Nhóm cơ phốt pho (Lân hữu cơ) 4

1.1.3.3 Nhóm cơ nito 4

1.1.3.4 Nhóm pyrethroid (họ cúc tổng hợp) 4

1.1.4 Ảnh hưởng của hóa chất bảo vệ thực vật 5

1.4.1.1 Ảnh hưởng đến môi trường 5

1.1.4.2 Ảnh hưởng tới con người và động vật 6

1.1.5 Thực trạng và tình hình kiểm soát thuốc BVTV ở Việt Nam 7

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích dư lượng thuốc BVTV trong mẫu rau và mẫu nước 10

1.2.1 Phương pháp phân tích sắc ký 10

1.2.2 Phương pháp xử lý mẫu trong phân tích hóa chất BVTV 14

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 17

2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn 17

2.1.1 Thiết bị 17

2.1.2 Dụng cụ 17

2.1.3 Hóa chất 17

2.1.4 Chất chuẩn và chuẩn bị dung dịch chuẩn 17

2.2 Đối tượng phân tích 20

2.3 Thu thập và bảo quản mẫu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp phân tích đồng thời đa nhóm dư lượng hóa chất BVTV trên

thiết bị LC-HRMS 23

2.4.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 23

2.4.3 Phân tích mẫu thực 24

2.5 Thực nghiệm 24

2.5.1 Phân tích trên thiết bị UPLC- Orbitrap MS 24

2.5.1.1 Chương trình sắc ký 24

2.5.1 2 Điều kiện phân tích khối phổ Orbitrap MS 25

2.5.2 Xử lý mẫu 26

2.5.2.1 Mẫu nước 26

2.5.2.2 Mẫu rau 27

2.5.3 Ảnh hưởng của nền mẫu trong phân tích LC-Orbitrap MS đối với mẫu rau 29

2.5.4 Độ chính xác khối và cơ chế phân mảnh 31

2.5.5 Đánh giá độ ổn định của tín hiệu phân tích và kiểm soát chất lượng 31

2.5.6 Xử lý số liệu 32

2.5.7 Phân tích mẫu thực 32

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 33

3.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ Orbitrap và Độ chính xác khối 38

3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích 44

3.3.1 Độ ổn định của tín hiệu phân tích 44

3.3.2 Khoảng tuyến tính 45

3.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 48

3.3.4 Hiệu suất của quá trình chiết 49

3.4 Kết quả phân tích mẫu thực 52

3.4.1 Mẫu nước 52

3.4.2 Mẫu rau 55

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

DANH MỤC VIẾT TẮT

ADI Acceptable daily intake Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận

được APCI Atmospheric pressure ionization Ion hóa tại áp suất khí quyển

CRM Certificated reference Material Mẫu đối chứng được chứng nhận

ESI Electrospray ionization Ion hóa va chạm điện tử

FAO Found agriculture organization Tổ chức Nông nghiệp và lương

thực Liên hợp quốc

FWHM Full width at half maximum Độ rộng lớn nhất tại ½ chiều cao

pic GC-MS Gas chromatography- mass spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ

(UP)LC-(HR)MS

Ultrahigh performance liquid chromatography- high resolution mass spectrometry

Sắc ký lỏng (siêu hiệu năng cao) ghép nối khối phổ (phân giải cao)

MDL Method of detection limit Giới hạn phát hiện của phương

pháp

MQL Method of quantification limit Giới hạn định lượng của phương

pháp

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

OPs- Organophosphorus groups Nhóm cơ photpho (Lân hữu cơ)

mẫu

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

WHO World health organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 1 Quy định của Việt Nam về ngưỡng cho phép của hoạt chất BVTV 9

Bảng 1 2 Phương pháp phân tích đa nhóm dư lượng thuốc BVTV 12

Bảng 2 1 Danh mục 53 hoạt chất BVTV phân tích trên thiết bị LC- Orbitrap MS 18

Bảng 2 2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc 19

Bảng 2 3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nội chuẩn 20

Bảng 2 4 Thông tin mẫu nước mặt phân tích trong luận văn 20

Bảng 2 5 Các mẫu rau phân tích trong luận văn 22

Bảng 2 6 Chương trình gradient pha động 25

Bảng 3 1 Thời gian lưu của chất phân tích trong dung dịch chuẩn và nền mẫu 36

Bảng 3 2 Độ chính xác khối của các chất phân tích trong dung dịch chuẩn và trong nền mẫu 40

Bảng 3 3 Thông tin về phân mảnh của các chất phân tích 42

Bảng 3 4 Độ lệch chuẩn tương đối của tín hiệu phân tích khi phân tích lặp lại liên tục trong ngày và ở điều kiện nhiệt độ khác nhau 44

Bảng 3 5 Phương trình đường chuẩn của các chất phân tích 46

Bảng 3 6 MDL và MQL của phương pháp phân tích 48

Bảng 3 7 ME, RE, R (%) của quá trình chiết mẫu 50

Bảng 3 8 Kết quả phân tích mẫu nước mặt tại 5 khu vực 52

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Hóa chất Bảo vệ thực vật 2

Hình 1 2 Chu trình phát tán của hóa chất BVTV trong hệ sinh thái nông nghiệp 5

Hình 1 3 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao 13

Hình 1 4 Cấu trúc Orbitrap MS 14

Hình 2 1 Vị trí lấy mẫu nước tưới 21

Hình 2 2 Điều kiện nhận biết chất bằng khối phổ phân giải cao Orbitrap MS 26

Hình 2 3 Quy trình xử lý mẫu nước 27

Hình 2 4 Quy trình xử lý mẫu rau 29

Hình 2 5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá độ thu hồi, ảnh hưởng của nền mẫu và độ thu hồi toàn bộ quá trình xử lý mẫu rau 30

Hình 3 1 Sắc đồ tổng phân tách đồng thời đa nhóm 53 hoạt chất BVTV trên các cột pha đảo khác nhau: (a) cột PFP Hypersil GOLD, (b) cột Hypersil ODS, (c) cột HyperClone 34

Hình 3 2 Cấu tạo của pha tĩnh PFP 34

Hình 3 3 Sắc đồ 3 chất phân tích trong dung môi và nền mẫu rau (a) (đợt 1), trong dung môi và nền mẫu nước (b) (đợt 2) 36

Hình 3 4 Phân mảnh của Carbaryl (phân tích trên chế độ FullMS-confirmation) 39

Hình 3 5 Độ ổn định của 3 chất chuẩn đồng hành trong dung dịch chuẩn và trong mẫu nước 45

Hình 3 6 Hàm lượng hoạt chất BVTV phát hiện trong mẫu nước 54

Hình 3.7 Sự phân bố một số hoạt chất BVTV trong các mẫu nước mặt ở 5 làng rau trên địa bàn Hà Nội 55

Hình 3 8 Sắc đồ mẫu rau cải cúc (a) và rau xà lách (b) 56

nhu cầu cấp thiết của xã hội, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sàng lọc các

thuốc bảo vệ thực vật trong mẫu nước tưới và mẫu rau trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao LC/HRMS” Mục đích của đề tài này là nghiên cứu xây dựng

một quy trình phân tích phù hợp để xác định đồng thời nhiều nhóm thuốc trừ sâu khác nhau trên thiết bị LC/HRMS hiện có, đồng thời đánh giá các yếu tố ảnh hưởng của thiết

bị và nền mẫu tới hiệu suất thu hồi của quá trình phân tích Từ đó, áp dụng quy trình phân tích đã được xây dựng để xác định được nhiều nhóm thuốc trừ sâu khác nhau trong các mẫu môi trường và thực phẩm (nước và rau)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật

1.1.1 Giới thiệu chung về hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) là thuật ngữ chung chỉ các chất hóa học tổng hợp, những chế phẩm sinh học, những chất có nguồn gốc thực vật, động vật, được điều chế để chống lại các tác nhân gây hại mùa màng từ môi trường bên ngoài như nấm, côn trùng, cỏ dại và chuột Bên cạnh đó, nhiều loại hóa chất BVTV còn có khả năng làm tăng năng suất cây trồng và chất lượng sản phẩm nông nghiệp [20], [70] Theo tổ chức Nông nghiệp và lương thực Liên hợp quốc (FAO), hóa chất BVTV được định nghĩa là một hỗn hợp các chất hóa học được điều chế với mục đích phòng chống, ngăn ngừa và tiêu diệt, kiểm soát các tác nhân gây hại từ tự nhiên như động, thực vật và các trung gian truyền bệnh, cùng một số các bộ phận phát triển theo xu hướng gây hại cho chính cây trồng Ngoài ra, chúng còn là công cụ hữu ích tăng chất lượng và sức khỏe cây trồng, giảm rụng lá, chống rụng quả sớm…

