Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn streptococcus pneumoniae và haemophilus influenzae gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ THẢO NHI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE GÂY BỆNH VIÊ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THẢO NHI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE

GÂY BỆNH VIÊM PHỔI Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THẢO NHI

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE

GÂY BỆNH VIÊM PHỔI Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K47 - CNSH

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Người hướng dẫn: BS CKI Nguyễn Thị Huyền

TS Nguyễn Xuân Vũ

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

i

LỜI CẢM ƠN

Qua quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, được sự đồng ý của Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em được phân công đến thực tập tại Khoa Vi

sinh - Bệnh viện TW Thái Nguyên với đề tài: “Nghiên cứu khả năng kháng kháng

sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi tại bệnh viện Trung ương Thái Nguyên”

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới BS CKI Nguyễn Thị Huyền và toàn thể anh, chị kỹ thuật viên làm việc tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực tập

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Xuân Vũ - Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập

Với điều kiện thời gian có hạn cũng như kinh nghiệm và kiến thức còn hạn chế nên đề tài của em sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận đươc

sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy/Cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức phục vụ cho việc học tập, công việc sau này

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Lê Thảo Nhi

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [ 1 ] 7

Bảng 2.2 Kháng sinh được thử nghiệm và giới hạn vòng vô khuẩn 14

Bảng 2.3 Các nghiên cứu gần đây về bệnh viêm phổi ở trẻ em tại Việt Nam 16

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm 20

Bảng 4.1.Tỉ lệ vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhân nhi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 26

Bảng 4.2 Tỉ lệ phân lập S pneumoniae và H influenzae theo mẫu bệnh phẩm 27

Bảng 4.3 Tỷ lệ phân lập đc các loại vi khuẩntheo nhóm tuổi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 27

Bảng 4.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Streptococcus pneumoniae phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 28

Bảng 4.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Haemophilus influenzae được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 30

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.2 Kháng sinh thử nghiệm chủng vi khuẩn Haemophilus influenzae 30

iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

chuẩn phòng thí nghiệm và Lâm sàng)

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu, yêu cầu của đề tài 2

1.2.1.Mục tiêu của đề tài 2

1.2.2.Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về bệnh viêm phổi 3

2.1.1 Khái niệm về bệnh viêm phổi cộng đồng 3

2.2.2 Đặc điểm sinh lí của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae tác nhân chính gây bệnh viêm phổi 3

2.2.3.Thuốc kháng sinh và cơ chế tác dụng 5

2.2.4 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn 9

2.2.5 Sử dụng thuốc kháng sinh cho trẻ em 10

2.6 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (kháng sinh đồ) của Kirby- Bauer 12

2.6.1 Nguyên lý của kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán 12

2.6.2 Trang thiết bị, sinh phẩm 12

2.6.3 Môi trường 13

2.6.4 Khoanh kháng sinh 13

2.7 Phương pháp kháng sinh đồ tự động bằng máy Vitek 2 Compact 14

vi

2.7.1 Giới thiệu chung về máy Vitek 2 Compact 14

2.7.2 Phương pháp kháng sinh đồ tự động bằng máy Vitek 2 Compact 15

2.8 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 16

2.8.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 18

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 18

3.2 Nội dung nghiên cứu 18

3.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 18

3.4 Xử lý số liệu 19

3.5 Phương pháp thí nghiệm 19

3.5.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm 19

3.5.2 Phương pháp phân lập 19

3.5.3 Các kĩ thật trong nghiên cứu 20

3.5.4 Các phương pháp định danh vi khuẩn 21

3.5 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán của Kibry-Barer 23

3.6 Kháng sinh đồ bằng hệ thống tự động máy Vitek 2 Compact 24

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả phân lập và định danh các chủng vi khuẩn gây bện của bệnh nhân nhi tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên 26

4.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh viêm phổi bệnh viện phân lập được tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 28

4.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 28

4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Haemophilus influenza được phân lập tại Bệnh viện TW Thái Nguyên 30

1

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Viêm phổi là một dạng nghiêm trọng của nhiễm trùng đường hô hấp dưới cấp

rối loạn trao đổi khí [29 ] và còn là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh

lý nhiễm khuẩn ở hầu hết các nước trên thế giới trong đó có Việt Nam [ 1]

