Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng haemophilus influenzae type b virus viêm gan b trong vắcxin 5 thành phần (DTwP hib hepb) trên động vật thí nghiệm

Một trong những nội dung trong nghiên cứu và phát triển vắc xin 5 thành phần tên thương mại là IVACPENTA tại IVAC, đánh giá tính sinh miễn dịch của 2 kháng nguyên Haemophilus influenzae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

Mã số sinh viên: 57131167

Khánh Hòa, tháng 7/2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khánh Hòa, tháng 7/2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu và thực hiện của cá nhân tôi với sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Văn Duy và ThS Nguyễn Sỹ Tuấn trên cơ

sở các lý thuyết đã học và thí nghiệm thực tế tại Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Các

số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đồ án tham khảo tư liệu và sử dụng thông tin được đăng tải trong danh mục tài liệu tham khảo

Sinh viên thực hiện

Võ Nguyễn Phương Linh

Ban Giám đốc Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế đã cho phép và tạo mọi điều kiện tốt nhất để giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

PGS TS Nguyễn Văn Duy, giảng viên Viện Công nghệ sinh học và Môi

trường, đã truyền đạt kiến thức, trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

ThS Nguyễn Sỹ Tuấn, người đã hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, định hướng và

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

CN Trần Ngọc Nhơn, Dược sĩ Trần Ngọc Liên cùng các anh chị Phòng Kiểm định và Phòng Chăn nuôi động vật thí nghiệm đã giúp đỡ, động viên, góp ý và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè lời cảm ơn sâu sắc vì đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn và chúc mọi người luôn vui vẻ, hạnh phúc!

Nha Trang, tháng 6 năm 2019

Sinh viên thực hiện

Võ Nguyễn Phương Linh

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Vắc xin phối hợp 5 thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B, viêm phổi/màng não do HiB (Vắc xin DTwP-HepB-HiB) được Liên minh toàn cầu về Vắc xin và Tiêm chủng (GAVI) hỗ trợ cho Việt Nam để sử dụng trong Chương trình Tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) miễn phí trong cho trẻ dưới 1 tuổi từ tháng 06/2010 đến nay Tuy nhiên lượng vắc xin 5 trong 1 do GAVI tài trợ từ năm 2015 sẽ giảm dần đến ngưng hoàn toàn vào năm 2020 và Việt Nam phải tự đảm bảo nguồn vắc xin thay thế Trước tình hình đó tháng 02/2019, Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) chính thức được Bộ Y tế giao nhiệm vụ phát triển vắc xin 5 thành phần để chủ động nguồn vắc xin nội lực thay thế vắc xin nhập ngoại hiện nay đã trở nên cần thiết, cấp bách Một trong những nội dung trong nghiên cứu và phát triển vắc xin 5 thành phần (tên thương mại là IVACPENTA) tại IVAC, đánh giá tính sinh miễn dịch của 2 kháng

nguyên Haemophilus influenzae (HiB) và viêm gan B (HepB) của vắc xin

IVACPENTA trên động vật thí nghiệm là yêu cầu bắt buộc đầu tiên để xác định tính tương thích của chúng khi phối hợp với các kháng nguyên giải độc tố bạch hầu (D), giải độc tố uốn ván (T) và nước cốt vi khuẩn ho gà bất hoạt (wP) Đề tài được thực

hiện với mục tiêu: “Đánh giá khả năng tạo đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B

và kháng thể kháng HiB trên động vật thí nghiệm của vắc xin IVACPENTA (vắc xin 5 thành phần DTwP-HiB-HepB) từ đó đánh giá tính tương thích miễn dịch của các kháng nguyên viêm gan B và HiB trong vắc xin IVACPENTA” do Viện

Vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) nghiên cứu phát triển

Đánh giá sự tạo thành kháng thể HBsAb trên chuột nhắt trắng được thực hiện bằng cách miễn dịch cho các nhóm chuột (mỗi nhóm 8 con), hoặc vắc xin IVACPENTA hoặc vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia, trong đó mỗi chuột trong một nhóm tương ứng nhận được một lượng kháng nguyên HBsAg (viêm gan B) là 5

µg (1/4); 1,25 µg (1/16); 0,3125 µg (1/64); 0,0781 µg (1/256) hoặc 0,0195 µg (1/1024) Sau 28 ngày thu huyết thanh miễn dịch và chuẩn độ hiệu giá kháng thể viêm gan B (HBsAb) bằng bộ kít HBsAb của hãng Diagnostic Bioprobes Srl – Italy Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của 2 kháng nguyên HepB và HiB được thực hiện trên

hai nhóm thỏ, mỗi nhóm 10 con, mỗi con thỏ sẽ nhận 3 liều vắc xin cách nhau 21 ngày hoặc IVACPENTA hoặc COMBE-FIVE (vắc xin thương mại đang lưu hành trong CTTCMR) Huyết thanh máu nền (trước tiêm) và huyết thanh miễn dịch sau mỗi mũi tiêm 20 ± 3 ngày được thu thập Kháng thể HBsAb trong huyết thanh thỏ được xác định bằng bộ kít HBsAb của hãng Diagnostic Bioprobes Srl – Italy; kháng thể HiB được xác định bằng phản ứng ELISA với kháng nguyên gắn phiến HBO – HSA và cộng hợp kháng thể dê kháng thỏ Kết quả nghiên cứu đã đạt được:

1 Thành phần viêm gan B trong vắc xin IVACPENTA đã tạo được đáp ứng kháng thể HBsAb trên chuột nhắt trắng tương đương vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia, đạt yêu cầu về công hiệu theo tiêu chuẩn dự kiến

2 Thành phần viêm gan B trong vắc xin IVACPENTA tạo được đáp ứng miễn

dịch rất cao trên thỏ nhưng yếu hơn so với vắc xin COMBE-FIVE: sau 3 mũi tiêm hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (GMT) đạt: 6939,03 ± 4673,07 mIU/ml và tỷ số hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (RGMT) sau liều tiêm thứ ba so với sau liều tiêm thứ nhất tăng 4,8 lần; ở vắc xin COMBE-FIVE GMT đạt 7242,42 ± 11801,59 mIU/ml và RGMT tăng 11,38

lần

3 Thành phần kháng nguyên HiB trong vắc xin IVACPENTA tạo được đáp ứng miễn dịch trên thỏ không khác biệt đáng kể so với vắc xin COMBE-FIVE, sau

3 liều tiêm, hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) đạt 118,54

± 30,53 U/ml và RGMT tăng 97,16 lần so với máu nền, ở vắc xin FIVE, GMT đạt 127,09 ± 44,59 U/ml và RGMT tăng 98,52 lần

COMBE-Những kết quả trên đã chứng minh về khía cạnh sinh miễn dịch hai thành phần kháng nguyên HepB và HiB trong vắc xin IVACPENTA tỏ ra tương thích với các thành phần kháng nguyên còn lại là D, T và wP Đây là một trong những cơ sở quan trọng xác định công thức và qui trình phối hợp vắc xin IVACPENTA để tạo được vắc xin đạt yêu cầu về tính an toàn và công hiệu theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN iii

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỒNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 BỆNH DO VI KHUẨN HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B VÀ VIRUS VIÊM GAN B 4

