Nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm tứ thời (cymbidium ensifolium) từ mô rễ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời in vitro.. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thí

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-o0o -

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU TẠO CHỒI ĐỊA LAN KIẾM TỨ THỜI

(CYMBIDIUM ENSIFOLIUM) TỪ MÔ RỄ BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành/chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Thái Nguyên - năm 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-o0o -

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU TẠO CHỒI ĐỊA LAN KIẾM TỨ THỜI

(CYMBIDIUM ENSIFOLIUM) TỪ MÔ RỄ BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp : K47 - CNSH

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Người hướng dẫn : 1 TS Bùi Tri Thức

2 GS.TS Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên - năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm, cùng toàn thể quý thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn để em có được kiến thức như ngày hôm nay

Em cũng xin chân thành cảm ơn TS Bùi Tri Thức đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập, giúp em hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn GS TS Ngô Xuân Bình đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Cuối cùng em xin được cảm ơn quý thầy, cô và gia đình, các bạn học cùng lớp K47 - CNSH và toàn thể gia đình đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện về mặt tinh thần cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện tốt nhất luận văn tốt nghiệp, song trong quá trình thực hiện không thể tránh được những thiếu sót nhất định Vì vậy, em rất mong được sự góp ý của quý thầy, cô giáo và các bạn để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Kim Ngân

năng nhân nhanh mô rễ 44 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng kich thích tạo chồi

từ mô rễ 46 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng kích thích tạo chồi từ

mô rễ 48 Bảng 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA và NAA đến khả

năng tạo cây hoàn chỉnh từ rễ 50

năng nhân nhanh mô rễ 45 Hình 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng kích thích tạo chồi

từ mô rễ 47 Hình 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng kích thích tạo chồi từ

mô rễ 49 Hình 4.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin kết hợp với BA và NAA đến khả

năng tạo chồi từ rễ 51

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

of wild fauna and flora - Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp

IUCN International Union for Conservation of Nature and Natural

Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

MỤC LỤC iv

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về lan Kiếm 4

2.1.1 Phân bố, phân loại và đặc điểm của địa lan 4

2.1.2 Hiện trạng cây Địa lan kiếm Việt Nam 7

2.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ sản phẩm từ các loài địa lan kiếm trên thế giới 12

2.1.4 Tình hình sản xuất, tiêu thụ địa lan kiếm ở Việt Nam 14

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống địa lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam16 2.2 Giới thiệu về giống địa lan kiếm Tứ Thời 18

2.2.1 Phân loại khoa học 18

2.2.2 Sự phân bố 19

2.2.3 Hình thái 19

2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 19

2.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 19

2.3.2 Sự phân hoá tế bào 20

2.3.3 Sự phản phân hoá tế bào 20

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 20

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 20

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 21

2.4.3 Môi trường dinh dưỡng 21

2.5 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô địa lan Tứ Thời trên thế giới và trong nước 24

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời in vitro 26

3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời 26

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng kích thích tạo chồi từ mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời 27

3.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường tạo cây hoàn chỉnh từ mô rễ địa lan kiến Tứ Thời 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 27

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28

3.4 Các phương pháp xử lý số liệu 33

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời 34

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến khả năng tái sinh mô rễ 34

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh mô rễ 36

4.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng GA3 đến khả năng tái sinh mô rễ 38

4.2 Kết quả nghiên cứu môi trường nhân nhanh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời 40

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng nhân nhanh mô rễ 40

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh mô rễ 42

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA và NAA đến khả năng nhân nhanh mô rễ 43

4.3 Kết quả nghiên ảnh hưởng của chất kích thich sinh trưởng đến khả năng kích thích tạo chồi từ mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời 45

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine đến khả năng kích thích tạo chồi từ mô rễ 45

4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng kích thích tạo chồi từ mô rễ 47

4.4 Kết quả nghiên cứu môi trường tạo cây hoàn chỉnh từ mô rễ địa lan kiến Tứ Thời.49 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine kết hợp với BA và NAA đến khả năng taọ cây hoàn chỉnh từ mô rễ 50

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Địa lan kiếm (Cymbidium) còn gọi là Địa Lan hay Thổ Lan, là một chi thuộc họ

Lan (Orchidaceae), được mệnh danh là nữ hoàng của các loài lan [15] Chúng có

những điểm nổi bật cả về kinh tế và thẩm mỹ được nhiều người quan tâm và khai thác

Ở Việt Nam, khí hâu nhiệt đới gió mùa phù hợp cho sự phát triển của các loài thực vật nói chung và hoa lan nói riêng Các khu rừng ở Việt Nam thường được nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới đề cập tới là nơi tập trung nhiều loài lan rừng đẹp và quý hiếm như: lan Hồ Điệp, lan Vũ Nữ, lan Hoàng Thảo Giả Hạc, Quế Lan Hương, và đặc biệt là các loài địa lan kiếm bản địa Các loài lan kiếm bản địa ở Việt Nam rất đa dạng và có giá trị cao Chính vì vậy, chúng đang bị khai thác một cách

ồ ạt, thiếu kiểm soát và quản lý Nhiều loài kiếm bản địa đang bị đe dọa và dần biến mất khỏi tự nhiên Hiện nay 52 loài Địa Lan của Việt Nam đều rơi vào tình trạng nguy cấp trong đó loài địa lan Tứ Thời là một trong những loài đang bị báo động về

nguy cơ tuyệt chủng gần Địa lan kiếm Tứ Thời (Cymbidium ensifolium) vẫn chưa

được Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) phân hạng Tuy nhiên, nó đã được đánh giá tạm thời là dễ bị tổn thương (VU) theo tiêu chí Danh sách đỏ của IUCN [13] Địa lan kiếm Tứ Thời được liệt kê trong phụ lục II của Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) [16] Việc nghiên cứu nhân giống với nhằm nhân nhanh và bảo tồn các giống lan quý như trên trước bờ vực tuyệt chủng là việc cần thiết

