PHƯƠNG PHÁP PHỔ đạo hàm và ỨNG DỤNG TRONG xác ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMOXICILLIN và CLOXACILLIN TRONG THUỐC KHÁNG SINH

Trong số các kỹ thuật này, phương pháp phổ đạo hàm và đạo hàm tỷ đối được biết đến với ưu điểm nổi bật, cho phép định lượng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiết hoặ

LỜI MỞ ĐẦU

Kháng sinh được sử dụng rất nhiều ở Việt Nam do mô hình bệnh tật của nước ta chủ yếu là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm kí sinh trùng và nhiễm nấm Amoxicillin và Cloxacillin là 2 kháng sinh thuộc nhóm Penicillin được sử dụng phổ biến hiện nay1 Để nâng cao hiểu quả điều trị cũng như tạo điều kiện sử dụng thuốc thuận tiện, sự kết hợp Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri trong cùng một chế phẩm đã và đang được chỉ định cho các bệnh nhiễm đường hô hấp, sinh dục tiết niệu, da và mô mềm, điều trị cấp cứu các nhiễm khuẩn có nguy cơ cao Việc định lượng Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang được tiến hành chủ yếu bằng phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao Đây là kỹ thuật phân tích hiện đại, có khả năng định tính và định lượng đồng thời các chất trong hỗn hợp với tính chọn lọc, độ nhạy, độ đúng và độ lặp cao Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi chi phí tốn kém (trang thiết bị, dung môi hóa chất) và thời gian phân tích kéo dài

Ngày nay, nhờ sự hỗ trợ của công nghệ thông tin, các kỹ thuật quang phổ được ứng dụng nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc Trong số các kỹ thuật này, phương pháp phổ đạo hàm và đạo hàm tỷ đối được biết đến với ưu điểm nổi bật, cho phép định lượng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiết hoặc tinh chế đối với hỗn hợp đa thành phần, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí

1

MỤC LỤC

1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM VÀ PHỔ ĐẠO HÀM TỶ ĐỐI 2

1.1.1 Phương pháp phổ đạo hàm.2 2

1.1.1.1 Sự ra đời của phương pháp phổ đạo hàm 2

1.1.1.2 Khái niệm phổ đạo hàm 2

1.1.1.3 Các phương pháp tính toán2 2

1.1.1.4 Ứng dụng của phổ đạo hàm trong phân tích định tính 2

1.1.1.5 Ứng dụng của phổ đạo hàm trong phân tích định lượng.4 2

1.1.1.6 Quy trình định lượng các chất bằng phương pháp quang phổ đạo hàm 2

1.1.1.7 Ưu điểm, nhược điểm phổ đạo hàm.4-5 2

1.1.1.8 Ứng dụng của phổ đạo hàm 2

1.1.2 Phổ đạo hàm tỷ đối.5, 7 2

1.1.2.1 Đạo hàm tỷ đối giao nhau tại điểm không (zero-crossing ratio spectra derivative spectrophotometry) 2

1.1.2.2 Đạo hàm tỷ đối số chia kép (Double divisor ratio spectra derivative spectrophotometry)8 2

1.1.2.3 Đạo hàm phổ tỷ đối số chia liên tiếp (Successive ratio spectra derivative spectrophotomerty)9 2

1.1.2.4 Ưu điểm và nhược điểm.7 2

1.1.3 So sánh 2 phương pháp 2

1.1.3.1 Giống: 2

1.1.3.2 Khác nhau: 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH 2

1.2.1 Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri 2

1.2.2 Một số đặc điểm dược động học của Amoxicillin và Cloxacillin1, 11 2

2

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2

1.3.1 Một số phương pháp định lượng đơn AMO hoặc CLO trong chế phẩm10 2

1.3.1.1 Định lượng AMO 2

1.3.1.2 Định lượng CLO 2

1.3.2 Kết luận về các phương pháp phân tích tham khảo 2

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU12 2

2.1 Đối tượng nghiên cứu 2

2.2 Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2

2.2.1 Thiết bị 2

2.2.2 Hóa chất 2

2.3 Phương pháp phân tích 2

2.3.1 Các phương pháp phổ13 2

2.3.2 Phương pháp HPLC: 14 2

2.4 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời AMO và CLO 2

2.4.1 Các phương pháp phổ 2

2.4.1.1 Quy trình xử lý mẫu 2

2.4.1.2 Phương pháp phổ đạo hàm 2

2.4.1.3 Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối 2

2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng 2

2.4.2.1 Điều kiện sắc kí 2

2.4.2.2 Đánh giá và áp dụng phương pháp 2

3 CHƯƠNG 3 TỔNG KẾT 2 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AMO: amoxicillin

CLO: cloxacillin

PĐH: phổ đạo hàm

PĐHTĐ: phổ đạo hàm tỷ đối HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao

3

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình dạng phổ hấp thu và phổ đạo hàm các bậc.3 2

Hình 2: Các phương pháp tính toán: peak-peak (a); tiếp tuyến-đỉnh (b); peak-zero (c); zero-crossing (d) 2

Hình 3: Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thu và phổ đạo hàm bậc 1.3 2

Hình 4: Sự phân bệt đối xử với các peak rộng.3 2

Hình 5: Ứng dụng phổ đạo hàm trong các lĩnh vực khác nhau.6 2

Hình 6: (a) Phổ hấp thu của dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1(1); dung dịch CLO 100.0 µg.mL-1(2); hỗn hợp dung dịch AMO 100.0 µg.mL-1, CLO 100.0 µg.mL-1 (3) và phổ tổng cộng (4) của (1) và (2); (b) Phóng to phổ của hình (a) 2

Hình 7: Phổ đạo hàm bậc nhất của AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) và CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) 2

Hình 8: Phổ đạo hàm bậc hai của AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) và CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) 2

Hình 9: Phổ đạo hàm tỷ đối của dung dịch hỗn hợp CLO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) và AMO (100.0 µg.mL-1) và đơn CLO (100.0 µg.mL-1) với số chia AMO 60.0 µg.mL-1 .2 Hình 10 Phổ đạo hàm tỷ đối của dung dịch hỗn hợp AMO (60.0 – 140.0 µg.mL-1) và CLO (100.0 µg.mL-1) và đơn AMO (100.0 µg.mL-1) với số chia CLO 60.0 µg.mL-1 2

Hình 11: Sắc kí đồ tách 2 chất AMO 100.0 µg.mL-1 và CLO 100.0 µg.mL-1 2

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri10 2

Bảng 2: Hiệu chuẩn của AMO và CLO bằng cách sử dụng phương pháp quang phổ HPLC và UV 2

Bảng 3: Kết quả khảo nghiệm để xác định AMO và CLO trong viên nang FACLACIN 2 và so sánh với HPLC 2

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Sơ đồ xử lý mẫu để tiến hành phương pháp quang phổ 2

Sơ đồ 2: Sơ đồ pha dung dịch chuẩn 2

4

1.1.1 Phương pháp phổ đạo hàm 2

1.1.1.1 Sự ra đời của phương pháp phổ đạo hàm.

Phép đo quang phổ UV-Vis là một trong những phương pháp lâu đời nhất trong những phương pháp quang phổ phân tử Với độ nhạy khá cao nên bằng phương pháp này

ta có thể xác định hàm lượng vết cỡ mg.L-1 (ppm) của nhiều nguyên tố Ngoài ra còn có thể xác định đồng thời nhiều nguyên tố khi chúng cùng có mặt mà không mất nhiều thời gian để tách Để xác định các nguyên tố có hàm lượng dưới ppm người ta thường dùng biện pháp làm giàu các sản phẩm nghiên cứu như: phương pháp chiết lỏng lỏng, phương pháp điện kết tủa cộng kết khi có mặt của các chất chiết góp… trước khi đo độ hấp thu hoặc sử dụng phương pháp động học trắc quang Tuy nhiên phương pháp trên vẫn còn những hạn chế và nhược điểm nhất là trong trường hợp phân tích hỗn hợp các chất mà phổ hấp thu của chúng chồng phủ lên nhau Để khắc phục nhược điểm đó, các nhà khoa học đã có ý tưởng chuyển đổi phổ hấp thu sang phổ đạo hàm nhằm tìm ra một hướng nghiên cứu mới Những phần mềm chuyên dụng trên các máy tính điện tử được kết nối với máy quang phổ đã cho phép chuyển phổ hấp thu (hay phổ bậc 0) thành phổ đạo hàm bậc 1, bậc 2, bậc cao hơn