1.1.1 Bệnh do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B 4

1.1.1.1 Tác nhân gây bệnh 4

1.1.1.2 Kháng nguyên polysaccharide vỏ của Haemophilus influenzae type B (cPRP) 6

1.1.1.3 Dịch tễ học lâm sàng 7

1.1.2 Bệnh viêm gan siêu vi B 8

1.1.2.1 Tác nhân gây bệnh 8

1.1.2.2 Dịch tễ học lâm sàng 10

1.2 VẮC XIN PHÒNG BỆNH 12

1.2.1 Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B 12

1.2.2 Vắc xin phòng viêm gan B 13

1.2.3 Vắc xin phối hợp 5 thành phần và phát triển vắc xin IVACPENTA tại Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế 15

1.3 PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA) XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ TRONG HUYẾT THANH MIỄN DỊCH 17

1.3.1 Nguyên tắc 17

1.3.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp 19

1.3.3 Kỹ thuật ELISA gián tiếp 20

1.3.4 Kỹ thuật ELISA sandwich 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23

2.2 VẬT LIỆU 23

2.2.1 Động vật thí nghiệm 23

2.2.2 Vắc xin và sinh phẩm 23

2.2.3 Dung dịch và hóa chất 24

2.2.4 Thiết bị chuyên dụng 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Nguyên tắc chung 25

2.3.2 Đánh giá đáp ứng kháng thể của viêm gan B (HepB) 25

2.3.2.1 Đáp ứng kháng thể của viêm gan B trên chuột nhắt 25

2.3.2.2 Đáp ứng kháng thể của viêm gan B trên thỏ 28

2.3.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của Haemophilus influenzae type B (HiB) 30

2.3.3.1 Gây miễn dịch cho thỏ và thu huyết thanh 30

2.3.3.2 Phương pháp chuẩn độ kháng thể kháng Haemophilus influenzae type B

(HiB) 30

2.3.3.3 Đánh giá kết quả 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG VIÊM GAN B TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ TRÊN THỎ CỦA VẮC XIN IVACPENTA 34

3.1.1 Đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B trên chuột 34

3.1.2 Đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B trên thỏ của vắc xin IVACPENTA so sánh với vắc xin COMBE-FIVE 39

3.2 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ KHÁNG H INFLUENZAE TYPE B (HIB) TRÊN THỎ CỦA VẮC XIN IVACPENTA SO SÁNH VỚI VẮC XIN COMBE-FIVE 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC

số lượng tương đối của các tiểu thể vi rút viêm gan B trong 1 ml huyết tương bệnh nhân mang vi rút viêm gan B mạn tính 9 Hình 1.5 Mô hình của virus viêm gan B (tiểu thể Dane) và mô hình của 2 dạng tiểu thể mang kháng nguyên HBsAg 10 Hình 1.6 Sơ đồ thực hiện kĩ thuật ELISA trực tiếp 19 Hình 1.7 Sơ đồ thực hiện kĩ thuật ELISA gián tiếp 21 Hình 2.1 Sơ đồ phân phối mẫu chuẩn và huyết thanh chuột trên phiến ELISA chuẩn

độ hiệu giá kháng thể HBsAb 27 Hình 2.2 Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ thu huyết thanh miễn dịch kháng viêm gan B

và H influenzae type B 28

Hình 2.3 Sơ đồ phân phối mẫu chuẩn và huyết thanh thỏ trên phiến ELISA chuẩn độ hiệu giá kháng thể HBsAb 29 Hình 2.4 Sơ đồ ELISA định lượng kháng thể kháng HiB 32 Hình 3.1 So sánh hiệu giá kháng thể HBsAb trung bình nhân (GMT) trên chuột của vắc xin IVACPENTA và vắc xin mẫu chuẩn viêm gan B (REF) ở 5 nồng độ HBsAg miễn dịch tương ứng 37 Hình 3.2 Hiệu giá kháng thể kháng viêm gan B (HBsAb) trung bình nhân sau 3 mũi tiêm vắc xin IVACPENTA và COMBE-FIVE 41

Hình 3.3 Tỷ số hiệu giá kháng thể kháng viêm gan B trung bình nhân (RGMT) trên thỏ sau mũi tiêm thứ hai và thứ ba so với sau mũi tiêm thứ nhất 43 Hình 3.4 Hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (GMT) trước và sau tiêm vắc xin IVACPENTA và COMBE-FIVE 48 Hình 3.5 Tỷ số hiệu giá kháng thể kháng HiB trung bình nhân (RGMT) giữa các mũi tiêm so với máu nền 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hiệu giá kháng thể kháng viêm gan B (HBsAb) của vắc xin IVACPENTA

trên chuột 34

Bảng 3.2 Hiệu giá kháng thể kháng viêm gan B (HBsAb) của vắc xin mẫu chuẩn

(REF) viêm gan B trên chuột 35

Bảng 3.3 So sánh tỷ lệ chuột có đáp ứng phân theo mức độ hiệu giá kháng thể HBsAb

giữa vắc xin IVACPENTA và vắc xin mẫu chuẩn Viêm gan B 38

Bảng 3.4 Đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B trên thỏ sau 3 mũi tiêm vắc xin

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CDC Centers for Disease Control

Pertussis whole cell

Vắc xin bạch hầu – uốn ván –

ho gà toàn tế bào EPI Expanded Programme on

and Immunization

Liên minh toàn cầu về Vắc xin

và Tiêm chủng GMT Geometric Mean Titer Hiệu giá trung bình nhân

HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi virus viêm

gan B HBeAg Hepatitis B e antigen Kháng nguyên e của virus viêm

gan B HBsAg Hepatitis B surface antigen Kháng nguyên bề mặt virus

viêm gan B HepB Hepatitis B Vaccine Vắc xin viêm gan B do virus

viêm gan B HiB Haemophilus influenzae type B

HIV Human Immunodeficiency

Virus

Virus gây suy giảm miễn dịch ở

người IVAC Institute of Vaccines and

Medical Biologycals

Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế

PBS Dung dịch đệm Phosphate

Buffered Saline PRP Polyribosyl – Ribitol –

Phosphate

Phân tử Polyribosyl –Ribitol –Phosphate cấu tạo nên chuỗi Oligosaccaride/Polysacharide kháng nguyên HiB

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

PHẦN MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Lợi ích vắc xin mang lại cho nhân loại là vô cùng to lớn đặc biệt đối với trẻ

em, vắc xin giúp trẻ em sống khỏe mạnh bằng cách bảo vệ trẻ chống lại bệnh tật Hiện nay đã có sẵn hàng chục loại vắc xin được sử dụng để bảo vệ trẻ em phòng chống lại những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như bạch hầu, ho gà, uốn ván, bại liệt, sởi, viêm

gan B, viêm màng não/viêm phổi do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B (vắc

xin HiB), ung thư cổ tử cung Chương trình vắc xin và miễn dịch toàn cầu của Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã khuyến cáo sử dụng vắc xin viêm gan B và vắc xin HiB trong Chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) và coi việc đưa vắc xin cộng hợp HiB vào CTTCMR cho trẻ em là ưu tiên có tính quốc gia Vắc xin 5 thành phần bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B và viêm phổi/viêm màng não do vi khuẩn