Hình 1 1 Hóa chất Bảo vệ thực vật

Hiện nay, danh mục các hóa chất BVTV trên thế giới đã tăng đến hàng nghìn [34]–[54], thuộc hơn 100 nhóm khác nhau Trong đó, các nhóm benzoylurea, carbamate, cơ phốt pho, pyrethroid, sulfonylurea, triazine được sử dụng rất rộng rãi trong nông nghiệp [45] Ước tính, hàng năm, thế giới sử dụng khoảng 2,5 triệu tấn hóa chất BVTV phục vụ cho nông nghiệp Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra nguy cơ phơi nhiễm hóa chất BVTV với nồng độ cao có thể dẫn đến các căn bệnh hiểm nghèo

như ung thư, đột biến gen ở cơ thể người và động vật [11], [34], [48]-[50] Do vậy, việc

sử dụng các hoạt chất này đang ngày càng được kiểm soát một cách nghiêm ngặt ở nhiều quốc gia trên thế giới Để đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng và tạo điều kiện thương mại quốc tế, đến nay, tổ chức Nông nghiệp và lương thực liên hợp quốc (FAO) và tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã thiết lập dư lượng tối đa (MRL) cho

218 hoạt chất BVTV khác nhau có mặt trong 309 mặt hàng thực phẩm Ở Mỹ, dư lượng các hoạt chất này trong thực phẩm cũng được theo dõi và kiểm soát bởi Cơ quan Quản

lý thực phẩm và dược phẩm (FDA) (các loại trái cây, rau quả, ngũ cốc) và Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) (các loại thịt, sữa, trứng và nuôi trồng thủy hải sản) Còn theo quy định của Ủy ban Châu Âu, MRL của từng thuốc BVTV trong thực phẩm đều phải dưới 0,01 mg/kg [47]–[61] Mức độ rủi ro phơi nhiễm tối thiểu được cho là có thể chấp nhận được đối với cơ thể người (ADI, đơn vị mg/kg trọng lượng cơ thể) đã được Tổ chức Nông nghiệp và thực phẩm kết hợp với tổ chức Y tế thế giới công bố tại chương trình quốc tế về an toàn hóa chất (IPCS) (WHO 2018; http://www.who.int/pcs/jmpr/jmpr.htm)

1.1.2 Các dạng hóa chất bảo vệ thực vật được sản xuất trên thị trường

Về cơ bản, thuốc BVTV được sản xuất dưới các dạng sau [12], [13]:

- Thuốc sữa (viết tắt là EC hay ND): gồm các hoạt chất, dung môi, chất hóa sữa

và một số chất khác Thuốc ở thể lỏng, trong suốt, tan trong nước thành dung dịch nhũ tương tương đối đồng đều, không lắng cặn hay phân lớp

- Thuốc bột thấm nước (viết tắt là WP, BTN): còn gọi là bột hòa nước, gồm hoạt chất, chất độn, chất thấm ướt và một số chất phụ trợ khác Thuốc ở dạng bột mịn, phân tán trong nước thành dung dịch huyền phù, pha với nước để sử dụng

- Thuốc phun bột (viết tắt là DP): chứa các thành phần hoạt chất thấp (dưới 10%) nhưng chứa tỉ lệ chất độn cao, thường là đất sét hoặc bột cao lanh Ngoài ra, thuốc còn chứa các chất chống ẩm, chống dính Ở dạng bột mịn, thuốc không tan trong nước

- Thuốc dạng hạt (viết tắt là G hoặc H): gồm các hoạt chất, chất độn, chất bao viên

và một số chất phụ trợ khác

1.1.3 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Theo tài liệu của Hội đồng châu Âu, thị trường hiện nay có khoảng 1209 hoạt chất thuộc hơn 100 nhóm [31], [34], [54] Có nhiều tiêu chí phân loại hóa chất BVTV dựa trên công dụng, cấu trúc hóa học, nguồn gốc, con đường xâm nhập, độc tính… Trong khuôn khổ đề tài này, nghiên cứu tập trung vào phân loại hóa chất BVTV dựa theo cấu tạo hóa học của chúng

1.1.3.1 Nhóm cơ clo (Clo hữu cơ)

Hóa chất BVTV thuộc nhóm clo hữu cơ là các hóa chất BVTV tổng hợp mà trong cấu trúc phân tử chứa một hoặc nhiều nguyên tử Cl liên kết trực tiếp với nguyên

tử carbon Chúng thường có độ độc cao (ở mức độ I hoặc II), điển hình là DDT, Lindan, Endosulfan, Aldrin, BHC, Chlordan, DDE, Dieldrin, Eldrin, Heptachlor, Keltan, Methoxyclor, rothan, Perthan, TDE, Toxaphen…Hầu hết các thuốc BVTV thuộc nhóm này đã bị cấm sử dụng vì chúng là các chất hữu cơ khó phân hủy, tồn lưu lâu trong môi trường [8] Công ước Stockholm về các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy cũng quy định về việc giảm thiểu và loại bỏ các hóa chất BVTV đa phần thuộc nhóm cơ clo [13] Trong các hợp chất nêu trên, DDT và Lindan là những hóa chất được sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam từ trước những năm 1960 – 1993 [13]

1.1.3.2 Nhóm cơ phốt pho (Lân hữu cơ)

Nhóm thuốc BVTV cơ photpho (lân hữu cơ) là dẫn xuất của các ester trung tính hay amide của acid phosphoric (mang gốc P-O) hay thiophosphoryl (P-S), được sử dụng rộng rãi để diệt sâu bọ, côn trùng [11], [12]

Chúng ít tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi hữu cơ Hầu hết các hóa chất thuộc nhóm này cũng đã bị cấm do độc tính cao Tuy nhiên, chúng lại kém bền, có thể phân hủy nhanh trong cơ thể sống và môi trường hơn nhóm clo hữu cơ Nhóm hợp chất này và sản phẩm chuyển hóa của chúng tập trung cao ở gan và thải ra ngoài theo đường tiết niệu ở các động vật có vú Một số thuốc BVTV cơ photpho phổ biến như: diazinon, dichlorvos, dimethoate, malathion, methamidophos, triazophos, trichlorfon…

1.1.3.3 Nhóm cơ nito

Hóa chất thuộc nhóm cơ nito (carbamate) là các dẫn xuất từ axit carbamic [12], [10] Chúng ít tan trong nước nhưng có khả năng tan trong nhiều dung môi hữu cơ, có thời gian bán phân hủy nhanh Đây là nhóm thuốc rất phổ biến trong nông nghiệp, được dùng thay thế cho một số thuốc cơ clo như DDT hay cơ phot pho bởi chúng không bền,

dễ bị phân hủy dưới tác động của môi trường thành CO2 và NH3 [10] Nhóm hoạt chất này thường có giá thành không quá cao, hiệu lực ổn định, ít phụ thuộc vào ngoại cảnh như nhóm lân hữu cơ Một số hợp chất tiêu biểu gồm carbaryl, carbosulfan, carbofuran…

1.1.3.4 Nhóm pyrethroid (họ cúc tổng hợp)

Hoạt chất pyrethroid được chiết xuất từ cây hoa cúc pyrethrum cinerariaetrifolium, gây độc cấp tính yếu và tác động lên hệ thần kinh gây thiếu oxy, đào thải qua đường nước tiểu Các hợp chất này ít tan trong nước, tan được trong nhiều dung môi hữu cơ, phân hủy nhanh và ít tích lũy trong môi trường

1.1.4 Ảnh hưởng của hóa chất bảo vệ thực vật

1.4.1.1 Ảnh hưởng đến môi trường

Hóa chất BVTV khi được phun rải, một phần sẽ được đưa vào cơ thể động thực vật qua quá trình hấp thụ, sinh trưởng, phát triển hay qua chuỗi thức ăn; một phần khác

sẽ rơi vãi ra ngoài, bay hơi vào mô trường hay bị cuốn theo nước mưa, dòng chảy đi vào đất, nước, không khí… gây ô nhiễm môi trường [13]

Hình 1 2 Chu trình phát tán của hóa chất BVTV trong hệ sinh thái nông nghiệp

Hóa chất BVTV đi vào trong đất do các nguồn: phun xử lý đất, các hạt thuốc rơi vào đất, theo mưa lũ, theo xác sinh vật vào đất Theo kết quả nghiên cứu phun thuốc cho cây trồng có tới 50% số thuốc rơi xuống đất, ngoài ra, còn một số thuốc rải trực tiếp vào đất Khi vào đất, một phần thuốc trong đất được cây hấp thụ, phần còn lại được keo đất giữ lai Thuốc tồn tại trong đất dần dần được phân giải qua hoạt động sinh học của đất và qua các tác động của các yếu tố lý, hóa Tuy nhiên, tốc độ phân giải chậm nếu thuốc tồn tại với lượng lớn, nhất là trong đất có hoạt tính sinh học kém

Theo chu trình tuần hoàn, hóa chất BVTV tồn tại trong môi trường đất sẽ rò rỉ ra ngòi theo các mạch nước ngầm hay do quá trình rửa trôi, xói mòn gây ra ô nhiễm Mặt khác, nước có thể bị nhiễm thuốc trừ sâu nặng nề do người sử dụng đổ hóa chất dư thừa, chai lọ chứa hóa chất, rửa dụng cụ ở các kênh mương hoặc do nước mưa chảy tràn từ các kho hóa chất BVTV tồn lưu [8]