1.1.1.2 Khái niệm phổ đạo hàm.

Nếu diễn tả độ hấp thu (A) là một hàm theo bước sóng (λ) thì trong phương pháp phổ đạo hàm, độ hấp thu (A) được lấy vi phân theo bước sóng (λ) để tạo ra phổ đạo hàm bậc 1, bậc 2, bậc cao hơn

PĐH bậc 2, có một cực tiểu chính tại λmax của phổ hấp thu, ngoài ra có 2 cực đại phụ ở 2 phía của cực tiểu chính

PĐH bậc 3 ngoài cực tiểu và cực đại tại điểm uốn của phổ hấp thu còn có 1 cực tiểu và 1 cực đại phụ nằm ở 2 phía của cự tiểu và cực đại chính

PĐH bậc 4 lại có 1 cực đại chính trùng với λmax của phổ hấp thu ngoài ra còn có 2 cực đại phụ và 2 cực tiểu phụ

Như vậy chỉ từ 1 cực trị của phổ hấp thu ta có số cực trị của PĐH của 1 chất sẽ bằng số bậc PĐH cộng 1.

 Phương pháp peak-zero: Khoảng cách zn tỉ lệ với nồng độ chất phân tích(Hình 2c)

 Phương pháp zero-crossing: Xác định nồng độ chất này tại điểm qua 0 của phổ đạo hàm chất khác (Hình 2d)

Hình 2: Các phương pháp tính toán: peak-peak (a); tiếp tuyến-đỉnh (b); peak-zero (c); zero-crossing (d)

1.1.1.4 Ứng dụng của phổ đạo hàm trong phân tích định tính.

Phổ đạo hàm phức tạp hơn phổ hấp thu do phổ đạo hàm có số cực trị tăng lên Do

đó xét về mặt định tính phổ đạo hàm có tính đặc trưng hơn phổ hấp thu Những phổ hấp thu rất giống nhau nhưng khi lấy phổ đạo hàm thì có thể xuất hiện sự khác biệt lớn

1.1.1.5 Ứng dụng của phổ đạo hàm trong phân tích định lượng 4

Theo định luật Lambert-Beer: độ hấp thu (A) tỉ lệ thuận bề dày lớp dung dịch ánh sáng đi qua (l), với nồng độ chất tan trong dung dịch (C) và với hệ số hấp thu phân tử (ɛ)

 ɛ là hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1.cm-1; L.mg-1.cm-1)

 l là bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua (cm).Mặt khác bề dày lớp dung dịch (l) không đổi và tại bước sóng xác định thì đạo hàm của ɛ là hằng số Do đó từ phương trình (3) - (3c) ta thấy giá trị đạo hàm của độ hấp thu

A chỉ còn phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của chất tan trong dung dịch

Ngoài ra vì phổ đạo hàm là kết quả của chuyển đổi từ phổ hấp thu cho nên giá trị của phổ đạo hàm tại mỗi bước sóng cũng có tính cộng giống như phổ hấp thu khi ta đo phổ của hỗn hợp nhiều chất

Bước 3: Sau khi xác định được bước sóng đo ở một bậc đạo hàm nhất định, tiến hành định lượng các chất theo phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn

1.1.1.7 Ưu điểm, nhược điểm phổ đạo hàm 4-5

Ưu điểm

- Phân tích được các chất có phổ hấp thu chồng chập lên nhau và có cực đại hấp thucách nhau chỉ vài nm.

- Đơn giản trong phép tính toán

- Xử lý mẫu không phức tạp, ít tốn kém hơn các phương pháp khác (GC, HPLC)

Do không cần qua khâu chiết tách khi xử lý mẫu nên phổ đạo hàm được sử dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc khi phân tích trong dạng bào chế định lượng cáchoạt chất chứa 2 hoặc 3 thành phần hoặc dạng bào chế chứa 1 thành phần nhưng

có mặt chất bảo quản hoặc tá dược là thành phần có ảnh hưởng rất lớn đến việc định lượng