Theo tổ chức y tế thế giới và UNICEF, năm 2015, khoảng 16% trẻ tử vong dưới 5 tuổi là do viêm phổi., ước tính mỗi năm trên thế giới có khoảng 155 triệu trẻ em dưới 5 tuổi được chẩn đoán viêm phổi, trong đó 151 triệu trường hợp thuộc các nước

nguyên nhân hàng đầu mà trẻ em đến khám và điều trị tại các bệnh viện và cũng là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở trẻ em.Theo số liệu báo cáo năm 2004 của UNICEF và WHO thì nước ta có khoảng 7,9 triệu trẻ < 5 tuổi và với tỷ lệ tử vong chung là 23‰ thì mỗi năm có khoảng 38.000 trẻ tử vong trong đó viêm phổi chiếm 12% trường hợp Như vậy mỗi năm có khoảng 4500 trẻ < 5 tuổi tử

nhất với 2 triệu trường hợp mỗi năm[ 29]

Viên phổi ở trẻ em có thể do virus, vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác Theo WHO

tác nhân thường gặp nhất là Streptococcus pneumoniae (phế cầu) tiếp đến là

Haemophilus influenzae (HI) sau đó là các loại vi khuẩn khác (Branhamella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens và Respiratoy Synticyal

(RSV) [29]

Streptococcus pneumoniae (phế cầu) và Haemophilus influenzae (HI) là nguyên

nhân hàng đầu gây viêm phổi cộng đồng ở trẻ em dưới 5 tuổi[6]

Kháng sinh đã giúp điều trị bệnh và góp phần hạ thấp tỷ lệ tử vong Tuy nhiên, trong điều trị viêm phổi có xu hướng sử dụng quá rộng rãi và phối hợp kháng sinh quá thường xuyên một cách không cần thiết.Việc chọn lựa kháng sinh hợp lý là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định kinh phí cũng như thành công của

2

quá trình điều trị Do vậy, việc hiểu biết đặc điểm và tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh viêm phổi là rất quan trọng nhằm bảo đảm điều trị kháng sinh trúng đích và cải thiện tử vong bệnh nhân

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng

kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumonia và Haemophilus

influenzae gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Bệnh viện Trung Ương

Thái Nguyên”

1.2 Mục tiêu, yêu cầu của đề tài

1.2.1.Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của vi

khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae gây bệnh viêm phổi ở

trẻ em dưới 5 tuổi tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Thu mẫu bệnh phẩm của trẻ em dưới 5 tuổi được chẩn đoán mắc bệnh viêm

phổi tại Bệnh viện viện Trung Ương Thái Nguyên

- Xác định các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus

influenzae phân lập từ mẫu bệnh phẩm

- Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus

pneumoniae và Haemophilus influenzae

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo, cho những nghiên cứu tiếp theo về

vi khuẩn gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài góp phần vào quá trình điều trị bệnh viêm phổi do vi khuẩn gây ra, cung cấp các thông tin cần thiết góp phần hỗ trợ bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp để điều trị đạt hiệu quả tối ưu cho bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới

5 tuổi

3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bệnh viêm phổi

2.1.1 Khái niệm về bệnh viêm phổi cộng đồng

Viêm phổi cộng đồng (VPCĐ) là viêm nhu mô phổi, một biểu hiện lâm sàng của nhiễm khuẩn hô hấp dưới (NKHH) NKHH dưới được xem là nhiễm khuẩn đường hô hấp xảy ra ở mốc dưới hai dây thanh âm NKHH dưới là một hội chứng bao gồm viêm phế quản, viêm phổi hoặc phối hợp cả ba bệnh này, có thể khó phân biệt trên lâm sàng [ 1 ]

2.2.2 Đặc điểm sinh lí của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenza tác nhân chính gây bệnh viêm phổi