Rất nhiều loại hóa chất BVTV có khả năng bay hơi và thăng hoa Khi phun thuốc, dưới tác động của các điều kiện tự nhiên, thuốc có thể lan truyền đến những khoảng cách xa, đóng góp vào việc ô nhiễm môi trường không khí

1.1.4.2 Ảnh hưởng tới con người và động vật

Hóa chất BVTV thường là các chất hóa học có độc tính cao nên rất độc hại đối với sức khỏe con người và là đối tượng có nguy cơ cao gây ô nhiễm nghiêm trọng nếu không được quản lý chặt chẽ [13], Các độc tố trong hóa chất BVTV xâm nhập vào rau quả, cây lương thực, thức ăn gia súc và động vật sống trong nước rồi xâm nhập vào các loại thực phẩm, thức uống như thịt, cá, sữa, trứng…, đi vào cơ thể con người và đông vật chủ yếu theo ba con đường: tiêu hóa (97,3%), qua da và hô hấp chỉ chiếm lần lượt 1,9% và 1,8% [12] Dư lượng hóa chất BVTV vượt quá giới hạn cho phép trong nông sản, thực phẩm là mối đe dọa đối với sức khỏe con người, gây nên các hôi chứng về thần kinh, tim mạch, hô hấp, tiêu hóa… và gây ra các căn bệnh hiểm nghèo Đây là vấn

đề nhức nhối hiện nay của toàn xã hội trước ma trận thực phẩm không an toàn, đặc biệt

là trong quản lý sử dụng hóa chất BVTV đối với rau, củ, quả Mặt khác, các công nhân làm việc trực tiếp với hóa chất (sản xuất, thủ kho thuốc, đi phun thuốc…) cũng có nguy

cơ chịu rủi ro nhiễm độc do tiếp xúc với các loại hóa chấy này nếu như không được trang bị phòng tránh cẩn thận, nghiêm ngặt Tùy theo mức độ ngộ độc, chúng có thế gây ra:

- Ngộ độc cấp tính: xảy ra khi chất độc xâm nhập vào cơ thể với liều lượng lớn,

phá hủy mạnh các chức năng sống, thể hiện qua các triệu chứng rõ ràng, đặc trưng của mỗi loại chất độc, thậm chí gây chết sinh vật

- Ngộ độc mãn tính: xảy ra khi chất độc xâm nhập vào cơ thể với liều lượng nhỏ,

nhiều lần, trong thời gian dài, được tích lũy lại trong cơ thể sinh vật, triệu chứng thể hiện chậm, lâu dài theo thời dan, gây tổn thương cho các cơ quan của cơ thể, gây đột biến, ung thư,… thậm chí tử vong

Khi đi vào cơ thể, chất độc phải tồn lưu một thời gian, ở nồng độ nhất định thì mới có thể phát huy tác dụng Tùy từng đối tượng và điều kiện khác nhau và tác động trên cơ thể của các hoạt chất BVTV cũng khác nhau:

- Tác động cục bộ, toàn bộ: chất độc chỉ gây ra những biến đổi tại những mô mà

nó trực tiếp tiếp xúc hoặc lan ra khắp cơ thể

- Tác động tích lũy: khi sinh vật tiếp xúc với chất độc nhiều lần, quá trình hấp thu

nhanh hơn quá trình bài tiết sẽ xảy ra hiện ượng tích lũy Mặt khác, tích lũy cũng có thể

do việc sử dụng thuốc lặp đi lặp lại nhiều lần

- Tác động liên hợp: khi hỗn hợp hai hay Trong cơ thể sinh vật, độ độc của chúng

có thể tăng lên nếu chúng biến đổi thành những chất độc tính cao hơn; hoặc giảm thậm chí mất tính độc do phản ứng với các chất trong cơ thể dưới tác động của men phân hủy

và phản ứng thủy phân, trao đổi Mặt khác, độ độc của thuốc cũng có thể không biến đổi ứng với một số hoạt chất đặc biệt (như sulfat đồng) Chất độc chỉ phát huy được

tính độc khi chúng đạt một lượng đủ lớn và tồn tại trong cơ thể sinh vật một thời gian

đủ dài, dựa trên các phản ứng với protein, gây tê liệt hệ men, ngăn cản sự tạo vitamin, phá hủy các chức năng sống cơ bản làm sinh vật ngộ độc rồi chết Nồng độ chất độc càng tăng, thời gian tích lũy trong cơ thể càng dài thì độc tố càng tác động sâu sắc đến

cơ thể sinh vật [12], [34], [47]–[50]

1.1.5 Thực trạng và tình hình kiểm soát thuốc BVTV ở Việt Nam

Ở nước ta, từ những năm 1990 đến nay, kinh tế chuyển từ tập trung bao cấp sang kinh tế thị trường, tất cả các thành phần kinh tế đều được phép kinh doanh thuốc BVTV Nguồn hàng phong phú, nhiều chủng loại, mạng lưới phân phối khắp cả nước được hình thành, giá cả ổn định, người nông dân có điều kiện lựa chọn thuốc Trung bình hằng năm, Việt Nam nhập khẩu, kinh doanh, buôn bán, sử dụng khoảng 100000 tấn Tuy nhiên, khoảng 32-40% số thuốc được nhập khẩu, sau đó gia công và xuất đi các nước khác, không sử dụng trong nước 10% là các loại thuốc xông hơi khử trùng để xử lý hàng nông sản trước khi xuất khẩu nhằm diệt các loại bệnh trên nông sản Thực tế, mỗi năm nước ta sử dụng khoảng 30000 tấn thuốc trừ sâu bệnh Mặc dù công tác quản lý thuốc đã được nêu cao nhưng nguồn cung ứng và lưu thông quá rộng đã gây khó cho công tác quản lý, quá nhiều tên thuốc đẩy người sử dụng vào ma trận khó lựa chọn được thuốc tốt và việc hướng dẫn kĩ thuật gặp không ít khó khăn Tình trạng thị trường tràn những loại thuốc độc hại cấm sử dụng, thuốc hết hạn…; hiện tượng nhập lậu các loại thuốc (bao gồm cả thuốc cấm, thuốc ngoài danh mục, thuốc hạn chế sử dụng) đã từng

là vấn đề chưa thể kiểm soát nổi Nhưng, kể từ năm 2016 đến nay, số lượng thuốc tồn đọng không được sử dụng, nhập lậu bị thu giữ đã giảm thiểu đáng kể thông qua các đợt tăng cường rà soát dọc các tỉnh biên giới, tăng cường ra quân truy quét của các tổ công tác, các lực lượng chức năng Điều đáng lo ngại là thuốc tồn dư bị lưu giữ trong các kho chứa tồi tàn hoặc bị chôn vùi dưới đất không đúng kĩ thuật nên nguy cơ phát tán vào môi trường rất cao

Ở một khía cạnh khác, thực trạng lạm dụng thuốc trên hầu hết các loại cây trồng của người nông dân thực sự là hồi chuông báo động đến với toàn thể cộng đồng xã hội Nhiều người mua thuốc về còn tự ý tăng nồng độ thuốc cao hơn khuyến cáo hoặc pha trộn nhiều loại thuốc trong một lần phun cho “chắc ăn” Một bộ phận không nhỏ nông dân, nhất là ở vùng miền núi còn khá mơ hồ về các đối tượng dịch gây hại, việc sử dụng thuốc BVTV theo nguyên tắc 4 đúng (đúng thuốc, đúng lúc, đúng liều lượng- nồng độ

và đúng cách) cũng như việc lơi là vận chuyển và xử lý bao gói thuốc sau sử dụng Phần lớn họ vứt bỏ vỏ thuốc sau khi sử dụng ngay tại ruộng đồng, rửa bình phun ngay trong kênh mương, ao sở tại Nước thải tử việc rửa các dụng cụ phun thuốc được đổ trực tiếp hoặc tưới tiêu ngay trong ruộng Thói quen này đã đưa một dư lượng lớn thuốc BVTV

vào nước trong kênh, mương, gây ô nhiễm nguồn nước mặt Hiện nay còn xuất hiện tình trạng người sử dụng phun trực tiếp hóa chất BVTV lên nông sản trước ngày thu hoạch, ngâm rau quả vào thuốc để bảo quản lâu ngày hoặc kích thích quả ra nhanh Đây

là nguyên nhân làm tăng lượng hóa chất BVTV trong các sản phẩm rau, củ, quả gây nguy hiểm đến sức khỏe người tiêu dùng Theo điều tra của Cục Y tế dự phòng về môi trường Việt Nam, hàng năm có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hóa chất do thuốc BVTV phải cấp cứu tại các bệnh viện và trên 300 trường hợp tử vong Điều này diễn ra đang có xu hướng ngày càng tăng lên một cách tiêu cực bởi thuốc BVTV hiện nay gần như được sử dụng ở tất cả các mặt hàng nông sản