- Tính kinh tế cao do chi phí cho thiết bị ít tốn kém hơn GC, HPLC

- Loại bỏ được hiện tượng trôi nền gây bởi sự không ổn định của trang thiết bị hoặc thao tác và giảm ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng khi các tiểu phân nhỏ xuất hiện trong mẫu, qua đó cải thiện độ chính xác của phép định lượng (Hình 3)

Hình 3: Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thu và phổ đạo hàm bậc 1 3

Nhược điểm

- Phương pháp này phụ thuộc máy móc vì cần có phần mềm chuyên dụng để

chuyển từ phổ hấp thu sang phổ đạo hàm

- Khi tăng bậc đạo hàm, độ nhọn của các dải

phổ tăng lên tuy nhiên tín hiệu đạo hàm

giảm và độ rộng của các dải phổ thu hẹp

lại Đáng chú ý, khi tăng n tỷ số tín hiệu –

nhiễu (signal to noise ratio) lại giảm đặc

biệt với các peak tù Chính vì vậy, để ứng

dụng quang phổ đạo hàm trong phân tích,

phải cân nhắc giữa thuận lợi và khó khăn

để lựa chọn được bậc đạo hàm thích hợp

Hình 4: Sự phân bệt đối xử với các peak rộng 3

Xét hỗn hợp gồm 3 chất X, Y, Z với giá trị độ hấp thu của hỗn hợp:

A = αCx + βCy + γCz (5)Trong đó:

A là độ hấp thu của hỗn hợp

Cx, Cy, Cz là nồng độ các chất X, Y, Z

α, β, γ là hệ số hấp thu của các chất X, Y, Z

Độ hấp thu của chất chuẩn X với nồng độ là A0,X = α (6)

Phương trình (5) chia phương trình (6), ta được:

= + + (7)

Mà =k (const) (8)  = + + (9)Đạo hàm bậc 1 phương trình (7) ta được:

= + (10)Dựa vào phổ đạo hàm thu được, ta chon bước sóng λy mà tại đó = 0

(10) => =

Tại λy ta thu được giá trị đạo hàm của chất Z với X là chất chia mà tại đó phổ tỷ đối của chất Y với X bằng 0 Lập đường chuẩn của giá trị đạo hàm theo nồng độ của dung dịch chuẩn Z, dựa vào đường chuẩn, ta xác định được nồng độ chất Z

Tương tự dựa theo đường chuẩn giá trị đạo hàm theo nồng độ (với X là chất chia) tại bước sóng mà tại đó phổ tỷ đối của Z bằng 0, ta xác định được nồng

Tại một vùng bước sóng hay một số bước sóng nhất định, số hạng thứ nhất không đổi, khi lấy đạo hàm:

=

Khi phương trình trờ thành: =

Phương trình cho thấy tín hiệu không còn phụ thuộc vào nồng độ của X, Y trong mẫu thử, chọn bước sóng mà tại đó phổ đạo hàm cực đại hoặc cực tiểu để định lượng Z, tính tương tự cho X, Y

1.1.2.3 Đạo hàm phổ tỷ đối số chia liên tiếp (Successive ratio spectra derivative spectrophotomerty) 9

Trong phương pháp này, số chia là độ hấp thu của chất chuẩn Z

Trong phương trình, đạo hàm tỷ đối số chia liên tiếp tỉ lệ với nồng độ của

X, không phụ thuộc nồng độ 2 chất còn lại Do đó phương pháp có thể định lượng

Nhược điểm:

Phương pháp phổ đạo hàm tỷ đối áp dụng không thuận lợi trong trường hợp có sự chênh lệch lớn về nồng độ các chất trong hỗn hợp, dẫn đến sự chệnh lệch lớn về tín hiệu đạo hàm.