2.2.2.1.Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

Thuật ngữ Diplococcus pneumoniae được sử dụng năm 1926 do các đặc tính của vi khuẩn xuất hiện khi nhuộm Gram mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân (cầu

khuẩn nối đôi) Năm 1928, những nghiên cứu trên vi khuẩn Pneumococcus gây

bệnh viêm phổi ở chuột đã giúp các nhà sinh học đi đến kết luận vật liệu chứa thông tin di truyền là DNA Sau đó vào năm 1974, qua nuôi cấy phân lập trên môi trường nhân tạo, các nhà khoa học đã phát hiện vi khuẩn này mọc thành chuỗi trong môi

trường lỏng và đổi tên thành Streptococcus pneumoniae (liên cầu gây viêm phổi hay

- Phế cầu không di động, không sinh nha bào, có vỏ khi trong cơ thể người

Tính chất nuôi cấy:

- Môi trường thạch máu Gentamycin là môi trường chọn lọc đối với Phế cầu khuẩn

 Tính chất sinh vật học:

- Phế cầu bị ly giải bởi mật hoặc muối mật, không mọc được trong môi trường

có ethylhydrocuprein (test optochin dương tính) Men catalase âm tính

Cấu trúc kháng nguyên:

- Kháng nguyên thân: là loại protein ít đặc hiệu và polysaccharide chung cho các loại phế cầu

- Kháng nguyên vỏ: là loại polysaccharide mang tính đặc hiệu type

Tiêu chuẩn chẩn đoán:

+ Song cầu phải hình ngọn nến, Gram (+)

+ Khuẩn lạc có đỉnh trên môi trường thạch máu Gentamycin, tan máu

+ Thử nghiệm Optochin dương tính

+ Bị ly giải bởi muối mật(thử nghiệm Neufeld dương tính)

2.2.2.2 Vi khuẩn Haemophilus influenza

Haemophilus influenzae do Richard Pleiffer phân lập lần đầu tiên từ một

bệnh nhân bị chết trong vụ dịch cúm lớn năm 1982 (nên còn gọi là trực khuẩn

Pleiffer) người ta tin rằng nó chính là căn nguyên gây ra bệnh cúm (influenzae) và đặt tên là bacterium influenzae Mãi đến năm 1933 khi phát hiện ra virus cúm

(second invader)

 Đặc điểm sinh học

Hình thể và kích thước:

5

H influenzae là trực khuẩn Gram âm,đa hình thái, xếp thành chuỗi,vi khuẩn

không sinh nha bào, có thể có vỏ và vỏ mất đi trong quá trình nuôi cấy do vi khuẩn

tự ly giải

Tính chất nuôi cấy:

H influenzae là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, khó nuôi cấy trên môi trường

dinh dưỡng thông thường hai yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường nhân tạo là:

 Yếu tố X (Heamin): Bền vững với nhiệt độ, là chất heamin trong máu yếu tố này cần thiết cho sự phát triển của một số men,yếu tố này có trong máu (trong huyết tương) và cả trong hồng cầu, trong điều kiện kỵ khí vi khuẩn không đòi hỏi yếu tố này vì nó luôn được tái tạo

 Yếu tố V(NAD = Nicotinamide- Adenine-Diniucleotide): Không bề với nhiệt là chất Nicotinamide Adenin Dinucleotide (NAD) là coenzyme của dehydrogenase, yếu tố này cũng nhiều trong máu nhưng có nhiều trong cao men

- Điều kiện nuôi cấy thích hợp Ph 7,6, khí trường 5-10%CO2, nhiệt độ 37℃

- Trên môi trường đặc (môi trường chocolate), vi khuẩn mọc tốt, sau 42 giờ

vi khuẩn phát triển tạo thành khuẩn lạc dạng S

- Trên môi trường lỏng vi khuẩn mọc chậm

- Tính chất sinh vật học: lên men đường glucose, không lên men đường lactose(thương dùng để phân loại cá type sinh học)

2.2.3.Thuốc kháng sinh và cơ chế tác dụng

2.2.3.1 Tổng quan về thuốc kháng sinh

Năm 1928, nhà khoa học Alexander Flemming người Scotland lần đầu tiên thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm penicilium thì khuẩn lạc gần nấm này sẽ không phát triển được, sau đó chất peniciline đã được chiết xuất từ nấm để dùng trong điều trị Vào năm 1941, peniciline trở thành kháng sinh đầu tiên được tìm ra và được sản xuất để dùng trong lâm sàng Khi đó, kháng sinh được coi

Kháng sinh được định nghĩa: “Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác.[1 ]