Hàng năm, căn cứ vào kết luận của cơ quan thẩm định thuốc BVTV và Hội đồng

Tư vấn thuốc BVTV Quốc Gia, Cục BVTV đều rà soát, xem xét để trình Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành :Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam” để bảo vệ sức khỏe người dân và môi trường Trong năm 2017, Bộ NNPTNT đã loại bỏ 6 hoạt chất gồm: trichlorfon, carbofuran, 2.4D paraquat [3], carbendazim, benomyl, thiophanate-methyl [2] ra khỏi danh mục thuốc được phép sử dụng tại Việt Nam Ngày 28/08/2018, thêm 4 hoạt chất gồm: acephate, diazinon, malathion, zinc phosphide tiếp tục bị loại ra khỏi danh mục này [4] Việc loại bỏ này được thực hiện theo quy định của Luật Bảo vệ và kiểm định thực vật do chúng có độ độc cao, ảnh hưởng sức khỏe con người, ảnh hưởng môi trường hoặc là những loại thuốc có hiệu lực sinh học thấp Tính đến hết năm 2018, theo thông

tư số 03 của BNNPTNT [5], có 1792 hoạt chất thuộc tất cả các nhóm trừ sâu, trừ bệnh, trừ chuột, diệt ốc, côn trùng… được phép sử dụng ở nước ta; 31 hoạt chất bị cấm sử dụng gồm 23 hoạt chất thuốc trừ sâu (Aldrin, BHC, Lindane, Cd, Carbofuran, Chlordane, Chlordimeform, DDT, Dieltdrin, Endosulfan, endrin, heptachlor, isobenzene, isodrin, Pb, Methamidophos, methyl parathion, monocrotophos, parathion ethyl, sodium pentachlorophenate monohydrate, pentachlorophenol, phosphamidon, polychlorocamphene, trichlorfon), 6 hoạt chất trừ bệnh (As, captan, captafol, hexachlorobenze, Hg, Se), 1 thuốc diệt chuột (Tl), 1 thuốc trừ cỏ (2.4.5 T) chủ yếu thuộc nhóm cơ clo và cơ phot pho Theo các tài liệu mới nhất, Cục BVTV đang tiếp tục rà soát và sẽ tiếp tục trình Bộ trưởng Bộ NNPTNT xem xét loại bỏ 3 hoạt chất khác gồm Fipronil, Chlorpyrifos và Glyphosate trong năm 2019 này Nghiên cứu này lựa chọn phân tích 53 chất thuộc 26 nhóm khác nhau bao gồm 09 chất nhóm cơ photpho, 03 chất carbamate, 02 benzoylurea, 02 neonicotinoid, 02 oxidiazole, 02 phenylurea, 03 strobilurin, 03 sulfonylurea và các nhóm khác rồi tiến hành thực nghiệm (chi tiết xem Bảng 2.1) Trong 53 chất được phân tích trong luận văn, mới chỉ có 11 hóa chất nằm trong danh mục cấm sử dụng tại Việt Nam theo Thông tư số 03 TT03/2018/BNNPTNT,

chủ yếu là nhóm Cơ phot pho (parathion-methyl, trichlorfon, diazinon, triazophos), Cơ clo (pentachlorophenol), Carbamate (carbofuran, carbosulfan, carbaryl, methomyl), Phenylurea (linuron), benzimidazole (carbendazim) Tại Việt Nam, Bộ Y tế có ban hành thông tư 50 (TT50/2016/BYT) [7] quy định giới hạn tối đa dư lượng cho phép của 72 hoạt chất BVTV trên một số nền mẫu rau, hiện nay còn rất nhiều hóa chất chưa có quy định về giới hạn này, 13 hoạt chất trong số đó được lựa chọn phân tích Còn theo QCVN 15: 2008/BTNMT, dư lượng tối đa của hoạt chất BVTV là 0,1 mg/kg đất khô Trên thế giới, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tối đa cho phép trong thực phẩm đã được kiểm soát rất nghiêm ngặt và có quy định rõ ràng, ở Châu Âu [28], [61], [70], và ở Mỹ [68] tối đa 0,01 mg/kg

Bảng 1 1 Quy định của Việt Nam về ngưỡng cho phép của hoạt chất BVTV

STT Tên chất

Trong thực phẩm Trong đất khô ADI

(mg/kg thể trọng)

TT 50/2016BYT [7] QCVN 15:

2008/BTNMT [6] mg/kg mg/kg đất khô

Rau họ bắp cải: 5 Rau củ: 10 Rau gia vị: 70

Xà lách: 3

4 Carbofuran 0-0,001 Hạt cà phê: 1

5 Carbosulfan 0-0,01 Củ cải đường: 0,3

6 Chlorantraniliprole 0-2 Rau họ bắp cải: 2

STT Tên chất

Trong thực phẩm Trong đất khô ADI

(mg/kg thể trọng)

TT 50/2016BYT [7] QCVN 15:

2008/BTNMT [6] mg/kg mg/kg đất khô

Xà lách: 0,3 Rau họ cải: 0,2 Bắp cải: 2

2006, Ủy ban châu Âu DG-SANCO số 3131/2007) yêu cầu sàng lọc thuốc BVTV đều

sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) và sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) [34] Đầu những năm 1970, việc phân tách thuốc BVTV chủ yếu được thực hiện trên thiết bị sắc kí còn phát hiện và định lượng chủ yếu dùng detector bắt giữ điện tử (ECD), nito-phot pho (NPD) hay detector quang hóa ngọn lửa (FPD) đối với sắc ký khí và UV, diode array, huỳnh quang đối với sắc ký lỏng Ngày nay, việc ghép nối detector vạn năng MS cùng kiểu ion hóa thích hợp với thiết bị tách sắc ký tạo thành hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ hoặc 2 lần khối phổ sử dụng nguồn ion hóa va chạm điện tử (GC-EI-MS, GC-EI-MS/MS), sắc ký khí khối phổ sử dụng nguồn ion hóa hóa học (GC-CI-MS) [11], [19], [35], [50], [52], [69], sắc ký lỏng khối phổ hoặc 2 lần khối phổ sử dụng nguồn ion hóa tia lửa điện (LC-ESI-MS LC-ESI-MS/MS) [37], [38] giúp chọn lọc ion

phân tử và các phân mảnh thích hợp để giảm tín hiệu nhiễu của nền mẫu Đây được coi

là một công cụ mang lại hiệu quả rất tốt trong lĩnh vực tách và phân tích hoạt chất BVTV trong mẫu môi trường và thực phẩm bởi cho độ nhạy rất cao (0,1-1 ng), độ chọn lọc cao Trong đó, LC-MS/MS với cột tách pha đảo được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích lượng vết, siêu vết thuốc trừ sâu, đặc biệt là trong phân tích đa nhóm dư lượng [56]

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS) là một trong những phương pháp sắc

ký hiện đại nhất hiện nay Phương pháp này ngày càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm, hình sự… Thiết bị LC-MS được cấu tạo gồm 2 phần: Phần sắc ký lỏng (LC) dùng để phân tách các chất, chủ yếu dựa trên độ phân cực và đưa ra thông tin dưới dạng thời gian lưu Phần khối phổ (MS) hay còn gọi là đầu dò mang nhiệm vụ tách các ion

dựa vào tỉ lệ giữa khối lượng và điện tích (m/z) Trong hệ thống sắc ký lỏng, pha tĩnh

(hay còn gọi là cột tách) chứa các vật liệu nhồi bên trong cột và pha động chứa các dung môi chảy qua cột Hệ dung môi pha động sẽ mang các chất phân tích có trong mẫu đi dọc theo cột, tương tác với các pha Các phân tử có tương tác nhiều với pha tĩnh sẽ có

xu hướng bị giữ lại trong cột và tách ra sau, nghĩa là thời gian lưu của các phân tử này

sẽ lớn hơn các phân tử ít tương tác với pha tĩnh trong cột, nhờ đó, các chất được phân tách khỏi nhau Sau khi đi ra khỏi cột tách, các chất phân tích sẽ đi vào buồng ion hóa

và bị ion hóa, được nhận biết bằng hệ thống khối phổ Do vậy, phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ được dùng để định lượng các chất cần phân tích Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay phân tử trong một điện trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) ảnh hưởng rất lớn đến chuyển động này của ion Một đầu dò khối phổ cơ bản gồm 4 phần là bộ phận dẫn mẫu, nguồn ion hóa, bộ phân tách khối lượng ion (mass analyzer) và ion detector [9]