Nhân giống lan hiện nay thường sử dụng phương pháp gieo hạt do vậy không giữ được các đặc tính của các cây mẹ, cây bản địa Ngoài ra tỷ lệ nảy mầm của các loài lan thường rất thấp Việc tìm ra phương pháp nhân giống riêng cho các loài địa lan được các nhà nghiên cứu thực hiện trên các bộ phận khác nhau như chồi, mảnh

lá Tuy nhiên hiện nay, đa phần các giống lan mới được nhân giống thành công từ chồi và đỉnh sinh trưởng Việc sử dụng chồi, đỉnh sinh trưởng nuôi cấy giữ được đặc tính của cây mẹ nhưng đồng thời cũng tiêu diệt cây mẹ Việc nghiên cứu nhân giống vô tính sẽ rất khó khăn với những loài trên bờ vực tuyệt trủng có số lượng

cây mẹ còn rất ít Việc nhân giống từ các bộ phận khác của cây mà không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây mẹ có ý nghĩa lớn Đặc biệt đối với giống có số lượng mẫu không nhiều, và khó thu thập từ tự nhiên Sử dụng mảnh mô rễ để nhân giống lan nếu thành công có vai trò rất lớn với việc bảo tồn các giống lan Đặc biệt với các giống số lượng cá thể ít, và khó nhân giống bằng các phương pháp nhân giống tự nhiên

Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tế khách quan trên, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo chồi địa lan kiếm Tứ Thời (cymbidium

ensifolium) từ mô rễ bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Xác định môi trường tối ưu trong tạo chồi và rễ từ rễ cây địa lan kiếm Tứ Thời

bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được nồng độ thích hợp của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ mô rễ

- Xác định được môi trường thích hợp để nhân nhanh mô rễ địa lan

- Xác định được nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho khả năng tái sinh chồi từ mô rễ

- Xác định được môi trường thích hợp cho ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào

kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm một phương pháp nhân giống địa lan kiếm mới, phương pháp tạo chồi từ mô rễ Phương pháp này đem lại lợi ích lớn đặc biệt cho những giống trên bờ vực tuyệt chủng có số lượng loài còn rất ít

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Xây dựng quy trình tạo chồi từ mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống địa lan kiếm Tứ Thời góp phần bảo tồn giống

đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học sau này tại phòng thí nghiệm Khoa CNSH & CNTP

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lan Kiếm

2.1.1 Phân bố, phân loại và đặc điểm của địa lan

2.1.1.1 Phân bố và phân loại

Địa lan Kiếm Cymbidium thuộc ho ̣phụ Orchidioideae Các loài trong chi Lan

Kiếm có đặc điểm hoa lớn, đẹp, bền Lan Kiếm đa phần đều sống phụ trên cây mục khác hoặc hốc đá có mùn [17]

Địa lan Kiếm được phân bố trên một vùng vô cùng rộng lớn khắp Đông Nam Á, các hải đảo trên Thái Bình Dương đến Hy Lạp Sơn, từ Philippines đến Fidgi bao gồm

cả Việt Nam [17] Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, đây là môi trường thích hợp cho địa lan sinh trưởng và phát triển Có nhiều loài địa lan Kiếm đượng tìm thấy ở Việt Nam Địa lan tìm thấy tại vùng rừng núi khu vực phía Tây bắc và phía Đông bắc của Việt Nam Trong khu vực Đông bắc, địa lan Kiếm được tìm thấy ở các tỉnh như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hải Phòng, Hòa Bình Với nhiều loài đặc hữu cho tiểu vùng khí hậu tại nơi tìm thấy chúng [20]

Địa lan gồm 52 loài thuộc họ Lan Căn cứ vào mùa có thể phân Địa lan ra thành

3 nhóm: Địa lan thu là nhóm lan thường ra hoa vào mùa thu như: Bạch ngọc, Tố tâm, Trần Mộng ; địa lan đông là nhóm địa lan ra hoa vào mùa đông; và địa lan xuân là nhóm hoa địa lan ra hoa vào mùa xuân như: Đại mạc, Thanh trường, Đại hoàng, Hoàng vũ, Thanh ngọc Trong đó địa lan xuân chiếm phần đa Nó phong phú hơn về chủng loại hơn và có giá trị hơn so với các nhóm còn lại [20]

Căn cứ vào màu sắc của hoa có thể chia địa lan thành sáu nhóm như:

Nhóm 1 - Hoa màu nâu: Đại mạc và các biến thể

Nhóm 2 - Hoa màu vàng: Hoàng lan và các biến thể

Nhóm 3 - Hoa màu xanh: Thanh lan và các biến thể

Nhóm 4 - Hoa màu hồng: Hồng lan và các biến thể

Nhóm 5 - Hoa màu trắng: Bạch lan và các biến thể

Nhóm 6 - Hoa màu đen (hoặc nâu đen): Hắc lan và các biến thể

Trong đó Hồng lan và Hắc lan là 2 loài đặc hữu và quý hiếm nhất [20]

2.1.1.2 Đặc điểm hình thái của Địa lan kiếm

Về hình thái bên ngoài, Địa lan kiếm là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ Có loài rễ mọc bám trên vỏ cây (phụ sinh), mặt đất (bì sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây (thực sinh), trong đất mùn (địa sinh) Rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ củ rễ [17] Thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan với nhau Các

củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi căn hành

cũ, có thể mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con Do đó người ta

xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial) [20]

Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1

cm đến 15 cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá [20]

Lá thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách Khi phiến lá rụng, vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành Vài loài không có cuống lá Tùy theo từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá Một số loài ít chịu râm có phiến lá màu xanh vàng, còn lại thường là xanh đậm Bản lá

và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ưa bóng râm Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến Đầu lá nhọn hay chia thành 2 thùy Kích thước của bản lá biến động từ 0,5 cm đến 6 cm Chiều dài

lá thay đổi từ 10 cm đến 150 cm [20]

Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Chồi hoa thường xuất hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân hơi dẹp Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra 2 phía hình đuôi cá, còn ở chồi hoa các lá bao hoa luôn ôm chặt quanh phát hoa Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay

buông thõng Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luôn phiên theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn, bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu

nở Thoạt nhìn, hoa Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau, thực ra chỉ có hai cánh hoa