Haemophilus influenza type B đầu tiên được giới thiệu và đưa vào sử dụng năm 1990

Việc tích hợp vắc xin viêm gan B và viêm màng não do HiB vào vắc xin DTP để tạo thành vắc xin phối hợp 5 trong 1 một bước tiến lớn đúng theo yêu cầu về một vắc xin cải tiến mang lại nhiều tiện ích cho người dùng và là phương tiện để bổ sung vắc xin viêm gan B và HiB vào các chương trình tiêm chủng trên toàn thế giới

Ở Việt Nam, Chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR), khởi xướng từ năm 1981 và triển khai trên toàn quốc từ năm 1995 với mục tiêu cung cấp dịch vụ tiêm chủng miễn phí cho trẻ em dưới 1 tuổi, bảo vệ trẻ khỏi mắc 6 loại bệnh truyền nhiễm phổ biến và gây tử vong cao là bạch hầu, uốn ván, ho gà, lao, sởi, bại liệt Chương trình tiếp tục được mở rộng đối với một số vắc xin khác như vắc xin viêm gan B (vắc xin thứ 7, năm 1997), vắc xin viêm não Nhật Bản B, vắc xin thương hàn, vắc xin tả Vắc xin HiB là vắc xin thứ 11 được đưa vào chương trình dưới dạng vắc xin phối hợp 5 thành phần do Liên minh toàn cầu về Vắc xin và Tiêm chủng (GAVI) tài trợ miễn phí cho trẻ dưới 1 tuổi từ tháng 06/2010 Vắc xin 5 thành phần do GAVI tài trợ sẽ kết thúc hoàn toàn vào 12/2019, do vậy, việc chủ động sản xuất vắc xin phối hợp 5 trong 1 bằng nguồn nội lực thay thế trở nên cần thiết, cấp bách Đây là việc làm

hoàn toàn khả thi, chủ động cung cấp giúp giảm chi phí nhập vắc xin, sử dụng tiện ích do giảm số mũi tiêm, giảm gánh nặng về hậu cần, thuận lợi tích hợp triển khai trong hệ thống TCMR hiện hành

Với lý do đó, tháng 02/2019, Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) được

Bộ Y tế chỉ định nghiên cứu sản xuất vắc xin phối hợp 5 thành phần HepB) để thay thế vắc xin ngoại nhập cung cấp cho CTTCMR phòng chống các bệnh

(DTwP-HiB-bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm màng não do vi khuẩn Haemophilus influenzae type

B và virus viêm gan B miễn dịch cho trẻ em lứa tuổi từ 2 đến 6 tháng

Vắc xin DTwP-HiB-HepB (vắc xin IVACPENTA) được phối hợp dựa trên cơ

sở vắc xin ba thành phần bạch hầu, uốn ván và ho gà (DTwP) của IVAC và 2 thành

phần kháng nguyên mới là kháng nguyên vỏ vi khuẩn Haemophilus influenzae type

B (Poly-Ribitol-Phosphat hay PRP) cộng hợp gọi tắt là kháng nguyên HiB và kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg) gọi tắt là kháng nguyên HepB

Nghiên cứu về tính sinh miễn dịch của 2 kháng nguyên HiB và HepB trên động vật thí nghiệm là yêu cầu bắt buộc đầu tiên để đánh giá tính tương thích về tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên HiB và HepB khi phối hợp với 3 kháng nguyên giải độc tố bạch hầu (D), giải độc tố uốn ván (T) và nước cốt vi khuẩn ho gà bất hoạt (wP), là cơ sở để lựa chọn đánh giá công thức và qui trình phối hợp vắc xin 5 thành phần đạt yêu cầu về tính an toàn và công hiệu theo tiêu chuẩn của Tổ chức y tế thế giới (WHO)

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng tạo đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B và kháng thể kháng HiB trên động vật thí nghiệm của vắc xin IVACPENTA (vắc xin 5 thành phần DTwP-HiB-HepB) từ đó đánh giá tính tương thích miễn dịch của các kháng nguyên HepB và HiB trong vắc xin IVACPENTA

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B của vắc xin IVACPENTA so với vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia (REF)

- Đánh giá đáp ứng kháng thể kháng viêm gan B của vắc xin IVACPENTA so với vắc xin COMBE-FIVE (là vắc xin đối chứng hiện đang được lưu hành trong CTTCMR Quốc gia)

- Đánh giá đáp ứng kháng thể kháng HiB của vắc xin IVACPENTA so với vắc xin COMBE-FIVE (là vắc xin đối chứng hiện đang được lưu hành trong CTTCMR Quốc gia)

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đây là 1 trong 6 nội dung nghiên cứu của nhiệm vụ thứ nhất trong dự án:

“Nghiên cứu sản xuất vắc xin phối hợp 5 trong 1, dạng dung dịch, hấp phụ tá chất nhôm, gọi tắt DTwP-HepB-HiB (bạch hầu, uốn ván, ho gà toàn tế bào, viêm

gan B, viêm màng não do H influenzae type B” được Bộ Y tế giao cho Viện Vắc

xin và Sinh phẩm y tế thực hiện từ tháng 02/2019 đến tháng 12/2019

Kết quả của đề tài là một trong những cơ sở quan trọng xác định công thức và qui trình phối hợp vắc xin IVACPENTA trên cơ sở nền tảng vắc xin DTP của IVAC

và 2 thành phần bên ngoài HiB và HepB để tạo được vắc xin 5 thành phần HepB-HiB) đạt yêu cầu về tính an toàn và công hiệu theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y

(DTwP-tế thế giới (WHO)

Kết quả của đề tài sẽ góp phần quan trọng để nghiên cứu sản xuất thành công vắc xin IVACPENTA hấp phụ trên tá chất nhôm (Al), kịp thời phục vụ cho CTTCMR Quốc gia vào năm 2021, khẳng định về năng lực, trình độ khoa học công nghệ của Việt Nam, tính ưu việt của chiến lược tự túc vắc xin, an ninh vắc xin quốc gia của Bộ

Y tế và Nhà nước Việt Nam

CHƯƠNG I TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH DO VI KHUẨN H INFLUENZAE VÀ VIRUS VIÊM GAN B

1.1.1 Bệnh do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B

1.1.1.1 Tác nhân gây bệnh

Haemophilus influenzae do Richard Pfeiffer phân lập lần đầu tiên từ một bệnh

nhân bị chết trong một dịch cúm lớn năm 1892 Do vậy, lúc đầu người ta cho rằng đó

chính là tác nhân gây ra bệnh cúm và đặt tên là Bacterium influenzae Mãi đến năm

1933, khi phát hiện ra virus cúm thì căn nguyên của bệnh cúm cũng như vai trò của

B influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm, còn B influenzae là

vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào niêm mạc đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm (Lê Văn Phủng, 2007)

Haemophilus influenzae là một vi khuẩn gram âm thuộc họ Pasteurellaceae,

không sinh nha bào, không di động, có thể có vỏ Chủng có vỏ được phân loại dựa theo thành phần hóa học của polysaccharide cấu thành vỏ, bao gồm 6 type huyết thanh: a, b, c, d, e, f Trong đó type b là type thường gặp và cũng là type gây bệnh nặng nhất (Pittman, 1931)