Đáng chú ý, sự phát triển không ngừng của khoa học kĩ thuật ngày nay đã đưa đến sử dụng khối phổ phân giải cao (độ phân giải > 10000- FWHM) cho ưu thế tuyệt vời về độ chính xác khối (< 5 ppm) và độ nhạy của thiết bị , tiêu biểu có thể kể đến khối phổ thời gian bay (TOF, Q-TOF) và Orbitrap có tác dụng rất tốt trong việc phân tích sàng lọc lượng vết và siêu vết thuốc BVTV trong nền mẫu thực phẩm Những năm gần đây, sắc ký lỏng ghép nối khối phổ phân giải cao Orbitrap (LC-HRMS) đã được áp dụng trong các nghiên cứu về phản ứng sinh học của con người Cụ thể, năm 2016, Cortejade cùng cộng sự đã phát triển thành công phương pháp phân tích sàng lọc mục tiêu và định lượng đa nhóm 38 chất chuyển hóa trong nước tiểu trong đó bao gồm 12 hoạt chất BVTV, các chất chuyển hóa và các chất có tính chất tương tự với chúng Tương tự,

Roca cùng cộng sự năm 2014 dã phát triển phương pháp phân tích định lượng các chất

chuyển hóa từ thuốc BVTV trong nước tiểu bằng phương pháp LC-HRMS [24]

Bảng 1 2 Phương pháp phân tích đa nhóm dư lượng thuốc BVTV

Số lượng

chất phân

tích

Nền mẫu Xử lý mẫu Phương pháp

phân tích Kiểu detector MS

Phổ khối phân giải cao hiện nay phát triển 2 phiên bản là khối phổ thời gian bay

và khối phổ Orbitrap Khối phổ thời gian bay (TOF) có 2 kĩ thuật là TOF-MS và

QqTOF-MS ghép nối sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng đã được áp dụng trong lĩnh vực phân

tích dư lượng và nhận dạng thuốc BVTV, đặc biệt là trong lĩnh vực nhận dạng các chất

chưa biết (non-targeted compound), phân tích chuyển hóa… Thiết bị khối phổ thời gian

bay đo chính xác giá trị m/z dựa trên sự chênh lệch thời gian bay từ đầu vào bộ phận

MS đến bộ phận tách phân tích ion khối, với tốc độ cao, độ nhạy lớn và độ phân giải

cao (khoảng 10.000) với độ chính xác khối thường thấp hơn 2 mDa [34] Hệ thống

LC-TOF-MS hiện nay đã cải tiến cho phép tự động hóa hiệu chuẩn bằng cách sử dụng nguồn

ion hóa kép và tham chiếu bù độ trôi của mảnh ion khối < 3 ppm Do vậy, ưu điểm của

khối phổ thời gian bay là cho phép sàng lọc số lượng lớn chất phân tích (đặc biệt là

thuốc trừ sâu) Ngoài ra, TOF-MS cũng áp dụng thế phân mảnh cung cấp thông tin cấu

trúc thông qua mô hình phân mảnh đặc trưng của từng hợp chất cùng với phép đo khối

lượng chính xác, tính theo đồng vị của nguyên tố và thành phần nguyên tổ trong ion phân tử

Kĩ thuật phổ khối phân giải cao thứ hai là khối phổ Orbitrap (Q-Exactive Orbitrap hay Orbitrap MS) [57]

Hình 1 3 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao

Hệ thống khối phổ phân giải cao (Q-Exactive Focus, Orbitrap MS) được bổ sung các tính năng ưu việt hơn so với các khối phổ phân giải thấp như: có phần Quadrupole chọn lọc các ion mẹ, nguồn S-lens rất nhạy và tốc độ scan cao (xử lý các tín hiệu nâng cao) Chất phân tích sau khi đi ra khỏi cột tách sẽ được ion hóa ở buồng ion hóa theo kiểu ion hóa tia điện ESI Tại đây, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của các khí mang, mẫu được phun thành dạng sương và tích điện trên bề mặt Các hạt nhỏ tích điện này được “transfer tube” đưa vào các bộ phận tiếp theo, loại bỏ bớt thành phần tạp

và chọn lọc các ion mẹ quan tâm đi vào buồng C-trap Tại đây, các mảnh khối sẽ được phân lập rồi đi vào buồng ion trap Các ion bị giữ lại do lực hút tĩnh điện của chúng với điện cực bên trong nằm cân bằng với quán tính Do đó, các ion quay vòng quanh điện cực tạo ra quỹ đạo hình elip [64] Các ion khối khác nhau sẽ có tần số góc quay khác nhau, qua đó có thể nhận biết được tín hiệu của các mảnh khối

Hình 1 4 Cấu trúc Orbitrap MS 1.2.2 Phương pháp xử lý mẫu trong phân tích hóa chất BVTV

Quy trình xử lý mẫu phân tích hóa chất BVTV trên các nền mẫu khác nhau bằng phương pháp sắc ký thường bao gồm các bước: chiết, làm sạch, làm giàu trước khi bơm phân tích lên thiết bị Với các mẫu có nền không quá phức tạp như mẫu nước sạch, đôi khi có thể phân tích trực tiếp trên thiết bị mà không cần xử lý Tuy nhiên, phần lớn các mẫu thực phẩm và môi trường đều yêu cầu phải xử lý mẫu trước khi phân tích để loại bớt các nhiễu và làm giàu mẫu Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, xu hướng phân tích đa nhóm dư lượng ngày càng được quan tâm nhiều, ứng với các chất phân cực lớn và kị nước Một số nghiên cứu về xử lý mẫu trong phân tích hóa chất BVTV được nêu trong Bảng 1.3

Chiết với dung môi thích hợp (SE) là phương pháp chiết được sử dụng rộng rãi nhất trong phân tích dư lượng thuốc BVTV trong đó bao gồm các kĩ thuật chiết soxhlet, chiết lỏng-lỏng [8], chiết QuEChERS [44], [48] chiết gia tốc dung môi (E-916 hoặc ASE) [16] Thông thường, để phục vụ mục đích phân tích đa nhóm với số lượng chất phân tich lớn, các dung môi được lựa chọn để chiết thường có độ phân cực trung bình, tiêu biểu như ACN, ethyl acetate với Na2SO4 khan, MeOH, hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp Đặc biệt, pH là yếu tố quan trọng trong quá trình xử lý mẫu, cần khảo sát và điều chỉnh giá trị thích hợp sử dụng axit formic, axetic, đệm muối HCOONH4…

Xét bước làm sạch, chiết pha rắn (SPE) là một trong những kĩ thuật được áp dụng phổ biến nhất vừa làm sạch, vừa làm giàu mẫu bằng cách cho dịch chiết hấp phụ lên cột pha rắn rồi rửa giải chất phân tích bằng dung môi thích hợp Vật liệu hấp phụ (hay vật liệu nhồi cột chiết pha rắn) là yếu tố đặc biệt quan trọng Trong phân tích thuốc BVTV, nhiều nghiên cứu đã tiến hành sử dụng một số loại cột có sẵn của các hãng trên thị trường như cột pha đảo (octadecyl-silica RP-C18), OASIS HLB [7], OASIS MCX, cột trao đổi ion, cột carbon hoạt tính… [18], [60] Ưu điểm của phương pháp SPE là khả

năng làm giàu mẫu cao, giúp loại bỏ ảnh hưởng của các chất gây nhiễu Hiện nay trên thế giới, kĩ thuật SPE đã được tự động hóa và ghép nối tích hợp với hệ thống LC/MS

Sự phát triển này tuy chưa được áp dụng phổ biến ở các nước đang phát triển như Việt Nam nhưng đây là một bước tiến mới trong nền khoa học kĩ thuật, giúp giảm thiểu tối

đa các ảnh hưởng từ môi trường bên ngoài đến quá trình thực nghiệm, tiết kiệm dung môi sử dụng so với phương pháp chiết lỏng—lỏng và tiết kiệm tối đa được thời gian và nhân công lao động

Đặc biệt, phương pháp QuEChERS được áp dụng rất rộng rãi và được coi là phương pháp chiết an toàn, nhanh chóng, dễ thực hiện, giá thành rẻ và cho hiệu quả cao được phát triển để xác định dư lượng thuốc BVTV trong các mặt hàng nông sản như trái cây, rau, củ, quả Phương pháp này được phát triển bởi S Lehotay và M Anastassiades tại USDA/ ARS-ERRC ở Wyndmoor, Pennsylvania [63] Kể từ khi ra đời cho đến nay, phương pháp này liên tục được cải tiến để tăng hiệu suất xử lý mẫu Các phương pháp tiêu chuẩn Châu Âu EN 15662.2008 và AOAC 2007.01 đã được phát triển một phần từ phương pháp này QuEChERS có giá trị vì tính đơn giản, chi phí thấp,

độ nhạy thấp và có khả năng chiết xuất các thuốc BVTV từ nhiều nền mẫu khác nhau Ngoài ra, nó còn linh hoạt với các kỹ thuật phân tích được sử dụng như sắc ký khí và sắc ký lỏng Hiện nay, QuEChERS đã được chấp nhận trên toàn cầu như là một phương pháp chuẩn bị mẫu có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu [44]

Quy trình chiết QuEChERS thường bao gồm các bước như sau:

- Bước 1: Đồng nhất và lấy mẫu: Mẫu được đồng nhất để tăng diện tích bề mặt có

sẵn làm tăng hiệu suất chiết và đảm bảo tính đại diện của một mẫu Quá trình đồng nhất thường trong điều kiện lạnh để tránh heienj tượng phân hủy thuốc trừ sâu do quá trình đồng nhất sinh nhiệt Thông thường, 10-15 g mẫu đồng nhất được chuyển vào ống ly tâm 50 mL Đối với các mẫu khô (hàm lượng nước < 25%) có thể phải giảm khối lượng mẫu và thêm nước trước khi đồng nhất

- Bước 2: Thêm dung môi chiết: Thông thường thêm 10-15 mL ACN vào ống ly

tâm vì dung môi này có thể dễ dàng tách ra khỏi nước Do hầu hết các mẫu thực phẩm chứa 80-95% nước, việc tách mẫu ra khỏi nước rất quan trọng Dung dịch nội chuẩn có thể được thêm vào ở bước này để theo dõi hiệu suất chiết và hỗ trợ định lượng các chất cần phân tích

- Bước 3: Chiết lỏng: Sau khi thêm dung môi, lắc ống trong vòng 1 phút

- Bước 4: Thêm đệm và làm khô: ba phương pháp được công nhận khác nhau về

lượng muối và loại đệm sử dụng Mục đích của MgSO4 là để loại nước và NaCl để tách pha, muối acetate để loại các kim loại có trong mẫu Do tính háo nước của MgSO4 nên

khi hút nước trong mẫu nó tỏa nhiệt rất mạnh, có thể phân hủy một vài hợp chất cần phân tích Do đó, thường để lạnh ống ly tâm trước khi thêm muối

• Phương pháp gốc MgSO4 và NaCl

• AOAC 2007.01: MgSO4 và NaOAc (Natri acetate)

• EN 15662.2008: MgSO4, Na3Citrate, Na2Citrate

- Bước 5: Chiết: lắc mạnh ống trong 1 phút (1 số hoạt chất BVTV proton hóa mạnh

ở pH thấp do đó, đệm cần phải được điều chỉnh pH 2-7 trước khi chiết (ví dụ sử dụng đệm 1% Acetic trong ACN)

- Bước 6: Tách: Ly tâm ống fancol để tách riêng lớp hữu cơ khỏi mẫu

- Bước 7:Tách cặn và làm sạch với dSPE: Hút một phần lớp hữu cơ (lớp trên) vào ống ly tâm 15 mL để làm sạch bằng dSPE Bước này cho phép loại bỏ chất béo, protein, chất màu-chlorophyll… trước khi phân tích với các chất hấp phụ sau: PSA và MgSO4

là chất làm sạch thông dụng Đối với nền mẫu béo cao, C18 được thêm vào bước này, còn đối với mẫu có màu cao (chlorophyll và carotinoids) thì thêm Graphitized Carbon black (GCB)

- Bước 8:Tách lớp: Ly tâm ống fancol 15 mL để tách lớp trên bề mặt

- Bước 9:Hút lớp trên vào vial: Hút lớp hữu cơ phía trên vào vial Tùy thuộc vào chương trình và thiết bị phân tích mà dung dịch này có thể được pha loãng hoặc làm giàu để đạt độ nhạy cần thiết

- Bước 10:Bảo quản và phân tích: Dịch chiết cuối cùng có thể thêm 0,1% acetic acid hoặc 5% Formic acid như chất bảo quản để đảm bảo sự ổn định của thuốc trừ sâu (đặc biệt là các thuốc nhạy cảm với base) Thông thường sẽ thêm chất bảo vệ như Sorbitol, Gulonolactone, ethylglycerol vào lớp trên cùng của vial để cách ly với môi trường

Các phương pháp chiết thông thường phổ biến nhưng bị nhiều hạn chế như cần

sử dụng lượng mẫu và dung môi lớn, khuấy hoặc đun nóng với cùng dung môi trong thời gian dài làm tăng nguy cơ phân hủy nhiệt của nhiều thuốc trừ sâu Phương pháp QuEChERS đã khắc phục những vấn đề này 1 cách nhanh chóng, tiết kiệm dung môi, góp phần làm cho môi trường thân thiện hơn Vì vậy, luận văn đã lựa chọn phương pháp chiết QuEChERS và phương pháp chiết kết hợp làm sạch (SPE) để thực hiện quá trình

xử lý mẫu

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn

2.1.1 Thiết bị

- Thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao UPLC (Ultimate 3000) ghép nối với hệ thống khối phổ phân giải cao Orbitrap Q-Exactive Focus của hãng Thermo Fisher (Mỹ)

- Bể siêu âm có gia nhiệt S 100H, Elma (Đức)

- Cân phân tích 4 số Practum 224-1S, Sartorius (Đức)

- Máy lọc nước siêu sạch Milli-Integral 3, Merk Millipore (Pháp)

- Máy vortex

- Máy ly tâm

- Bộ chiết pha rắn và bơm chân không đi kèm

- Máy xay mẫu

- Micropipet 100, 200, 500 µL và đầu hút đi kèm

- Pipet Pasteur và đầu bóp

- LC- vial 1.5 mL (Thermo Fisher)

- Axit formic (FA), n- hexane, Ethanol (EtOH) của hãng Merck, ammonium

formate (HCOONH4) độ tinh khiết dùng cho phân tích

2.1.4 Chất chuẩn và chuẩn bị dung dịch chuẩn

- 53 chất chuẩn gốc (độ tinh khiết > 90%), hãng Dr Ehrenstorfer GmbH

- Các chất chuẩn gốc được phân loại thành 26 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, cân chính xác trên cân 5 số và chuẩn bị thành các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000

µg/mL trong các dung môi hòa tan như MeOH, n- hexane, ACN, EtOH và bảo quản ở

-20 0C trong các lọ vial tối màu

Bảng 2 1 Danh mục 53 hoạt chất BVTV phân tích trên thiết bị LC- Orbitrap MS

1 Fenoxaprop-P-ethyl C18H16ClNO5 Aryloxyphenoxypropionate

2 Fenoxanil C15H18Cl2N2O2 Amide

3 Chlorantraniliprole C18H14BrCl2N5O2 Anthranilic diamide

4 Fluopicolide C14H8Cl3F3N2O Benzamide pyridine

Bảng 2 2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc

làm việc (ppb)

V định mức (mL)

V chuẩn gốc (µL)

C chuẩn gốc (ppb)

Bảng 2 3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc có nội chuẩn

Kí hiệu

C chuẩn làm việc (ppb)

V IS 10 ppm (µL)

V chuẩn gốc (µL)

Nồng độ nội chuẩn (ppb)

V định mức (mL)

Lập đường chuẩn bằng cách bơm phân tích 5 µL các dung dịch chuẩn làm việc

từ cal1 đến cal7, cal8

2.2 Đối tượng phân tích

Đối tượng nghiên cứu trong luận văn là các mẫu rau và mẫu nước mặt thu thập tại các làng rau và chợ địa phương thuộc huyện Đông Anh, Gia Lâm, Thanh Trì, Hoài Đức –Hà Nội

2.3 Thu thập và bảo quản mẫu

20 mẫu nước mặt có thể tích khoảng 500 mL/mẫu thu thập tháng 4 năm 2018 tại

5 khu vực, mỗi khu vực lấy 4 mẫu dọc theo các mương gom tưới tiêu của các làng trồng rau Mẫu sau đó được axit hóa ở pH 3 bằng axit formic

Bảng 2 4 Thông tin mẫu nước mặt phân tích trong luận văn

Nước ngầm bơm từ dưới lòng đất lên

Xà lách, rau cải, hành, mồng tơi, rau muống, cà chua…

Nước lấy từ trạm bơm

Xà lách các loại, cà chua, rau muống, cải xanh…

3 N3-01

N3-02

Làng trồng rau Tiên Dương,

Nước lấy từ giếng khoan

Các loại cải xanh, xà lách, rau muống, các loại rau thơm

Nước giếng khoan, nước mưa đọng ở cống rãnh cạnh ruộng

Rau thơm, các loại củ: su hào,

đỗ, cà chua…

Hình 2 1 Vị trí lấy mẫu nước tưới

24 mẫu rau bao gồm 8 loại: rau muống, rau ngót, cải ngọt, cải cúc, tía tô, kinh giới, rau mùi, xà lách, mỗi loại 3 mớ thu mua ngẫu nhiên ở 3 hàng rau tại chợ Vân Canh, Hoài Đức, Hà Nội Các mẫu rau được rửa,qua để loại bỏ phần đất cát bám trên rau, nhặt

bỏ các lá vàng úa, và rễ rồi đem nghiền bằng máy xay sinh tố

Bảng 2 5 Các mẫu rau phân tích trong luận văn

Chợ Vân Canh, Hoài Đức, Hà Nội

STT Loại rau Hình ảnh Mã hóa Thu mua

Tất cả các mẫu đều được bảo quản trong điều kiện -20 0C và không có ánh sáng chiếu vào để hạn chế biến đổi sinh học của mẫu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân tích đồng thời đa nhóm dư lượng hóa chất BVTV trên thiết bị LC-HRMS