Hiện nay từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamid và quinolon.Để bảo đảm sử dụng thuốc hợp lý, cần nắm vững những kiến thức liên quan đến kháng sinh, vi khuẩn gây bệnh

và người bệnh

Kháng sinh được dùng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng hoặc điều trị dự phòng các bệnh có khả năng gây thành dịch hoặc dự phòng trong các ca phẫu thuật nhằm chống nhiễm trùng từ môi trường ngoại cảnh

Các nhóm kháng sinh được sắp xếp theo cấu trúc hoá học Theo cách phân loại này, kháng sinh được chia thành các nh óm như sau:[ 1]

2.2.3.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [1]

Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động vào 4 thành phần cấu tạo cơ bản của tế bào và phát huy tác dụng: kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn, đặc biệt có hiệu quả ở các vi khuẩn đang sinh trưởng

và phát triển mạnh bằng cách:

+ Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: các kháng sinh nhóm

beta-lactam,fosfomycin và vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên

8

không tạo được khung murein - tức là vách không được hình thành Tế bào con sinh

ra không có vách, vừa không sinh sản được vừa dễ bị tiêu diệt hoặc bị li giải, đặc biệt ở vi khuẩn Gram-dương Như vậy, những kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn nhưng chỉ với những tế bào đang phát triển (degenerative bactericide)

+ Gây rối loạn chức năng màng bào tương: chức năng đặc biệt quan trọng

của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc; khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài ào ạt vào trong, dẫn tới chết, ví

dụ polymyxin B, colistin Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối (absolute bactericide), tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ - không nhân lên

+ Ức chế sinh tổng hợp protein: tham gia sinh tổng hợp protein ngoài

ribosom còn có các ARN thông tin và các ARN vận chuyển Điểm tác động là ribosom 70S của vi khuẩn: tại tiểu phần 30S ví dụ như aminoglycosid (nơi ARN thông tin trượt qua), tetracyclin (nơi ARN vận chuyển mang acid amin tới) hoặc tại tiểu phần 50S (nơi acid amin liên kết tạo polypeptid) như erythromycin, cloramphenicol, clindamycin Kết quả là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm ngừng trệ quá trình sinh trưởng và phát triển

+ Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic gồm ba cấp độ:

- Ngăn cản sự sao chép của ADN mẹ tạo ADN con, ví dụ do kháng sinh gắn vào enzym gyrase làm ADN không mở được vòng xoắn, như nhóm quinolon

- Ngăn cản sinh tổng hợp ARN, ví dụ do gắn vào enzym ARN-polymerase như rifampicin

- Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết cho tế bào: quá trình sinh tổng hợp acid folic – coenzym cần cho quá trình tổng hợp các purin và pyrimidin (và một số acid amin) bị ngăn cản bởi sulfamid và trimethoprim

Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào.[ 1]

9

2.2.4 Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.2.4.1 Khái niệm

Kháng thuốc (AMR) là tình trạng các vi sinh vật (như vi khuẩn, vi rút, nấm

và ký sinh trùng) kháng lại các thuốc kháng sinh đã nhạy cảm với các vi sinh vật này trước đây Sinh vật đề kháng (vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng) có thể chịu được

sự tấn công của các thuốc chống vi khuẩn (như thuốc kháng sinh, thuốc kháng vi rút, thuốc chống sốt rét) dẫn đến việc áp dụng các phương pháp, thuốc điều trị đặc hiệu sẽ trở nên không hiệu quả, nhiễm khuẩn kéo dài (thậm chí gây tử vong) và có thể lây lan cho người khác AMR là hệ quả tất yếu của quá trình sử dụng thuốc trong điều trị và đặc biệt gia tăng khi việc lạm dụng thuốc kháng sinh ngày càng phổ biến hơn.[9 ]

Sử dụng kháng sinh có lợi ích to lớn trong điều trị, chăm sóc người bệnh và

cả thú y khi được kê đơn và điều trị đúng Tuy nhiên, những loại thuốc này đã được

sử dụng rộng rãi, kéo dài, lạm dụng, làm cho các vi sinh vật thích nghi với thuốc, tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn trở thành kháng thuốc, làm cho thuốc kém hiệu quả hoặc không hiệu quả Tình trạng kháng thuốc không chỉ là mối lo ngại của các bác sỹ lâm sàng trong điều trị mà còn là mối quan tâm chung của toàn xã hội đối với sức khỏe cộng đồng