Hình 1.1 Vi khuẩn H influenzae nhuộn Gram dưới kính hiển vi quang học [27]

Về đặc điểm nuôi cấy, H influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy Chúng

không mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc trong môi trường đã

có sẵn cả hai yếu tố X và V H influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp catalase,

peroxidase và các cytochrome c của hệ thống vận chuyển điện tử Trong phòng thí

nghiệm, H influenzae thường được phân lập trên môi trường thạch socola Khi thêm

máu ngựa vào môi trường agar ở 80 oC, nhiệt giải phóng các yếu tố X và V từ các tế

bào hồng cầu và biến môi trường thành màu nâu socola H influenzae mọc tốt hơn

trong khoảng nhiệt độ 35 – 37 oC với sự có mặt của CO2 (3-5%) (WHO, 2011)

Hình 1.2 Khuẩn lạc H influenzae trên môi trường thạch socola [24]

H influenzae ký sinh bắt buộc trên niêm mạc đường hô hấp, 75% trẻ lành có mang vi khuẩn ở mũi họng; ở người lớn, tỷ lệ này thấp hơn Bệnh do H influenzae

gây ra thường là thứ phát (sau sởi, cúm), gồm: viêm màng não, viêm đường hô hấp trên (thanh quản, tai giữa, xoang), viêm đường hô hấp dưới (viêm phế quản cấp và

mạn tính, viêm phổi) hoặc nhiễm khuẩn huyết Viêm màng não do H influenzae là

một bệnh nặng và cấp tính, cần được chẩn đoán và điều trị Đáng chú ý rằng tỷ lệ kháng kháng sinh đối với tất cả các chủng HiB tăng đều đặn trong những năm gần

đây với khoảng 30% chủng HiB phân lập được kháng ampicillin (Gessner et al., 2002)

1.1.1.2 Kháng nguyên polysaccharide vỏ của Haemophilus influenzae type B

(cPRP)

Polysaccharide Polyribosyl-Ribitol-Phosphate (cPRP) là một chất tạo thành

vỏ của vi khuẩn Haemophilus influenzae type B (HiB), giúp HiB chống lại phản ứng

diệt khuẩn của cơ thể, tạo độc lực mạnh cho vi khuẩn Kháng nguyên vỏ Polysaccharide được cấu tạo bởi những chuỗi polyribosephosphate, disaccharide ribose-ribitol nối kết với nhau thông quan liên kết phospho-diester (Zamenhof et al., 1953)

Hình 1.3 Công thức cấu tạo một đơn phân Ribose Phosphate cấu tạo

nên phân tử PRP [26]

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên CPS (Capsular Polysaccharide covers the Surface) thuộc loại đáp ứng miễn dịch type 2 không phụ thuộc tế bào T (TI-2), kích thích tế bào miễn dịch tạo ra kháng thể mà không cần có sự trợ giúp của các tế bào T có kháng nguyên hòa hợp tổ chức lớp 2 (MHC II) Sự hoạt hóa các tế bào miễn dịch đối với các CPS theo con đường bổ thể bởi yếu tố C3d khởi đầu quá trình đáp ứng của tế bào B chuyển dạng thành tế bào Plasma tạo ra kháng thể không chỉ là IgM

mà còn tạo ra IgG và IgA Một hệ thống tín hiệu đặc hiệu có thể điều hòa đáp ứng

quan trọng để tạo ra những kháng thể này và đáp ứng khác nhau về tính chất và mức

độ đối với mỗi cá thể tùy thuộc và tuổi và tình trạng miễn dịch của họ Do tính chất kháng nguyên CPS tạo một đáp ứng không phụ thuộc tế bào T nên các CPS được sử dụng như vắc xin không hiệu quả đối với trẻ dưới 2 tuổi do hệ thống miễn dịch của trẻ chưa hoàn chỉnh (Zarei et al., 2016)

5 tuổi mắc các bệnh do HiB gây ra và ước tính 371.000 trong số này tử vong (Watt

et al., 2009) Bệnh thường có kết hợp với nhiễm khuẩn huyết và HiB cũng là nguyên nhân gây viêm thanh quản, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng ngoài tim, viêm mủ màng phổi và viêm xương tủy xương Viêm phổi và viêm màng não mủ do HiB là nguyên nhân gây tử vong phổ biến ở trẻ dưới 5 tuổi tại các nước đang phát triển Có đến 30% số bệnh nhi bị viêm màng não do vi khuẩn HiB để lại di chứng thần kinh vĩnh viễn, tổn thương não, điếc, chậm phát triển, rối loạn tâm thần (Shell et al., 1972) Bệnh viêm màng não do vi khuẩn dễ gây tử vong cho trẻ nếu không được điều trị kháng sinh sớm Ngay cả khi được xử trí đúng bằng kháng sinh thì vẫn có từ 3-20%

số trẻ bị mắc bệnh có thể tử vong [28]

Bệnh do HiB gây ra chủ yếu lây lan khi người bệnh ho hoặc hắt hơi, hoặc tiếp xúc với dịch tiết ra từ mũi và cổ họng người bệnh Triệu chứng của bệnh là sốt, nôn, ngủ lịm, màng não bị kích thích với biểu hiện não phồng ở trẻ nhỏ hoặc cổ và lưng cứng ở trẻ lớn hơn Bệnh tiến triển nặng dẫn tới hôn mê Tỷ lệ tử vong ở bệnh nhi hôn mê lên đến 50% (Lê Văn Hiệp, 2006)

Trẻ dưới 2 tháng tuổi được bảo vệ bởi kháng thể của mẹ Sau đó nguy cơ mắc bệnh tăng nhanh, đạt đỉnh ở 1 tuổi rồi giảm xuống ở 2-3 tuổi là thời điểm trưởng

thành của hệ miễn dịch (80% trường hợp viêm màng não mủ do HiB ở trẻ dưới 1 tuổi) Tỷ lệ bệnh do HiB (trước khi có vắc xin) thay đổi từ 8 đến 60/100.000 dân mỗi năm, tùy thuộc mỗi quốc gia Theo ước tính hàng năm có ít nhất 3 triệu trường hợp mắc bệnh nặng và khoảng 386.000 trường hợp tử vong do HiB (WHO, 2006)

Tại Việt Nam, theo thống kê năm 2000 do WHO hợp tác với Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương tiến hành, ước tính HiB gây ra 625 trường hợp viêm màng não, 107.565 trường hợp viêm phổi nặng hàng năm Theo ước tính khoảng 35 đến 77 trường hợp tử vong do viêm màng não HiB và 441 đến 957 trường hợp tử vong do viêm phổi HiB ở trẻ em dưới 5 tuổi hàng năm tại Việt Nam Nhìn chung, tỷ lệ mắc viêm màng não HiB được ước tính là 18/100.000 Ước tính tỷ lệ trẻ em dưới 5 tuổi mắc bệnh viêm màng não do HiB ở Thành phố Hồ Chí Minh (22,5/100.000) cao hơn

so với Hà Nội (9,8/100.000) Trên quy mô toàn quốc ước tính mỗi năm có tổng cộng

883 đến 1.915 trường hợp viêm màng não do HiB và 4.414 đến 9.574 trường hợp viêm phổi do HiB ở những trẻ dưới 5 tuổi (Nyambat et al., 2011)