ở bên trong, còn lại là 3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ ba chuyên hóa thành cánh môi, màu sắc rực rỡ hơn, xẻ thành ba thùy tạo

ra dạng nửa hình ống Hai thùy bên ôm lấy trụ, thùy thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làm chỗ đậu cho côn trùng khi đến hút mật và thụ phấn cho hoa Giữa cánh môi có hai gờ dọc song song màu vàng Tận cùng bên trong có dĩa mật

và đôi khi có những tuyến tiết mùi hương [20]

Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ nhị

- nhụy (hay trục hợp nhụy) hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trên cùng, mang

2 khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà dễ mở rời Hộc chứa phấn khối của trục hợp nhụy cách với nuốm nhụy bởi

một cái gờ (mỏ) nổi lên Cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ

phấn được nhờ côn trùng Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả [20]

Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt Khi chín, quả mở theo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới [20]

Hạt lan có kích thước nhỏ li ti Khối lượng toàn bộ hạt trong một quả chỉ bằng1/10 đến 1/1000 miligam Trong đó không khí chiếm khoảng 76 - 96% thể tích của hạt do nó được cấu tạo bởi một khối chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí Do đó, họ hoa lan còn được gọi là họ vi tử Phải trải qua 5 - 8 tháng hạt mới chín Trong tự nhiên, phần lớn hạt thường chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm Do đó hạt nhiều có thể theo gió bay rất xa, nhưng hạt nảy

mầm thành cây lại rất hiếm Chỉ ở trong những khu rừng già ẩm ướt, vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm [20]

2.1.2 Hiện trạng cây Địa lan kiếm Việt Nam

Địa lan Kiếm là một loài cây không những có giá trị thẩm mỹ, giá trị khoa học

mà còn có giá trị kinh tế rất cao Hoa Lan kiếm có một nét đẹp kiêu sa, quyến rũ và mềm mại, mang dáng vẻ sang trọng và huyền bí Hiện nay cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu về thưởng thức cái đẹp càng gia tăng Nghề trồng hoa cây cảnh nói chung và đặc biệt chọn tạo giống hoa lan xuất khẩu nói riêng, đã và đang trở thành một ngành kinh tế thu nhiều lợi nhuận [22]

Địa lan Kiếm có giá trị thương mại cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều

Chi Cymbidium trên thế giới ghi nhận 52 loài địa lan Trong đó 52 loài địa lan

Kiếm được ghi nhận tại Việt Nam Như vậy, nước ta là một trong các quốc gia có nguồn lan kiếm tự nhiên phong phú Không những phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan kiếm đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng Vì vậy tình trạng thu thập và xuất khẩu lan kiếm một cách ồ ạt, không kiểm soát dẫn đến việc lan kiếm ngày càng hiếm trong tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, quần thể lan Kiếm càng có nguy cơ suy giảm nghiêm trọng Dưới đây là danh sách 30 loài lan Kiếm đặc hữu của Việt Nam [20]

Bảng 2.1: Danh sách 30 loài lan kiếm đặc hữu của Việt Nam

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

3 Cymbidium banaense Đoản kiếm Bà Na,

Thiên Nga (PHH), Lan kiếm Bà Nà (TH)

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

Cymbidium poilanei Đào Liễu

Đồng danh: Cymbidium densiflorum,

Cymbidium longifolium, Cyperorchis

Đồng danh: Cymbidium pendulum,

Cymbidium tricolor, Cymbidium wallichii

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (Tiếng Việt) Ghi chú

affine ; Cymbidium maguanense,

24 Cymbidium qiubeiense Chưa có tên

Đồng danh: Cyperorchis schroederi

Hoàng lan (PHH), Kiếm

fragrans ; Cymbidium hoosai

Kiếm tầu (TH), Mặc lan, Thanh trường, Đại hoàng *

29 Cymbidium wenshanense Chưa có tên

30 Cymbidium wilsonii

Đồng danh: Cymbidium giganteum Chưa có tên

Ghi chú: Các giống đánh dấu (*) dưới đây đã được liệt kê vào Phụ Lục II của Công ước CITES Hiện nay,

21 loài tìm thấy tại Việt Nam nằm trong danh sách CITES 2017

Trên thực tế, mức độ thu hẹp quần thể tất cả các loài Địa lan kiếm Việt Nam được đang diễn ra trong thời gian gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện ra tốc độ phá huỷ mạnh mẽ trên diện rộng của những khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu trên các đỉnh núi đá vôi [11]

Trước tình hình Địa lan kiếm cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai, chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài địa lan Kiếm và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng[11]

2.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ sản phẩm từ các loài địa lan kiếm trên thế giới

Trước đây, cây lan được cho là xuất hiện đầu tiên ở châu Âu qua bản viết tay bằng chữ Hy Lạp, vào khoảng năm 370 - 285 trước Công nguyên [8] Nhưng thực tế, cây lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông, vào khoảng từ năm 551 - 497 trước Công nguyên Cây lan biết đến đầu tiên ở Trung Hoa là Kiến lan được tìm ra đầu tiên

ở Phúc Kiến - Trung Quốc đó là Cymbidium ensifonymum là một loài bán địa lan Ở

Phương Đông, lan được chú ý đến bởi vẻ đẹp duyên dáng của lá và hương thơm tuyệt vời của hoa Vì vậy, trong thực tế lan được chiêm ngưỡng trước tiên là lá chứ không phải màu sắc của hoa Quan niệm thẩm mỹ thời ấy chuộng tao nhã chứ không ưa phô trương sặc sỡ Lan đối với người Trung Hoa hay lan đối với người Nhật, tượng trưng cho tình yêu và vẻ đẹp, hương thơm tao nhã, tất cả thuộc về phái yếu, quý phái và thanh lịch Khổng Tử đề cao lan là vua của những loài cây cỏ có hương thơm Phong trào chơi phong lan và địa lan ở Trung Quốc phát triển rất sớm, từ thế kỷ thứ V trước công nguyên đã có tranh vẽ về phong lan còn lưu lại từ thời Hán Tông Ở châu Âu bắt đầu để ý đến phong lan từ thế kỷ thứ 18, sau Trung Quốc đến hàng chục thế kỷ và cũng nhờ các thuỷ thủ thời bấy giờ mà phong lan đã đi khắp các miền của địa cầu Lúc đầu là Vanny sau đó đến Bạch Cập, Hạc Đính rồi Kiến Lan Lan chính thức ra nhập

vào ngành hoa cây cảnh trên thế giới 400 năm nay [11] Địa lan (Cymbidium) hay còn

gọi Thổ lan là một loại hoa lan khá phổ thông, vì hội đủ điều kiện: có nhiều hoa, to đẹp, đủ màu sắc và lâu tàn, rất thông dụng cho việc trang trí trưng bày Hiện nay, nước