2.2.4.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Kháng sinh có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn nhưng trong môi trường

có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh [19].Kháng thuốc thật gồm kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được:

Kháng thuốc tự nhiên: Là sự kháng thuốc của những vi khuẩn không nằm trong phổ tác dụng của một kháng sinh nào đó kháng thuốc tự nhiên là do đặc thù cấu trúc và sinh lý của tế bào vi khuẩn, nó tự nhiên và bền vững Ví dụ: E coli không chịu tác động của Erythromycin, tụ cầu kháng lại Colistin, trực khuẩn lao kháng lại Penicillin…

Kháng thuốc thu được: Là sự kháng thuốc của những vi khuẩn nằm trong phổ tác dụng của một kháng sinh nhưng đã trở nên kháng lại kháng sinh đó

10

2.2.4.3.Tình hình kháng thuốc trên thế giới

Trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển, vấn đề kháng thuốc đã trở nên báo động Gánh nặng về chi phí điều trị do các bệnh nhiễm khuẩn gây ra khá lớn do việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền Năm 2011, tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia Toàn cầu có khoảng 640.000 trường hợp lao đa kháng thuốc (MDR - TB), trong số đó khoảng 9% là siêu kháng thuốc[3]

2.2.4.4 Tình hình kháng thuốc tại Việt Nam

Điểm lại kết quả báo cáo tính nhạy cảm của các kháng sinh đã được tiến hành

từ năm 2003-2006 cho thấy tỉ lệ đề kháng của Klebsiella spp đối với các kháng

sinh cephalosporins thế hệ 3, thế hệ 4, fluoroquinolon và aminosid đã tăng nhanh từ

>30% trong năm 2003 lên >40% trong năm 2006; đối với Pseudomonas spp từ

>40% trong năm 2004 lên >50% trong năm 2006 và đối với Acinetobacter

spp.từ>50% trong năm 2004 lên >60% trong năm 2006 Trong khi imipenem/cilastatin, carbapenem được đưa vào thị trường Việt Nam mới gần được

10 năm, cũng đã giảm nhạy cảm đối với các trực khuẩn gram âm không sinh men

Tỷ lệ đề kháng imipenem/cilastatin của Pseudomonas spp tăng dần qua các năm

12,5% (2003), 15,5% (2005) và 18,4% (2006)[3 ]

Theo số liệu báo cáo của 15 bệnh viện trực thuộc Bộ, bệnh viện đa khoa tỉnh ở

Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh,… về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh giai đoạn 2008 - 2009 cho thấy: năm 2009, 30 - 70% vi khuẩn gram âm đã kháng với cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4, gần 40-60% kháng với

aminoglycosid và fluoroquinolon Gần 40% chủng vi khuẩn Acinetobacter giảm

nhạy cảm với imipenem.[ 20 ]

2.2.5 Sử dụng thuốc kháng sinh cho trẻ em[1]

Việc lựa chọn kháng sinh điều trị viêm phổi ở trẻ em chủ yếu dựa vào đặc điểm lâm sàng, lứa tuổi, tình trạng miễn dịch, mức độ nặng nhẹ của bệnh cũng như

11

tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp để có quyết định thích hợp.[1 ]

 Theo tuổi và nguyên nhân:

- Đối với trẻ sơ sinh và < 2 tháng tuổi: Nguyên nhân thường gặp là liên cầu

B, tụ cầu, vi khuẩn Gram-âm, phế cầu (S pneumoniae) và H influenzae

- Trẻ từ 2 tháng đến 5 tuổi nguyên nhân hay gặp là phế cầu (S pneumoniae)

và H influenzae

- Trẻ trên 5 tuổi ngoài S pneumoniae và H influenzae còn có thêm Mycoplasma

pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila

 Theo tình trạng miễn dịch:

-Trẻ bị suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay mắc phải đặc biệt là trẻ bị HIV -