1.1.2 Bệnh viêm gan siêu vi B

1.1.2.1 Tác nhân gây bệnh

Năm 1963, khi nghiên cứu tính đa dạng các protein huyết thanh, Baruch Blumberg và cộng sự đã phát hiện ra một protein chưa từng được biết đến trước đây trong huyết thanh của một thổ dân Australia Ông gọi protein này là kháng nguyên Australia (AuAg) Lúc đầu, Blumberg tin rằng AuAg thực sự là một protein huyết thanh đa hình giống như kháng nguyên lipoprotein mà ông đã phát hiện ra trước đó Nhưng đến năm 1967, Blumberg nhận ra rằng kháng nguyên Australia có liên quan đến viêm gan Sau đó, AuAg được xác định là kháng nguyên bề mặt của hạt virus và năm 1976 được gọi là HBsAg (Hepatitis B surface antigen) – kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B Năm 1973, Dane và cộng sự phát hiện trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm viêm gan B có các hạt kiểu virus mang kháng nguyên bề mặt HBsAg dạng hình cầu và dạng hình sợi có kích thước 17-22 nm, và các hạt virus hoàn chỉnh,

có đường kính khoảng 42 nm bao gồm lớp kháng nguyên vỏ HBsAg và lõi có đường kính 36 nm (Venkatakrishnan & Zlotnick, 2016)

Virus viêm gan B (HBV) lây nhiễm hơn 300 triệu người trên toàn thế giới và

là nguyên nhân chính gây bệnh gan và ung thư gan Về cấu trúc, virus viêm gan B

(Hepatitis B Virus – HBV) thuộc họ Hepadnaviridae, là virus mang ADN hai sợi

không khép kín, có trọng lượng phân tử 2x106 dalton, được cấu tạo bởi 3200 nucleotide, capsid có đối xứng hình khối, kích thước khoảng 27 nm, bao capsid dày khoảng 7 nm được cấu tạo bởi 3 protein cấu trúc: P lớn, P trung bình và P nhỏ; bao tạo cho virus có hình cầu đường kính 42 nm (đó là hạt Dane) (Lê Thị Oanh, 2007)

Hình 1.4 Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử (nhuộm âm bản) các dạng hình thể và số lượng tương đối của các tiểu thể virus viêm gan B trong 1 ml huyết tương bệnh nhân mang virus viêm gan B mạn tính (Gerlich, 2013)

Tiểu thể Dan hay

virus viêm gan B

(109/ 1 ml huyết

thanh)

Tiểu thể hình ống (1010/ 1 ml huyết thanh)

Tiểu thể hình cầu (1013/ 1 ml huyết thanh)

Hình 1.5 Mô hình của virus viêm gan B (tiểu thể Dane) và mô hình của 2 dạng

tiểu thể mang kháng nguyên HBsAg (Gerlich, 2013)

1.1.2.2 Dịch tễ học lâm sàng

Theo thống kê, trên thế giới, số người mắc viêm gan B mãn tính cao gấp 7 lần

số người nhiễm HIV/AIDS Tổ chức Y tế thế giới (WHO) định nghĩa nhiễm virus viêm gan B như sau:

“Viêm gan B là một trong những căn bệnh nguy hiểm của nhân loại và là một vấn đề sức khỏe cộng đồng toàn cầu nghiêm trọng Viêm gan có nghĩa là sự viêm của gan, và nguyên nhân phổ biến nhất là do nhiễm một trong 5 loại virus, được gọi là viêm gan A, B, C, D và E Tất cả các loại virus này có thể gây ra một bệnh cấp tính với các triệu chứng kéo dài vài tuần bao gồm: vàng da và mắt (bệnh vàng da); nước tiểu sẫm màu; cực kì mệt mỏi; buồn nôn; nôn và đau bụng Nó có thể mất từ một vài tháng cho đến một năm để khỏe trở lại Virus viêm gan B có thể gây ra nhiễm trùng mãn tính trong đó bệnh nhân không bao giờ thoát khỏi virus và nhiều năm sau phát triển thành bệnh xơ gan hoặc ung thư gan

Mô hình virus viêm gan

B (tiểu thể Dane)

Mô hình các tiểu thể (hạt) kháng

nguyên HBsAg

HBV là loại viêm gan siêu vi nguy hiểm nhất và là loại duy nhất gây viêm gan mạn tính có vaccine phòng ngừa Virus viêm gan B lây nhiễm khi tiếp xúc với máu hoặc dịch cơ thể của người nhiễm bệnh giống như virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), loại virus gây ra AIDS Tuy nhiên, HBV có khả năng lây nhiễm cao gấp 50 đến 100 lần so với HIV Các con đường lây nhiễm HBV chủ yếu là: (a) chu sinh (từ mẹ sang con khi sinh); (b) giữa trẻ em với nhau; (c) khi tiêm và truyền không

Viêm gan virus B là vấn đề y tế cộng đồng rất đáng quan tâm, đặc biệt ở các nước châu Á và châu Phi Giám sát dịch tễ học đã phát hiện có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm HBV, trong đó có khoảng 350 triệu người mạn tính (5-10% người lớn và 70-90% trẻ em) và khoảng 600.000-1.200.000 người chết hàng năm gây ra bởi HBV (Lavanchy, 2008) Cứ 122 triệu trẻ em sinh ra hàng năm ở những nước này thì có 1,3 triệu trẻ bị chết do bệnh viêm gan gây ra bởi HBV (999.000 ở Châu Á và 230.000 ở Châu Phi) (Lê Văn Hiệp, 2006)

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới; theo ước tính có khoảng 8,6 triệu người đang bị nhiễm HBV Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B mạn tính ở phụ nữ là khoảng 8,8% và ở nam giới là 12,3% [30] Thêm vào đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ tử vong do ung thư gan cao nhất (14,8-

23,7/100.000) mà nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm HBV mạn tính (Do, 2015) Ước tính số người nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam đã tăng từ 6,4 triệu trường hợp vào năm 1990 lên 8,4 triệu trường hợp vào năm 2005 (Nguyen, 2010)