Mỹ có nhiều vườn địa lan dùng cho kỹ nghệ cắt bông như Gallup & Tripping ở Santa Barbara nhưng cũng phải nhập hàng triệu đô la mỗi năm từ các nước Châu Âu và châu

Á để cung ứng cho thị trường trong nước Trước năm 1930, nước Mỹ không có nhiều giống lan và cũng không có nhiều người thích chơi lan hay vườn lan Nói riêng về California thì chỉ có 2- 3 vườn lan ở Oakland và San Francisco, nhưng chỉ dùng cho kỹ

nghệ cắt bông, không có bán cây Lúc bấy giờ các vườn lan chỉ có cát lan (Cattleya) hay địa lan (Cymbidium) nhưng cũng không có nhiều giống lan hay hoa đẹp, những

giống này được nhập cảng từ nước Anh [24]

Nước Anh là nơi nghiên cứu và lưu trữ hồ sơ những loài thảo mộc hay bông hoa, tất cả tên tuổi của những loài thảo mộc hay bông hoa đều được đăng ký và lưu trữ ở Anh Quốc Sau năm 1930 địa lan mới được nhập cảng vào nước Mỹ nhưng rất giới

hạn, địa lan rất đắt giá, giá tính từng củ một, dù củ không có lá, hay củ có lá giá cả cũng không khác biệt bao nhiêu Có nhiều loại, một củ với giá có thể tới 800 đô la

Một cây địa lan tên Cymbidium rosanna “pinkie” được bán đấu giá 2.500 đô la và có

người mua với giá 2.600 đô la (Dẫn theo Phạm Cường -Thursday November 1, 2007 - 07:42am (PDT)) Nhưng khi chiến tranh thế thứ II bắt đầu, tất cả nhiên liệu chỉ dành cho chiến tranh, nên các vườn lan ở nước Anh không còn nhiên liệu để sưởi ấm cho lan vào mùa đông nữa Vì không muốn mất những loại địa lan đã gây giống nhiều năm, nên họ phải xuất ra nước ngoài, trong đó có cả nước Mỹ [24] Theo tạp chí (Chinese Cymbidium History Part 1), hiện nay tại Mỹ đã có những nghiên cứu về cây địa lan ở một số khâu kỹ thuật sau:

+ Nghiên cứu giá thể (môi trường) trồng, mỗi một điều kiện khác nhau có thể dùng các giá thể khác nhau: Ở vùng có nhiệt độ môi trường thấp (65H0 F ban ngày và 45H0 F ban đêm) với độ ẩm trung bình có thể thêm vỏ cây linh sam và đá bọt biển (peclit thô) vào hỗn hợp trên Hỗn hợp này có nhiều tác dụng nhất cho khí hậu lạnh vào mùa đông và ấm nóng vào mùa hè vì vỏ cây giúp giữ lại lượng ẩm đáng kể trong hỗn hợp Ở điều kiện khí hậu khô có thể tăng thêm rêu và rong biển chúng sẽ làm sự thoát ẩm diễn ra chậm lại Nhưng cần sử dụng cẩn thận khi thêm rong (rêu) vì sự tưới nước thường xuyên sẽ dẫn đến thừa ẩm, úng làm bộ rễ thối rữa, cây dễ bị bệnh và chết Người ta đã sử dụng các loại giá thể, mục đích giữ cho rễ cây ẩm, song không quá ẩm, rễ cây luôn mát mẻ phát triển tốt [ 24]

Theo một số nhà trồng lan Châu Á thì ở khí hậu ấm nóng chỉ sử dụng duy nhất là

đá, tuy nhiên không giới thiệu (khuyên) cho điều kiện khí hậu mát mẻ, những hỗn hợp

đá sẽ giữ lại ít nước và được dùng trong điều kiện có độ ẩm thấp Ở vùng ẩm thấp nhiệt độ môi trường cao (85◦C ban ngày và 65◦C ban đêm) có thể trồng với sự pha trộn của đá mịn thô hoặc có thể là cây dương xỉ thêm vào 1 ít hỗn hợp đá thô [11]

+ Nghiên cứu về thay chậu và tách cây: Phương pháp chính của sự sinh sản địa lan kiếm châu Á đặc biệt bởi sự đẻ nhánh Những chậu cây có giá thể sâu và rộng có thể để từ 2-3 năm mới thay giá thể và cho nhiều cây vào chậu tạo sự sinh sản mới, ở điều kiện này sẽ tạo nhiều cụm hoa Tuy nhiên cần lưu ý tới vết cắt khi tách cây phải được xử lý bằng sunfua làm giảm sự tiếp xúc của virut [2]

+ Nghiên cứu về độ ẩm: Trong mùa hè - mùa sinh trưởng nên tưới nước 2 lần/ tuần, tưới nước từ miệng chậu sao cho nước qua chậu khoảng 10 giây, có thể dùng bình tưới phân sau khi tưới nước, cần giữ độ ẩm ở 75% Khi cây vào thời kỳ nghỉ ngơi cần tưới ít nước và giữ độ ẩm từ 40-60% Tưới nước vừa đủ cây có bộ rễ sinh trưởng khoẻ và đều đặn [19]

