KẾT QUẢ xét NGHIỆM tìm KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN BẰNG kĩ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG GIÁN TIẾP TRÊN tế bào HEP 2 tại BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn 4HEp-2 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO... bệnh nhân do

Cô Vũ Nguyệt Minh, người thầy đã trực tiếp dìu dắt, tận tình hướng dẫn

và cho tôi những kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại để tôi hoàn thành tốt luận văn này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn đảng ủy, ban giám hiệu, phòng đào tạo trường Đại học Y Hà Nội, bộ môn Da liễu trường Đại học Y Hà Nội, các cán

bộ nhân viên Bệnh viện Da liễu Trung ương, đặc biệt Phòng khám chuyên đề

đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ, gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên giúp đỡ tôi tiếp thêm cho tôi sức mạnh để vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập cũng như viết bản khóa luận này!

***************************************

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

PHẠM THỊ CHÚC

-LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi:

Phòng đào tạo đại học – Trường Đại học Y Hà Nội

Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Bộ môn Da liễu – Trường Đại học Y Hà Nội

Tôi xin cam đoan toàn bộ số liệu và kết quả thu thập được trong luận vănnày là trung thực, chưa từng công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác.Tôi xinchịu mọi trách nhiệm về tính chính xác của những thông tin và số liệu đưa ra

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015

Sinh viên

Phạm Thị Chúc

ANA Antinuclear antibody

Kháng thể kháng nhân

Anti IgG-FITC Kháng thể kháng IgG của người đã gắn

huỳnh quangAnti- phospholipid Kháng thể kháng phospholipid

Anti-Sjögren's-syndrome-related antigen A

assay-(Miễn dịch gắn men)

(phức hợp huỳnh quang)

Hội chứng CREST Calcinosis Raynaud Esophalageal

Sclero-dactylic Telangiectasis

(kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang)

SLE Systemic lupus erythematosus

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể 3

1.1.1 Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnhquang gián tiếp trên tế bào HEp-2 3

1.1.2 Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể khác 9

1.2 Tổng quan về bệnh tổ chức liên kết tự miễn 10

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 17

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 17

3.1 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp

-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/-2013 - 1-2/-2014 -20

3.1.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu được làm xét nghiệm tìm ANA bằng kĩthuật MDHQGT trên tế bào HEp - 2 20

3.1.2 Tình hình tiến hành xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên

tế bào HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương 21

3.1.3 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

3.2.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu đủ tiêu chuẩnchẩn đoán SLE, XCBHT,VBC trong nghiên cứu (N2=448) 24

3.2.2 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

HEp-2 của các bệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn (n1=317) HEp-25

3.2.3 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

HEp-2 của các bệnh nhân XCBHT đủ tiêu chuẩn (nHEp-2=117) 29

3.2.4 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

HEp-2 của các bệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn (n3=14) 33

Chương 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Khảo sát chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tếbào HEp - 2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/2013 - 12/2014(N1=1267) 37

4.1.1 Một vài đặc điểm của nhóm nghiên cứu 37

4.2 Đánh giá kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tếbào HEp- 2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêuchuẩn tại Bệnh viện Da liễu Trung ương 39

4.2.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tựmiễn đủ tiêu chuẩn 39

4.2.2 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

HEp-2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn 4HEp-2

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

bệnh nhân do phòng khám chuyên đề và phòng khám khác chỉ định 22Bảng 3.2: So sánh chẩn đoán sơ bộ và kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩthuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 của phòng khám chuyên đề 23

Bảng 3.3 Đặc điểm nhóm nghiên cứu đủ tiêu chuẩn chẩn đoán SLE, XCBHT,VBC trong nghiên cứu 24

Bảng 3.4 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 củabệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn trong nghiên cứu 25

Bảng 3.5 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với sốlượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SLE 27

Bảng 3.6 Mối tương quan giữa mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bàoHEp-2 với số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SLE 28

Bảng 3.7 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 củabệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán XCBHT 29

Bảng 3.8 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với sốlượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh XCBHT 31

Bảng 3.9 Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với sốlượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh XCBHT 32

Bảng 3.10 Phân bố các dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 củabệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn 33

Bảng 3.11 Phân bố dạng lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với sốlượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh VBC 35

Bảng 3.12 Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 so với

số lượng tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh VBC 36

ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 trong nghiên cứu 20

Biểu đồ 3.2: Phân bố theo giới tính của nhóm bệnh nhân được làm xét nghiệmtìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 21

Biểu đồ 3.3 Phân bố đơn vị chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuậtMDHQGT trên tế bào HEp-2 21

Biểu đồ3.4: Phân bố các mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2của bệnh nhân SLE đủ tiêu chuẩn trong nghiên cứu 26

Biểu đồ 3.5: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 củabệnh XCBHT đủ tiêu chuẩn 30

Biểu đồ 3.6: Phân bố mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 củabệnh nhân VBC đủ tiêu chuẩn 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình xét nghiệm MDHQGT trên tế bào HEp-2 5

Hình 1.2: Một số dạng lắng đọng MDHQGT trên tế bào HEp-2 thường gặp

8

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu bệnh nhân 19

Với nền y học tiến bộ hiện nay có rất nhiều kĩ thuật miễn dịch giúp pháthiện các tự kháng thể như kĩ thuật miễn dịch gắn men, kĩ thuật kết tủa khuếchtán kép trên thạch Trong đó, xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩthuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 (Human Epithelialtype 2) là kĩ thuật mới được áp dụng tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, chophép phát hiện nhiều loại kháng thể như kháng thể kháng nhân và kháng thểkháng lại nhiều thành phần cấu trúc tế bào Tế bào HEp-2 là tế bào được lytrích từ các tế bào ung thư thanh quản của người, có nhân tế bào lớn, hình thái

dễ quan sát Việc sử dụng tế bào HEp-2 làm kháng nguyên trong miễn dịchhuỳnh quang gián tiếp để phát hiện kháng thể kháng nhân đã được sử dụng từnhững năm 1980, cho kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu cao Theo nghiên cứucủa Henrique A Mariz (2011) trên 153 bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết

tự miễn bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 chothấy tỷ lệ kháng thể kháng nhân dương tính là 90,2 % [6] Xét nghiệm tìmkháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tếbào HEp-2 đã được áp dụng trên thế giới từ những năm 1980, tuy nhiên tạiBệnh viện Da liễu Trung ương kĩ thuật này mới được triển khai từ tháng5/2013 Mặt khác, hiện nay tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu cụ thể về

kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài "Kết quả xét nghiệm tìm kháng thể

kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương" với 2 mục tiêu:

1 Khảo sát chỉ định xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/2013- 12/2014.

2 Đánh giá kết quả xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp- 2 của các bệnh nhân mắc bệnh tổ chức liên kết tự miễn đủ tiêu chuẩn.

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 Các kĩ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể

1.1.1 Xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2

1.1.1.1 Lịch sử

Kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (MDHQGT) được Coons đềxướng năm 1942, đây là một bước ngoặt trong nghiên cứu miễn dịch học,miễn dịch bệnh học cũng như nghiên cứu bệnh sinh một số bệnh Năm 1954,Coons và weller đã áp dụng kỹ thuật MDHQGT để nghiên cứu và chẩn đoán

tự kháng thể Sau 3 năm, Weir và Johson đã dùng kĩ thuật này để phát hiệnkháng thể kháng nhân (antinuclear antibody- ANA) trong huyết thanh bệnhnhân lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE) Trướcđây, kháng nguyên thường dùng trong xét nghiệm là cắt lát cơ quan của loàigậm nhấm, tổ chức hay dùng là gan và thận chuột Do vậy tỉ lệ dương tính củaANA trong SLE thường thấp Theo nghiên cứu của Rowell chỉ gặp 37% ANAdương tính ở bệnh nhân SLE Mai Trọng Khoa nghiên cứu trên 38 bệnh nhânSLE cho thấy tỉ lệ dương tính của ANA là 60,5% [7] Để khắc phục nhữnghạn chế của kháng nguyên cắt lát mỏng tổ chức của chuột, ngày nay tế bàoHEp-2 đã được sử dụng thay thế

Tế bào HEp-2 là tế bào được ly trích từ các tế bào ung thư thanh quảncủa người Nhân tế bào rất lớn và hình thái dễ quan sát Do được nuôi cấynên tế bào HEp-2 xuất hiện trên tiêu bản ở nhiều giai đoạn phát triển khácnhau giúp xác định dễ dàng các kháng thể mà trên mảnh cắt tổ chức khôngcho phép

1.1.1.2 Định nghĩa

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IF: Immunofluorescence) là một kĩthuật hóa mô dùng phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể và vị trí khu trúcủa các kháng nguyên, kháng thể đó Kháng thể đặc hiệu được gắn với phứchợp huỳnh quang (FITC: Fluorescein Isothiocyanate), giúp chúng ta quan sátđược phản ứng miễn dịch dưới kính hiển vi huỳnh quang [8]

Có 2 kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang cơ bản được sử dụng trong ngành

1.1.1.3 Nguyên lý

Kháng thể (nếu có) trong huyết thanh bệnh nhân sẽ kết hợp với khángnguyên nhân (nhân tế bào HEp-2), phức hợp kháng nguyên-kháng thể đượcphát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang nhờ kết hợp với kháng thể khángIgG của người đã gắn huỳnh quang (anti IgG-FITC)

Tế bào HEp-2 được sử dụng như một cơ chất nền trong phương phápnày để phát hiện các loại ANA, kháng hạt nhân, kháng các thành phần củabào tương (DNA, histon, nucleosom, ribosom, enzyme…) [7]

1.1.1.4 Cách tiến hành xét nghiệm tìm kháng thể kháng nhân bằng kỹ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2

- Các xét nghiệm được thực hiện tại phòng xét nghiệm Bệnh viện DaLiễu Trung ương với kit FLUORO HEPANA của hãng MBL – Nhật bản

- Lấy bệnh phẩm: Lấy máu tĩnh mạch 3ml vào ống không chống đông,

để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, ly tâm với tốc độ 2000 vòng/15 phút Chắtphần huyết thanh vào ống 1,5ml, lưu ở tủ lạnh sâu -800C

- Chuẩn bị bệnh phẩm: Huyết thanh

bệnh nhân được pha loãng với dung

dịch phosphate buffer saline (PBS)

theo tỷ lệ 1:40

- Chuẩn bị lam kính có gắn tế bào

HEp-2: Lam kính được để ở nhiệt độ

phòng ít nhất 5 phút trước khi sử dụng

- Hút 50 l huyết thanh đã pha loãng

nhỏ vào mỗi giếng trên lam, không

chạm đầu típ vào đáy mỗi giếng

- Ủ lam ở buồng ẩm, nhiệt độ 37 0C,

- Làm khô xung quanh lam, nhỏ một

giọt glycerin vào mỗi giếng, đậy lam

Ủ ở buồng ẩm, 37 0C - 30 phút

Làm khôGlycerin

Đọc bằng kính hiển viHình 1.1 Quy trình xét nghiệmMDHQGT trên tế bào HEp-2

1.1.1.5 Nhận định kết quả:

- Gián tiếp thông qua kháng thể IgG có gắn FITC, dưới kính hiển vihuỳnh quang sẽ phát hiện được các kháng thể người bệnh gắn trên tế bàoHEp-2 Tuỳ vị trí gắn và mức độ huỳnh quang, kết quả sẽ đưa ra kiểu lắngđọng và đậm độ huỳnh quang.

- Âm tính: nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn bộ tế bào màu đỏnhân sẫm hơn

- Dương tính: trên nền tế bào đỏ, nhân tế bào to tròn nhuộm màu sángxanh Test được nhận định dương tính khi hiệu giá huyết thanh pha loãng là1/40 trở lên

Âm tính

Nhân không nhuộm màu sáng xanh, toàn

bộ tế bào màu đỏ, nhân màu đỏ sẫm hơn

Dạng lắng đọng Homogenerous (đồng

nhất)

- Toàn bộ nhân bắt màu đồng nhất, mịn

- Tế bào phân chia: bắt màu sáng hơn tế

Dạng lắng đọng Specked (đốm nhân)

- Nhân tế bào bắt màu không mịn và đều

- Hạt nhân không bắt màu

- Tế bào phân chia: không bắt màu

- Kháng thể: Anti-extractable nuclearantigens (anti-ENA) (Sm, SSA, SSB,ribonucleoprotein- RNP)

- Bệnh: SLE (anti-Sm), bệnh tổ chức liênkết hỗn hợp (anti-RNP), SS (anti-SSB)

Dạng lắng đọng Peripheral (viền nhân)

- Màng nhân bắt màu sáng hơn so với trungtâm nhân

- Tế bào phân chia: bắt màu sáng hơn tếbàothường

Nồng độ quyết định ngưỡng dương tính, gợi ý loại kháng thể (vì cónhững kháng thể dương tính ở những nồng độ pha loãng rất lớn và ngược lại,

có những kháng thể dương tính ở nồng độ nhỏ hơn)

Kiểu lắng đọng huỳnh quang và vị trí xuất hiện huỳnh quang trong tếbào giúp định hướng một cách trực tiếp tình trạng bệnh học, có thể gợi ý loại

tự kháng thể có khả năng nhất trong huyết thanh của bệnh nhân

Có nhiều yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả của xét nghiệm tìm ANAbằng kỹ thuật MDHQGT như: bản chất của chất nền, bản chất huyếtthanh, sự chọn lựa dung dịch đệm pha loãng và sự kết hợp huỳnh quang,điều kiện ủ và rửa, kính hiển vi huỳnh quang, huyết thanh chứng và phụthuộc chủ quan người đọc

1.1.2 Các kỹ thuật xét nghiệm phát hiện tự kháng thể khác

1.1.2.1 Miễn dịch kết tủa khuếch tán kép trên thạch (ouchterlony)

Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạchagarose Phức hợp này sẽ khuếch tán và tạo nên những đường kết tủa trên bềmặt thạch, sau đó dùng huyết thanh chuẩn hoặc kháng nguyên mẫu để sosánh Kĩ thuật này cho phép phát hiện nồng độ tối thiểu là 3mg/ml [10], [11]

Kỹ thuật này được đánh giá có độ nhạy, độ đặc hiệu thấp hơn các kỹ thuậtmiễn dịch gắn men, MDHQGT, miễn dịch đánh dấu [12]

1.1.2.2 Miễn dịch gắn men (Enzyme linked immunosorbent assay-ELISA) Nguyên tắc: Phương pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa

kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme.Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phảnứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiệnmàu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với khángnguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyênhay kháng thể cần phát hiện

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyênhoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Theo tác giảSinico, độ nhạy của phương pháp ELISA dao động từ 70 đến hơn 90% [13]

và từ 90 – 96% theo nghiên cứu của Copple [14] ELISA có tính tự động hóacao nhưng kém đặc hiệu so với MDHQGT và chất lượng phụ thuộc nhiều vàohãng sản xuất

1.1.2.3 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay-RIA)

Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3, Cacbon 14, I125

đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp khángnguyên kháng thể Kỹ thuật định lượng miễn dịch phóng xạ có thể phát hiện

nồng độ tối thiểu là 0,0001 mg/ml [10], [11] Tuy nhiên, RIA đòi hỏi sinh vậtphẩm đắt tiền, máy đo tia gamma hoặc beta và trang bị xử lý chất thải.

1.2 Tổng quan về bệnh tổ chức liên kết tự miễn

1.2.1 Khái niệm

Bệnh tổ chức liên kết tự miễn (Autoimmune connective tissue diseases ACTDs) là các bệnh lý do có sự kết hợp của tự kháng thể với tự khángnguyên dẫn đến tổn thương thực thể và chức năng tại tế bào, tổ chức hay cơquan[1],[2]

Lupus ban đỏ hệ thống (Systemic lupus erythematosus - SLE) là một bệnh

tự miễn có tổn thương đa cơ quan được đặc trưng bởi sự có mặt của ANA vànhiều tự kháng thể khác Cơ chế bệnh sinh của SLE rất phức tạp Bệnh là hậuquả của sự tương tác giữa yếu tố di truyền (gen bệnh), nội tiết và yếu tố môitrường (thuốc, tia cực tím, virus ) dẫn đến đáp ứng miễn dịch bất thường, sảnxuất không ngừng các tự kháng thể bệnh lý Các tự kháng thể này kết hợp vớikháng nguyên tạo phức hợp miễn dịch gắn vào các tổ chức đích gây tổn thương[2], [15] Ở Mỹ, theo thống kê hàng năm của Centers for disease control (CDC )

có khoảng 1,8-7,6 trường hợp mắc mới trên 100.000 dân, tỉ lệ mắc bệnh khoảng52/100.000 dân Bệnh gặp chủ yếu ở nữ giới, tỷ lệ nữ/nam là 9/1[1], [3]

1.2.2.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán SLE:

Tiêu chuẩn chẩn đoán của Hội Khớp học Mỹ năm 1997 gồm: [2], [10]

1 Ban cánh bướm ở hai bên má, phía dưới 2 mắt, có thể phẳng hoặc gồ lên mặt da

2 Ban hình đĩa: những mảng màu đỏ, nổi gồ lên kèm theo vảy da

3 Nhạy cảm với ánh sáng

4 Loét miệng, mũi hầu: thường ít đau

5 Viêm khớp: thường không gây biến dạng khớp, có thể sưng khớp và ấnđau

6 Viêm thanh mạc: tình trạng viêm của các túi hoặc màng phổi, tim vàkhoang ổ bụng

7 Tổn thương cầu thận: Protein niệu >500mg/24h hoặc tế bào niệu

8 Rối loạn về thần kinh, biểu hiện bằng cơn động kinh hoặc rối loạn tâmthần không do các nguyên nhân khác

9 Rối loạn về máu: giảm số lượng các thành phần bạch cầu, hồng cầu… trong máu

10 Rối loạn miễn dịch: phát hiện kháng thể kháng Axit DeoxyriboNucleic (DNA), kháng Smith hoặc kháng thể antiphospholipid

người già [16]

- Kháng thể kháng DNA [1], [16]

Kháng thể kháng DNA bao gồm kháng thể kháng DNA chuỗi kép

(anti-ds DNA - antibodies to double-stranded DNA): tỉ lệ dương tính cao 70-90%

ở bệnh nhân SLE [2], [17], độ đặc hiệu cao 95% [3], rất có ý nghĩa trong chẩnđoán SLE

Kháng thể kháng DNA chuỗi đơn (anti-ss DNA - antibodies to stranded DNA) gặp ở 30% bệnh nhân SLE, tuy nhiên nó có thể gặp trongbệnh SLE do thuốc, các bệnh nhiễm trùng và các bệnh tự miễn khác

single Kháng thể kháng Histon (Antibodies to individual histones)

70% bệnh nhân SLE có kháng thể kháng Histon dương tính, đó là khángthể kháng tiểu phần H1 và H2B Kháng thể kháng Histon H2A-2B, H3, H4thường thấy trong bệnh SLE do thuốc

- Kháng thể kháng chất nhiễm sắc (Antibodies to chromatin)

Chất nhiễm sắc là phức hợp gồm DNA và protein loại Histon, trong đónucleosom là phức hợp của DNA và Histon loại 2A-2B Kháng thể khángchất nhiễm sắc dương tính ở 69% bệnh nhân SLE

- Kháng thể kháng nhân hòa tan

+ Kháng thể kháng Smith (Splicesome ribonucleoprotein- Sm): Khángnguyên Smith là phức hợp của protein loại B, B’, D, E, F, G với các Acidribonucleic (RNA) nhân loại U1, U2, U4-6 và U5 Phức hợp này đóng vai tròquan trọng đối với sự gắn của tiền RNA thông tin, bước không thể thiếu trongquá trình sao chép RNA từ DNA Như vậy, anti Sm thực chất gồm nhiềukháng thể kháng lại các protein nhân khác nhau Anti Sm có độ đặc hiệu caođối với bệnh SLE Theo tác giả Lock RJ tỷ lệ anti Sm dương tính trong bệnhSLE bằng phương pháp ELISA là 34- 45%, độ đặc hiệu 88- 100% [18] Tronggiai đoạn lui bệnh, anti- dsDNA có thể trở về giá trị bình thường nhưng anti

Sm vẫn dương tính Do đó định lượng anti Sm có ý nghĩa trong chẩn đoánSLE, đặc biệt khi giá trị anti- dsDNA ở ngưỡng bình thường.

+ Kháng thể kháng Ro (Anti-Sjögren's-syndrome-related antigen A - Anti

SSA)

Anti SSA kháng phức hợp gồm 5 tiểu phần RNA tương bào (Y1-Y5) vàkhoảng 4 protein có trọng lượng phân tử 62, 60, 52, 50 kilo dalton Theo tácgiả Lock RJ độ nhạy bằng phương pháp ELISA của anti SSA trong bệnh SLE

là 61%, độ đặc hiệu 80- 93% [18] Kháng thể này gặp trong lupus ở trẻ sơsinh, lupus bán cấp ở da, bệnh nhân lupus có tổn thương thận và phổi, hộichứng Sjögren

- Kháng thể kháng phospholipid (Anti- phospholipid)

Anti-phospholipid gặp ở 24% bệnh nhân SLE Hội chứng khángphospholipid đặc trưng bởi sẩy thai nhiều lần, tiền sản giật, huyết khối tĩnhmạch, động mạch trung tâm và ngoại vi

1.2.3 Bệnh xơ cứng bì hệ thống (systemic sclerosis)

Xơ cứng bì hệ thống (XCBHT) là một bệnh tự miễn mạn tính, không rõcăn nguyên, đặc trưng về lâm sàng bởi tình trạng rối loạn vận mạch, xơ, teo

da, tổ chức dưới da, cơ khớp, tiêu hóa, phổi, tim, thận, hệ thần kinh Bệnhthường gặp ở nữ (tỷ lệ nữ/nam = 4/1) Tần số bệnh XCBHT khoảng 2,3- 10bệnh nhân trên 1.000.000 người dân Tuổi khởi phát trong khoảng từ 30 – 40tuổi [1], [2] Nguyên nhân tử vong thường do tổn thương nội tạng như tăng ápđộng mạch phổi, xơ hóa phổi, bệnh tim

XCBHT được chia làm 2 thể chính:

- XCBHT khu trú (Localized cutaneous systemic sclerosis - lcSSc): còngọi là hội chứng CREST (Calcinosis Raynaud Esophalageal Sclero-dactylicTelangiectasis) gồm các biểu hiện calci hóa đầu chi, hội chứng Raynaud, tổnthương thực quản, xơ cứng đầu chi và giãn mạch Thương tổn da giới hạn ở

vùng đầu chi, mặt, ngực mà không có ở gốc chi, thân mình, tiến triển chậm [19]

- XCBHT lan tỏa (Diffuse cutaneous systemic sclerosis – dcSSc): xơcứng vùng gốc chi, thân và mặt XCBHT lan tỏa tiến triển nhanh gây tổnthương nội tạng, rối loạn chức năng nhiều, tỉ lệ tử vong cao

1.2.3.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Tiêu chuẩn chẩn đoán XCBHT theo Hội thấp khớp học Mỹ (ACR) 1980:

- Tiêu chuẩn chính: XCB hướng tâm, đối xứng, da dầy, căng cứng

- Tiêu chuẩn phụ:

+ Xơ cứng da đầu chi

+ Sẹo lõm hoặc loét ở ngón tay

+ Xơ phổi vùng đáy 2 bên: Trên phim X quang thấy mờ hình dải hoặcnốt mờ ở hai đáy phổi, mờ có thể lốm đốm tạo thành hình "tổ ong" Nhữngtổn thương này không do bệnh phổi nguyên phát gây nên

Chẩn đoán xác định XCBHT khi có một tiêu chuẩn chính hoặc trên haitiêu chuẩn phụ ở trên

1.2.3.2 Một số tự kháng thể thường gặp trong bệnh XCBHT

- Kháng thể Topoisomerase I (Scl - 70/Topol)

Trước đây, kháng thể này có tên gọi là Scl- 70 vì kháng đoạn trọnglượng phân tử 70 kilodalton của enzym DNA topoisomerase I, enzyme có vaitrò tháo xoắn chuỗi DNA xoắn kép trong quá trình phiên mã Ngày này đượcgọi là kháng thể Topoisomerase I, kháng thể này gặp ở 25 - 40% bệnh nhânXCBHT, thường ở thể tổn thương da lan toả [20]

- Kháng thể kháng Centromere

Kháng thể kháng đoạn trung tâm của chromosome, gặp ở 60% bệnhnhân XCBHT thể giới hạn, đặc hiệu cho thể này (98%) Chúng cũng có 6% ởbệnh nhân SLE, 17% ở bệnh nhân xơ gan đường mật tiên phát

- Kháng RNA polymerase I, II, III

Gặp ở 4 - 20% bệnh nhân, liên quan với XCBHT có tổn thương thận.Ngoài ra, có thể gặp các tự kháng thể khác như kháng thể khángFibrillarin (U3-RNP)

1.2.4 Bệnh viêm bì cơ (VBC)

VBC là một bệnh hệ thống biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau, trong

đó chủ yếu tác động đến da, cơ và mao mạch, đặc trưng bởi các dát đỏ phù nềtrên da, yếu cơ và các dấu hiệu viêm Cơ chế bệnh sinh còn chưa rõ ràng Tỷ

lệ bệnh khoảng 5,5 trường hợp trong 1.000.000 dân tại Mỹ, nữ mắc bệnh gấpđôi nam giới Bệnh có thể gặp ở bất kỳ lứa tuổi nào, song có 2 lứa tuổi thườnggặp: ở người lớn khoảng 50 tuổi, trẻ nhỏ 5-10 tuổi [2]

1.2.4.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Tiêu chuẩn chẩn đoán của Nhật Bản năm 1995 gồm:

- Triệu chứng da:

1 Ban tím sẫm quanh hốc mắt (helitrope rash)

2 Sẩn Gottron: ban xuất huyết sừng hóa, mảng đỏ hoặc tím ở mặt duỗicủa ngón tay

3 Ban đỏ ở mặt duỗi các khớp ngoại vi lớn (khuỷu, gối)

- Triệu chứng về cơ và ngoài cơ

1.Yếu cơ gốc chi: chi trên, chi dưới, thân mình

2.Tăng creatinin kinase hoặc aldolase huyết thanh

3 Đau cơ khi bóp hoặc đau tự nhiên

4 Thay đổi trên điện cơ (đơn vị vận động đa pha ngắn có điện thế rung tựnhiên)

5 Xét nghiệm kháng thể kháng Jo-1 dương tính

6 Viêm khớp không có phá hủy khớp

7 Dấu hiệu viêm hệ thống: sốt, C reaction protein (CRP) tăng, máu lắng

>20mm/h

8 Sinh thiết cơ có tình trạng viêm cơ vân, thoái hóa sợi cơ.

Chẩn đoán xác định VBC khi có ít nhất 1/3 tiêu chuẩn về da và 4/8 tiêuchuẩn về cơ và ngoài cơ

1.2.4.2 Một số tự kháng thể trong bệnh VBC

- Kháng thể Mi-2 (Anti-Mi-2)

Anti-Mi-2 kháng lại enzyme tháo xoắn chuỗi DNA, có độ đặc hiệu cao, pháthiện được ở 25% bệnh nhân VBC [2] Thường xuất hiện ở bệnh nhân VBC cóbiểu hiện cấp tính, tiên lượng tốt

- Kháng thể Jo-1(Anti-Jo-1)

Anti-Jo-1 (antihistidyl transfer RNA synthetase) kháng lại enzyme tổng hợpHistidyl-tRNA, một enzyme của bào tương Anti-Jo-1 gặp khoảng 20-30% bệnhnhân VBC thường kết hợp viêm phổi kẽ, hiện tương Raynaud, viêm khớp [2]

- Kháng thể 155/140 (Tif 1γ)

Tif 1γ - Transcriptional intermediary factor 1 là kháng thể kháng yếu tố trung gianphiên mã 1γ, gặp trong VBC phối hợp với ung thư, VBC ở trẻ em

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

Mục tiêu 1: Đối tượng của nghiên cứu bao gồm 1267 hồ sơ được chỉ định làmxét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 từ phòngkhám chuyên đề và từ các phòng khám khác tại Bệnh viện Da liễu Trungương (chỉ lấy kết quả lần 1, không lấy kết quả xét nghiệm lần 2) trong khoảngthời gian 5/2013- 12/2014

Mục tiêu 2: Đối tượng của nghiên cứu bao gồm 448 hồ sơ đủ tiêu chuẩn chẩnđoán bệnh tổ chức liên kết miễn dịch bao gồm SLE (tiêu chuẩn ACR 1997),XCBHT (tiêu chuẩn ACR 1980) và VBC (tiêu chuẩn Nhật Bản 1995) đangquản lý tại phòng khám chuyên đề bệnh tổ chức liên kết tự miễn tại Bệnh viện

Da liễu Trung ương và có kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuậtMDHQGT trên tế bào HEp-2 trong khoảng thời gian 5/2013- 12/2014

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

Với mục tiêu 2, chúng tôi không đưa vào nghiên cứu các hồ sơ:

- Bệnh nhân chưa được làm xét nghiệm tìm ANA bằng kỹ thuật MDHQGTtrên tế bào HEp-2

- Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh tổ chức liên kết hỗn hợp (Overlap) hoặcbệnh tổ chức liên kết tự miễn chưa phân loại

- Bệnh nhân chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán xác định SLE, XCBHT, VBC theocác tiêu chuẩn trên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Mô tả cắt ngang hồi cứu

đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tổ chức liên kết tự miễn bao gồm SLE,XCBHT và VBC đang quản lý tại phòng khám chuyên đề bệnh tổ chức liênkết tự miễn tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

+ Thống kê kết quả xét nghiệm MDHQGT trên tế bào HEp-2 của các bệnhnhân nêu trên

+ Xử lý số liệu thu được và đưa ra nhận định

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê y học dựa vàochương trình phần mềm SPSS 20.0 Các số liệu định lượng được biểu hiệndưới dạng trung bình ± SD, các số liệu định tính được biểu hiện dưới dạng tỷ

lệ %

2.4 Cách khống chế sai số trong nghiên cứu

- Các công cụ thu thập thông tin, mẫu bệnh án được thiết kế thích hợp theomục tiêu nghiên cứu

- Quá trình tiến hành xét nghiệm tìm ANA bằng kỹ thuật MDHQGT trên tếbào HEp-2 được thực hiện theo đúng quy trình và việc nhận định kết quảđược thực hiện bởi các bác sĩ quản lý nhóm bệnh tổ chức liên kết tự miễn, cóchụp ảnh tất cả các kết quả

- Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tổ chức liên kết tự miễn gồm SLE, XCBHT,VBC do các bác sĩ quản lý nhóm bệnh tổ chức liên kết tự miễn đánh giá

- Người nghiên cứu sẽ tiến hành thu thập thông tin và thống kê lại các kết quảxét nghiệm và bệnh cảnh lâm sàng đã được nhận định bởi các bác sĩ quản lýnhóm bệnh tổ chức liên kết tự miễn tại Bệnh viện Da liễu Trung ương.

2.5 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu bệnh nhân

Chương 3

Mục tiêu 1

BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM

Chỉ định xét nghiệm MDHQGT trên tế bào HEp-2

- Không phải bệnh tổ chức liên kết tự miễn

Mục tiêu 2

Có kết quả HEp-2 n= 540

Không đủ tiêu chuẩn

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp

-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 5/-2013 - 1-2/-2014

3.1.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu được làm xét nghiệm tìm ANA bằng kĩthuật MDHQGT trên tế bào HEp - 2

3.1.1.1 Đặc điểm phân bố theo tuổi của nhóm nghiên cứu được làm xétnghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp -2

3.1.1.2 Đặc điểm phân bố theo giới tính của nhóm nghiên cứu được làm xétnghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2

77.70%

Nam Nữ

Biểu đồ 3.2: Phân bố theo giới tính của nhóm bệnh nhân được làm xét nghiệmtìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào HEp-2

Nhận xét: Trong nhóm bệnh nhân được làm xét nghiệm, nữ giới chiếm77,7%, tỷ lệ nữ / nam = 3/1

3.1.2 Tình hình tiến hành xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên

tế bào HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

3.1.2.1 Phân bố đơn vị chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuậtMDHQGT trên tế bào HEp-2 tại Bệnh viện Da liễu Trung ương

42.60%

57.40%

Phòng khám khác chỉ định Phòng khám chuyên đề chỉ định

Biểu đồ 3.3 Phân bố đơn vị chỉ định xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuậtMDHQGT trên tế bào HEp-2

Nhận xét: Phòng khám chuyên đề chỉ định 727 xét nghiệm tìm ANA bằng kĩthuật MDHQGT trên tế bào HEp-2 tương ứng 57,4%, phòng khám khác chỉđịnh 540 xét nghiệm tương ứng 42,6%

3.1.3 Kết quả xét nghiệm tìm ANA bằng kĩ thuật MDHQGT trên tế bào

HEp-2 của phòng khám chuyên đề và phòng khám khác

Bảng 3.1: Tỷ lệ mức độ lắng đọng huỳnh quang trên tế bào HEp-2 của cácbệnh nhân do phòng khám chuyên đề và phòng khám khác chỉ định