1.2 VẮC XIN PHÒNG BỆNH

1.2.1 Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B

Những ý tưởng đầu tiên về một loại vắc xin HiB polysaccharide tách chiết từ

vỏ của vi khuẩn H influenzae ra đời vào thập niên 70 của thế kỷ trước nhưng mãi đến

năm 1985, vắc xin Hib polysaccharide (HbPV) được phát triển bởi Porter Anderson

và Davis Smith mới được cấp phép ở Mỹ Vắc xin HbPV được sử dụng đến năm 1988

vì loại vắc xin này không thật sự hiệu quả ở trẻ em dưới 18 tháng tuổi vì ở ở lứa tuổi này hệ miễn dịch còn non của trẻ chưa có đáp ứng không phụ thuộc tế bào T Vắc xin HiB cộng hợp được phát triển bởi John Robbins và Rachel Schneerson đã được cấp phép tại Mỹ vào tháng 12 năm 1987 và thay thế hoàn toàn vắc xin HbPV [31] Trước

khi có vắc xin, tỷ lệ nhiễm và mắc bệnh do vi khuẩn H influenzae type B ở trẻ em

dưới 5 tuổi trên toàn thế giới khoảng 71/100.000 trẻ, trong đó viêm màng não do HiB

là 57/100.000 trẻ (tương ứng với khoảng 445.000 và 357.000 trường hợp mỗi năm) (Peltola, 2000) Sau hai năm sử dụng vắc xin HiB cộng hợp, tỷ lệ mắc HiB tại các nước Anh, Mỹ, New Zealand, Bắc Ailen, Úc, Cuba đã giảm xuống rất thấp (từ 1/600 xuống 1/30.000) Tại Mỹ, khi vắc xin HiB được giới thiệu lần đầu tiên (năm 1988),

tỷ lệ mắc bệnh của HiB đã giảm trên 99% Từ năm 1996 đến năm 2000, trung bình

68 trẻ em mỗi năm được ghi nhận là bị bệnh do HiB Hầu hết những trường hợp này xảy ra ở những trẻ không được tiêm vắc xin hoặc tiêm vắc xin không đầy đủ (Briere

et al., 2012) Theo báo cáo của Cộng hòa Dominican, trước khi có vắc xin tỷ lệ viêm màng não là 49/100.000 trẻ dưới 5 tuổi, trong đó 65% trường hợp xác nhận nguyên nhân do HiB Sau 2 năm sử dụng vắc xin từ 2002-2004, tỷ lệ viêm màng não giảm xuống còn 16/100.000 trẻ, trong đó chỉ có 26% xác nhận ca bệnh do HiB Hiện nay bệnh viêm màng não do HiB dường như không xuất hiện ở các nước Tây Âu, Canada,

Mỹ, Úc và Phần Lan (Lê Văn Hiệp, 2006)

Trong vòng khoảng 30 năm, từ khi vắc xin HiB cộng hợp đầu tiên được giới thiệu cho đến nay đã đã phát triển 5 loại vắc xin cộng hợp HiB với các loại protein khác nhau, thành phần kháng nguyên của vắc xin này là Polyribosyl-Ribitol-

Phosphate (PRP) được tinh chế từ vỏ vi khuẩn Haemophilus influenzae type B và sau

đó cộng hợp với một trong bốn loại protein tải: protein màng ngoài vi khuẩn Neisseria meningitidis (OMPC), giải độc tố uốn ván (T), giải độc tố bạch hầu (D) và protein

độc tố bạch hầu (CRM 197) mất tính độc nhờ sử dụng chủng bạch hầu tái tổ hợp (Nguyễn Thị Kê, 2001)

1.2.2 Vắc xin phòng viêm gan B

Việc phát hiện ra kháng nguyên bề mặt HBsAg có khả năng tạo miễn dịch bảo

vệ chống lại virus viêm gan B đã tạo tiền đề phát triển công nghệ sản xuất vắc xin viêm gan B Kể từ khi vắc xin viêm gan B được giới thiệu đầu tiên năm 1982, hơn một tỷ liều vắc xin viêm gan B đã được sử dụng trên toàn thế giới Lịch tiêm cơ bản gồm 3 liều tiêm bắp, đối với trẻ sơ sinh tốt nhất tiêm mũi đầu tiên trong vòng 24 giờ đầu sau sinh, mũi thứ 2 cách mũi tiêm đầu tiên 1 tháng và mũi thứ 3 cách 2 tháng sau mũi tiêm đầu Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vắc xin có hiệu quả đến 95% trong việc ngăn ngừa trẻ em và người lớn mắc viêm gan B nếu họ chưa nhiễm bệnh Ở nhiều quốc gia nơi có 8-15% trẻ em từng bị nhiễm HBV mạn tính, tỷ lệ này đã giảm xuống dưới 1% ở các nhóm trẻ được tiêm chủng [29] Trải qua 40 năm phát triển, công nghệ sản xuất vắc xin viêm gan B đã có những bước tiến đáng kể để tạo ra được vắc xin thế hệ III an toàn, hiệu quả, tiện ích và giá rẻ hơn Những khác biệt về công nghệ sản xuất các thế hệ vắc xin viêm gan B như sau:

 Vắc xin huyết tương (thế hệ I): Được sản xuất từ HBsAg tinh khiết từ huyết tương người lành mang kháng nguyên HBsAg, là hỗn hợp của nhiều phân type HBsAg khác nhau đang lưu hành trong một nước Vắc xin này có tính an toàn cao, hiệu lực bảo vệ cao, giá thành thấp, tuy nhiên với các chiến lược tiêm phòng vắc xin VGB hiện nay trên toàn

thế giới thì nguồn kháng nguyên tự nhiên giàu HBsAg sẽ dần dần bị cạn kiệt và không còn đủ cung cấp cho các nhà sản xuất vắc xin

 Vắc xin tái tổ hợp (thế hệ II): Vắc xin VGB thế hệ II được sản xuất dựa vào kỹ thuật di truyền và công nghệ gen Loại vắc xin này có nhược điểm là chỉ chứa một kháng nguyên S và chỉ có một phân type HBsAg Tuy nhiên, loại vắc xin này cũng có tính miễn dịch cao dù có một số đối tượng không sinh đáp ứng miễn dịch và được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng của nhiều quốc gia

 Vắc xin thế hệ III: Cũng sử dụng công nghệ di truyền như vắc xin thế

hệ II nhưng có thêm kháng nguyên tiền S1 và tiền S2, cho hiệu quả bảo

vệ cao đặc biệt ở các trẻ nhỏ sinh ra từ các bà mẹ dương tính với HBsAg

và HBeAg, cũng như sinh đáp ứng miễn dịch đối với những người không đáp ứng miễn dịch với các loại vắc xin khác

Vắc xin viêm gan B được sử dụng phổ biến rộng khắp toàn quốc lần đầu tiên

ở Đài Loan trong Chương trình tiêm chủng quốc gia vào tháng 7, 1984 cho trẻ em

Từ năm 1991, WHO đã kêu gọi tất cả các quốc gia bổ sung vắc xin viêm gan B vào chương trình tiêm chủng quốc gia [29]

Tại Việt Nam, vắc xin viêm gan B được triển khai lần đầu trong CTTCMR từ năm 1997 tại 2 địa bàn là Thủ đô Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh Số tỉnh triển khai tiêm vắc xin viêm gan B tăng dần qua các năm từ 29 tỉnh năm 1998 lên 42 tỉnh năm 2000 Từ năm 2006 đến nay, tỷ lệ tiêm vắc xin VGB đủ 3 mũi ở trẻ em dưới 1 tuổi luôn đạt trên 90%, ngoại trừ năm 2007 đạt thấp do tình trạng thiếu vắc xin Tại Việt Nam, vắc xin viêm gan B được tiêm miễn phí cho trẻ em trong CTTCMR quốc gia [32]

Trong CTTCMR của Việt Nam hiện nay, vắc xin viêm gan B là loại vắc xin thế hệ thứ II ở dạng vắc xin đơn giá (dùng cho trẻ mới sinh trong vòng 24 giờ đầu) hay vắc xin đa giá (dùng cho trẻ trên 2 tháng tuổi) Vắc xin đơn giá do công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) sản xuất là vắc xin thế hệ thứ II sử dụng kháng

nguyên HBsAg tổng hợp từ nấm men Vắc xin viêm gan B dùng cho trẻ từ 2 tháng tuổi trở lên là vắc xin phối hợp 5 thành phần COMBE-FIVE do GAVI tài trợ Ngoài

ra, có một số vắc xin viêm gan B ngoại nhập khác ở dạng đơn giá hay đa giá (vắc xin