+ Nghiên cứu về ánh sáng: Mùa hè cần độ che phủ khoảng 60-70% ánh sáng, trong mùa đông có thể giảm 20% Lá cây tiếp nhận ánh sáng tốt nhất sẽ xanh và sáng bóng và có độ cong thanh nhã Màu xanh vàng có thể cho biết là lá quá thừa ánh sáng,

lá bị gãy gập và rụng có thể là ánh sáng yếu [2]

+ Nghiên cứu về nhiệt độ tới sinh trưởng và phát triển: Nhiệt độ khác nhau có

ảnh hưởng quan trọng đến quá trình ra hoa Địa lan Kanran và Gorengi đòi hỏi nhiệt

độ ban đêm khoảng 40-50◦C để bắt đầu nở hoa, địa lan Sinence cần nhiệt độ 50-60◦C + Nghiên cứu về bón phân: Khi cây con phát triển cần bón phân 1 tuần/ lần, ngừng tưới phân khi cây chuyển sang giai đoạn nghỉ ngơi [24]

+ Nghiên cứu về bộ rễ đánh giá khả năng sinh trưởng của cây: Mùa xuân là thời gian tốt nhất để kiểm tra bộ rễ, nếu rễ bám quá chặt vào chậu có thể đập bỏ chậu Kiểm tra bộ rễ sẽ giúp ta biết được lượng nước tưới, giá thể trồng và sức khoẻ của cây [2]

2.1.4 Tình hình sản xuất, tiêu thụ địa lan kiếm ở Việt Nam

Nghề trồng hoa lan ở Việt Nam có lịch sử rất lâu đời Vua Trần Nhân Tông lập nên "Ngũ bách viên" trong đó có 500 loài hoa quý được sưu tập từ khắp các vùng đất nước, chủ yếu là Địa lan kiếm (loài lan bản địa có nhiều hương) thuộc chi Cymbidium [6] Các loài lan kiếm đó còn tồn tại đến ngày nay, được các gia đình khá giả thích chơi các loài lan này và phát triển trong dân gian Hiện nay, một số loài lan quý hiếm vẫn tồn tại như Thanh Ngọc, Mạc đen, Đại mạc biên, Đại mạc, Hoàng vũ, Thanh trường, Hoàng điểm, Bạch Ngọc, Bạch cập, Mạc xuân , giá trị mỗi chậu lan nhỏ lên tới vài triệu đồng thậm chí cả chục triệu đồng khi tến đến xuân về [7]

Những nghiên cứu về lan kiếm Việt Nam thời kì đầu không rõ rệt lắm, có lẽ người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro - nhà truyền giáo Bồ Đào Nha, Ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 Trong cuốn

“Flora cochin chinensis” gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến Nam phần Việt Nam là aerides, Phaius và Sarcopodium mà đã được Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera plante rum” (1862- 1883) [6] Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu được công bố đáng kể là F gagnepain và

A gnillaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ "Thực vật Đông Dương chí" (Flora Genera Indochine) do H Lecomte chủ biên, xuất bản từ những năm 1932 - 1934 Trong điều kiện hội nhập, đầu tư phát triển công nghiệp, đô thị và du lịch với tốc độ cao, nhu cầu về hoa cho nội tiêu và xuất khẩu gia tăng mạnh Hoa, cây cảnh mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho người trồng hoa, đồng thời thúc đẩy du lịch, hội nhập và đời sống văn hóa tinh thần của quốc gia Đã có những công ty hàng năm sản xuất và tiêu thụ hoa lan doanh thu lên hàng tỷ đồng như Sài gòn Orchidex, công ty hoa Hoàng Lan , song các công ty này chủ yếu buôn bán các giống lan nhập nội Hiện nay trong nước có nhiều người sưu tầm và nghiên cứu về lan và cũng có những công ty trồng lan để bán và xuất cảng nhưng với số vốn hạn hẹp, kỹ thuật thô sơ nên không thể nào cạnh tranh nổi với các nước láng giềng như Thái Lan, Đài Loan đã có mặt trên thị trường quốc tế từ lâu Ngoài ra, do quy luật quốc tế bảo vệ các giống vật và cây hiếm quý do quy ước Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora (CITIES) đã cấm mua bán một số đặc sản, cho nên hoa lan của Việt Nam khó lòng được chính thức nhập cảng vào Hoa Kỳ Trong khi đó nhiều lái buôn đã thuê người vào rừng thẳm, núi cao để kiếm lan bất kỳ lớn, nhỏ quý giá hay không đem bán cho các lái buôn Trung Quốc, Thái Lan hoặc Đài Loan với giá rẻ mạt: 2 – 3 USD/kg Những cụm lan rừng vẫn được bày bán tại các hội hoa lan tại Santa Barbara hay South Coast Plaza có thể là xuất xứ tại Việt Nam [21] Như vậy, các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, các đề tài, dự án nghiên cứu về hoa lan của Việt Nam trong những năm gần đây tập trung vào một số nội dung như: thu thập đánh giá một số loài địa lan thơm của miền Bắc Việt Nam; điều tra khảo sát nguồn gen hoa lan của Việt Nam; nhập giống, đánh giá và tuyển chọn một số giống hoa lan có nguồn gốc ở nước ngoài; nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống trong

invitro đối với lan Hồ điệp (Phalaenopsis) [9]

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống địa lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam

Hiện nay, việc nhân giống địa lan kiếm thường sử dụng phương pháp lai truyền thống Bên cạnh đó, để tạo ra số lương cây giống với sinh khối lớn các nhà chọn giống còn sử dụng kĩ thuật sinh học hiện đại để chọn lọc và nhân giống, bao gồm, kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống vô tính các loài Địa lan kiếm, sử dụng phương pháp đột biến gây đa bội hóa Địa lan kiếm [20]

Đối với phương pháp nhân giống truyền thống, yêu cầu số lượng giống lai tự nhiên đã được thu thập phải phong phú Con lai tự nhiên có thể là kết quả của 2 loài giao phấn với nhau hoặc của các dòng trong cùng một loài giao phấn nhờ côn trùng Điều kiện để một phép lai có thể xảy ra trong tự nhiên là 2 cá thể phải giống nhau về mùa hoa, cùng khu phân bố và cùng kích thước hoa Điển hình nhất là cây lai Hồng

