Nghiên cứu kết quả một số thông số hóa sinh nước tiểu bằng các phương pháp khác nhau

Tổng phân tích nước tiểu là một trong những xét nghiệm nước tiểu được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, test thử 10 thông số cho biết: tỷ trọng nướctiểu, pH, số bạch cầu, nitrit, protein,

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xét nghiệm nước tiểu là một test sàng lọc thường quy, được chỉ định nhưmột phần của quy trình khám lâm sàng Xét nghiệm nước tiểu giúp phát hiệnnhững bất thường của nước tiểu, là một trong những cơ sở rất có giá trị hỗ trợbác sĩ lâm sàng trong việc chẩn đoán, theo dõi bệnh, đánh giá hiệu quả cácphương pháp điều trị cũng như cung cấp thông tin cần thiết về sức khỏe củangười bệnh

Bên cạnh đó, việc lấy mẫu nước tiểu cũng tương đối đơn giản (trừtrường hợp lấy mẫu nước tiểu 24h), không đòi hỏi áp dụng thủ thuật, giátương đối rẻ nên người bệnh dễ dàng chấp nhận, do đó xét nghiệm nước tiểu

có thể tiến hành thuận lợi, dễ dàng

Tổng phân tích nước tiểu là một trong những xét nghiệm nước tiểu được

sử dụng phổ biến nhất hiện nay, test thử 10 thông số cho biết: tỷ trọng nướctiểu, pH, số bạch cầu, nitrit, protein, glucose, các thể cetonic, urobilinogen,bilirubin và hồng cầu trong nước tiểu Đây là một xét nghiệm có độ đặc hiệucao, giúp đánh giá nhanh, chính xác các yếu tố sinh hóa nước tiểu; thườngđược chỉ định để chẩn đoán các bệnh lý nhiễm trùng của hệ thống thận - tiếtniệu cũng như để chẩn đoán các bệnh lý không thuộc hệ thống thận - tiết niệusong có gây ra các thay đổi trong thành phần nước tiểu

Mặc dù vậy, kết quả thu được từ xét nghiệm tổng phân tích chỉ mangtính chất tương đối Trong trường hợp các bác sĩ lâm sàng muốn theo dõichẩn đoán và điều trị của bệnh nhân thì cần phải tiến hành xét nghiệmđịnh lượng

Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kết quả một số thông

số hóa sinh nước tiểu bằng các phương pháp khác nhau” với hai mục

tiêu là:

1 So sánh kết quả các thông số protein, glucose, bạch cầu và hồng cầu trong nước tiểu giữa phương pháp bán định lượng trên máy phân tích nước tiểu tự động và phương pháp định lượng.

2 Tìm hiểu mối tương quan của các chỉ số này giữa hai phương pháp.

Chương 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nước tiểu (Urine)

Nước tiểu là dịch bài suất quan trọng nhất chứa phần lớn các chất cặn bãcủa cơ thể Những thay đổi về các chỉ số hóa lý và đặc biệt là những thay đổi

về thành phần hóa học của nước tiểu phán ánh các rối loạn chuyển hóa [1]

1.2 Sự tạo thành nước tiểu

Nước tiểu được tạo thành liên tục tại các đơn vị chức năng của thận lànephron Ở người, mỗi thận có khoảng hơn 1triệu nephron Mỗi nephron gồmmột bó bao mạch được bọc bởi bao Bowman( cầu thận) và ống thận( bao gồmống lượn gần, quai helle, ống lượn xa, ống góp) Sự bài tiết nước tiểu nhờ 2quá trình siêu lọc và tái hấp thu.[1]

1.2.1 Sự lọc của cầu thận

Mao mạch cầu thận cho nước và các chất có phân tử nhỏ trong máu qualại dễ dàng và như một màng chắn các phân tử lớn Các phân tử lớn như cácprotein TLPT 70.000 không qua được Vì vậy nước tiểu ban đầu (nước tiểu ởtrong bao Bowman) có nồng độ các chất như trong huyết tương trừ protein.[1]

- Lớp tế bào biểu mô (lá trong) của bao Bowman: là một lớp tế bàobiểu mô có chân, giữa các tua nhỏ có các khe nhỏ có đường kínhkhoảng 70-75 A0.

Hình 1: Cấu tạo màng lọc cầu thận

Màng lọc là một màng có tính thấm chọn lọc rất cao Những chất cóđường kính < 70 A0 (TLPT~ 15.000 Dalton) đi qua được màng; những chất

có đường kính và có trọng lượng phân tử lớn hơn 80.000 Dalton như globinkhông đi qua được màng Các phân tử có kích thước trung gian mà mangđiện tích âm khó đi qua màng hơn là các phân tử không mang điện tích.Các chất gắn với protein không qua được màng Các chất bám vào màng sẽ

bị thực bào

Áp suất lọc (Filtration Pressure - P L )[1][2].

Quá trình lọc là quá trình thụ động, phụ thuộc vào sự chênh lệch giữacác áp suất, áp suất lọc được tính theo công thức:

- PB là áp suất thủy tĩnh trong bao Bowman (đối lập với sự hút nước từbao Bowman vào trong mạch).

Chất không được tái hấp thu

Có một số chất được đào thải qua cầu thận nhưng không được tái hấp thu

ở ống thận như: inulin, mannitol, natri hyposulfit

Tái hấp thu hoàn toàn (Glucose)

Glucose chỉ được tái hấp thu ở ống lượn gần Mức glucose máu 1,8 g/lđược gọi là “ngưỡng glucose của thận” Khi nồng độ glucose máu thấp hơnngưỡng glucose của thận thì glucose được tái hấp thu hoàn toàn theo cơ chếvận chuyển tích cực thứ phát (đồng vận chuyển với natri nhờ chất mang) và

có giới hạn Khi nồng độ glucose máu cao hơn ngưỡng glucose của thận thìglucose không được tái hấp thu hoàn toàn và một phần glucose sẽ bị đào thảiqua nước tiểu

Tái hấp thu 99% (nước)

Tái hấp thu nước là hậu quả của tái hấp thu các chất có lực thẩm thấucao: natri, kali, clo, bicarbonat để duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu Nướcđược tái hấp thu ở ống lượn gần, ống lượn xa, quai Helle và ống góp trong đó75-89 % nước do cầu thận lọc được tái hấp thu ở ống lượn gần Sự tái hấp thunước ở ống lượn gần không làm thay đổi áp suất thẩm thấu Nước tiểu đi khỏiống lượn gần là đẳng trương với huyết tương

Tái hấp thu phần lớn (Na + ,Cl - ,urê)

Sự tái hấp thu natri rất phức tạp, ở ống lượn gần 70% muối được tái hấpthu Yếu tố chính gây sự tái hấp thu là áp suất thẩm thấu và áp lực thủy tĩnhtrong mao mạch ống thận Sự tái hấp thu natri ở ống lượn là quá trình tích cựcđòi hỏi năng lượng lớn

Cl- được tái hấp thu thụ động song song với Na+

Urê được tái hấp thu đến 40-50%, urê tái hấp thu thụ động hoàn toàn phụthuộc vào nồng độ urê trong máu

Chất được bài tiết ở cầu thận, ống thận và tái hấp thu ở ống thận

Acid uric được cầu thận lọc khoảng 6 mg/phút, ống thận bài tiết khoảng

6 mg/phút Ở ống thận 95-98% lượng đó được tái hấp thu, lượng acid uricđược đào thải khoảng 0,33 mg/phút tương đương 600 mg/24h

Creatinin được lọc qua cầu thận và cũng được tái hấp thu ở ống thận.Hàm lượng creatinin được coi như một dấu hiệu để theo dõi chức năng thận

Tái hấp thu protein và acid amin

Protein phân tử lượng nhỏ và acid amin được tái hấp thu hoàn toàn ở ốnglượn gần theo cơ chế vận chuyển tích cực Protein được chuyển vào trong tếbào ống thận theo cơ chế “ẩm bào” Các acid amin tự do trong lòng ống lượnđược vận chuyển tích cực nhờ protein mang đặc hiệu qua màng Mỗi ngày,thận tái hấp thu tới 30g protein

1.3 Thành phần và tính chất của nước tiểu[1][3].

1.3.1 Các tính chất vật lý của nước tiểu

Màu sắc

Nước tiểu bình thường có màu từ vàng nhạt đến màu hổ phách tùy theolượng nước tiểu và độ đậm đặc Những sắc tố chính trong nước tiểu là các sảnphẩm có nitơ như urobilin (sản phẩm oxy hóa của urobilinogen),các dẫn xuấtcủa indoxyl Ở bệnh gan mật nước tiểu có màu nâu vàng của bilirubin Nước

tiểu màu hồng do có máu Nước tiểu đục như nước vo gạo do có dưỡng chấp.

Sức căng bề mặt của nước tiểu

Sức căng bề mặt của nước tiểu thấp hơn nước, khoảng 64-69 dyne/cm2(của nước là 72) Trong viêm gan tắc mật, nước tiểu có muối mật gây sứccăng bề mặt giảm

Tỷ trọng

Tỷ trọng nước tiểu thay đổi trong ngày Nước tiểu 24h ở điều kiện 150C

tỷ trọng dao động 1,005-1,030, trung bình là 1,014-1,028 Trường hợp đáiđường tỷ trọng có thể tới 1,03-1,04, trường hợp đái nhạt tỷ trọng lại thấp

pH

pH của nước tiểu 24h hơi acid khoảng 5-6, trung bình 5,8 pH này thayđổi phụ thuộc vào chế độ lao động và chế độ ăn, nó có thể biến đổi từ 4,8 đến8,5 Nước tiểu có pH acid khi chế độ ăn nhiều thịt và ngược lại nó có pH kiềmkhi ăn nhiều rau pH thường thấp nhất vào buổi sáng sớm khi chưa ăn và caonhất sau các bữa ăn

1.3.2 Thành phần hóa học của nước tiểu[1]

Thành phần trung bình của các chất trong nước tiểu 24h được trình bày ởbảng sau:

Bảng 1: Thành phần các chất trong nước tiểu 24h

Anion (gam) Cation (gam) Chất hữu cơ (gam)Clorua 6-12

Mg++ 0,10-0,2

Urê 20-30Creatinin 1,0-1,8Acid uric 0,4-0,8Acid amin 2,0-4,0Acid hyppuric 0,1-1,0

và phospho Nồng độ urê trong nước tiểu giảm do tổn thương biểu mô ốngthận như viêm thận cấp do nhiễm độc

- Creatinin: sự bài xuất creatinin trung bình ở người trưởng thành namgiới là 20-25 mg/kg thân trọng Teo cơ, thoái hóa cơ, ưu năng tuyến cận giáptrạng creatinin trong nước tiểu tăng

- Acid uric: chế độ ăn nhiều đạm, lượng acid uric tăng Viêm thận,bệnh chuyển hóa nucleoprotein ở tế bào như bệnh bạch cầu,acid uric nướctiểu tăng

- Acid amin: nước tiểu chứa tất cả acid amin, mỗi acid amin chiếmkhoảng 10-30 mg trong nước tiểu 24h

- Các hormon, vitamin, enzym: trong nước tiểu có amylase, có cácvitamin B1, PP, C và các dạng dẫn xuất của chúng, có các hormon sinh dụcnam, sinh dục nữ, vỏ thượng thận dưới dạng dẫn xuất gluco liên hợp.

1.4 Thể tích nước tiểu

Thể tích nước tiểu trung bình ở người lớn trong 24h khoảng 1.000-1.400

ml, tương đương 18-20 ml/kg thân trọng Thể tích nước tiểu thay đổi theođiều kiện sinh lý, bệnh lý Lượng nước tiểu tính theo thân trọng ở trẻ emnhiều hơn người lớn Uống ít nước, làm việc trong điều kiện ẩm, nóng ranhiều mồ hôi, lượng nước tiểu ít Một số trường hợp bệnh lý nước tiểu có thể

>2500 ml/24h trong bệnh đái tháo đường, đái nhạt Lượng nước tiểu cũng cóthể dưới 750 ml/24h trong các trường hợp thiểu niệu, vô niệu trong viêm cầuthận cấp, viêm ống thận cấp do ngộ độc, mất máu, bỏng nặng[1]

1.5 Tổng phân tích nước tiểu

1.5.1 Nguyên lý hoạt động chung của máy phân tích nước tiểu 10 thông

số[4].

Máy phân tích nước tiểu 10 thông số là một máy quang kế khúc xạ được

sử dụng để đo bán định lượng 10 thông số trong nước tiểu bằng cách sử dụngthanh nhúng nước tiểu Các bóng đèn 2 cực (diod) phát ra ánh sáng được sửdụng như nguồn sáng và thời gian đo được tối ưu hóa để phản ứng hóa học và

sự tạo màu xảy ra trong các vùng phản ứng của thuốc thử

Đầu đo trong máy chứa 3 bóng đèn có các bước sóng khác nhau Quethử được đặt ở một vị trí cố định và đầu đo di chuyển trên mỗi miếng đệmthuốc thử, bắt đầu từ vị trí “tham chiếu” – nơi hệ thống quang học bắt đầuhoạt động

Trong quá trình đo, máy kiểm tra vị trí của thanh thử dưới đầu đo bằngcách thực hiện sự kiểm tra một cách chính xác dòng ánh sáng khúc xạ được

đo Nếu que nhúng được đặt thiếu chính xác dưới đầu đo, máy sẽ thông báomột tín hiệu “lỗi”.

1.5.2 Giới thiệu 10 thông số hóa sinh trong xét nghiệm tổng phân tích

nước tiểu.[3]

Tổng phân tích nước tiểu là xét nghiệm thường được sử dụng nhất vì nó

có thể trả lời sơ bộ cho bác sĩ lâm sàng biết tình trạng nước tiểu của bệnhnhân, qua đó phản ánh phần nào chức năng đường tiết niệu và chuyển hóatrong cơ thể

Lấy nước tiểu giữa dòng làm xét nghiệm Một que thử (dipstick) được nhúngvào nước tiểu rồi cho chạy qua máy 10 thông số, kết quả trả về bao gồm:

- Tỷ trọng nước tiểu (SG)

Thử nghiệm này phản ánh nồng độ các ion có trong nước tiểu Bìnhthường tỷ trọng nước tiểu vào khoảng 1,014-1,028 Đo tỷ trọng giúp đánh giákhả năng cô đặc nước tiểu của thận

- pH nước tiểu (pH)

pH đánh giá tính acid hoặc kiềm của nước tiểu thông qua nồng độ ion H+

tự do có trong nước tiểu Bình thường nước tiểu có tính acid nhẹ, pH từ 5-6

- Các bạch cầu (LEU)

Nhiễm trùng tiết niệu sinh ra các tế bào có mủ, những tế bào này giảiphóng enzym esterase Thử nghiệm này phản ánh sự có mặt của các enzymesterase của các bạch cầu có hạt (granulocyte) Bình thường trong nước tiểukhông có hoặc có rất ít bạch cầu

- Nitrit (NIT)

Bình thường nitrit không có trong nước tiểu, nó được tạo thành do vikhuẩn chuyển hóa nitrat có trong thức ăn thành nitrit Phản ứng thể hiện sự cómặt của nitrit, thông qua đó có thể phát hiện một cách gián tiếp các vi khuẩntạo nên nitrit có trong nước tiểu

- Glucose (GLU)

Nước tiểu bình thường có một lượng nhỏ các ose như: glucose, fructose,arabinose, galactose nên nước tiểu có tính khử yếu, khó phát hiện bằng phảnứng thuốc thử Fheling Giá trị bình thường của glucose trong nước tiểu đotrên máy phân tích nước tiểu tự động urisys 2400 là <2,8 mmol/l

- Các thể cetonic (KET)

Các thể cetonic trong nước tiểu bao gồm acid acetoacetic, acid hydroxybutyric và aceton Trong xét nghiệm chỉ phát hiện được 2 chất là acidacetoacetic và aceton Nước tiểu bình thường chứa vài miligam acid acetic/ 1lít nước tiểu và vài trăm miligam acid beta hydroxybutyric

Que thử phản ứng với cả hồng cầu và hemoglobin (có thể cả myoglobin)

do vậy mà phản ứng không hoàn toàn đặc hiệu với hồng cầu Bình thườngkhông có hồng cầu trong nước tiểu

1.6 Protein niệu

1.6.1 Chỉ số protein niệu

Ở người khỏe mạnh, protein bài tiết trong nước tiểu thay đổi, giao động

từ 10-140 mg/l Đối với người già thì protein niệu bình thường là <150mg/24h Protein niệu bình thường bao gồm albumin, globulin huyết thanh vàcác protein được tiết ra bởi ống thận Albumin được bài tiết bình thường với

tỷ lệ 10 mg/24h Các protein khác bao gồm α2-microglobulin, microglobulin , và post-gama protein[5] Protein xuất hiện trong nước tiểu docác cơ chế sau:

β2 Thay đổi tính thấm cầu thận với protein huyết tương là nguyên nhânphổ biến nhất của protein niệu

- Thay đổi tái hấp thu ở ống thận với các protein huyết tương bìnhthường được lọc qua cầu thận, dẫn tới bài tiết các protein TLPT 10000-70000

- Do các nguyên nhân trước thận: các paraprotein và protein nội sinhđược tạo thành quá nhiều và lọc qua màng lọc cầu thận, vượt quá khả tái hấpthu ở ống thận Ví dụ protein Bence Jones trong bệnh đa u tủy xương,myoglobin trong tổn thương đụng dập cơ, hoặc hemoglobin trong các bệnh dotruyền máu tan huyết, sản phẩm của fibrin trong đông máu nội mạch rải rác

- Do tăng bài tiết của ống thận, thường là các protein Tamm-horsfall

- Hủy hoại của mô thận và các sản phẩm của mô

- Do tắc bạch mạch thận, dẫn tới dưỡng chấp niệu

Dấu hiệu protein niệu được coi là dương tính (+) khi có 250 mg proteintrở lên trong 1 lít nước tiểu lấy từ một mẫu ngẫu nhiên Máy phân tích nướctiểu tự động urisys 2400 định lượng protein niệu cho kết quả như sau:

Âm tính: protein < 0,25g/l

(+) : 0,25 ≤ protein < 0,75g/l

(++) : 0,75 ≤ protein < 1,5g/l

(+++) : 1,5 ≤ protein < 5g/l

(++++) : protein ≥ 5g/l

1.6.2 Kỹ thuật xác định protein niệu

a Xác định protein niệu bằng máy phân tích nước tiểu tự động (kết quả tổng phân tích)

Máy phân tích nước tiểu tự động xác định lượng protein có trong nướctiểu dựa trên nguyên lý bán định lượng:

Trên thanh giấy thử, ở vùng phản ứng với Protein có chứa hỗn hợp dungdịch đệm citrat và chỉ thị màu tetrabromophenol blue (pH=3), khi pH hằngđịnh, nếu có Protein nó sẽ chuyển màu từ vàng sang xanh ve nhạt rồi đậm.Trường hợp này nên dùng mẫu nước tiểu đầu tiên vào buổi sáng để xétnghiệm là tốt nhất vì lúc này nước tiểu được cô đặc một cách đầy đủ

Phương pháp này có nhược điểm là độ nhạy que thử kém, tại mứcprotein niệu 30 mg/dl hoặc cao hơn, que thử có thể tin cậy được, nhưng kếtquả dưới mức này là khó dự đoán hơn Que thử có thể phát hiện protein trongnước tiểu với độ nhạy 150mg/l, nhạy cảm với albumin và kém nhạy cảm vớicác protein khác[6] Ngoài ra, phương pháp này không thể phát hiện được hếtcác loại protein có trong nước tiểu, điều này đặc biệt đúng với các loại proteintrước thận (tức là protein Bence – Jones, myoglobin, hemoglobin) và cácprotein niệu hình ống, microalbumin niệu, tất cả đều thoát khỏi sự phát hiệncủa que thử.[7]

b Định lượng protein niệu

Có nhiều phương pháp xác định lượng protein niệu như phương phápdùng nhiệt hoặc phương pháp dùng acid sulfosalicilic lạnh hoặc bằng phươngpháp cổ điển khác Ở đây chúng tôi thực hiện theo 2 phương pháp sau:

 Định lượng Protein niệu trên máy bán tự động[3]

Dùng acid tricloacetic 5% để kết tủa Protein Soi độ đục bằng quang kế

(máy quang kế 4010).

Acid tricloacetic là một acid hữu cơ có tác dụng làm biến tính protein(thay đổi tính tan, hoạt tính sinh học, cấu trúc ), khi đó protein bị đông tụ lạithành dạng keo không hòa tan (kết tủa không thuận nghịch) Phản ứng nàyđược sử dụng rộng rãi, có thể phát hiện protein trong nước tiểu với độ nhạy10mg/l[6]

 Định lượng Protein niệu trên máy phân tích hóa sinh tự động(Olympus AU 2700)

Pyrogallol đỏ kết hợp với molybdate tạo thành phức màu đỏ hấp thụ tối

đa ở bước sóng 470 nm, nếu có sự xuất hiện của protein sẽ tạo thành phứcmàu xanh tím hấp thụ tối đa ở bước sóng 600 nm Đậm độ của phức hợp tỷ lệthuận với nồng độ protein có trong mẫu thử

Phản ứng này dựa trên tương tác của protein với các tính chất đặc trưngcủa phức hệ pyrogallol red – molybdate (PRM) với một giới hạn hàm lượngprotein Căn cứ vào sự hình thành phức hệ, màu sẽ chuyển từ đỏ sang xanhtím Phản ứng có thể phát hiện protein trong nước tiểu với độ nhạy 10mg/l[6].Phương pháp này hữu dụng, đơn giản, rẻ tiền vì phức màu ít hấp thụ đặc biệt

và ít phản ứng với các chất khác ngoài protein

1.7 Glucose niệu

1.7.1 Chỉ số Glucose niệu

Ngưỡng đào thải glucose của thận là nồng độ glucose 160-180 mg/dltrong huyết thanh.[2] Ở người bình thường glucose niệu khoảng 0,5 mmoltrong nước tiểu 24 giờ Với nồng độ này các xét nghiệm bình thường khôngphát hiện được Glucose niệu được gọi là dương tính khi vượt quá nồng độ200-250 mmol trong nước tiểu 24 giờ Ngưỡng đào thải glucose của thậnkhác nhau đối với từng cơ thể và cũng chịu ảnh hưởng của một số bệnh lý củathận[8] Glucose xuất hiện trong nước tiểu trong một số trạng thái bệnh như

đái tháo đường Các đường khác có thể xuất hiện trong nước tiểu nhưgalactose trong bệnh galactosemia.[9]

Máy phân tích nước tiểu tự động urisys 2400 định lượng glucose niệucho kết quả như sau:

Bình thường: glucose < 2,8 mmol/l

(+) : 2,8 ≤ glucose < 5,5 mmol/l

(++) : 5,5 ≤ glucose < 17 mmol/l

(+++) : 17 ≤ glucose < 56 mmol/l

(++++) : glucose ≥ 56 mmol/l

1.7.2 Kỹ thuật xác định glucose niệu

a Xác định glucose niệu bằng máy phân tích nước tiểu tự động (kết quả tổng phân tích)

Máy phân tích nước tiểu tự động xác định lượng glucose trong nước tiểudựa trên nguyên lý bán định lượng: Dưới tác dụng của enzym Glucooxydase/peroxydase Glucose bị oxy hóa thành oxy già và acid gluconic Nước oxy già

sẽ oxy hóa chỉ thị màu để chuyển vùng phản ứng từ vàng sang xanh ve (vớichỉ thị màu được dùng là tetrametylbenzidine) hoặc sang nâu (với chỉ thị màuđược dùng là chromogenkaliiode)

Phương pháp náy đặc hiệu với glucose, không giúp phát hiện fructose vàcác đường khác

b Định lượng glucose niệu trên máy phân tích hóa sinh tự động (Au2700)

Máy phân tích hóa sinh tự động xác định lượng glucose trong nước tiểudựa theo phương pháp hexokinase:

Glucose + ATPHK , Mg2+¿

→¿ Glucose-6-phosphate + ADPGlucose-6-phosphate + NAD+ G 6 P−DH → Gluconate-6-P + NADH + H+ HK: hexokinase

G6P-DH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

Đo ở bước sóng 340 nm

Có thể xác định glucose niệu bằng phương pháp khác như: phương phápglucose oxidase (GOD) hay có thể dùng phương pháp Benedict để phát hiệncác đường có tính khử

1.8 Hồng cầu niệu, Bạch cầu niệu

1.8.1 Hồng cầu niệu

Hồng cầu là những tế bào có hình dạng và cấu trúc đặc biệt Chúng lànhững tế bào không có nhân và các bào quan Hồng cầu có hình đĩa lõm haimặt và được coi như những túi nhỏ chứa hemoglobin[2] Bình thường hồngcầu không có trong nước tiểu hoặc có thể có ở dạng vết Nước tiểu có hồngcầu có thể gặp trong trường hợp nhiễm khuẩn đường sinh dục-tiết niệu,sỏithận hay xuất hiện trong trường hợp bệnh lý như viêm thận cấp, lao thận,ung thư thận; có hemoglobin trong các trường hợp sốt rét ác tính, hoàng đảm

do tiêu huyết, bỏng nặng[1] Đôi khi sự xuất hiện hồng cầu trong nước tiểukhông phải là tình trạng bệnh lý mà có thể do vận động nhiều, nhiễm máukinh nguyệt

Máy phân tích nước tiểu tự động urisys 2400 định lượng hồng cầu niệucho kết quả như sau:

Bạch cầu là những tế bào có chức năng chống lại các tác nhân lạ đi vào

cơ thể Chúng là một phần của hệ thống bảo vệ cơ thể Các tế bào này sẽ thực

bào các chất hoặc vi khuẩn, khử độc, sản xuất kháng thể, giải phóng các chấttruyền tin hóa học, các enzym và những chất khác[2] Bình thường bạchkhông có trong nước tiểu hoặc cũng có thể có với số lượng không đáng kể.Nước tiểu có bạch cầu thường gặp trong viêm thận cấp, nhiễm khuẩn đườngtiết niệu, viêm Ở mẫu nước tiểu nhược trương (có áp suất thẩm thấu thấp),bạch cầu có thể có kích thước lớn hơn bình thường song hiện tượng nàykhông có ý nghĩa bệnh lý.[9]

Máy phân tích nước tiểu tự động urisys 2400 định lượng bạch cầu niệucho kết quả như sau:

1.8.3 Kỹ thuật xác định hồng cầu niệu, bạch cầu niệu

a Xác định hồng cầu niệu, bạch cầu niệu bằng máy phân tích nước tiểu tự động (kết quả tổng phân tích).

- Máy phân tích nước tiểu tự động xác định số lượng hồng cầu có trongnước tiểu dựa trên nguyên lý: Hemoglobin và hồng cầu (có thể cả Myoglobin)đóng vai trò như một peroxydase tác dụng lên peroxit hydro giải phóng oxyhoạt động Oxy này sẽ oxy hóa chỉ thị màu làm vùng phản ứng chuyển màu từvàng sang xanh ve

Giấy nhúng nước tiểu đã bổ sung cho xét nghiệm vi thể (soi tìm hồngcầu) vì nó có khả năng phát hiện cả hồng cầu còn nguyên hoặc đã bị vỡ

- Máy phân tích nước tiểu tự động xác định số lượng bạch cầu có trongnước tiểu dựa trên nguyên lý: Xét nghiệm này thể hiện sự có mặt của các bạchcầu có hạt (granulocyte) thông qua enzym esterase Các enzym esterase có tác

dụng thủy phân este của indoxyl và indoxyl được giải phóng sẽ phản ứng vớimuối diazonium để cho một sản phẩm màu tím.

Phản ứng này không chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của các vi khuẩn,trichomonad hoặc hồng cầu có mặt trong nước tiểu

b Xác định hồng cầu niệu, bạch cầu niệu bằng máy soi cặn nước tiểu

Máy soi cặn nước tiểu IQ 200 Elite đếm số lượng hồng cầu, bạch cầubằng phương pháp dòng chảy chụp ảnh kỹ thuật số:

- Mẫu nước tiểu được đưa qua dòng chảy tế bào đã được bao phủ bởihóa chất iQ lamina

- Kính hiển vi phóng đại các hạt bên trong tế bào giúp nhận diện tếbào

- Máy ảnh kỹ thuật số chụp 500 hình (24 hình/giây)

Có thể đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu trong nước tiểu bằng phươngpháp khác như: phương pháp soi cặn bằng kính hiển vi quang học, xét nghiệmcặn Addis

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng

- Những người đi kiểm tra sức khỏe có chỉ định xét nghiệm hóa sinhnước tiểu

- Những bệnh nhân có tình trạng bệnh lý cho kết quả xét nghiệm hóasinh nước tiểu có trị số bất thường.

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Khoa Hóa sinh Bệnh viện Bạch Mai – Số 78 đường Giải Phóng Phương Mai - Đống Đa - Hà Nội

-2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp cắt ngang mô tả

2.2.2 Cách lấy mẫu

Lấy bệnh phẩm là yếu tố rất quan trọng để chẩn đoán xác định bệnh lý.Yêu cầu phải tuân thủ đúng phương pháp mới cho kết quả chính xác

a Lấy mẫu nước tiểu ngẫu nhiên

Đúng như tên gọi, mẫu này được lấy ngẫu nhiên vào bất kỳ lúc nào Đây

là mẫu được lấy thuận lợi nhất Loại mẫu này dùng tốt nhất trong các trườnghợp nhận định tính chất vật lý, thành phần hóa, tinh thể và trụ niệu

- Cách lấy nước tiểu ngẫu nhiên

Đi tiểu bỏ đoạn đầu của bãi nước tiểu rồi hứng phần sau vào dụng cụđựng Dụng cụ đựng phải sạch Nên làm xét nghiệm ngay, nếu không phảiđậy kín và để nơi thoáng mát

b Lấy mẫu nước tiểu 24h

Một số xét nghiệm định lượng, nhất là đối với những bệnh nhân đangtheo dõi điều trị thì cần phải lấy nước tiểu 24h, ví dụ urê, creatinin,protein Yêu cầu bình đựng phải sạch, vô khuẩn, để nơi thoáng mát hay trongngăn mát tủ lạnh

- Cách lấy nước tiểu 24h

Vào giờ ấn định, ví dụ 6h sáng, bệnh nhân đi tiểu hết bỏ phần nước tiểunày đi Sau đó hứng tất cả các bãi nước tiểu trong ngày, kể cả khi đi đại tiệnvào một dụng cụ sạch 6h sáng hôm sau đi nốt bãi cuối cùng vào đó rồi trộntoàn bộ mẫu nước tiểu và đo thể tích Ghi rõ họ tên, tuổi, số lượng nước tiểu24h, các thuốc đã dùng Lấy một lượng nước tiểu vừa đủ để làm xét nghiệmmang đến phòng xét nghiệm

2.2.3 Qui trình nghiên cứu

Sau khi bệnh nhân được thăm khám lâm sàng một cách toàn diện tạiKhoa Khám bệnh bệnh viện Bạch Mai, có chỉ định xét nghiệm nước tiểu ngẫunhiên, nước tiểu 24 giờ, những bệnh nhân đảm bảo thỏa mãn các tiêu chuẩnnghiên cứu Những bệnh nhân này được lấy mẫu nước tiểu ngẫu nhiên vànước tiểu 24 giờ rồi mang đến phòng xét nghiệm để tiến hành làm xétnghiệm Quy trình xét nghiệm được thực hiện theo sơ đồ sau:

2.3 Phương pháp xác định các chỉ số nghiên cứu

2.3.1 Xác định các chỉ số protein, glucose, hồng cầu, bạch cầu trong

nước tiểu bằng máy phân tích nước tiểu tự động.

 Nguyên lý

10 thông số hóa sinh nước tiểu được bán định lượng bằng thanh giấy thử

sử dụng kỹ thuật đo phản quang Riêng xét nghiệm tỷ trọng nước tiểu thựchiện trên máy Urisys 2400 thì được đo bằng khúc xạ kế và kết quả có giá trịđịnh lượng

 Chuẩn bị

- Phương tiện: Máy phân tích nước tiểu tự động Urisys 2400

- Hóa chất: Urisys 2400 casette

Hóa chất được bảo quản ở 25-300C

1,5g/ln=16

5g/ln=46

KQ TPT BTn=17

ĐLIQ200Elite

ĐLAu2700Nhóm III

BĐL(TPT)Urisys2400

ĐLAu2700

KQ TPTKhác BTn=10

- Nước tiểu (tốt nhất lấy vào buổi sáng), trừ mẫu bảo quản bằng acid,bảo quản ở 2-80C.

+ Tiến hành kỹ thuật

- Bệnh phẩm được phân tích trên máy phân tích nước tiểu tự độngUrisys 2400 theo chương trình của máy

- Kết quả sau khi được đánh giá sẽ được chuyển vào phần mềm quản lý

dữ liệu hoặc vào sổ lưu kết quả (tùy thuộc vào điều kiện của phòng xétnghiệm)

- Trả kết quả cho khoa lâm sàng, cho người bệnh

2.3.2 Định lượng protein niệu

a Định lượng Protein niệu trên máy bán tự động

nm (600 đến khoảng 700 nm) Giá trị mật độ quang thu được là E (E = E thử

-E trắng)

 Tính kết quả theo công thức

C = (E thử - E trắng).K.Độ hòa loãng (nếu có)

Pyrogallol đỏ kết hợp với molybdate tạo thành phức màu đỏ hấp thụ tối

đa ở bước sóng 470 nm, nếu có sự xuất hiện của protein sẽ tạo thành phứcmàu xanh tím hấp thụ tối đa ở bước sóng 600 nm Đậm độ màu của phức hợp

tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu thử

 Chuẩn bị

- Máy phân tích hóa sinh tự động Olympus AU 2700

- Thuốc thử đã được đóng trong lọ sẵn sàng để sử dụng, thành phần củathuốc thử bao gồm:

+ Pyrogallol Red 0,015 g/l

- Cài chương trình trên máy theo protocol của máy: chỉ làm khi bắt đầutriển khai xét nghiệm trên máy và khi có thay đổi trong chương trình cài đặt.

- Dựng đường chuẩn: được làm khi bắt đầu triển khai xét nghiệm trênmáy, khi thay đổi một trong các yếu tố: nồng độ chuẩn mới, thuốc thử mới,thay bóng đèn hay thay cóng phản ứng và khi thấy kết quả kiểm tra chấtlượng không đạt

- Mẫu huyết thanh kiểm tra chất lượng, mẫu bệnh phẩm định lượng proteinniệu chọc dò hoặc dịch não tủy được phân tích trên máy phân tích sinh hóa tựđộng (máy phân tích hóa sinh tự động AU 2700) theo protocol của máy

- Mẫu bệnh phẩm chỉ được chạy trên máy phân tích khi kết quả kiểm trachất lượng đạt được độ chính xác và xác thực trong giới hạn cho phép vàkhông vi phạm các luật của quy trình kiểm tra chất lượng

 Kết quả

Kết quả được máy tự động tính toán dựa trên đường chuẩn đã được xâydựng trước từ bước chuẩn định (calibration), kết quả sẽ được máy in ra vàhiển thị trên màn hình kết quả của máy Phương pháp chỉ tuyến tính tới nồng

độ 2,5 g/l, quá nồng độ trên phải hòa loãng bệnh phẩm và định lượng lại

2.3.3 Định lượng glucose niệu

 Nguyên lý

Định lượng glucose niệu theo phương pháp hexokinase:

Glucose + ATPHK , Mg2+¿

→¿ Glucose-6-phosphate + ADPGlucose-6-phosphate + NAD+ G 6 P−DH → Gluconate-6-P + NADH + H+ HK: hexokinase

G6P-DH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

Đo ở bước sóng 340 nm

 Chuẩn bị

- Máy phân tích hóa sinh tự động Olympus AU 2700

- Hóa chất của Olympus (phương pháp Hexokinase): bảo quản tránhánh sáng Ổn định trong 30 ngày sau khi mở nắp và bảo quản trên máy

- Huyết thanh kiểm tra chất lượng của Biorad

- Kính hiển vi phóng đại các hạt bên trong tế bào giúp nhận diện tếbào.

- Máy ảnh kỹ thuật số chụp 500 hình (24 hình/giây)

 Chuẩn bị

- Bệnh phẩm: nước tiểu tươi lấy giữa dòng hoặc nước tiểu 24h, thểtích ít nhất khoảng 3 ml, đo trong vòng 1 giờ sau khi lấy, nếu không phải đậynắp và để ở 2-80C

- Thiết bị: máy soi cặn nước tiểu IQ 200 Elite

- Hóa chất: bộ hóa chất kèm theo máy do công ty Minh Tâm cung cấp gồm: + iQ Lamina

+ iQ Control and Focus Set

+ iQ Calibrator Pack

+ Iris Diluent Pack

+ Iris System Cleanse

 Tiến hành kỹ thuật

- Bệnh phẩm được phân tích trên máy soi cặn nước tiểu tự động IQ 200Elite theo chương trình của máy

- Kết quả sau khi được đánh giá sẽ được chuyển vào phần mềm quản lý

dữ liệu hoặc vào sổ lưu kết quả (tùy thuộc vào điều kiện của phòng xétnghiệm)

- Trả kết quả cho khoa lâm sàng, cho người bệnh

2.4 Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý và phân tích bằng phần mềm thống kê y họcSPSS 20.0 Các thuật toán được sử dụng:

- Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn

- Sử dụng test kiểm định χ2 để phân tích mối liên quan giữa các biến Sựkhác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05

Sử dụng phương trình tuyến tính với hệ số tương quan r tìm hiểu mốiliên quan giữa 2 biến định lượng Hệ số tương quan r có giá trị từ -1 tới +1.Khi r > 0: tương quan đồng biến, r < 0: tương quan nghịch biến; giá trị tuyệtđối của hệ số tương quan càng gần 1 thì tương quan càng chặt Xác định mức

độ tương quan như sau:

|r|≤0,1: Mối tương quan thấp, không đáng kể

0,2≤ |r|≤ 0,3: Mối tương quan thấp

0,4≤ |r| ≤ 0,5: Mối tương quan trung bình

0,6 ≤|r| ≤0,7: Mối tương quan cao

|r|≥ 0,8 trở lên: Mối tương quan rất cao

2.5 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1/2015 đến tháng 5/2015

2.6 Đạo đức nghiên cứu

- Lựa chọn đối tượng nghiên cứu là dựa trên sự chấp thuận của đốitượng nghiên cứu Các đối tượng có quyền từ chối không tham gia nghiên cứuhoặc dừng ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình nghiên cứu

- Các thông tin của đối tượng tham gia nghiên cứu đều được bảo mật

- Số liệu sử dụng trong báo cáo hoàn toàn trung thực

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả Protein niệu

Chúng tôi thực hiện so sánh kết quả Protein niệu giữa phương pháp bánđịnh lượng (tổng phân tích) trên máy phân tích nước tiểu tự động với phươngpháp định lượng bằng Acid Tricloacetic (TCA) 5% và định lượng trên máyphân tích hóa sinh tự động AU 2700 của 100 bệnh nhân đến khám bệnh tạiBệnh viện Bạch Mai thu được kết quả sau:

a Đối với những bệnh nhân cho kết quả tổng phân tích là âm tính.

Chúng tôi lấy 15 mẫu bệnh phẩm của những bệnh nhân đi khám sứckhỏe cho kết quả protein niệu tổng phân tích là âm tính để định lượng proteinniệu bằng 2 phương pháp TCA 5% và trên máy AU 2700 Kết quả được thểhiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả protein niệu định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau ở những mẫu nước tiểu có kết quả TPT là âm tính.

- Phương pháp bán định lượng cho kết quả âm tính khi protein

<0,25g/l Kết quả nhóm II và nhóm III phần lớn <0,25g/l

- Chưa thấy sự khác biệt về kết quả protein niệu giữa nhóm I và II, nhóm I và III, nhóm II và III (p>0,05)

b Đối với những bệnh nhân cho kết quả tổng phân tích là 0,25 g/l.

Chúng tôi lấy 13 mẫu bệnh phẩm tổng phân tích có kết quả protein niệu

là 0,25g/l để định lượng protein niệu bằng 2 phương pháp TCA 5% và trênmáy AU 2700 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả protein niệu định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau ở những mẫu nước tiểu có kết quả TPT là 0,25 g/l.

Chẩn đoán

Kiểm tra sứckhỏe

protein niệu bằng phương pháp tủa với TCA 5% và trên máy Au 2700 là kháphù hợp.

- 12/13 mẫu nước tiểu của người đi kiểm tra sức khỏe có kết quả proteinniệu của 3 phương pháp tương đương nhau, riêng mẫu số 13 của bệnh nhân đa

u tủy xương cho kết quả lệch nhau nhiều giữa 3 nhóm

- Chưa thấy sự khác biệt về kết quả protein niệu giữa nhóm I và II, nhóm

I và III, nhóm II và III (p>0,05)

c Đối với những bệnh nhân cho kết quả tổng phân tích là 0,75 g/l.

Chúng tôi lấy 10 mẫu bệnh phẩm tổng phân tích có kết quả protein niệu

là 0,75g/l để định lượng protein niệu bằng 2 phương pháp TCA 5% và trênmáy AU 2700 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả protein niệu định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau ở những mẫu nước tiểu có kết quả TPT là 0,75 g/l.

Chẩn đoán

Kiểm tra sứckhỏe

I và II, III khá tương đương nhau

- 7/10 mẫu nước tiểu của người đi kiểm tra sức khỏe có kết quả proteinniệu của 3 phương pháp tương đương nhau 3/10 mẫu của bệnh nhân có bệnh

lý về thận Kết quả khác biệt khá lớn ở mẫu số 10 là của bệnh nhân suy thận

- Chưa thấy sự khác biệt về kết quả protein niệu giữa nhóm I và II, nhóm

I và III, nhóm II và III (p>0,05)

d Đối với những bệnh nhân cho kết quả tổng phân tích là 1,5 g/l.

Chúng tôi lấy 16 mẫu bệnh phẩm tổng phân tích có kết quả protein niệu

là 1,5g/l để định lượng protein niệu bằng 2 phương pháp TCA 5% và trênmáy AU 2700 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả protein niệu định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau ở những mẫu nước tiểu có kết quả TPT là 1,5 g/l.

STT TPT (BĐL)

(g/l)

ĐL - TCA5% (g/l)

II và nhóm III phần lớn nằm trong dải từ 1,5 đến <5g/l do vậy mà kết quảnhóm I và II, III khá tương đương nhau.

- 10/16 mẫu nước tiểu của người đi kiểm tra sức khỏe có kết quả proteinniệu của 3 phương pháp tương đương nhau 6/16 mẫu của bệnh nhân có bệnh

lý về thận Kết quả khác biệt khá lớn là mẫu số 16 ở bệnh nhân đa u tủyxương

- Chưa thấy sự khác biệt về kết quả protein niệu giữa nhóm I và II,nhóm I và III, nhóm II và III (p>0,05)

e Đối với những bệnh nhân cho kết quả tổng phân tích là 5 g/l

Chúng tôi lấy 46 mẫu bệnh phẩm tổng phân tích có kết quả protein niệu

là 5g/l để định lượng protein niệu bằng 2 phương pháp TCA 5% và trên máy

AU 2700 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.5: Kết quả protein niệu định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau ở những mẫu nước tiểu có kết quả TPT là 5 g/l.

STT BĐL (TPT)

(g/l)

ĐL – TCA5% (g/l)

- Phương pháp bán định lượng (tổng phân tích) cho kết quả protein = 5g/

l tức là trong dải ≥5g/l Kết quả nhóm II và nhóm III phần lớn đều ≥5g/l dovậy mà kết quả nhóm I và II, III khá tương đương nhau

- 2/46 mẫu nước tiểu của người đi kiểm tra sức khỏe cho kết quả proteincủa 3 phương pháp tương đương nhau 44/46 mẫu của bệnh nhân có bệnh lý

về thận Kết quả định lượng protein bằng 2 phương pháp TAC 5% và trênmáy AU 2700 khác biệt khá nhiều so với kết quả tổng phân tích

- Sự khác biệt thống kê về kết quả protein niệu giữa nhóm I và II, nhóm I

và III, nhóm II và III là rất nhỏ (p>0,05)

Để tìm hiểu thêm mối tương quan về chỉ số protein niệu giữa 3 phươngpháp chúng tôi thực hiện so sánh kết quả tổng phân tích với kết quả 2 phươngpháp định lượng theo nhóm bệnh nhân, kết quả được thể hiện ở bảng 3.6