4 trong 1, vắc xin 5 trong 1 hoặc vắc xin 6 trong 1) ngoại nhập sử dụng ở khu vực tiêm dịch vụ cũng đang tồn tại ngoài thị trường tự do song song với vắc xin trong CTTCMR

1.2.3 Vắc xin phối hợp 5 thành phần và phát triển vắc xin IVACPENTA tại Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế

Vắc xin viêm gan B lần đầu tiên được WHO đánh giá tiền thẩm định năm

1987, tiếp theo đó là vắc xin HiB năm 1998 Tổ chức Y tế thế giới trong chương trình vắc xin và miễn dịch toàn cầu đã khuyến cáo sử dụng vắc xin HiB và HepB trong CTTCMR, coi việc đưa vắc xin cộng hợp HiB vào chương trình tiêm chủng cho trẻ

em là ưu tiên có tính quốc gia

Việc tích hợp vắc xin viêm gan B và viêm màng não do HiB vào vắc xin DTP

để tạo thành vắc xin phối hợp 5 trong 1 là một bước tiến lớn đúng theo yêu cầu về một vắc xin cải tiến và có thể trở thành phương tiện để bổ sung vắc xin viêm gan B

và HiB vào chương trình tiêm chủng trên toàn thế giới Trong cuối thập kỷ 90, nhiều nhà sản xuất đã thành công trong việc hỗn hợp vắc xin cộng hợp viêm màng não type

B (HiB) và vắc xin viêm gan B (HepB) với vắc xin phối hợp bạch hầu, uốn ván, ho

gà (DTP) tạo ra vắc xin nhiều thành phần như vắc xin DTP- HiB- HepB, DTP- HiB, DTP- HepB

Vắc xin phối hợp là một biện pháp hữu hiệu trong việc làm giảm số mũi tiêm

và làm đơn giản hóa công tác tiêm phòng, vì thế mang lại những lợi ích toàn diện cho trẻ em, cha mẹ, bệnh viện, người quản lý y tế và nhà quản lý sức khỏe (Dodd, 2003)

Một ưu điểm khác của vắc xin phối hợp là làm giảm lượng chất bảo quản đưa vào cơ thể, trong đó có Merthiolate là hợp chất của thủy ngân có thể tích lũy trong cơ thể vượt quá giới hạn an toàn của TCYTTG nếu như sử dụng những vắc xin riêng rẽ

Việc sử dụng vắc xin phối hợp là một biện pháp thiết thực để hạn chế việc phải tiêm quá nhiều mũi chích ngừa, nhất là để bắt đầu những đợt tiêm chủng cho những trẻ em bị chậm lịch trình Việc sử dụng vắc xin phối hợp có thể giúp cho sự bao trùm toàn diện của chương trình tiêm chủng được xảy ra đúng lúc Một số nhà cung cấp cho tiêm chủng và phụ huynh phản đối thực hiện nhiều hơn hai hoặc ba vắc xin tiêm trong một lần thăm khám bởi vì những mũi kim và sự đau đớn làm cho những đứa trẻ

sợ hãi và còn vì những mối lo âu có liên quan đến tính an toàn không được chứng minh

Những thuận lợi tiềm năng khác của vắc xin phối hợp bao gồm: a) giảm chi phí của việc cất trữ trong kho và quản lý những vắc xin riêng biệt, b) giảm chi phí cho nhiều lần đi thăm khám sức khỏe, và c) làm cho dễ dàng việc đưa thêm vắc xin mới vào chương trình tiêm chủng Giá của một vắc xin phối hợp mới đôi khi có thể vượt quá tổng giá tiền của những vắc xin riêng biệt cho cùng những loại bệnh Tuy nhiên, vắc xin phối hợp có thể được cho là giá trị kinh tế hơn nếu như xét đến những chi phí trực tiếp và gián tiếp của những mũi tiêm tăng cường, trì hoãn hay bỏ lỡ việc tiêm chủng, việc mua bán tăng thêm và bảo quản (Dodd, 2003)

Các bệnh bạch hầu, ho gà, uốn ván, viêm gan B, viêm phổi/màng não do vi khuẩn HiB là những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt dưới 1 tuổi Vắc xin cơ bản phòng các bệnh này đã được triển khai trong CTTCMR ở hầu hết các nước trên thế giới Hiện nay trên 170 quốc gia trên thế giới, bao gồm cả 72 quốc gia được liên minh GAVI tài trợ

đã sử dụng vắc xin 5 thành phần, trong đó Ấn Độ được ước tính chiếm đến 20% nhu cầu về vắc xin thành phần (28.000.000 liều) trong năm 2014

Tại Việt Nam, chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR) đã được triển khai trên toàn quốc từ năm 1985 với các loại vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm nguy hiểm là lao, bạch hầu, ho gà, uốn ván, sởi bại liệt, viêm gan B, viêm não Nhật Bản, thương hàn và tả TCYTTG cũng khuyến cáo đưa thêm vào CTTCMR vắc xin phòng

bệnh do vi khuẩn Haemophilus influenzae type B, tác nhân quan trọng gây bệnh viêm

phổi, viêm màng não ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Việt Nam cũng được Liên minh toàn cầu về Vắc xin và Tiêm chủng (GAVI) hỗ trợ triển khai vắc xin phối hợp 5 trong 1 (DTwP-HepB-HiB) miễn phí trong TCMR cho trẻ dưới 1 tuổi từ tháng 06/2010 đến năm 2015 Từ 2015 trở đi lượng vắc xin 5 thành phần do GAVI cung cấp sẽ giảm dần đến ngưng hoàn toàn vào 2020

Từ năm 1990 đến nay, IVAC là nhà sản xuất và cung cấp cho CTTCMR vắc xin bạch hầu, uốn ván, ho gà (DTwP) hàng đầu của Việt Nam (Lê Văn Bé, 2013) Trong những năm 1998-2008, IVAC cũng đã từng nghiên cứu phát triển ở qui mô phòng thí nghiệm các vắc xin 4 thành phần (DTwP-HiB) hoặc 5 thành phần (DTwP-HiB-HepB) đã được nghiên cứu phát triển ở qui mô phòng thí nghiệm với 3 thành phần D, T, wP của IVAC và 2 thành phần HiB, HepB nhập ngoại từ Chiron (Ý) hoặc

từ Cuba (Lê Văn Bé, 2003) Do đó IVAC có đủ cơ sở và tiềm năng để phát triển vắc xin 5 thành phần Tháng 2/2019, IVAC chính thức được Bộ Y tế giao nhiệm vụ phát triển vắc xin 5 thành phần ở qui mô pilot (40.000 liều) và tiến tới qui mô công nghiệp (5-7 triệu liều/năm) để chủ động nguồn vắc xin nội lực thay thế vắc xin 5 thành phần nhập ngoại hiện nay đã trở nên cần thiết, cấp bách Đây là việc làm hoàn toàn khả thi, chủ động cung cấp giúp giảm chi phí nhập vắc xin, sử dụng tiện ích do giảm số mũi tiêm, giảm gánh nặng về hậu cần, thuận lợi tích hợp triển khai trong hệ thống TCMR hiện hành