Các điều kiện và thông số của thiết bị LC-HRMS phân tích trong luận văn được tham khảo từ tài liệu ứng dụng phân tích thuốc BVTV của Hãng Thermo Fisher [22] Các thí nghiệm được tiến hành trên hệ thống LC-MS bao gồm:

- Bơm phân tích một dung dịch chuẩn lặp lại để kiểm tra độ ổn định của tín hiệu phân tích trong ngày và liên ngày

- Bơm phân tích các dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở mục 2.1.4 từ cal 1-cal 7 (đối với mẫu rau) và từ cal1-cal8 (đối với mẫu nước, có nội chuẩn) Sử dụng phần mềm điều khiển X-calibur thu thập thông tin từ: sắc ký đồ, thời gian lưu của từng chất, tỉ số S/N

Sử dụng phần mềm TraceFinder phiên bản 3.3 để xây dựng đường chuẩn và xử lý số liệu thu được

2.4.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu cho phân tích sắc ký thường bao gồm 3 bước là chiết mẫu, làm sạch dịch chiết và làm giàu dịch chiết trước khi bơm phân tích trên thiết bị Trong luận văn này, các thí nghiệm được tiến hành bao gồm:

- Mẫu trắng (mẫu “blank”): phân tích mẫu trắng để kiểm tra sự nhiễm bẩn từ

môi trường, dụng cụ, hóa chất, thiết bị vào mẫu Mẫu trắng được thực hiện trong luận văn là mẫu trộn tiến hành theo quy trình

- Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu rau và độ thu hồi của quá

trình chiết QuEChERS trong quá trình xử lý mẫu rau phân tích hóa chất BVTV:

Các thí nghiệm được tiến hành với mẫu “trộn” (mẫu pool) thêm chuẩn qua từng giai đoạn của quá trình xử lý mẫu trước khi bơm phân tích trên thiết bị LC-MS

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp: đánh giá các thông số khoảng

tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp, độ thu hồi

2.4.3 Phân tích mẫu thực

Để đánh giá tính ứng dụng của quy trình phân tích đã được xác nhận giá trị sử dụng, một số mẫu thực được tiến hành phân tích theo quy trình Độ chính xác của phương pháp phân tích trên mẫu nước mặt được đảm bảo thông qua việc sử dụng chất chuẩn đồng hành thêm vào từ bước xử lý mẫu và trải qua các giai đoạn trong quá trình phân tích Kết quả đường tính toán dựa trên đường ngoại chuẩn (mẫu rau) và đường nội chuẩn (mẫu nước) Đường ngoại chuẩn của các chất phân tích là đường tương quan giữa nồng độ các chất chuẩn và tín hiệu diện tích pic của các chất tương ứng Đường nội chuẩn của các chất phân tích (khi phân tích mẫu nước) là đường tương quan giữa nồng

độ các chất chuẩn và tỉ lệ diện tích pic của chất phân tích với nội chuẩn tương ứng Chất phân tích có mặt trong mẫu thực được xác định dựa trên 2 yếu tố: thời gian lưu giữ trên cột sắc ký (thông qua đại lượng thời gian lưu RT) và phổ khối (thông qua độ chính xác của mảnh phổ ion mẹ và mảnh ion con)

2.5 Thực nghiệm

2.5.1 Phân tích trên thiết bị UPLC- Orbitrap MS

Các thông số UPLC-Orbitrap MS được điều khiển bởi phần mềm Xcalibur phiên bản 4.0 (Thermo Scientific, Mỹ)

2.5.1.1 Chương trình sắc ký

- Cột sắc ký: Hypersil GOLD PFP (150 x 2.1 mm, 3 µm; P/N 25403-152130; Thermo Scientific)

- Nhiệt độ cột tách: 40 0C

- Pha động: (A): 0.1% FA + 5 mM HCOONH4 trong nước deion

(B): 0.1% FA + 5 mM HCOONH4 trong MeOH

- Tốc độ dòng: 0.3 mL/phút

- Thể tích bơm mẫu: 5 µL, sử dụng hệ thống bơm mẫu tự động Trước mỗi đợt bơm mẫu, mẫu QC được bơm lặp lại 5 lần để kiểm tra cường độ và thời gian lưu Mẫu blank được bơm lặp 3 lần sau 10 mẫu Xét cả sequence, số lượng mẫu blank và mẫu QC chiếm khoảng 20% tổng số lần bơm mẫu trên hệ thống LC/HRMS

- Nhiệt độ khay chứa mẫu: 10 0C

- Chương trình gradient pha động phân tích mẫu

Bảng 2 6 Chương trình gradient pha động

2.5.1 2 Điều kiện phân tích khối phổ Orbitrap MS

Hệ thống Thermo Orbitrap Q-Exactive Focus, kiểu ion hóa tia lửa điện (ESI), độ phân giải 70000-FWHM vận hành cả chế độ ion hóa dương và ion hóa âm) Trước khi bơm phân tích, hệ thống khối phổ Thermo Orbitrap MS được hiệu chuẩn độ chính xác khối sử dụng dung dịch Pierce Positive/Negative Ion Calibration solution (Thermo Fisher, CAS 88324)

Các thông số của nguồn ion hóa tia lửa điện :

+ Sheath gas pressure: 32 psi + Spray voltage: + 2800 V (chế độ ion hóa dương

-2500 V (chế độ ion hóa âm) + Auxiliary gas flow rate: 7 L/min + S-lens RF level: 50 V

+ Sweep gas flow rate: 0 L/min + Vaporier temperature: 295 0C

+ Capillary temperature: 320 0C

Hình 2 2 Điều kiện nhận biết chất bằng khối phổ phân giải cao Orbitrap MS

- Chế độ quét toàn dải FullMS với độ phân giải 70000-FWHM quét khối ion mẹ trong dải khối m/z 80 – 1000 ở cả 2 chế độ ion hóa dương và âm được dùng để định lượng các chất phân tích

- Chế độ “FullMS/ddMS2” (Full-scan data dependent MS/MS) đo khối của các phân mảnh (MS/MS) và chế độ “FullMS/confirmation” (đính kèm bảng thông tin về khối của ion mẹ của các chất phân tích) để xác nhận lại mảnh con tương ứng với các ion mẹ phân tích Hai chế độ này dược dùng để định tính các chất phân tích với các thông số cài đặt như sau:

+ Độ phân giải: 17500-FWHM + Cửa sổ phân lập: 1.0 m/z

+ Maximum AGC target: 8e4 + Minimum AGC target: 5e3

2.5.2 Xử lý mẫu

2.5.2.1 Mẫu nước

Quy trình được tham khảo bởi các tài liệu phân tích đa nhóm dư lượng thuốc BVTV trong các mẫu nước mặt, nước ngầm áp dụng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột OASIS HLB [20], [25] Nguyên tắc hoạt động của phương pháp chiết pha rắn và đặc tính của cột OASIS HLB cũng được tìm hiểu một cách kĩ lưỡng trước khi lựa chọn

xử lý mẫu [71] Để đánh giá chung phương pháp phân tích, thí nghiệm được thực hiện với mẫu “pool” là mẫu trộn các thể tích bằng nhau của từng mẫu và tiến hành xử lý mẫu bằng kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột OASIS HLB 6-cc (P/N WAT106202, Waters corporation, Mỹ) Các cột SPE được hoạt hóa lần lượt bằng 10 mL MeOH và

10 mL nước deion (điều chỉnh pH 3 bằng acid formic) Các mẫu được spike 250 ng/mL

IS và làm lặp thêm 3 mẫu spike 250 ng/mL chất chuẩn để tính hiệu suất thu hồi 100

mL mẫu được nạp lên cột chảy dưới áp suất tự nhiên qua đêm với tốc độ 1 giọt/giây Chất phân tích được rửa giải với 10 mL MeOH Dịch chiết sau đó được cô quay về khoảng 0.5 mL định mức tới 1 mL bằng pha động MeOH (chứa 0.1% FA + 5 mM HCOONH4) Mẫu được chuyển vào LC-vials và bơm phân tích trên hệ thống UPLC-HRMS Quy trình tham khảo tài liệu của Casado và cộng sự [20] Ngoài ra, 20 mẫu thực được tiến hành phân tích theo quy trình đã nêu, hàm lượng chất phân tích được tính toán dựa trên đường nội chuẩn