AIDS thường bị viêm phổi do ký sinh trùng như Pneumocystis carini., Toxoplasma,

do nấm như Candida spp, Cryptococcus spp, hoặc do virus như Cytomegalo virus, Herpes simplex hoặc do vi khuẩn như S aureus, các vi khuẩn Gram âm và

Legionella spp

 Theo mức độ nặng nhẹ của bệnh:

Các trường hợp viêm phổi nặng và rất nặng (suy hô hấp, sốc, tím tái, bỏ bú, không uống được, ngủ li bì khó đánh thức, co giật, hôn mê hoặc tình trạng suy dinh dưỡng nặng thường là do các vi khuẩn Gram-âm hoặc tụ cầu nhiều hơn là do phế

cầu và H influenzae

 Theo mức độ kháng thuốc:

Mức độ kháng kháng sinh tùy theo từng địa phương, từng vùng (thành thị có

tỷ lệ kháng kháng sinh cao hơn ở nông thôn, ở bệnh viện tỷ lệ kháng thuốc cao hơn

ở cộng đồng, ở nơi lạm dụng sử dụng kháng sinh có tỷ lệ kháng thuốc cao hơn nơi

sử dụng kháng sinh an toàn và hợp lý )

Ở Việt Nam từ những năm 1989 được sự tài trợ của tổ chức SIDA - Thụy Điển, chương trình ASTS đã thống nhất về kỹ thuật kháng sinh đồ trong toàn quốc

là kỹ thuật của Kirby - Bauer cải tiến: Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch Đây là phương pháp đơn giản và có thể tiến hành ở các phòng thí nghiệm hàng ngày không cần nhiều trang thiết bị và máy móc hiện đại, dựa vào vùng ức chế tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh để xác định vùng nhạy cảm của kháng sinh đó đối với chủng vi khuẩn gây bệnh [ 2 ]

2.6.1 Nguyên lý của kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán[2]

Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm được đánh giá dựa vào vùng ức chế tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh Khi đặt khoanh giấy kháng sinh trên bề mặt thạch, kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch; càng xa khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng giảm Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi kháng sinh đạt đến một nồng độ nhất định Dựa vào đường kính vùng ức chế và điểm gãy trong tài liệu hướng dẫn phiên giải kết quả kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm có thể phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I (intermediate-trung gian), R (resistant - đề kháng) hoặc NS (non-susceptible

- không nhạy cảm).[2]

2.6.2 Trang thiết bị, sinh phẩm

- Tủ ấm

- Máy trộn, lắc

13

- Đĩa thạch Mueller-Hinton

- Khoanh giấy kháng sinh

- Độ đục chuẩn McFarland 0,5

- Nước muối 0,9% vô trùng

- Tăm bông (que gòn) vô trùng

- Đèn cồn, que cấy, panh, ống nghiệm

2.6.3 Môi trường

- Môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ cho các vi khuẩn hiếu khí

dễ nuôi cấy là môi trường thạch đĩa Muller-Hinton có độ dày 4± 0,5 mm

- Môi trường có ảnh hưởng đến đường kính vùng ức chế do môi trường có ảnh hưởng lên khả năng phát triển của vi khuẩn, khả năng khuếch tán của kháng sinh và hoạt tính của kháng sinh Do vậy, việc sử dụng môi trường thích hợp cho từng phương pháp làm kháng sinh đồ là rất cần thiết

2.6.4 Khoanh kháng sinh

Bảo quản: Khoanh kháng sinh được bảo quản ở nhiệt độ -20℃ nếu muốn bảo quản trong thời gian dài Bảo quản 2-8 ℃ với khoanh kháng sinh đang sử dụng hoặc được sử dụng rất sớm khoanh giấy được đặt trở lại ngay sau khi sử dụng Nguyên nhân khoanh kháng sinh bị ẩm gây phá hủy kháng sinh đồ là sự ngưng tụ của không khí trong phòng thí nghiệm ấm vào khoanh kháng sinh lấy ra từ tủ lạnh [7]

Hướng dẫn lựa chọn khoanh kháng sinh theo CLSI (2018): Quá trình cân nhắc đánh giá cho từng nhóm kháng sinh để thử nghiệm dựa trên hiệu quả lâm sàng, tình trạng kháng kháng sinh, giảm thiểu nguy cơ kháng kháng sinh, giá thành, tăng hiệu quả chữa trị Thử nghiệm đối với các loại thuốc kháng sinh chọn lọc có thể sử dụng cho mục đích chống nhiễm khuẩn