Vắc xin 5 thành phần của IVAC đang phát triển hiện nay có tên thương mại là IVACPENTA được nghiên cứu trên nền tảng của vắc xin bạch hầu, uốn ván, ho gà (DTwP) phối hợp từ 3 thành phần bạch hầu (D), uốn ván (T), ho gà (toàn tế bào bất

hoạt-wP) của IVAC và 2 thành phần kháng nguyên vỏ vi khuẩn Haemophilus influenzae type B (HiB) và kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HepB) nhập

từ các công ty trong và ngoài nước

1.3 PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA) XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ TRONG HUYẾT THANH MIỄN DỊCH

1.3.1 Nguyên tắc

 Nguyên tắc chung:

Các kỹ thuật ELISA đôi khi còn được gọi là EIA rất đa dạng và đặc điểm chung là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate, TMB, ABTS) enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu hoặc tín hiệu của chất phát quang chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua đậm độ màu và cường

độ sáng phát ra mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Các kỹ thuật ELISA có độ nhạy khá cao và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để phát hiện và định lượng nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh và các chất có bản chất là peptid, protein, kháng thể, hormon,… và được sử dụng rất nhiều trong kiểm tra công hiệu, nhận dạng vắc xin và sinh phẩm; định lượng hàm lượng các chất tồn dư trong vắc xin

có bản chất là protein như: BSA, ovalbumin, gentamicin, neomycin…

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, phản ứng cần có hoạt tính xúc tác của enzyme; thực hiện qua hai bước: phản ứng miễn dịch học (sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể) và phản ứng hóa học (thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử (oxygen) từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thử nghiệm)

 Nguyên tắc thực hiện thử nghiệm:

- Sử dụng kit ELISA chuyên dụng: Phải tuân thủ đầy đủ các bước cơ bản của

quy trình theo hướng dẫn sử dụng, đánh giá thử nghiệm của từng bộ kit

- Quy trình ELISA tự gắn kit: Theo Quy trình thao tác chuẩn Các bước cơ bản

bao gồm: Pha hóa chất (kháng thể hoặc kháng nguyên) để gắn phiến; Nhỏ lên phiến chuyên dụng; Ủ phiến; Xử lý phiến sau gắn rồi cũng pha mẫu và làm

các bước tương như quy trình của kit thương mại Tuy nhiên kit tự gắn thì bước rửa nên rửa bằng tay để hạn chế sự bong tróc các kháng nguyên/kháng thể đã gắn trên giếng

- Tính kết quả: Theo phần mềm chuyên dụng được công nhận

1.3.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp

Đây là dạng đơn giản nhất trong các kỹ thuật ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt phiến và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme) Các bước thực hiện được

mô tả khái quát trong Hình 1.6

Hình 1.6 Sơ đồ thực hiện kỹ thuật ELISA trực tiếp

Gắn kháng nguyên vào phiến ELISA

 Ưu điểm: Đơn giản (chỉ cần kháng thể gắn enzyme, cơ chất và dung dịch dừng phản ứng); Nhanh (chỉ vài bước đã có kết quả); Hạn chế xảy ra phản ứng chéo

vì chỉ sử dụng một loại kháng thể duy nhất

 Nhược điểm:

 Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thông thường kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (vị trí trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng một kháng thể gắn vào một epitope

 Phản ứng miễn dịch của kháng thể sơ cấp bị hạn chế bởi có gắn với enzyme đánh dấu hoặc các đuôi

 Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng nên mất thời gian và tốn kém… Không phù hợp cho các vắc xin đa type

Từ những ưu và nhược điểm trên nên phương pháp này thường được dùng để phát hiện nhanh kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm và rất ít được lựa chọn trong việc định lượng

1.3.3 Kỹ thuật ELISA gián tiếp

Trong kỹ thuật này kháng thể kết hợp kháng nguyên không được gắn enzyme

mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

 Ưu điểm:

 Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên (nhất là các vắc xin đa type) nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

 Phản ứng miễn dịch của kháng thể sơ cấp không bị hạn chế bởi nó không gắn với enzyme đánh dấu hoặc các đuôi

 Độ nhạy/độ đặc hiệu được tăng lên vì mỗi kháng thể sơ cấp có chứa một số epitope có thể gắn với kháng thể thứ cấp được đánh dấu enzyme

 Nhược điểm:

 Độ đặc hiệu của từng kháng thể là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thử nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng thể khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

 Phản ứng chéo có thể diễn ra với kháng thể thứ cấp tạo phản ứng không đặc hiệu (dương tính giả cao)

 Quy trình kéo dài thêm 1 bước ủ

Các bước thực hiện được mô tả khái quát trong Hình 1.7

Hình 1.7 Sơ đồ kỹ thuật thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

Gắn kháng nguyên vào phiến ELISA

Từ những ưu-nhược điểm trên nên phương pháp này thường được dùng để phát hiện (nhanh) kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm và rất ít được lựa chọn trong việc định lượng

1.3.4 Kỹ thuật ELISA sandwich

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thử nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt giữ (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là ELISA sandwich trực tiếp (DAS-ELISA) và ELISA sandwich gián tiếp (TAS-ELISA)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là hai kháng nguyên HiB và HepB trong vắc xin phối hợp 5 thành phần (DTwP–HiB–HepB) (Vắc xin IVACPENTA) do Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế sản xuất

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện trong thời gian từ tháng 03/2019 đến tháng 06/2018 Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm thuộc Tổ Miễn dịch – Phòng Kiểm định – Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Nha Trang

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng Swiss: số lượng 80 con, chuột cái, 4-5 tuần tuổi, trọng lượng 15-17 g/con có nguồn gốc từ trại chăn nuôi động vật thí nghiệm Suối Dầu (IVAC) Mỗi hộp được gắn nhãn chứa đầy đủ thông tin Trong mỗi hộp chuột, từng con được đánh 2 dấu trên thân để phân biệt theo từng nhóm và từng chuột Trong suốt thời gian làm thí nghiệm, chuột được nuôi trong điều kiện phòng nuôi khép kín, có kiểm soát môi trường và điều kiện vi khí hậu

Thỏ: số lượng 20 con, 5-6 tháng tuổi, trọng lượng 1,7-2,2 kg/con, có nguồn gốc từ trại chăn nuôi động vật thí nghiệm Suối Dầu (IVAC) Cả 2 giới được chia đều cho mỗi nhóm

2.2.2 Vắc xin và sinh phẩm

- Vắc xin thử nghiệm: Vắc xin IVACPENTA

- Vắc xin đối chứng: Vắc xin COMBE-FIVE

- Vắc xin viêm gan B mẫu chuẩn quốc gia (REF)

- Bộ kit định tính / định lượng kháng thể bề mặt viêm gan B (Hepatitis B surface

antibody – HBsAb) (Dia.Pro Diagnostic Bioprobes Srl – Italy)

- Huyết thanh thỏ đối chứng âm với kháng HiB