Hoàng, con lai tự nhiên giữa cây Hồng lan (Cymbidium insigne) và cây Hoàng lan (Cymbidium giganteum) Bản thân nhóm Hồng Hoàng có rất nhiều dạng khác nhau về

màu sắc cánh hoa và sắc tố đỏ trên cánh môi Tuy nhiên, phải nhờ đến bàn tay con người, những phép lai giữa các loài rất cách biệt nhau mới có thể thực hiện Việc tạo

giống Cymbidium phát triển theo tiến trình thu thập giống hoang dại, nhờ có sự hỗ trợ

của những tiến bộ sinh học, đã đạt được những kết quả không ngờ [18]

Khoảng đầu thế kỷ này, một số lan rừng đã được thu thập từ các vùng rừng nhiệt đới đưa về trồng ở châu Âu Từ những giống hoang dại đó, những phép lai đã được thực hiện Mục tiêu của những phép lai này là tạo được những giống có đặc tính kinh

tế và giá trị thẩm mỹ cao như hoa nhiều, lớn, bền, màu sắc sặc sỡ Đó cũng chính là lý

do tại sao Cymbidium không phải là cây nguyên sản ở châu Âu nhưng các giống lai

được nuôi trồng để cắt cành ở đây lại có số lượng rất lớn so với các châu lục khác[16]

Cây Cymbidium lai đầu tiên xuất hiện năm 1889 là cây Cymbidium

eburneolowianum được tạo ra bằng phép lai giữa lan C eburneum và lan C lowianum

Trong 20 năm tiếp theo, chỉ xuất hiện thêm 14 con lai nữa nhưng chúng không có giá trị cao lắm Trong những năm đầu của thế kỷ 20, người ta tìm thấy ở Miến Điện và

Đông Dương nhiều loài giá trị, nhất là C parishii, C insigne, C erythrostylum (Bạch

hồng) có màu sắc từ trắng đến hồng, chúng đã đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các con lai đẹp sau này [18]

C hookerianum và C lowianum đã được dùng để tạo ra những giống hoa màu

xanh C eburneum (Bạch lan) và C insigne (Hồng lan) đã cho ra các giống màu trắng

và màu hồng C traceyanum cho ra các giống màu vàng C ansonii cho ra những

giống màu đỏ và màu hồng C parishii dùng để tạo ra những giống có cánh môi đỏ

thắm như Cymbidium miretta Những công trình lai tạo, chọn giống Cymbidium vào đầu thế kỷ này đáng kể nhất là của H G Alexander, đã cho ra đời cây lai C

Alexanderi Westonbirt (C eburneolowianum x C insigne) Cây này cho đến nay vẫn

giữ một vị trí quan trọng trong việc tạo ra các giống mới màu trắng, hồng, vàng, xanh, nhất là những giống ra hoa vào mùa thu và mùa đông Cùng thời gian này, còn có cây

lai C pauwelsii (C insigne x C lowianum), là cây đầu dòng để tạo ra những giống có phát hoa lớn và sức phát triển mạnh như C babylon (C olympus x C pauwelsii) Đến

lượt mình, (C olympus x C pauwelsii) lại là cây đầu dòng thông dụng để tạo ra những giống mới có màu sắc rực rỡ [18]

Những năm gần đây có khuynh hướng tạo ra những giống Cymbidium có màu

sắc tinh khiết, không có sắc tố đỏ cả trên cánh môi Do đó, sẽ có những giống chỉ có

màu vàng, xanh hay trắng Phương pháp để đạt kết quả này là hồi giao nhiều lần với C

lowianum var concolor (Thanh ngọc) Một hướng lai tạo khác không kém lý thú là tạo

ra những giống với nhiều màu sắc rực rỡ phối hợp với nhau: màu 2 cánh hoa và cánh môi khác với màu của 3 lá đài, hoặc cánh hoa có nhiều màu tạo thành các đốm khảm

Về hình dạng hoa thì ngày càng có những giống lai mới có cánh hoa và lá đài tròn, hoa kín và tròn Hoa nhiều trên một cành và độ bền của hoa cắt cành cũng là những đặc điểm được quan tâm khi chọn tạo giống [18]

Một nhóm Cymbidium khác có kích thước thân, lá, hoa nhỏ hơn, gọi chung là C

miniature, cũng được lai tạo ra và chiếm một vị trí đáng kể cạnh nhóm hoa lớn, do

chúng thích hợp với điều kiện nhà ở ngày càng chật hẹp hiện nay Những cây đầu

dòng để tạo giống trong nhóm này có thể kể C Devonianum (Gấm ngũ hồ); C

ensifolium (Mặc lan); C Pumilum và C Tigrinum, C Devonianum cho ra những giống

có cành hoa buông thõng, màu xanh, vàng và nâu, cánh môi có bệt đỏ đậm; C

ensifolium được khai thác ở 2 đặc tính di truyền là mùa hoa (cuối hè và thu) và hương

thơm C tigrinum cho ra những con lai nở hoa mùa xuân, cây thấp lùn, lá ngắn, giả hành nhỏ, hoa màu xanh đến vàng Nhưng đáng kể nhất vẫn là C Pumilum đã cho ra

nhiều giống miniature màu sắc phong phú Ưu điểm của nhóm hoa nhỏ này là yêu cầu không khắt khe lắm về nhiệt độ thấp để phân hóa hoa nên có thể nuôi trồng rộng rãi hơn ở nước ta [18]

Phương pháp sử dụng kĩ thuật sinh học hiện đại trong chọn lọc và nhân giống: Giữa những nhóm hoa lớn và hoa nhỏ cũng đã có những phép lai, tạo ra những giống

Cymbidium kết hợp được đặc điểm của cả 2 nhóm: hoa lớn trung bình, số lượng hoa

trên một cánh nhiều, dễ trồng trọt và năng suất hoa cao Việc lai tạo giống không ngừng lại ở việc thụ phấn, gieo hạt đơn giản mà còn dùng đến những kỹ thuật sinh học

hiện đại để tạo ra nhiều giống đa bội Cymbidium cũng là chi đầu tiên của hoa lan được