14

Bảng 2.2 Kháng sinh được thử nghiệm và giới hạn vòng vô khuẩn [ 1]

2.7 Phương pháp kháng sinh đồ tự động bằng máy Vitek 2 Compact

2.7.1 Giới thiệu chung về máy Vitek 2 Compact

Máy định danh và làm kháng sinh đồ tự động Vitek 2 Compact là cấu hình cải tiến của hệ thống Vitek 2 theo xu hướng đơn giản, gọn nhẹ, ít chiếm nhiều diện

15

tích, phù hợp cho các phòng xét nghiệm vừa và nhỏ Vitek 2 Compact có thể làm định danh và kháng sinh đồ đồng thời 60 test, với giao diện trực quan, dễ sử dụng

và an toàn Có trên 8000 máy Vitek đã được sử dụng trên nhiều quốc gia cũng như

ở Việt Nam Vitek2 Compact được tích hợp cơ sở dữ liệu khổng lồ sau nhiều năm nghiên cứu của bioMerieux về vi sinh Các phòng thí nghiệm của bioMerieux liên tục nghiên cứu thêm và cập nhật những loại chủng vi khuẩn mới cũng như những

tính chất sinh vật hóa học của chúng vào cơ sở dữ liệu của hệ thống Vitek

khuẩn để hỗ trợ cho việc xét nghiệm và công tác nghiên cứu đạt hiệu quả nhất

nhất về phần cứng, phần mềm mà còn kế thừa hơn 40 năm kinh nghiệm của bioMerieux trong lĩnh vực định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ

2.7.2 Phương pháp kháng sinh đồ tự động bằng máy Vitek 2 Compact

2.7.2.1.Nguyên lý kháng sinh đồ bằng hệ thống tự động

Nguyên lý hoạt động: Nguyên lý định danh vi sinh vật và phân tích độ nhạy

cảm kháng sinh bằng cách theo dõi liên tục sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng của thẻ (card) Phương pháp được thực hiện theo nguyên lý sự suy giảm cường độ sáng,hệ thống quang học sử dụng ánh sang nhìn thấy để theo dõi trực tiếp

sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sang bị chặn lại(hay sự suy giảm cường độ ánh sang) khi ánh sáng đi qua giếng hệ thống sử dụng các bước song 660nm, 568nm,428nm

Nguyên lý xét nghiệm:

Định danh vi sinh vật: dùng phương pháp đo mầu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi mầu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ

Kháng sinh đồ: dựa trên giá trị MIC (nồng độ ực chế tối thiểu)

16

2.8 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Tại Việt Nam nhiều nhóm tác giả đã tiến hành nghiên cứu về nhằm xác định căn nguyên chủ yếu gây bệnh ở trẻ em kết quả đều thống nhất với tài liệu báo cáo của

UNICEF và WHO về tác nhân chính gây bệnh viêm phổi ở trẻ em là S pneumoniae

và H influenza

Kết quả nghiên cứu cho thấy mặc dù nhóm tác nhân gây viêm phổi không thay đổi theo thời gian nhưng tình hình đề kháng của các nhân này đã tăng mạnh do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn đến các loại kháng sinh thông thường

Bệnh phẩm

Số kết quả dương tính

Vi sinh vật xác định được

Tại khoa

Hô Hấp

BV Nhi Thanh Hóa

01/01/2012 đến 30/08/2012

H infuenzae M.catarrhalis

11 trung tâm tham gia

Máu, dịch não tủy, đàm

mủ xoang, dịch tỵ hầu

Khoa Nhi

BV Bạch Mai

hầu dịch 340

S.pneumoniae

H influenza M.catarrhali

Khoa Nội Tổng Hợp

BV Nhi Đông Cần Thơ

Tháng 5/2012-10/2013

Dịch tỵ hầu, dịch rửa phế quản

1876 S.pneumoniae

H influenzae

17

2.8.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Viêm phổi là bệnh rất phổ biến ở trẻ < 5 tuổi Theo Rudan and et al (2008),