1.2.1 Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri

Bảng 1: Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri 10

O O

CH3

CH 3

HO

COOH H

H H

NH2H

COONa H

H 3 C

H

.H2O Cl

((6R)-6-3-(2-clorophenyl)-5-Tính

chất

vật lý

Bột kết tinh màu trắng dạng tinh thể,

vị đắng Khó tan trong nước, alcol;

không tan trong ether, chloroform,

dầu; tan tốt trong các dung dịch acid

hoặc hydroxyde kiềm loãng

pH (nước) = 3.5 ÷ 5.5

Bột kết tinh màu trắng, hoặc gần trắng, có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm Dễ tan trong nước, methanol Tan trong ethanol 96% Không tan trong ethylacetate

pH (nước) = 5.0 ÷ 7.0

1.2.2 Một số đặc điểm dược động học của Amoxicillin và Cloxacillin 1, 11

Amoxicillin là một kháng sinh beta-lactam phổ trung bình được sử dụng để điềutrị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương nhạy cảm với penicillin cũng như một

số vi khuẩn Gram âm Amoxicillin có khả năng kháng acid dạ dày Nó được hấp thu nhanh hơn và hấp thu hoàn toàn hơn các kháng sinh beta-lactam khác khi dùng đường uống Sau khi uống liều 250 mg amoxicillin 1 – 2 giờ, nồng độ amoxicillin trong máu đạtkhoảng 4 - 5 µg.mL-1, khi uống 500 mg, nồng độ amoxicillin đạt khoảng 8 – 10 µg.mL-1 Tăng liều gấp đôi có thể làm nồng độ thuốc trong máu tăng gấp đôi Khoảng 60% liều uống amoxicillin thải nguyên dạng qua nước tiểu trong vòng 6 - 8 giờ Amoxicillin có nồng độ cao trong dịch mật và một phần thải qua phân

Cloxacillin là một penicillin bán tổng hợp dùng ở dạng muối natri để điều trị nhiễm khuẩn tụ cầu do các vi sinh vật penicillinase dương tính Không giống amoxicillin,thuốc kháng sinh này được hấp thu không đầy đủ từ đường tiêu hóa, và sự hấp thu bị giảm đi bởi sự có mặt của thực phẩm trong dạ dày Cloxacillin chuyển hóa ở mức độ hạn chế Thuốc chưa biến đổi và các chất chuyển hóa được bài tiết trong nước tiểu bằng cách lọc qua cầu thận và bài tiết ở ống thận Khoảng 35% liều uống đào thải qua nước tiểu

Tuy thành phần chưa biến đổi sẽ được thải ra ngoài nhưng nếu dùng không đúngliều: dùng không đủ liều không chỉ không trị dứt bệnh của cá nhân mà có khi gây hại chocộng đồng do hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn; và dùng quá liều sẽ gây hại cho chính người dùng thuốc, thậm chí có thể tử vong Vì vậy cần kiểm soát hàm lượng thành phần chặt chẽ trong thuốc

1.3.1 Một số phương pháp định lượng đơn AMO hoặc CLO trong chế phẩm 10

1.3.1.1 Định lượng AMO

Phương pháp HPLC

AMO được tách ra khỏi nền mẫu nhờ tương tác giữa pha tĩnh và pha động ở cột C18 sau đó đưa đến đầu dò UV và cho tín hiệu định lượng là diện tích peak hoặc chiều cao peak chọn bước sóng 254 nm Thành phần pha động được sử dụng gồm có MeOH:

Phép đo iod sau phản ứng (định lượng viên nang, viên nén amoxicillin)

Thủy phân AMO trong môi trường kiểm Sản phẩm phân hủy của AMO được phản ứng với iod Định lượng iod dư bằng Na2S2O3 0.01N với chỉ thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lượng Tiến hành song song với mẫu trắng Kết quả tính theo phương pháp thừa trừ

Phương pháp đo quang phổ tử ngoại

Dựa vào định luật Lambert-beer, độ hấp thu tỉ lệ nồng độ chất phân tích Định lượng trực tiếp AMO, sau khi được pha loãng trong dung môi, được đo ở bước sóng 325nm Tiến hành song song với mẫu chuẩn

1.3.1.2 Định lượng CLO

Phương pháp HPLC.

CLO được tách ra khỏi nền mẫu nhờ tương tác giữa pha tĩnh và pha động ởcột pha đảo cột C18 sau đó đưa đến đầu dò UV và cho tín hiệu định lượng là diện tích peak hoặc chiều cao peak, chọn bước sóng 225 nm Thành phần pha động được sử dụng gồm có acetonitrile : dd KH2PO4 0.05 M pH 5.0 (1:96), acetonitrile :

dd KH2PO4 0.02M pH 6.8 (20:80); hoặc acetonitrile : dd KH2PO4 2.7 µg.mL-1, pH 5.0 (25:75)