áp dụng thành công phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống vô tính hàng loạt trong ống nghiệm để có số lượng cây giống lớn, đồng nhất và sạch bệnh trong một thời gian tương đối ngắn Hiện nay, xu hướng của các nhà chọn giống là phối hợp giữa phương pháp lai tạo truyền thống với các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại trong chọn giống thực vật nói chung cũng như chọn tạo giống Địa lan kiếm nói riêng [22]

2.2 Giới thiệu về giống địa lan kiếm Tứ Thời

2.2.1 Phân loại khoa học

Tên Việt Nam: Địa lan Tứ Thời

Tên Latin: Cymbidium ensifolium

Đồng danh: Epidendrum ensifolium L (1753) (Basionym), Jensoa ensata Raf

(1838)

- Cymbidium ensifolium vẫn chưa được IUCN phân hạng Tuy nhiên, nó đã

được đánh giá tạm thời là dễ bị tổn thương (VU) theo tiêu chí Danh sách đỏ của IUCN [9] Nó được liệt kê trong Phụ lục II của CITES [12]

2.2.3 Hình thái

Hình thái đặc trưng của địa lan Kiếm Tứ Thời là cây địa sinh, bụi dày, giả hành nhỏ, được các bẹ lá che lại Lá nhiều, dài, nhọn, có 3 gân lồi ở mặt dưới lá Chúng dài 65-85 cm, rộng 2,5- 3,0 cm Phát hoa từ bẹ lá, cao 25-40 cm, mang 6-10 hoa thơm, hoa lớn 4-5 cm Cánh hoa dạng mũi mác, mỏng nhỏ, màu xanh vàng với nhiều sọc đỏ nâu nằm liền nhau Lá đài giống cánh hoa Cánh môi thuôn, 2 thùy bên ngắn, rộng và tròn, có nhiều đốm đỏ nâu Thùy giữa dạng bầu dục, gợn sóng, có chấm rải rác màu nâu đỏ Trục hợp nhụy màu trắng vàng, phần bụng có chấm đổ nâu Cây ra hoa tháng 8 – 11, địa lan Kiếm Tứ Thời thường hân bố ở những rừng già, lá lợp ven suối trên 1400 m [21]

2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

2.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Gottlieb Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức là người đầu tiên khởi xướng ý tưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đưa giả thuyết về tính toàn năng của

tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” Theo ông mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ

đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào và là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [4]

2.3.2 Sự phân hoá tế bào

Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào và giai đoạn giãn của tế bào Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng Sau đó các tế bào bắt đầu phân hoá thành các mô chuyên hoá

để đảm nhận các chức năng khác nhau, các tế bào trong giai đoạn này có đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng Có thể nói rằng sự phân hoá tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá [4]

2.3.3 Sự phản phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hoá tế bào Các tế

bào đã phân hoá trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [4]

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.4.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô - tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá ), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân, rễ.) [22]

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau, trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [22] Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phương pháp phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật Hoá chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu Hiệu quả vô trùng tuỳ thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hoá chất Một số hoá chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaClO-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2- thuỷ ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin ) [22]

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng gồm buồng cấy vô trùng, các dụng cụ cấy

vô trùng và môi trường cấy vô trùng nhằm đảm bảo mẫu cấy sẽ không bị nhiễm vi sinh vật Để tạo điều kiện vô trùng, buồng cấy phải dùng đèn tử ngoại chiếu trong 30 phút sau đó được lau sạch bằng cồn 90°, dụng cụ và môi trường nuôi cấy thường được khử trùng ở 121°C trong 25-30 phút [2]

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ

2.4.3 Môi trường dinh dưỡng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận, các giai đoạn phát triển, phân hoá khác nhau của mẫu cấy và mục đích nuôi cấy như duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [2]

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau: nguồn cacbon, các nguyên tố khoáng đa lương và vi lượng, vitamin, chất hữu cơ tự nhiên và các chất điều hòa sinh trưởng

2.4.3.1 Nguồn Cacbon

Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không còn khả năng tự dưỡng do

không tiến hành quang hợp đầy đủ Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất là saccharose với hàm lượng từ 20-

30 g/l Ngoài ra còn có thể sử dụng các loại đường khác như fructose, rafinose, sorbitol, glucose, maltose, lactose, những loại đường này thường ít dùng hơn và chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt [2]

2.4.3.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Các chất vô cơ bao gồm thành phần khoáng đa lượng và khoáng vi lượng có trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [1] Các dạng ion của muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hoà áp suất thẩm thấu và điện thế màng [2]

- Nguyên tố đa lượng:

Quan trọng nhất là các nguyên tố: N, P, K, Mg, Ca, Na, S

- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni các nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [12]

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon [2]

2.4.3.4 Chất hữu cơ tự nhiên

Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin [2]

2.4.3.5 Các thành phần khác

Ngoài các thành phnh phần khácinh dưỡng như inositoly còn một số thành phần khác như agar và than hoạt tính Thành phc thành phnh phần khácinh dưỡng như inositoly còn một số thành phần khác như agar và than hoạt tính nin, các

Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo, cùng một số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường, agar cũng cung cấp một số chất dinh dưỡng như khoáng đa lượng, vi lượng, vitamins giúp tạo điều kiện tối ưu hóa cho mô, cây con cho tế bào, mô nuôi cấy [2]

Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascorbic [24]

2.4.3.6 pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số tộ pH của môi trường ảnh hưởnpH trong khoảng từ 5,5-6,0 Tuy nhiên, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ trong quá trình nuôi cấy [2]

2.4.3.7 Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần quyết định quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ và nhóm chất điều hoà sinh trưởng [2]

Dựa vào hoạt tính sinh lý có thể phân chất điều hoà sinh trưởng làm 2 nhóm: nhóm chất kích thích và nhóm ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [2]

- Auxin được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Các auxin thường được sử dụng là: NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) [23]

- Cytokinin được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeain có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra cytokinin còn làm chậm sự già hoá [2]