Hình 2 3 Quy trình xử lý mẫu nước 2.5.2.2 Mẫu rau

Nghiên cứu được thực hiện dựa trên phương pháp EN 15662:2008 xác định dư lượng thuốc BVTV trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật, sử dụng kĩ thuật chiết QuEChERS với đệm citrate [29] và Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) 9333:2012 xác định

dư lượng thuốc BVTV bằng sắc kí khí khối phổ và sắc kí lỏng khối phổ 2 lần- Phương pháp QuEChERS [1] Đây là kĩ thuật chuẩn bị mẫu hiện với ưu điểm xử lý mẫu nhanh chóng, dễ thực hiện, chi phí thấp, ổn định, an toàn và hiệu quả cao được phát triển để xác định dư lượng thuốc BVTV trong các mặt hàng nông sản (trái cây và rau quả)

Trong nghiên cứu này, để đánh giá phương pháp, mẫu “pool” được chia làm 3 nhóm để tiến hành thí nghiệm Mẫu “pool” [26] là mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn

24 mẫu rau đã được đồng hóa với khối lượng bằng nhau thực hiện theo quy trình như sau: cân 10 g mẫu rau đã được đồng nhất vào ống QuEChERS 50 mL (Thermo Scientific, P/N 60105-216) đã được nhồi sẵn 4 g MgSO4, 1 g NaCl, 1 g Na3Citrate, 500

mg Na2Citrate; trước khi thêm chính xác 10.0 mL ACN vào ống Mẫu sau đó được lắc đều, rung siêu âm 5 phút rồi ly tâm 15 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút Dịch chiết được lọc qua màng PTFE 0.45 µm Titan 3 (Thermo Scientific), chuyển vào lọ LC-vial (Thermo Scientific) rồi bơm phân tích trên hệ thống UPLC-Orbitrap Q-Exactive MS Trong đó, nhóm 1 được thực hiện theo quy trình trên, nhóm 2 và nhóm 3 lần lượt được spike 50 ppb mix chuẩn thuốc trừ sâu trước và sau khi chiết QuEChERS Bên cạnh đó, quy trình phân tích trên cũng được áp dụng trên 24 mẫu thực bao gồm 8 loại: rau muống rau ngót, cải ngọt, cải cúc, tía tô, kinh giới, rau mùi, xà lách thu mua tại chợ rau trên địa bàn xã Vân Canh, Hoài Đức, Hà Nội; Hàm lượng chất phân tích được tính toán dựa trên đường ngoại chuẩn

Hình 2 4 Quy trình xử lý mẫu rau 2.5.3 Ảnh hưởng của nền mẫu trong phân tích LC-Orbitrap MS đối với mẫu rau

Trong hệ thống sắc ký lỏng khối phổ, nền mẫu là yếu tố quan trọng nhất tác động tới độ lặp lại của phương pháp phân tích Ảnh hưởng của nền mẫu có thể được đánh giá thông qua các thí nghiệm với mẫu thêm chuẩn trước sau khi xử lý mẫu và trước khi bơm phân tích trên thiết bị, phương pháp dựng đường thêm chuẩn vào nền mẫu hay phương pháp sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu đồng vị [40]–[53] Trong khuôn khổ luận văn, các thí nghiệm được thiết kế như mục 2.5.2.2 và sơ đồ hình 2.5, trong đó ảnh hưởng của nền mẫu được thể hiện qua thí nghiệm thêm chuẩn vào dịch chiết mẫu “trộn” sau khi chiết QuEChERS

Hình 2 5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá độ thu hồi, ảnh hưởng của nền mẫu và độ

thu hồi toàn bộ quá trình xử lý mẫu rau

Ảnh hưởng của nền mẫu (ME) là các tín hiệu có thể gây ức chế hoặc tăng cường tín hiệu của chất phân tích trong phép đo trên thiết bị MS, được tính bằng tỉ lệ tín hiệu của chất phân tích trong dung dịch thêm chuẩn sau khi chiết với dung dịch chuẩn, theo công thức:

ME (%) = 100 ∗Spic của chất phân tíchtrong dung dịch mẫu thêm chuẩn sau khi chiết

Spic của chất phân tíchtrong dung dịch chuẩn (1)

Về lý thuyết, giá trị ME bằng 100% nghĩa là nền mẫu không ảnh hưởng đến phép đo trên trên thiết bị khối phổ, giá trị ME thấp hơn hoặc cao hơn 100% tương ứng với tín hiệu phân tích bị giảm hoặc tăng cường Trong khoảng từ 80% – 120% thì giá trị ME được chấp nhận và nền mẫu được coi là ảnh hưởng không đáng kể đến phép đo và ngược lại [60], [40]–[49]

Bên cạnh đó, thí nghiệm thêm chuẩn vào mẫu trước và sau khi chiết cũng nhằm mục đích đánh giá hiệu suất từng giai đoạn trong quá trình xử lý mẫu Độ thu hồi của quá trình chiết (RE) và của toàn bộ quá trình xử lý mẫu (R) được tính lần lượt theo các công thức:

RE(%) = 100 ∗Spic của chất phân tíchtrong dung dịch mẫu thêm chuẩn trước khi chiết

Spic của chất phân tíchtrong dung dịch mẫu thêm chuẩn sau khi chiết (2)

R(%) = 100 ∗Spic của chất phân tíchtrong dung dịch mẫu thêm chuẩn trước khi chiết

Spic của chất phân tíchtrong dung dịch chuẩn (3)

Áp dụng các phương trình (1), (2), (3) có thể tính toán được hiệu suất từng giai đoạn trong quá trình xử lý mẫu Đây là các thông số quan trọng để đánh giá hiệu quả toàn bộ quá trình xử lý mẫu Điều này rất có ý nghĩa khi phát triển và đánh giá phương pháp phân tích mới

2.5.4 Độ chính xác khối và cơ chế phân mảnh

Độ chính xác khối của tất cả các chất phân tích được đánh giá bằng cách bơm lặp 6 lần dung dịch chuẩn 50 ppb và mẫu trộn thêm chuẩn (50 ppb đối với mẫu rau sau khi xử lý mẫu và 25 ppb chứa 250 ppb chuẩn đồng hành đối với mẫu nước) trên thiết bị LC-Orbitrap MS Các ion phân tử được proton hóa tạo ra [M+H]+ ở chế độ ion hóa dương hoặc deproton hóa tạo ra [M-H]- ở chế độ ion hóa âm phụ thuộc vào bản chất cấu tạo hóa học của phân tử chất đó Tỉ số khối lượng và điện tích (m/z) đo được của các ion được chiết ra từ sắc đồ sử dụng phần mềm Thermo Xcalibur Tỉ số khối lượng

và điện tích (m/z) lí thuyết được tính toán trên phần mềm online envipat phiên bản 2.2 (https://www.envipat.eawag.ch/index.php) Độ chính xác khối tương ứng với chế đọ ion hóa dương (âm) được tính toán theo công thức (4) và biễu diễn ở đơn vị phần triệu (ppm):

Độ lệch khối = [M±H]thực nghiệm− [M ±H]lý thuyết

Việc phân mảnh các chất phân tích được tiến hành dưới năng lượng va chạm chuẩn hóa (NCE) 30% ở độ phân giải 17500-FWHM và kiểm tra lại thông tin qua thư viện NIST, thư viện phổ online Mass bank (http://www.massbank.jp/Search), và phần mềm Thermo Mass Frontier phiên bản 7.0 Phổ khối lượng của chất phân tích được xác định dựa vào ion phân tử đã được proton hoặc deproton hóa (M ± H], ion phân mảnh,

sự tính toán m/z dựa trên tỉ lệ đồng vị trong tự nhiên và độ chính xác khối của các ion này Độ chính xác khối của các ion thực nghiệm được đặt ở ± 5 ppm cho tất cả các chất phân tích tương ứng cả hai chế độ ion hóa dương và âm

2.5.5 Đánh giá độ ổn định của tín hiệu phân tích và kiểm soát chất lượng

Trước mỗi đợt bơm phân tích, hệ thống khối phổ được hiệu chuẩn độ chính xác khối sử dụng dung dịch Pierce Positive/Negative Ion Calibration solution (Thermo Fisher, CAS 88324) Mặt khác, dung dịch chuẩn (mẫu QC) và mẫu thêm chuẩn được phân tích lặp trong ngày và cách 3 tiếng sau mỗi lần bảo quản từ điều kiện -20 0C để kiểm tra độ ổn định của thời gian lưu và cường độ tín hiệu Độ ổn định của tín hiệu phân tích được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic (Speak) của 3

chất nội chuẩn dichlorvos-d 6 , dimethoate-d 6 , malathion-d 10 Tất cả các mẫu nước đều

sử dụng chất chuẩn đồng hành thêm vào trước khi tiến hành xử lý mẫu Bên cạnh đó, mẫu trắng dung môi được bơm lặp lại cứ sau 10 mẫu bơm của đợt phân tích để kiểm tra hiệu ứng chuyển tiếp giữa các mẫu Xét toàn bộ mỗi đợt phân tích, tổng số lượng mẫu trắng dung môi và mẫu kiểm soát chiếm khoảng 20% tổng số lượt bơm phân tích trên toàn hệ thống LC-MS của đợt đó [30] Theo hướng dẫn của FDA, độ lệch chuẩn tương