có hơn 150 triệu trẻ < 5 tuổi trên toàn thế giới mắc viêm phổi mỗi năm, trong đó, ở các nước đang phát triển chiếm 97,0% mà chủ yếu là Châu Phi và Đông Nam Á (Igor Rudan and Tomaskovic L., 2004; Igor Rudan and et al., 2008).Theo Hội nghị Washington năm 1991, số lần mắc viêm phổi hàng năm trong 100 trẻ ở Gadchiroli (Ấn Độ) là 13, ở Băngkok (Thái Lan) là 7, ở Maragua (Kenia) là 18, ở Basse (Gambia)

là 17, trong khi đó ở Chapel Hill (Mỹ) tỷ lệ này là 3,6 và ở Seatle (Mỹ) 3 (Nguyễn Thị Ngọc Hoa, 2014).[ 3]

Số liệu nghiên cứu giám sát ANSORP từ tháng 1/2000 đến tháng 6/2001 của

14 trung tâm từ 11 nước Đông Nam Á cho thấy tỷ lệ kháng cao của vi khuẩn

S.pneumoniae Trong số 685 chủng vi khuẩn S pneumoniae phân lập được từ người

bệnh, có 483 (52,4%) chủng không còn nhạy cảm với penicillin, 23% ở mức trung gian và 29,4% đã kháng với penicillin (MIC ≥ 2mg/l) Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất (71,4%) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) và Đài Loan (38,6%) Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam là 92,1%, Đài Loan là 86%, Hàn Quốc là 80,6%, Hồng Kông là 76,8% và Trung Quốc là 73,9% Số liệu từ nghiên cứu giám sát đa trung tâm đã

chứng minh rõ ràng về tốc độ và tỷ lệ kháng của S pneumoniae tại nhiều nước châu

Á, những nơi có tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất thế giới [3]

18

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, phạm vi và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae

gây bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5tuổi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ 01/01/2019 đến 30/4/2019

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

- Dụng cụ: Đĩa peptri, que cấy, đèn cồn, lamen, lam kính…

- Thiết bị: Tủ ấm 35℃và 37℃, Tủ lạnh 2-8℃, tủ đông -20℃, máy ly tâm, tủ

an toàn sinh học, cân phân tích, kính hiển vi

- Hóa chất: Khoanh kháng sinh, Brilliance Uti agar, Columbia agar, Kligler iron agar, MacConkey agar,Mueller hinton agar,Manitol salt agar, Tím tinh thể, Natri Clorid 0,9%, Lugol, Fucshin

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm viêm phổi trẻ em dưới 5 tuổi tại Bệnh viện TW Thái Nguyên

Nội dung 2: Phân lập, tuyển chọn và xác định vi khuẩn là Streptococcus

pneumoniae và Haemophilus influenzae

Nội dung 3: Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus

pneumoniae và Haemophilus influenzae

3.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật nuôi cấy phân lập

- Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kirby-Bauer

- Diễn giải kết quả kháng sinh đồ theo hướng dẫn tài liệu CLSI năm 2018 để xác định mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc đề kháng (R)

3.5.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm

-Tùy vào vị trí tổn thương, mẫu bệnh phẩm được lấy ở vị trí đường hô hấp trên hoặc đường hô hấp dưới:

- Bệnh phẩm đường hô hấp trên: dịch mũi, dịch hầu họng, dịch rửa mũi, dịch

- Sử dụng ống tăm bông chuyên dụng

- Lấy dịch tỵ hầu ở đường hô hấp trên

- Ghi nhãn lên ống đựng bệnh phẩm

• Lấy đờm dãi:

- Bệnh phẩm là mẫu đờm được lấy bằng cách vỗ lưng và hướng dẫn bệnh nhân khạc đờm, có hoặc hổ trợ bằng cách cho bệnh nhân xông khí dung với NaCl 0,9% trước khạc đờm hay soi phế quản và cấy dịch rửa phế quản (BAL)

-Bệnh phẩm được đựng ở lọ nhựa trong ghi rõ thông tin

3.5.2 Phương pháp phân lập

- Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy được thực hiện nuôi cấy ngay, nếu chưa nuôi cấy được luôn phải bảo quản trong tủ -4℃ Mẫu bệnh phẩm được cấy ria lên môi trường dinh dưỡng thích hợp