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì Kinetin và BAP được sử dụng phổ biến

vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin vơi tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea [2]

- Gibberellin được tách chiết lần đầu từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Giberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Giberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hoá phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [2]

2.5 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô địa lan Tứ Thời trên thế giới và trong nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2012, nhóm tác giả Mohanty P, Paul S, Das MC, Kumaria S , Tandon P thuộc Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa thực vật học, Đại học Hill Đông Bắc, Shillong, Meghalaya 793022, Ấn Độ đã tiến hành đề tài nghiên cứu: Một

phương thức đơn giản và hiệu quả cho việc nhân giống đại trà Cymbidium mastersii:

phong lan cảnh của Đông Bắc Ấn Độ Bốn môi trường dinh dưỡng được đánh giá cho

sự nảy mầm và phát triển protocorm sớm: Murashige và Skoog (MS), 1/2 MS, Knudson 'C' (KC), và Vacin và Went (VW) Ngoài ra, ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (KN), axit axetic α-naphthalene (NAA) và axit indole-3-butyric (IBA) đã được nghiên cứu một mình và kết hợp Tỷ lệ nảy mầm hạt giống tối đa (93,58 ± 0,56) thu được trong môi trường cơ sở MS sau 8-9 tuần nuôi cấy Protocorms thứ cấp (cơ quan giống như protocorm) được phát triển từ protocorms chính trên môi trường MS củng cố với nồng độ khác nhau và

sự kết hợp của cytokinin (BAP và KN) và auxin (NAA và IBA) Số lượng protocorms thứ cấp cao nhất (20.55 ± 0.62) / protocorms chính thu được trong môi trường MS bổ sung với 5.0 µM BAP và 2.5 µM NAA Nguồn auxin hiệu quả nhất thúc đẩy sản xuất rễ (7,46 ± 0,09 mỗi lần chụp) là 10,0 µM IBA Thực vật đã được thích nghi một cách hiệu quả (tỉ lệ sống 88%) trong nhà kính sử dụng môi trường rễ của gạch và than vô trùng nghiền (1: 1v / v) và phân hữu cơ (lá xả + phân bò, 1: 1v / v) [17]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam những nghiên cứu về lan lúc đầu còn chưa rõ rệt.Chỉ sau khi người Pháp đến Việt Nam thì mới có những công trình nghiên cứu được công bố đáng kể là

F Gagnepain và A Ginillaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông

Dương trong bộ “ Thực vật Đông Dương Chí ” Ở nước ta đã biết được 879 loài thuộc

152 chi họ lan [8]

Nguồn gen hoa phong lan của Việt Nam rất phong phú trong đó lan Hoàng Thảo

chiếm 30 – 40 % trong tổng số các loài lan của Việt Nam [3]

Như vậy, họ phong lan đã trở thành đối tượng cực kỳ phong phú và đặc sắc của Việt Nam doanh thu hang tỷ đồng như Sài Gòn Orchidex công ty hoa Hoàng Lan[7]

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu chính là mẫu rễ địa lan Kiếm Tứ Thời thu thập từ rừng Cao Bằng và được lưu giữ tại vườn lan Khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Phạm vi nghiên cứu:

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật trong điều kiện nhiệt độ 25ºC ± 2, độ ẩm 60 - 65%, thời gian chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux

Đề tài tập trung xác định thành phần và nồng độ thích hợp của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh, kích thích tạo chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ mô rễ lan Kiếm Tứ thời

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời in vitro

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng nhóm

Auxin (NAA) đến khả năng phát triển mô rễ

- Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng nhóm

Auxin (NAA) kêt hợp với than hoạt tính đến khả năng phát triển mô rễ

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng nhóm

Gibberellin (GA3) đến khả năng phát triển mô rễ

3.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời

- Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng nhân nhanh mô rễ

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng nhân nhanh mô rễ

- Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA kết hợp với IBA và NAA đến

khả năng nhân nhanh rễ địa lan kiếm Tứ Thời

3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng kích thích tạo chồi từ mô rễ địa lan kiếm Tứ Thời

- Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của kinitine đến khả năng kích thích chồi

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

Sử dụng các môi trường MS, có bổ sung agar 5,5 g/l, đường 30g/l, nước dừa 150ml/l, myo-inositol 100mg/l, các chất BA, Kinetin, NAA (mg/l), IAA, IBA, GA3 có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm, PH=5,6-5,8

Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào MT nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50-70 ml/bình

Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong 15 phút

Môi trường MS lần lượt bổ sung NAA, GA3, THT

Môi trường MS lần lượt bổ sung IAA, IBA và NAA

Môi trường MS bổ sung lần lượt kinetin, BA

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tạo chồi địa lan từ rễ bằng phương pháp in vitro

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Tái sinh mô rễ

Nhân nhanh mô rễ

Tạo chồi từ mô rễ

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức được

bố trí 3 lần nhắc lại, 30 mẫu/lần nhắc lại (10 bình x 3 mẫu/bình)

3.3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến

khả năng tái sinh mô rễ địa lan Tứ Thời

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến

khả năng tái sinh mô rễ

Chồi có từ 2 - 3 lá thì được sử dụng làm vật liệu cho nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến khả năng tái sinh mô rễ Thí nghiệm được bố trí với 5 mức nồng độ NAA khác nhau từ 0,0 đến 2,0 mg/l Công thức 0 mg NAA/l được sử dụng làm công thức đối chứng

Môi trường nền gồm agar 5,5g/l, pepton 1g/l, nước dừa 150ml/l, inositol 100mg/l

Chỉ tiêu theo dõi gồm số mẫu ra rễ, số rễ trên mẫu, chiều dài và chất lượng rễ sau 20 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA kết

hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh mô rễ

Chồi có từ 2 - 3 lá thì được sử dụng làm vật liệu cho nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh mô rễ Thí nghiệm được bố trí với 5 mức than hoạt tính khác nhau từ 0,0 đến 2,0 mg/l Công thức 0 mg than hoạt tính/l được sử dụng làm công thức đối chứng Các công thwucs thí nghiệm được bố trí như sau: