Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường xung quanh khu vực lồng cá tôm tại vịnh nha trang

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: ―Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường quanh khu vực lồng cá, tôm tại vịnh Nha Trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI

KHUẨN GÂY BỆNH CƠ HỘI PHÂN LẬP Ở MÔI TRƯỜNG

XUNG QUANH KHU VỰC LỒNG CÁ TÔM

TẠI VỊNH NHA TRANG

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Kim Hạnh

Th.S Văn Hồng Cầm Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trúc Hà

Mã số sinh viên: 57137123

Khánh Hòa, năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI

KHUẨN GÂY BỆNH CƠ HỘI PHÂN LẬP Ở MÔI TRƯỜNG

XUNG QUANH KHU VỰC LỒNG CÁ TÔM

TẠI VỊNH NHA TRANG

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Kim Hạnh ThS Văn Hồng Cầm Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trúc Hà

Mã số sinh viên: 57137123

Khánh Hòa, tháng 07 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: ―Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của

vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường quanh khu vực lồng cá, tôm tại

vịnh Nha Trang‖ là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công

bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Nha Trang, tháng 7 năm 2019 Sinh viên thực hiện

Trần Thị Trúc Hà

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Kim Hạnh, phòng Sinh Thái biển_ Viện Hải dương học, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện, cung cấp kiến thức chuyên môn, hỗ trợ, tận tâm góp ý và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá

Tôi xin cảm ơn ThS Văn Hồng Cầm và ThS Nguyễn Thị Kim Cúc, giảng viên bộ môn Sinh Học,Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại Học Nha Trang

là người đã truyền dạy kinh dày dặn và tận tâm chỉ bảo, luôn chia sẻ và quan tâm để tôi hoàn thành tốt nhất đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trường Đại Học Nha Trang đã luôn quan tâm, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức và góp ý những kinh nghiệm quý giá để nền vững chắc cho tôi thực hiện nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các Cô, Chú và các anh chị cán bộ đang công tác tại phòng Sinh thái biển_ Viện Hải dương học đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình và tập thể lớp 57CNSH thân thương đã luôn giúp đỡ, quan tâm và gắn bó trong suốt những năm tháng học tập và rèn luyện

Xin chân thành cảm ơn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về kháng sinh 4

1.1.1 Lịch sử hình thành chất kháng sinh 4

1.1.2 Phân loại kháng sinh 4

1.1.3 Tình hình sử dụng kháng sinh 11

1.2 Hiện tượng kháng kháng sinh 14

1.2.1 Khái niệm hiện tượng kháng kháng sinh 14

1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh 14

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội 17

CHƯƠNG 2 20

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp chung 21

2.2.2 Phương pháp thu mẫu 21

2.3 Phân lập vi khuẩn từ mẫu nước và trầm tích 22

2.4 Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 23

2.5 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 26

2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 28

2.7 Phương pháp xử lí số liệu 28

CHƯƠNG 3 29

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh cơ hội trong mẫu nước và trầm tích 29

3.2 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập……… 31

3.2.1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường nước 31

3.2.2 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong trầm tích 33

3.3 Kết quả định danh vi khuẩn kháng cả 5 loại kháng sinh 36

3.3.1 Đặc điểm sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh 37

3.3.2 Định danh vi khuẩn 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

KẾT LUẬN……… 41

ĐỀ XUẤT……… 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Tài liệu Tiếng Anh 43

Tài liệu Internet 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 5

Bảng 1.2 Bảng phân chia nhóm Pennicilin và phổ kháng khuẩn 6

Bảng 1.3 Bảng phân chia thế hệ Cephalosporin và phổ kháng khuẩn 7

Bảng 1.4 Bảng phân chia thể hệ Quinolon và phổ kháng khuẩn 10

Bảng 2.1 Pha loãng ½ nồng độ kháng sinh……… 24

Bảng 2.2 Đọc kết quả bộ kit Api 20E……… 28

Bảng 3.1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong môi trường nước ở Đầm Bấy và Hòn Miễu ………32

Bảng 3.2 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong nước ở 3 khoảng cách khác nhau từ lồng nuôi tôm/cá (0m, 100m và 200m) ở Đầm Bấy và Hòn Miễu ……… 33

Bảng 3.3 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong trầm tích ở Đầm Bấy và Hòn Miễu……… 34

Bảng 3.4 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong trầm tích thu ở 6 khoảng cách khác nhau từ lồng nuôi tôm/cá (0m, 25m, 50m, 100m, 150m và 200m) ở Đầm Bấy và Hòn Miễu ……… 36

Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm sinh hóa……… 39 Bảng 3.6 Kết quả định danh vi khuẩn kháng lại 5 loại kháng sinh thử nghiệm….40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế sự kháng kháng sinh……….15

Hình 2 1 Bản đồ thu mẫu (A) Vị trí 2 khu vực thu mẫu Hòn Miễu và Đầm Bấy, (B) Sơ đồ thu mẫu nước và trầm tích dưới lồng nuôi tôm cá 20

Hình 2 2 Pha loãng mẫu……… 22

Hình 2 3 Phương pháp cấy ria 23

Hình 2 4 Cách pha loãng nồng độ kháng sinh 24

Hình 2 5 Giếng pha loãng kháng sinh 26

Hình 2 6 Dãy phản ứng sinh hóa của bộ kít API 20E 26

Hình 2 7 Thuốc thử James,TDA, VP1, VP2 27

Hình 3.1 a: Chủng Vibrio, b: Chủng Salmonella- Shigella, c: Chủng Aeromonas 29

Hình 3.2 Số vi khuẩn phân lập được từ mẫu nước biển 30

Hình 3.3 Số vi khuẩn phân lập được từ mẫu trầm tích 30

Hình 3.4 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu nước ở Đầm Bấy………… 32

Hình 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu nước ở Hòn Miễu……….32

Hình 3.6 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu trầm tích ở Đầm Bấy… …….35

Hình 3.7 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ mẫu trầm tích ở Hòn Miễu……… 35

Hình 3.8 a: TCBS_HM200m b: SS_HM200m……… 37

Hình 3.9 Kết quả xác định đặc điểm sinh hóa của chủng TCBS_HM200m……….37

Hình 3.10 Kết quả xác định đặc điểm sinh hóa của chủng SS_HM200m… …… 38

Hình 3.11 Kết quả thử nghiệm oxidase……… 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ khi kháng sinh Penicillin được Alexander Fleming phát hiện ra và nối tiếp những thành công đó thì hàng trăm loại kháng sinh đã được phát hiện và đưa vào sử dụng Sự ra đời của kháng sinh mở ra thế giới cho các nhà khoa học nghiên cứu, đặc biệt là cho ngành y học về điều trị bệnh Song song đó, kháng sinh còn được sử dụng phổ biến trong các ngành có giá trị kinh tế như: chăn nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản, trồng trọt để phòng ngừa các dịch bệnh và đem lại hiệu quả cao về năng suất Tuy nhiên, việc lạm dụng và sử dụng thuốc kháng sinh bừa bãi trong y tế cũng như các hoạt động kinh tế khác có thể dẫn đến những hậu quả khôn lường Hiện nay, một lượng rất lớn các chất kháng sinh bị thải ra môi trường từ nhiều nguồn khác nhau, ví dụ như chất thải từ các khu trồng trọt, nuôi trồng thuỷ hải sản hoặc từ nguồn thải bệnh viện, trung tâm y tế, các cơ sở chăn nuôi gia súc…

Vịnh Nha Trang với diện tích hơn 500 km2, gồm 19 đảo lớn nhỏ, vịnh quy tụ hầu hết các hệ sinh thái điển hình như rạn san hô, thảm cỏ biển, rừng ngập mặn, hệ vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng (https://vi.wikipedia.org/wiki/Nha_Trang) Đầm Bấy và Hòn Miễu được chọn làm địa điểm lấy mẫu dựa trên các hoạt động nuôi trồng thuỷ hải sản lồng bè mạnh mẽ ở nơi đây Trong đó, khu vực Đầm Bấy được quy hoạch vùng nuôi công nghiệp với diện tích 25 ha với khoảng 120 lồng nuôi Tại Hòn Miễu các lồng bè nuôi trồng truyền thống được phát triển với diện tích khoảng 14 ha với khoảng 100 bè nuôi Cộng thêm điều kiện thiên nhiên ưu đãi tốt như: độ mặn cao và ổn định quanh năm nên các hoạt động nuôi trồng thuỷ sản ở nơi đây diễn ra rất mạnh mẽ và thu về sản lượng cao cho tiêu dùng lẫn xuất khẩu Tuy nhiên, việc xuất khẩu các sản phẩm thuỷ hải sản của Việt Nam đã từng bị ngưng trệ tại thị trường các nước EU do việc sử dụng quá nhiều chất kháng sinh trong nuôi trồng và vấn nạn ô nhiễm vùng biển quanh khu vực lồng bè (Gräslund và Bengtsson, 2001) Trong một công bố của nhóm nghiên cứu từ Đại học Stockholm, Thuỵ Điển đã có báo cáo về tình hình sử dụng các chất kháng sinh trong các lồng bè nuôi trồng thuỷ sản tại vịnh Nha Trang Trong đó, kết quả của công bố này cho thấy một lượng lớn các chất kháng sinh khác nhau như: Tetracycline, Trimethoprim, Rifampicine, Nifuroxazide và Colistine đã được dùng trong hoạt động nuôi trồng thuỷ hải sản ở vùng này Cụ thể: trung bình khoảng 555g kháng sinh được dùng cho mỗi tấn cá sản xuất và 5.555g kháng sinh cho mỗi tấn tôm hùm nuôi (Hedberg và

cs, 2018) Một phần đáng kể, dư lượng kháng sinh bị thải ra ngoài vùng nước xung quanh, lắng đọng ở trầm tích xunh quang lồng nuôi; và gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của các hệ sinh thái xung quanh (ví dụ như san hô, các loài cá tự nhiên, rong, tảo…) thông qua việc thay đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật sống cùng (Lalumera và cs,

dẫn đến sự phát triển của hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn, vi khuẩn gây bệnh chuyển gene ngang gây bệnh cho vi khuẩn khác hoặc gây bệnh cho con người (Rico và cs, 2017) Trước những thực trạng về việc sử dụng các chất kháng sinh một cách thiếu kiểm soát và mức độ nguy hại đối với sức khoẻ cộng đồng thì việc tìm hiểu và nghiên cứu về việc sử dụng các chất kháng sinh trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản và đánh giá mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các vùng nuôi là một điều hết sức cấp thiết

Vấn đề kháng kháng sinh không phải là chủ đề mới nhưng đang là cấp bách đòi hỏi phải có sự nổ lực để nhân loại không phải gánh chịu hậu quả về vấn đề lạm dụng kháng sinh Do đó nghiên cứu: ― Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường quanh khu vực lòng nuôi cá tại Vịnh Nha Trang‖ có ý nghĩa quan trọng để có thể xác định những khu vực ảnh hưởng bởi kháng sinh xung quanh khu vực lồng nuôi cá từ đó có giải pháp quản lý và phát triển nuôi trồng thuỷ sản một cách an toàn, hiệu quả và bền vững

Mục tiêu của luận văn:

Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường quanh khu vực lồng cá, tôm từ đó xác định những khu vực bị ảnh hưởng bởi kháng sinh quanh khu vực nuôi cá, tôm để đề xuất những biện pháp quản lý và góp phần tạo một môi trường biển trong sạch

Nội dung nghiên cứu:

 Đánh giá độ nhạy cảm của vi khuẩn phân lập được từ môi trường quanh khu vực nuôi (nước, trầm tích) đối với một số kháng sinh sử dụng phổ biến ở khu vực lồng nuôi cá, tôm

 Định danh vi khuẩn có khả năng kháng các loại kháng sinh thử nghiệm

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nước biển và trầm tích tại Hòn Miễu và Đầm Bấy_ Vịnh Nha Trang

Đề tài được thực hiện tại phòng Sinh thái biển_ Viện Hải Dương học số 1 Cầu Đá, Vĩnh Nguyên, Nha Trang

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

Ý nghĩa khoa học:

Kết quả của đề tài góp phần bổ sung vào nguồn tư liệu nghiên cứu khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập ở môi trường quanh khu vực lòng nuôi cá tại Vịnh Nha Trang

Ý nghĩ thực tiễn:

Kết quả đề tài góp phần xác định những khu vực xung quanh lồng nuôi cá tôm bị ảnh hưởng bởi kháng sinh và tạo môi trường nuôi trồng thủy sản an toàn, hiệu quả

và vững mạnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh

và tinh chế Penicilin đã được phát hiện nhờ Chain và Florey ở trường đại học Oxfoxd (Anh)

Vào những năm đầu thập kỉ 40 của thế kỉ XX gắn liền với việc sản xuất hàng loạt chất kháng sinh, đầu tiên là Penicilin, sau đó là Streptomicin (1943), Tetracylin (1950), Erythromycin (1953), Methicilin (1960), Gentamycin (1967), Vancomycin (1972), Imipenem and Ceftazidime (1985), Levofloxacin (1996) và nhiều loại kháng sinh mới khác (Lương Đức Phẩm, 1998) Đa phần các kháng sinh thương

mại được sản xuất từ các chủng Streptomyces spp (Weber và cs, 2003)

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Trong 80 năm qua, có hơn 140 loại kháng sinh được phát triển và sử dụng ở người (Spellberg, 2009) Có nhiều cách phân loại kháng sinh, dựa vào cấu trúc hóa học

chia làm 9 nhóm kháng sinh

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học (Nguyễn Thị Xuyên và cs,

2015; Bùi Thị Tho và cs, 2003)

Các Cephalosporin Các Beta-lactam khác:

- Carbapenem

- Monobactam

- Các chất ức chế lactamase

1.1.2.1.1 Phân nhóm Penicilin

Pennicilin G trong nhóm Penicilin được chiết xuất từ môi trường Penicilium nên nó

là kháng sinh tự nhiên còn lại đều là kháng sinh bán tổng hợp

Dựa vào phổ kháng khuẩn, có thể tiếp tục phân loại các kháng sinh nhóm Penicilin thành các phân nhóm với phổ kháng khuẩn tương ứng như sau (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Bảng phân chia nhóm Penicilin và phổ kháng khuẩn (Nguyễn Thị Xuyên

Các Penicilin phổ kháng khuẩn trung

bình

Phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn

Gram âm như E coli, Haemophilus

influenzae Do không bền vững với

enzyme Lactamase nên thường được kết hợp với các chất ức chế như: acid clavulanic hay sulbactam

Pseudomonas, Enterobacter Có hoạt

tính mạnh hơn so với Ampicilin trên

cầu khuẩn Gram dương và Listeria

monocytogenes, kém hơn Piperacilin

trên Pseudomonas Còn kháng sinh

như Mezlocilin, Piperacilin có phổ kháng khuẩn trên các chủng

Pseudomonas, Klebsiella và một số

chủng vi khuẩn Gram âm khác

1.1.2.1.2 Phân nhóm Cephalosporin

Các Cephalosporin khác nhau được hình thành bằng phương pháp bán tổng hợp Nhóm Cephalosporin được chia thành bốn thế hệ Sự phân chia này dựa vào phổ kháng khuẩn của kháng sinh, được xếp theo thứ tự từ thế hệ 1 đến thế hệ 4, hoạt tính trên vi khuẩn Gram dương giảm dần và hoạt tính trên vi khuẩn Gram âm tăng dần (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Bảng phân chia thế hệ Cephalosporin và phổ kháng khuẩn (Nguyễn Thị Xuyên và cs 2015; Bùi Thị Tho và cs 2003)

Cephalosporin thế hệ 1

Có hoạt tính mạnh trên các chủng vi khuẩn Gram dương nhưng hoạt tính tương đối yếu trên các chủng vi khuẩn Gram âm

Cephalosporin thế hệ 2 Có hoạt tính mạnh hơn trên vi khuẩn

Gram âm so với thế hệ 1

Cephalosporin thế hệ 3

Có hoạt tính mạnh trên vi khuẩn họ Enterobacteriaceae nhưng có hoạt tính kém hơn thế hệ 1trên cầu khuẩn Gram dương

Cephalosporin thế hệ 4

Có phổ tác dụng rộng hơn so với thế hệ

3 và bền vững hơn với các lactamase, có hoạt tính trên cả chủng Gram âm và Gram dương

1.1.2.2 Kháng sinh nhóm Aminoglycosid

Các Aminosid được phân lập từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật nên là sản phẩm tự

nhiên, một số khác cũng có thể là bán tổng hợp Kháng sinh thuộc nhóm này bao

gồm: Kanamycin, Gentamycin, Neltimicin, Tobramycin, Amikacin

Các kháng sinh nhóm Aminoglycosid có phổ kháng khuẩn chủ yếu tập trung trên

trực khuẩn Gram âm, tuy nhiên phổ kháng khuẩn của các thuốc trong nhóm không

hoàn toàn giống nhau

Kháng sinh nhóm Aminoglysid có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram âm,

phổ kháng khuẩn của mỗi loại kháng sinh là khác nhau Kanamycin có phổ kháng

khuẩn hẹp không có tác dụng trên Serratia hoặc P aeruginosa Tobramycin và

Gentamycin có hoạt tính tương tự nhau trên các trực khuẩn Gram âm, với

Tobramycin có tác dụng mạnh hơn trên P aeruginosa và Proteus spp., trong khi

Gentamycin mạnh hơn trên Serratia

1.1.2.3 Kháng sinh nhóm Macrolid

Kháng sinh nhóm Macrolid có tên thương mại là Nitrofurantoin có thể là sản phẩm

tự nhiên khi được phân lập từ môi trường nuôi cấy, cũng có thể là kháng sinh bán

tổng hợp Dựa vào cấu trúc hóa học chia làm 3 phân nhóm: thứ nhất, cấu trúc 14

nguyên tử carbon: Erythromycin, Oleandomycin, Roxithromycin, Clarithromycin,

Dirithromycin Thứ hai, cấu trúc 15 nguyên tử carbon: Azithromycin Thứ ba, cấu

trúc 16 nguyên tử carbon: Spiramycin, Josamycin

Phổ kháng khuẩn của nhóm này hẹp, tập trung trên các chủng Gram dương như

Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae, Listeria Monocytogenes

Có hoạt tính tốt trên vi khuẩn nội bào như Campylobacter jejuni, M pneumoniae,

Legionella pneumophila,…

1.1.2.4 Kháng sinh Lincosamid

Bao gồm 2 loại kháng sinh: Clindamycin và Lincomycin Trong đó, Clindamycin là

kháng sinh bán tổng hợp từ Lincomycin, còn Lincomycin là kháng sinh tự nhiên

Lincosamid phổ kháng khuẩn hẹp, có hoạt tính trên chủng Pneumococci,

S pyogenes, và Viridans streptococci, S aureus nhưng hoạt tính yếu trên chủng

S.aureus kháng Methicilin Mất hoạt tính trên trực khuẩn Gram âm hiếu khí như

Pseudomonas aeruginosa,… Kháng sinh Lincosamid có tác dụng tốt trên một số

chủng vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là B fragilis Kháng sinh nhóm này chỉ tác dụng

yếu hoặc không có tác dụng trên các chủng vi khuẩn không điển hình như

M pneumoniae hay Chlamydia spp

1.1.2.5 Kháng sinh Phenicol

Bao gồm 2 loại kháng sinh: Cloramphenicol và Thiamphenicol, trong đó

Cloramphenicol là kháng sinh tự nhiên, còn Thiamphenicol là kháng sinh tổng hợp

Pheniol có phổ kháng khuẩn rộng, có hoạt tính bao gồm trên Gram dương và một số

vi khuẩn Gram âm như: H influenzae, N meningitidis, N gonorrhoeae,

Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Shigella)

Cũng có tác dụng trên vi khuẩn kỵ khí như: Clostridium spp, B fragilis và một số vi

khuẩn không điển hình như: Mycoplasma, Chlamydia, Rickettsia

Hiện nay nhóm Phenicol không còn được sử dụng phổ biến do tỷ lệ vi khuẩn kháng

lại nhóm này cao và nhóm này có độc tính trong quá trình tạo màu

1.1.2.6 Kháng sinh nhóm Tetracyline (Cyclin)

Bao gồm các kháng sinh: Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Demeclocyclin,

Methacyclin, Doxycyclin, Minocyclin

Phổ kháng khuẩn của nhóm Tetracyline rộng có tác dụng trên cả Gram dương và

Gram âm và trên vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí Có tác dụng trên các chủng vi khuẩn

gây bệnh không điển hình như Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma

pneumoniae, Chlamydia spp.,… và có tác dụng trên một số xoắn khuẩn như

Borrelia recurrentis, Borrelia burgdorferi (gây bệnh Lyme), Treponema pallidum

(giang mai), Treponema pertenue Cyclin là nhóm kháng sử được sử dụng rộng rãi

từ rất lâu nên tỷ lệ vi khuẩn kháng rất cao

1.1.2.7 Kháng sinh nhóm Peptid

Kháng sinh nhóm này bao gồm 3 loại: Glycopeptid (Vancomycin, Teicoplanin), Polypeptid

(Polymyxin, Colistin), Lipopeptid (Daptomycin)

Kháng sinh Glycopeptid gồm 2 kháng sinh Vancomycin và Teicoplanin, có nguồn gốc tự

nhiên Hai kháng sinh này có phổ tác dụng cũng tương tự nhau, chủ yếu trên các chủng vi

khuẩn Gram dương (S aureus, S epidermidis, Bacillus spp., Corynebacterium spp…); phần

lớn các chủng Actinomyces và Clostridium nhạy cảm với kháng sinh Và không có tác dụng

trên trực khuẩn Gram âm và Mycobacteria Sử dụng chủ yếu trong điều trị S aureus kháng

Methicilin

Kháng sinh Polypeptid bao gồm Polymyxin B (hỗn hợp của Polymyxin B1 và B2)

và Colistine (hay còn gọi là Polymyxin E) Các kháng sinh này đều có nguồn gốc tự nhiên Polypeptid có phổ kháng khuẩn hẹp chỉ tập trung trên trực khuẩn Gram âm,

bao gồm Enterobacter, E coli, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Bordetella, và

Shigella, cũng có tác dụng trên phần lớn các chủng P aeruginosa, Acinetobacter

Kháng sinh Lipopeptid được sử dụng là Daptomycin, đây là kháng sinh tự nhiên chiết xuất từ

môi trường nuôi cấy Streptomyces roseosporus Lipopeptid có phổ kháng khuẩn có tác dụng trên vi khuẩn Gram dương hiếu khí và kỵ khí như Staphylococci, Streptococci,

Enterococcus, Corynebacterium spp., Peptostreptococcus, Propionibacteria, Clostridium perfringens…

1.1.2.8 Kháng sinh nhóm Quinolon

Kháng sinh nhóm này được sản xuất bằng tổng hợp hóa học Dựa vào phổ kháng khuẩn chia thành 4 thế hệ:

Bảng 1.4 Bảng phân chia thể hệ Quinolon và phổ kháng khuẩn

Thế hệ 1 Acid Nalidixic, Cinoxacin

Tác dụng trên vi khuẩn Gram âm họ

Enterobacteriaceae ở mức độ trung bình

Thế hệ 2

Loại1 Lomefloxacin, Norfloxacin, Enoxacin

Phổ kháng khuẩn tác dụng trên vi khuẩn Gram âm học Enterobacteriaceae

Loại 2 Ofloxacin, Ciprofloxacin

Phổ kháng khuẩn rộng hơn loại 1, có tác dụng trên vi khuẩn gây bệnh không điển hình Ciprofloxacin có tác dụng trên vi

khuẩn P aeruginosa Không có tác dụng

trên phế cầu và các vi khuẩn Gram dương

Thế hệ 3 Levofloxacin, Sparfloxacin,

Gatifloxacin, Moxifloxacin

Khác với thế 2, thế hệ 3 có tác dụng trên phế cầu và vi khuẩn Gram dương ngoài

ra vẫn có tác dụng trên vi khuẩn họ Enterobacteriaceae

Thế hệ 4 Trovafloxacin

Phổ kháng khuẩn rộng trên cả vi khuẩn Enterobacteriaceae, vi khuẩn kỵ khí,

Streptococci, P aeruginosa, vi khuẩn

không điển hình, S aureus nhạy cảm với

Methicilin

1.1.2.9 Các nhóm kháng sinh khác

Nhóm Co-trimoxazol là dạng sinh được kết hợp bởi kháng sinh Sulfamethoxazol với Trimethoprim, phổ kháng khuẩn của 2 loại kháng sinh này ức chế vi khuẩn tổng hợp acid folic Do đó phổ kháng khuẩn Co-trimoxazol khá rộng có tác dụng trên cả

vi khuẩn Gram âm và Gram dương Kháng sinh này được đưa vào sử dụng khá lâu

nên tỷ lệ vi khuẩn kháng lại cao điển hình như: Pseudomonas aeruginosa,

Bacteroides fragilis, và Enterococci

Nhóm Oxazolidinon đây là kháng sinh tổng hợp hóa học, điển hình là Linezolid Có

tác dụng trên các vi khuẩn Gram dương như Staphylococci, Streptococci,

Enterococci, cầu khuẩn Gram dương kỵ khí, Corynebacterium spp.,… Không có tác

dụng trên chủng Gram âm kỵ khí và hiếu khí

Kháng sinh nhóm 5-nitro-imidazol có nguồn gốc hóa học và có tác dụng trên hầu

hết các vi khuẩn kỵ khí như Bacteroides, Clostridium,…

1.1.3 Tình hình sử dụng kháng sinh

1.1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam

Ngày nay, kháng sinh đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới Kháng sinh mở đường cho sự phát triển của y học, trong hệ thống y học không thể thiếu kháng sinh (Laxminarayan và cs, 2013) Theo nghiên cứu của Zarb và cs, 2018 trên 303 bệnh viện của 53 quốc gia tỷ lệ sử dụng kháng sinh tại các bệnh viện ở Châu Phi là cao nhất với tỷ lệ 50%, thấp nhất ở Đông Âu với tỷ lệ 27,4% Đã có báo cáo về chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng lại kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 tại các nước Barbados, Jamaica và Trinidad (Pereira và cs, 2004) Cuộc khảo sát tự dùng thuốc kháng sinh ở thành phố Yogyakarta, Indonesia thuốc kháng sinh được mua mà không cần dùng toa tại cái hiệu thuốc là 64%, loại dùng phổ biến nhất là Amoxicillin với tỷ lệ 77% Ngoài ra, kháng sinh Ampicilline, Fradiomisin-gramisidin, Tetracycline và Ciprofloxacin để điều trị các triệu chứng sau: cảm lạnh thông thường bao gồm ho và viêm họng, đau đầu và các triệu chứng khác (Widayati

và cs, 2011) Điều đáng lo ngại ở đây là việc lạm dụng kháng sinh quá nhiều dẫn đến những hệ lụy nghiêm trọng như vi khuẩn sẽ kháng lại thuốc, gây ảnh hưởng đến môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người, hiển nhiên không phải bệnh gì dùng thuốc kháng sinh cũng khỏi, nếu lạm dụng sẽ nguy hại đến sức khỏe

Năm 2015, theo Cục Thú Y khảo sát 139 cơ sở sản xuất cá giống của 3 tỉnh (Bến Tre, Đồng Tháp và An Giang) cho thấy có 75,94% cơ sở sử dụng kháng sinh, bao gồm cả sử dụng kháng sinh nguyên liệu (30,69% trong tổng số cơ sở sử dụng kháng

sinh) Có 40% cơ sở sử dụng kháng sinh phòng bệnh hoặc cả trị bệnh (Dân trí, thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, 2016)

Tháng 1 vừa qua, FDA đã từ chối 32 lô hàng xuất khẩu tôm từ Ấn Độ Trong số 32

lô tôm bị từ chối nhập khẩu đã có 26 lô do liên quan đến kháng sinh bị cấm Ngoài việc từ chối tôm Ấn Độ bị nhiễm kháng sinh, FDA đã báo cáo từ chối 6 lô hàng tôm

khác từ Ấn Độ do sự hiện diện của Salmonella vào tháng 1/2019 (tepbac, tôm Ấn

Độ bị từ chối do dư lượng kháng sinh tăng đột biến, 2019) Theo Rio Praaning Prawira Adiningrat, Tổng thư ký của Tổ chức International Advise International ngành nuôi trồng thủy sản chịu trách nhiệm về một lượng lớn thuốc kháng sinh, ông cũng cho biết thêm khoảng 90% vi khuẩn ở nước biển kháng với ít nhất một kháng sinh và lên đến 20% vi khuẩn kháng với ít nhất năm kháng sinh Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAO) của Liên Hợp Quốc, các lô hàng thủy sản có dư lượng kháng sinh chiếm 28% số lô hàng thủy sản EU từ chối nhập khẩu và 20% số lượng thủy sản Hoa Kỳ từ chối nhập khẩu (Tổng cục thủy sản, Nguy cơ kháng kháng sinh đang tăng lên đối với nuôi trồng thủy sản, 2018)

Những khó khăn mà nền kinh tế mới nổi như Việt Nam phải đối mặt trong việc kiểm soát sử dụng kháng sinh do gánh nặng về các bệnh truyền nhiễm cao và phương phức tiếp cận kháng sinh còn hạn chế (Nguyễn Văn Kính, 2010) Theo cuộc khảo sát thuốc kháng sinh và vi khuẩn kháng kháng sinh của cộng đồng trẻ em người Việt tại Ba Vì kháng sinh được sử dụng phổ biến Ampicillin 74%, Penicillin 12%, Amoxycillin 11%, Erythromycin 5%, Tetracycline 4% và Streptomycin 2% (Larsson và cs, 2000)

Dương Thị Toan và cs, 2014 báo cáo về tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trang trại trên địa bàn tỉnh Bắc Giang thí nghiệm được thực hiện tại 20 trang trại nuôi lợn thịt và gà thịt có trên 17 loại kháng sinh được sử dụng trong các trang trại chăn nuôi Trong đó, trại nuôi lợn thịt có 6 loại kháng sinh được sử dụng phổ biến là Norfloxacine (60,0%), Tylosine (60,0%), Gentamycine (55,0%), Colistine (45,0%), Enrofloxacine (40,0%), Streptomycine (35,0%) và 6 loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong các trại chăn nuôi gà thịt là Doxycycline (55,0%), Tiamuline (50,0%), Tylosine (45,0%), Colistine (40,0%), Enrofloxacine (40,0%), Chlotetracycline (35,0%)

Trong một công bố của nhóm nghiên cứu từ Đại học Stockholm, Thuỵ Điển đã có báo cáo về tình hình sử dụng các chất kháng sinh trong các lồng bè nuôi trồng thuỷ sản tại vịnh Nha Trang Trong đó, kết quả của công bố này cho thấy một lượng lớn các chất kháng sinh khác nhau như: Tetracycline, Trimethoprim, Rifampicine, Nifuroxazide và Colistine đã được dùng trong hoạt động nuôi trồng thuỷ hải sản ở

vùng này Cụ thể: trung bình khoảng 555g kháng sinh được dùng cho mỗi tấn cá sản xuất và 5.555g kháng sinh cho mỗi tấn tôm hùm nuôi (Hedberg và cs., 2018)

1.1.3.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong ngành nuôi trồng thủy sản

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hiệp quốc, ngành nuôi trồng thủy sản có xu hướng phát triển nhanh và đóng vai trò quan trọng về vấn đề thực phẩm góp phần xây dựng kinh tế Tổ chức FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) cho biết, ngành nuôi trồng thủy sản đã có những tác động đáng kể đến nguồn cung cá của thế giới, đạt mức cao kỷ lục 20 kg vào năm 2014 nhờ sự tăng trưởng ổn định của nuôi trồng thuỷ sản Lần đầu tiên, các hoạt động nuôi trồng thủy sản có trách nhiệm đóng góp nhiều cá cho tiêu dùng của con người hơn so với các đối tác khai thác tự nhiên vào năm 2014, thu hoạch được 73,8 triệu tấn thủy sản trong năm với giá trị bán hàng ước tính đầu tiên là 160,2 tỷ USD (131,3 tỷ EUR) (Tổng cục thủy sản, nuôi trồng thủy sản thế giới, 2016) Theo báo cáo của Vũ Trường Tôn và cs, 2011 về tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nước ngọt ở đồng bằng sông Hồng ( ĐBSH) và đồng bằng sông Cửu Long ( ĐBSCL) có tới 23 trong 24 loại kháng sinh được sử dụng trong điều trị bệnh cho cá (16 loại sử dụng ở vùng ĐBSH và 18 loại sử dụng ở ĐBSCL) Trong khi đó chỉ có 9 loại kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh tôm (2 loại được sử dụng ở vùng ĐBSH và 9 loại sử dụng ở ĐBSCL) Đa số kháng dùng để điều trị bệnh và rất ít loại kháng sinh sử dụng với mục đích phòng bệnh Các kháng sinh nhóm Tetracycline, Sulfamide, các (Fluoro)Quionolone được sử dụng phổ biến nhất Sulphamethazole thuộc nhóm Sulfamide được sử dụng rất rộng rãi (chiếm 41,49% số hộ điều tra sử dụng) và đa số sử dụng kết hợp với Trimethoprim.Tiếp theo là Oxytetracylin, có tới 30,85% số hộ có sử dụng để phòng trị bệnh cho tôm cá

Số hộ sử dụng từ 1 – 2 loại kháng sinh trong điều trị bệnh chiếm tỷ lệ 38,3%, từ 3 –

4 loại kháng sinh chiếm 24,47% và có 9,57% số hộ sử dụng từ 5 – 7 loại kháng sinh khác nhau

Việc sử dụng kháng sinh ở Việt Nam nói chung và trong ngành nuôi trồng thủy sản

ở Việt Nam nói riêng đang rất phổ biến và được coi là giải pháp để giải quyết một

số vấn đề giảm và ngăn ngừa một số loại bệnh và giúp tăng năng suất ở thủy sản Bên cạnh đó, việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đang ở mức báo động Tính từ đầu năm 2014 đến tháng 9/2015, cả nước đã có gần 32.000 tấn hàng thủy sản bị trả về do nhiễm kháng sinh cấm, vi sinh và các loại tạp chất khác, cũng như vi phạm một số quy định nhập khẩu 9 tháng đầu năm 2015, 542 lô hàng thủy sản của 110 công ty xuất khẩu bị 38 nước nhập khẩu trả về Còn theo báo cáo của

Tổ chức Phát triển công nghiệp của Liên Hợp quốc (UNIDO) ở 4 thị trường lớn EU,

Mỹ, Nhật Bản, Australia thì Việt Nam là một trong 3 nước đứng đầu về số vụ bị từ chối nhập khẩu sản phẩm thủy sản giai đoạn 2006 - 2010 Sở dĩ tình trạng sử dụng kháng sinh ngày càng tràn lan là do dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp Thống

kê cho thấy, tỷ lệ nuôi tôm thành công ở Việt Nam chỉ 30 - 35%, trong khi Ấn Độ, Thái Lan trên 70% Một số nhà khoa học cũng lên tiếng về dịch bệnh trên tôm khá phổ biến, vì tôm là loài khó nuôi, dễ bị bệnh Các cơ sở nuôi chưa tuân thủ đúng thời gian ngừng sử dụng trước khi thu hoạch, dẫn đến tồn dư kháng sinh trên tôm Trên địa bàn tỉnh Nghệ An, cùng với dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều, ngư dân

đã sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh để phòng trị bệnh, thường sử dụng nhất là

kháng sinh có dẫn xuất từ Oxytetraxylin để trị bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra

Một phần đáng kể, các loại kháng sinh này lại bị thải ra người vùng nước xung quanh, lắng đọng ở trầm tích xunh quang lồng nuôi; và gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của các hệ sinh thái xung quanh (ví dụ như san hô, các loài cá tự nhiên, rong, tảo…) thông qua việc thay đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật sống cùng (Lalumera và cs, 2005; Hedberg và cs, 2018) Quan trọng hơn, sự hiện diện của kháng sinh có thể dẫn đến sự phát triển của hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh

mà cuối cùng có thể trực tiếp gây bệnh ở người hoặc lây lan qua các mầm bệnh gây bệnh ở người thông qua cơ chế chuyển gene ngang (Rico và cs, 2017)

1.2 Hiện tượng kháng kháng sinh

Năm 1945, Alexander Fleming đã cảnh báo sự nguy hiểm khi lạm dụng kháng sinh:

―Những người lạm dụng Penicillin ngày hôm nay, họ phải chịu trách nhiệm cho cái chết của những bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng Penicillin sau này‖

1.2.1 Khái niệm hiện tượng kháng kháng sinh

Hiện tượng kháng kháng sinh (antibiotic resistance) là khả năng tự nhiên của vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng thích ứng với các loại kháng sinh và không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh Hay nói cách khác các vi sinh vẫn tồn tại và phát triển bình thường trong môi trường có kháng sinh (Bùi Thị Tho, 2003)

1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh

Cơ chế kháng lại kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc từ gene Các gene kháng lại kháng sinh hiện diện hoặc có trong nhiễm sắc thể hoặc trong yếu tố di động như plasmid, yếu tố chuyển đổi vị trí Cơ chế này bao gồm 4 cơ chế chính: ức chế bằng enyme, giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn, biến đổi vị trí gắn kết và bơm đẩy

Hình 1.1 Cơ chế sự kháng kháng sinh

1.2.2.1 Ức chế bằng enzyme

Vi khuẩn sản sinh ra enzyme làm phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh, làm kháng sinh trở nên vô hiệu

Sự sản sinh enzyme (sinh men) Beta-lactamase:

Các Beta-lactamase là các enzyme do vi khuẩn sinh ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid Các men này kháng lại kháng sinh rất hiệu quả Chúng làm mất hoạt lực các kháng sinh nhóm Beta-lactamine bằng cách phá hủy nối amide của vòng beta-lactam, kháng sinh không còn tác dụng lên tế bào vi khuẩn (Cloutier, 1995; Guardabbasi và Couvalin, 2006)

Còn có thể kể tới các enzyme khác có thể phân hủy các nhóm kháng sinh như: enzyme Chloramphenidol acetyltranferase, enzyme Erythromycine esterase, enzyme Aminoglycoside acetyltranferase,…

1.2.2.2 Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn

Đối với vi khuẩn Gram âm có cấu tạo thêm một lớp vỏ bên ngoài có tác dụng như một hàng rào che chở Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong vi khuẩn bằng cách khuếch tán thụ động qua các kênh vận chuyển Giảm tính thấm của tế bào làm giảm lượng lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng do biến đổi tính thấm lớp màng tế bào bên trong hoặc lớp màng bên ngoài của vi khuẩn (Van- Veen và Konings, 1997)

1.2.2.3 Biến đổi vị trí gắn kết

Mỗi loại kháng sinh có tác dụng và vị trí gắn khác nhau trên vi khuẩn một cách đặc hiệu Hiện tượng này là do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmide, theo cơ chế làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng Bao gồm:

Biến đổi các protein liên kết với penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với

các kháng sinh nhóm Beta-lactamines có thể do đột biến gene ở nhiễm sắc thể, hoặc

do mắc phải gene bên ngoài có các PBP mới Cơ chế này thường gặp với các cầu

khuẩn Gram dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumonia,

nhưng rất hiếm gặp ở vi khuẩn Gram âm Trong số các vi khuẩn Gram âm, cơ chế

đề kháng này được thấy ở vi khuẩn Neisseria và hiếm gặp hơn ở Haemophilus

influenza (Cloutier, 1995; Guardabbasi và Couvalin, 2006)

Biến đổi vị trí gắn kết ở ribosom: Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn vị

ribosom đích có thể làm giảm hoạt tính của các kháng sinh như: Macrolides, Clindamycine, nhóm Aminosides hoặc Chloramphenicol Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của

vi khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom

Biến đổi men DNA-gyrase và men topoisomerase: DNA-gyrase là men cần thiết

cho hoạt tính của kháng sinh nhóm Quinolone Sự đột biến nhất thời ở độc nhất một acid amine của DNA-gyrase gây ra đề kháng Tương tự như thế đối với các đột biến

ở men topoisomerase

Biến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng này có thể xảy

ra khi dùng kháng sinh Vancomycine, như trường hợp các cầu khuẩn đề kháng với Vancomycine

Biến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của men dihydropteroate synthetase kháng

lại sự gắn kết với Sulfamide và của men dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với Trimetoprime đồng thời gây ra kháng thuốc Sự đề kháng của các vi khuẩn Gram âm đối với các Sulfamide là do plasmide tạo các enzyme đề kháng

1.2.2.4 Bơm đẩy

Vi khuẩn chủ động bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào Các chất vận chuyển đẩy kháng sinh ra là các thành phần bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần thúc đẩy cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại kháng sinh Các bơm đẩy này cần năng lượng Việc tiếp xúc thuận lợi với chất kháng sinh làm tăng số lượng bơm

do đợt biến chất mang, làm tăng tính đề kháng của vi khuẩn Các vi khuẩn gây bệnh

trên lâm sàng có mang bơm đẩy thuốc ra ngoài như: E coli, Shigella

1.2.3 Những nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của một số loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội

Các vi khuẩn trong điều bình thường sẽ không có khả năng gây bệnh nhưng trong điều kiện thuận lợi như cơ thể vật chủ suy yếu sẽ gây bệnh gọi là vi khuẩn gây bệnh

cơ hội Một số vi khuẩn gây bệnh cơ hội như: Sammonella, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus,…

Vấn đề kháng kháng sinh đang ở mức báo động không những ở Việt Nam mà trên

cả thế giới Vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại viện Paster (thành phố Hồ Chí

Minh) có tỉ lệ kháng kháng sinh cao, trong đó vi khuẩn P aeruginosa kháng lại tất

cả các loại kháng sinh khảo sát với tỉ lệ là trên 40% (Hoàn Doãn Cảnh và cs, 2014)

Vũ Ngọc Hiếu và cs, 2017 nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đái tháo đường trên da nhiễm trùng và mô mềm phân lập

được 560 chủng có 3 chủng xuất hiện nhiều nhất là Staphylococcus aureus (34,2%),

kế đến là Escherichia coli (15,3%) và Klebsiella pneumoniae (13,5%) và các vi khuẩn khác, trong đó có tỉ lệ Staphylococcus aureus kháng Methicilin là 53,7%, tỉ

lệ Enterococcus spp đề kháng và trung gian với Gentamicin và Chloamphenicol khá cao (đều 57,1%), Escherichia coli có tỉ lệ nhạy cảm thấp với các kháng sinh

nhóm Cephalosporin, Ampicillin, Fluoroquinolone và Aminoglycoside (trừ

Amikacin) trong khi ở Klebsiella pneumoniae và Proteus mirabilis chỉ ghi nhận các

tỉ lệ đề kháng thấp và trung bình với các nhóm kháng sinh trên Cả 3 chủng vi khuẩn đều còn khá nhạy với các kháng sinh nhóm Carbapenem, Amikacin

Theo nghiên cứu của Hoàng Văn Sơn và cs, 2018 về tính mẫn cảm kháng sinh của

vi khuẩn E coli và Salmonella phân lập từ mẫu bệnh lợn mắc bệnh tiêu chảy tại

Thanh Hóa được khảo sát trên 9 loại kháng sinh: Amoxicillin, Colistine sulphate, Enrofloxacin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Norfloxacin, Streptomycin,

Tetracyline thứ nhất kiểm tra tính kháng thuốc của 27 chủng E coli phân lập có 16

chủng kháng lại 6 loại thuốc chiếm tỷ lệ 59,26%, 7 chủng kháng 5 loại thuốc chiếm 25,93%, 2 chủng kháng lại 4 loại thuốc chiếm 7,41%, 2 chủng kháng lại 3 loại

thuốc chiếm 7,41%, thứ hai, kiểm tra 19 chủng Salmonella spp phân lập được có 9

chủng kháng lại 7 loại thuốc chiếm 47,37%, 7 chủng kháng lại 6 loại thuốc chiếm

36,84% Còn lại chỉ có 1 chủng kháng lại 3, 4, 5 loại thuốc

Trong nghiên cứu gần đây, các chủng Vibrio spp được phân từ thủy sản và nước

nuôi tại Tiền Giang kiểm tra tính kháng kháng sinh với 9 loại kháng sinh:

Tetracyline, Cefotaxime, Cefepime, Imipenem, Gentamycin và Ceftazidime,

Ciprofloxacin, Amikacin và Ampicillin đã phát hiện 235/243 (96,71%) chủng

Vibrio có khả năng kháng với ít nhất một loại kháng sinh khảo sát, có 51% số chủng

kháng với 1 loại kháng sinh, 30,8% số chủng kháng với 2 loại, và có đến 18,2% số

chủng có hiện tượng đa kháng kháng sinh Đáng chú ý là có 1 chủng

V parahaemolyticus kháng đến 6 loại kháng sinh, dự đoán sự xuất hiện vi khuẩn

siêu kháng (Huỳnh Ngọc Trưởng và cs, 2015)

Theo báo cáo tình hình nhiễm vi khuẩn Vibrio spp trên tôm bạc (Penaeus

merguiensis), tôm sú (Penaeus monodon), tôm rảo đất (Metapenaeus ensis) tại các

chợ quận Ninh Kiều thành phố Cần Thơ kết quả kháng sinh đồ của 26 trong số 27

dòng vi khuẩn phát sáng được thử với 6 loại thuốc kháng sinh thường dùng trong

nuôi thủy sản: Tetracyline, Ampicillin, Chloramphenicol, Nitrofurantoin,

Norfloxacin, và Trimethoprim/Sulfamethoxazole cho thấy 100% số dòng vi khuẩn

thử nghiệm kháng với Ampicilin, có khoảng 15% dòng vi khuẩn kháng với 2 loại

kháng sinh và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử, có 4% số dòng vi khuẩn kháng

với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm (Nguyễn Thu Tâm và cs, 2014) Manjusha và

cs, 2005 đã phân lập 119 chủng Vibrio từ mẫu nước nước biển, mẫu nước lợ của trại

nuôi tôm, mẫu tôm và mẫu hến có đến 30,3% kháng với ba loại kháng sinh, 55,5%

kháng với 4-10 loại kháng sinh, 14,14% đã kháng với hơn 10 loại kháng sinh, chỉ

có 16.8% mẫn cảm với tất cả các loại kháng sinh Qua những con số trên có thể

thấy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn rất cao, các kháng sinh đã hầu như

không còn tác dụng với một số vi khuẩn

Nghiên cứu của Akinbowale và cs, 2006 về vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập từ

nguồn nuôi trồng thủy sản ở Úc có tổng cộng 100 vi khuẩn Gram âm (Vibrio spp

và Aeromonas spp là chủ yếu) và bốn vi khuẩn Gram dương phân lập từ cá nuôi,

động vật giáp xác và nước từ bể nuôi ấu trùng cua được lấy từ các phòng thí nghiệm

khác nhau của Úc và kết quả cho biết tình trạng kháng thuốc lan rộng đối với

Penicillin và một số Cephalosporin cũng như Erythromycin, hơn một nửa (54,8%)

của tất cả các chủng được tìm thấy kháng với Ampicillin và Amoxycillin, 41,4%

kháng với Cephalexin, 23,1% với Cephalothin, 5,8% với Ceftiofur và 1,9% với

Cefoperazon, trong khi 47,1% kháng với Erythromycin Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus và Vibrio vulnificus kháng lại 10 loại kháng sinh thử nghiệm bao

gồm Ampicillin (AM, 10µg), Chloramphenicol (CP, 30µg), Gentamycin (GE, 10µg), Kanamycin (KM, 30µg), Nalidixic acid (NA, 30µg), Novobiocin (NB, 30µg), Penicillin (PL, 10µg), Rifampicin (RF, 10µg), Streptomycin (SM), 30µg) and Tetracycline (TE, 30µg) (Manivasagan và cs, 2010) Kết quả kiểm tra mức độ

mẫn cảm của 30 phân lập Salmonella, trong đó có 10 phân lập thuộc Salmonella

typhimurium và 5 phân lập Salmonella enteritidis, đối với 12 loại kháng sinh sử

dụng phổ biến đã kháng với phần lớn các kháng sinh thông dụng tại Cần Thơ, nhất

là Tilmicosin (100%), Enrofloxacin (83,3) và Flumequine (73,3%) Các kháng sinh

có hiệu lực trong điều trị bệnh do Salmonella gây ra ở vịt chỉ còn 4 loại kháng sinh

là Marbofloxacine (6,7%), Oxytetracycline (6,7%), Fosfomycine (0%) và Amikacine (0%) (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Tổng cộng có 31 loài vi khuẩn đã được phân lập ở Iskenderun, Thổ Nhĩ Kỳ: các

chủng phổ biến nhất được phân lập từ tất cả các mẫu là Escherichia coli (11,4%),

Aeromonas hydrophila (9,7%) và Stenotrophomonas maltophilia (9,3%) Có tỷ lệ

kháng cao với Ampicillin (93,2%), Streptomycin (90,2%) và Cefazolin (81,3%) và

tỷ lệ kháng thấp với Imipenem (16,5%), Meropenem (13,9%) và Cefepime (8,0%) Khoảng 56,8% tất cả các vi khuẩn được phân lập từ nước biển, trầm tích và tôm đã kháng 7 loại kháng sinh trở lên (Matyar, 2008)

Những con số trên đáng lo ngại, có thể thấy số vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh xuất hiện càng nhiều và để lại nhiều hậu quả khôn lường như xuất nhiều loại vi khuẩn kháng kháng sinh, làm mất cân bằng hệ sinh thái vì kháng sinh có thể tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi và tạo điều kiện cho những vi khuẩn có hại không bị ảnh hưởng đến kháng sinh phát triển mạnh mẽ, ảnh hưởng đến xuất nhập khẩu và hơn thế nữa ảnh hưởng đến sức khỏe con người trước hết là người sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản và thứ hai là ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm thu mẫu được chọn ở hai khu vực lòng nuôi cá tôm tại vịnh Nha Trang là Đầm Bấy có tọa độ 12°11,342’ vĩ độ bắc, 109°18,933’ kinh độ đông và Hòn Miễu

có tọa độ 12°11,048 vĩ độ bắc, 109°13,280’ kinh độ đông như (Hình 2.1A) Mẫu được thu vào ngày 20/2/2019, nhìn chung thời tiết vào ngày thu mẫu khá tốt, nắng, gió nhẹ, trời trong xanh

Hình 2.1 Bản đồ thu mẫu (A) Vị trí 2 khu vực thu mẫu Hòn Miễu và Đầm Bấy, (B)

Sơ đồ thu mẫu nước và trầm tích dưới lồng nuôi tôm cá

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chung

Thu mẫu nước và trầm tích

Phân lập và làm thuần vi khuẩn

Khảo sát khả năng kháng kháng sinh

của vi khuẩn đối với một số kháng

sinh thử nghiệm

Sơ đồ 1 Quy trình nghiên cứu Mẫu nước biển và trầm tích sau khi thu về tăng sinh bằng môi trường Marine Broth sau 24 giờ đem đi pha loãng, tiếp đến là cấy trang trên ba môi trường đặc hiệu Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS), Salmonella- Shigella agar (SS), Aeromonas agar (thành phần môi trường, tham khảo ở phần sau) Sau 24 giờ quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc trên mỗi đĩa môi trường Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau sau đó được cấy ria đến khi được khuẩn lạc thuần khiết Các chủng vi khuẩn sau khi làm thuần được tiến hành khảo sát khả năng kháng kháng sinh đối với một số kháng sinh thử nghiệm bằng cách phương pháp sử dụng đĩa 96 giếng Những chủng vi khuẩn có khả năng kháng các loại kháng sinh thử nghiệm được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định đặc điểm sinh hoá bằng

bộ kít API 20E

2.2.2 Phương pháp thu mẫu

Tại hai địa điểm thu mẫu (Đầm Bấy và Hòn Miễu), mẫu nước biển và trầm tích được thu nhờ thợ lặn có khí tài (SCUBA) Mẫu nước biển được thu ở ba khoảng

Thử nghiệm trên đĩa 96 giếng

Định danh vi khuẩn có khả năng

kháng các loại kháng sinh thử

nghiệm

Xác định đặc điểm sinh hóa bằng bộ kit API 20E

khác nhau trên mặt cách ngang tính từ lồng nuôi cá tôm, lần lượt là 0m, 100m, 200m (Hình 2.1B) Mẫu trầm tích được lấy có khoảng cách tính từ lồng nuôi cá tôm, lần lượt là 0m, 25m, 50m, 100m, 150m, 200m (Hình 2.1B) Các mẫu nước và trầm tích được chứa trong các ống falcon 15ml đã khử trùng, giữ ở nhiệt độ lạnh

4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương học trong vòng 2 tiếng

kể từ thời điểm thu mẫu cho các phân tích tiếp theo

2.3 Phân lập vi khuẩn từ mẫu nước và trầm tích

Mẫu thu về gồm nước và trầm tích được tăng sinh trên môi trường MB với tỷ lệ 1:9 Sau 24h chuẩn bị các ống nghiệm để pha loãng liên tiếp đến nồng độ 10-2, 10-4 trong nước muối sinh lý (Hình 2.2) Các mẫu sau khi pha loãng được sử dụng để

phân lập các nhóm Vibrio, Salmonella – Shigella, Aeromonas

Hình 2.2 Pha loãng mẫu

Đối với nhóm Vibrio và Salmonella- Shigella sử dụng nồng độ pha loãng 10-4

, với

Aeromanas sử dụng nồng độ pha loãng 10-2

Sau khi pha loãng sử dụng phương pháp cấy trang để phân lập nhóm vi khuẩn gây

bệnh: nhóm Vibrio trên môi trường TCBS (24h ± 2h), nhóm Salmonella- Shigella trên môi trường SS (24h ± 2h), nhóm Aeromonas trên môi trường Aeromonas agar

(48h ± 2h)(Thành phần môi trường ở phụ lục 4) Tất cả các khuẩn lạc đều được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch sau đó tiếp tục làm thuần bằng phương pháp ria ba chiều (Hình 2.3)

Hình 2.3 Phương pháp cấy ria

Phương pháp giữ giống:

Quy trình thực hiện:

Chủng vi khuẩn thuần sau khi được nuôi cấy sẽ được đem đi bảo quản trong Glycerol lỏng Dùng micropipette 1000 hút 500µl Glycerol cho vào các ống eppendorf 2ml đã được tiệt trùng sau đó cho vào mỗi ống 500µl dịch chứa vi khuẩn Các ống eppendorf được quấn paraffin ở phần nắp để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn trong suốt quá trình bảo quản, sau đó đem bảo quản ở tủ 4˚C để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo bao gồm đánh giá độ nhạy cảm của vi khuẩn và test sinh hóa

2.4 Khảo sát khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Nguyên tắc

Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu có thể ức chế vi khuẩn thử nghiệm Trong nghiên cứu này, phương pháp này được sử dụng để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh thử nghiệm từ đó xem xét loại kháng sinh nào ức chế vi khuẩn tốt

Quy trình thực hiện

Pha loãng kháng sinh

Sáu kháng sinh được lựa chọn thử nghiệm trong nghiên cứu này bao gồm: Tetracycline (TET), Colistine (COL), Trimethoprim (TRI), Nitrofurantoin (NIT),

Rifampicine (RIF)(Được phòng Sinh thái biển pha sẵn) Đây là 6 kháng sinh có phổ kháng khuẩn trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Các kháng sinh được pha loãng ở 6 nồng độ khác nhau Cụ thể là từ dung dịch mẹ pha dung dịch gốc cần dùng, từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độc thấp nhất cần dùng (Hình 2.4) Cụ thể trong nghiên cứu này, các kháng sinh sử dụng được pha

ở 6 nồng độ pha loãng như sau:

Bảng 2.1 Pha loãng ½ nồng độ kháng sinh

TET(µg/mL) COL(µg/mL) TRI(µg/mL) NIT(µg/mL) RIF(µg/mL)

Hình 2.4 Cách pha loãng nồng độ kháng sinh

Pha loãng vi khuẩn

Chuẩn bị sẵn 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường MB, tiếp đến cho thêm 200 μl dịch vi khuẩn vào ống chứa môi trường MB Lấy ống 0,5 McFarland (ứng với nồng

độ 108 mật độ vi khuẩn) pha sẵn so sánh với ống môi trường MB đã chứa dịch vi khuẩn trước đó; nếu độ đục giống nhau thì đem đi thử nghiệm độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh trên đĩa 96 giếng; còn nếu độ đục không giống nhau thì tiếp tục cho thêm 200 μl dịch vi khuẩn vào ống để tiếp tục so sánh với ống 0,5McFarland Độ đục chuẩn (McFarland) bằng cách trộn 0,05 ml dung dịch BaCl2

và 9,95 ml dung dịch H2SO4, độ đục của hỗn hợp trên tương đương với mật độ vi khuẩn là 108

Thử nghiệm trên đĩa 96 giếng

Dùng micropipet hút 0,5ml dịch vi khuẩn đã pha loãng cho vào đĩa 96 giếng, tiếp đến cho 0,5ml kháng sinh vào giếng đã cho vi khuẩn (các cột 8,9,10,11,12 là cột lặp của 1,2,3,4,5; cột 6,7 để trống) Sau đó, cho 0,5ml dịch vi khuẩn vào hàng G (đối chứng dương) và 0,5ml môi trường MB không chứa kháng sinh và vi khuẩn vào hàng H (đối chứng âm) (Hình 2.5) Dùng giấy bạc gói và ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng từ 22 giờ Sự phát triển của vi khuẩn sẽ được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 655nm bằng máy Microplate Reader BIORAD

Cách đọc kết quả:

Sau khi ủ các chủng vi khuẩn phân lập được với 5 loại kháng sinh ở nồng độ khác nhau, sự phát triển của các chủng vi khuẩn này trên đĩa 96 giếng được xác định thông qua chỉ số OD Giá trị của chỉ số OD thể hiện sự phát triển hay không của các chủng

vi khuẩn bằng việc so sánh với các giếng đối chứng dương (dịch vi khuẩn không có

sự có mặt của kháng sinh) Vi khuẩn được ghi nhận là kháng kháng sinh khi có chỉ số

OD tương đồng với chỉ số OD ở các giếng đối chứng dương.(Phụ lục 4)

Cách tính tỷ lệ % chủng vi khuẩn kháng kháng sinh:

Hình 2.5 Giếng pha loãng kháng sinh

2.5 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn

Nguyên tắc

Bộ kit API 20E được sử dụng để xác định các đặc điểm sinh hoá của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này thông qua việc kiểm tra các phản ứng sinh hoá Các chỉ tiêu kiểm tra bao gồm: oxidase, khả năng sinh H2S, khả năng di động Bộ kít API 20E đươc lựa chọn trong nghiên cứu này vì định danh vi khuẩn trong thời gian ngắn

và cho ra kết quả dựa trên những dải API hình thành sẵn

Hình 2.6 Dãy phản ứng sinh hóa của bộ kít API 20E

Quy trình thực hiện:

Cho 1 ít nước cất vào trong khay đục bộ kít nhầm giữ ẩm khi cho vào tủ ấm Dùng que cách ria lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống pha loãng đã chứa sẵn 5ml nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều cho tới khi thấy nước trong ống vẩn đục Dùng micropipet hút dịch vi khuẩn vào mỗi ô của bộ kít sao cho vừa đủ, trừ 5 ô ADH, LDC, ODC,H2S, URE cho thêm parafin để tạo điều kiện kỵ khí và 3 ô CIT, VP, GEL cho đầy mỗi ô Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm Sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả, đối với ô TDA nhỏ một giọt thuốc thử TDA, ô IND nhỏ một giọt thuốc thử James, ô VP nhỏ một VP1 và 1 giọt VP2 đợi 10 phút rồi đọc kết quả Kết quả âm tích hay dương tính tùy vào màu sẽ thay đổi trên bộ kít Ngoài ra, phản ứng oxidase của các chủng vi khuẩn cũng được tiến hành kiểm tra Các bước tiến hành kiểm tra phản ứng oxidase được tiến hành cụ thể như sau Dùng kẹp gắp, gắp 1 miếng giấy oxidase đã tẩm thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine cho vào đĩa peptri Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý vào miếng giấy oxidase Dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc đơn chấm lên miếng giấy đã tẩm thuốc Quan sát sự biến đổi màu trên miếng giấy Phản ứng oxydase (+): giấy tẩm thuốc thử chuyển sang màu tím Phản ứng oxydase (-): không thay đổi màu (Trần Linh Thước, 2007)

Hình 2.7 Thuốc thử James,TDA, VP1, VP2 Phương pháp đọc kết quả:

Bảng 2.2 Đọc kết quả bộ kit Api 20E

Chỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG (Ortho-nitrophenyl

ADH (arginine dihydrolase) Vàng Đỏ/cam

LDC (lysine decarboxylase) Vàng Đỏ/cam

ODC (ornithine decarboxylase) Vàng Đỏ/cam

CIT (citrate) Vàng Xanh/xanh lá

H 2 S (sinh H2S) Không màu Đen

TDA (tryptophane deaminase) Vàng Đỏ nâu

VP (phản ứng Voges-Proskauer) Không màu Hồng/đỏ

GEL (gelatin) Không khuếch tán Khuếch tán

GLU (glucose) Xanh/xanh lá Vàng/xám vàng

MAN (mantose) Xanh/xanh lá Vàng

INO (inositol) Xanh/xanh lá Vàng

SOR (sorbiol) Xanh/xanh lá Vàng

RHA (rhamnose) Xanh/xanh lá Vàng

SAC (sucrose) Xanh/xanh lá Vàng

MEL (melibiose) Xanh/xanh lá Vàng

AMY (amygdaline) Xanh/xanh lá Vàng

ARA (arabinose) Xanh/xanh lá Vàng

OX (oxidase) Không màu Tím

2.6 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

Các mẫu vi khuẩn được gửi tới phòng xét nghiệm công ty TNHH DV và TM Nam Khoa để định danh vi khuẩn Cụ thể, phương pháp giải trình tự 16S rRNA được tiến hành để định danh các vi khuẩn gây bệnh phân lập từ san hô có phát hiện virus đặc hiệu Ban đầu, bộ gen vi khuẩn được tách chiết bằng bộ kit của QIAgen và khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1495R có trình tự 27F: 5’ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG 3’;1495R: 5’CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA 3’ (Weisberg và cs, 1991) Sản phẩm PCR được tinh chế và giải trình tự bằng phương pháp Sanger Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST

2.7 Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm EXCEL và SPSS (Kruskal Wallis và Willcoxon)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn gây bệnh cơ hội trong mẫu nước và trầm tích

Dựa vào sự khác biệt về hình thái, màu sắc và kích thước khuẩn, 109 chủng vi khuẩn khác nhau trong mẫu trầm tích và nước biển ở khu vực nuôi trồng Đầm Bấy

và Hòn Miễu đã được phân lập và làm thuần (Đặc điểm miêu tả khuẩn lạc được thể hiện trong (Phụ lục 1) Trong đó, có 55 chủng phân lập trên môi trường TCBS, 36 chủng phân lập trên môi trường SS và 18 chủng phân lập trên môi trường

Aeromonas agar (Hình 3.1) Trong tổng số 109 chủng vi khuẩn phân lập, có 53

chủng phân lập từ khu lồng nuôi ở Đầm Bấy và 56 chủng từ Hòn Miễu

Hình 3.1 Hình ảnh đại diện một số chủng vi khuẩn phân lập được (a): Chủng phân lập trên môi trường TCBS, (b): Chủng phân lập trên môi trường SS, (c): Chủng

phân lập trên môi trường Aeromonas agar

Tổng số vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập được từ trong môi trường nước thu tại hai khu vực lồng nuôi Đầm Bấy và Hòn Miễu được thể hiện ở Hình 3.2 Tổng cộng

có 17 chủng phân lập được từ trong môi trường nước quanh lồng nuôi ở Đầm Bấy Trong đó, mức độ đa dạng chủng vi khuẩn phân lập được (dựa trên sự khác nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước… của khuẩn lạc) được ghi nhận cao nhất ở khoảng cách 100m (10 chủng) và thấp nhất ở khoảng cách 200m (3 chủng) Ở Hòn Miễu, tổng cộng có 10 chủng phân lập từ trong môi trường nước quanh lồng nuôi, mức độ

đa dạng cũng dựa vào sự khác biệt về màu sắc, hình dạng, kích thước,… của khuẩn lạc và được ghi nhận cao nhất ở khoảng cách 100m (5 chủng), thấp nhất ở khoảng cách 200m (2 chủng) Cũng giống như Đầm Bấy số chủng phân lập nhiều nhất ở khoảng cách 100m và thấp nhất ở khoảng cách 200m

Hình 3.2 Số vi khuẩn phân lập được từ mẫu nước biển Trong mẫu trầm tích thu từ xung quanh khu vực lồng nuôi ở Đầm Bấy, tổng số vi khuẩn gây bệnh cơ hội phâp lập được là 36 chủng trong đó ở khoảng cách 100m và 200m đều phân lập được nhiều vi khuẩn nhất với tổng số là 7 chủng và thấp nhất ở khoảng cách 150m với 4 chủng) Tại địa điểm Hòn Miễu, tổng số vi khuẩn phân lập được quanh môi trường bè cao hơn (46 chủng) so với Đầm Bấy, trong đó số chủng phân lập nhiều nhất ở khoảng cách 100m (10 chủng) và tiếp theo là 7 chủng ở 0m, 6 chủng ở 25m, 7 chủng ở 50m, ở 150m và 200m đều phân lập được 8 chủng (Hình 3.3)

Hình 3.3 Số vi khuẩn phân lập được từ mẫu trầm tích

3.2 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập

3.2.1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường nước

Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng sinh vi khuẩn phân lập từ môi trường nước xung quanh lồng nuôi đối với 5 loại kháng sinh thử nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.1, Hình 3.4 và 3.5 Cụ thể, ở khu vực Đầm Bấy, kết quả cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh đối với các kháng sinh khác nhau là khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (Kruskal-Wallis, P < 0,05, n = 6) Trong đó, kháng sinh

có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại cao nhất là TET và NIT, với tỉ lệ lần lượt là 96,6% ± 0,0 (Wilcoxon, P < 0,05, n = 6) và 92,5% ± 1,1 (Wilcoxon, P < 0,05, n = 6) Tỷ

lệ vi khuẩn kháng lại kháng sinh COL (51,6% ± 0,1) thấp hơn khoảng 1,8 lần so với TET và NIT (Wilcoxon, P < 0,05, n = 6) Tiếp theo là chỉ có khoảng 1/5 số

vi khuẩn phân lập được tại đây có khả năng kháng lại kháng sinh TRI (19,4 ± 0,1) Không có chủng vi khuẩn nào phân lập trong mẫu nước ở Đầm Bấy có khả năng kháng lại kháng sinh RIF (Bảng 3.1, Hình 3.4)

Ngược lại với khu vực Đầm Bấy, tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập được ở trong môi trường nước quanh khu vực lồng nuôi Hòn Miễu không cho thấy sự khác nhau về mặt thống kê đối với các kháng sinh khác nhau (Kruskal-Wallis, P > 0,05, n = 6) Trong đó, tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh đối với 3 loại kháng sinh TET, COL và NIT là khá tương đồng nhau, lần lượt là 63,3 ± 0,0, 62,2 ± 0,0, 68,9 ± 0,0 Tỷ lệ vi khuẩn kháng lại kháng TRI (38,8 %) và RIF (33,3 %) thấp hơn 3 loại kháng sinh trên, tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.1, Hình 3.5) Kết quả tương tự được báo cáo trong nghiên cứu của Kim và cs, 2004 khi cho thấy toàn bộ chủng vi khuẩn phân lập (151 chủng) được trong nghiên cứu này đều cho kết quả kháng lại kháng sinh TET Trong một nghiên cứu khác của Matyar và cs

2008, kết quả cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh với NIT cũng rất cao là 60% Theo báo cáo của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs 2005, xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở đồng bằng sông Cửu Long tỷ lệ vi khuẩn kháng TET là 86% , của NIT là 57% Giống kết quả

nghiên cứu của Ferrini và cs, 2008 các chủng Vibrio phân lập từ nước biển, các loài

hải sản tỷ lệ kháng lại kháng sinh TET cao (97%)