Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, xác định LD50 và tác dụng lên thần kinh trung ương trên thực nghiệm của siro laroxen

Đặt vấn đề - Thuốc tâm thần kinh đóng vai trò quan trọng - Thuốc có nguồn gốc hoá dược có nhiều tác dụng phụ

Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn

chất l ợng, xác định LD 50 và tác

dụng lên thần kinh trung ơng trên

thực nghiệm của siro laroxen

Cán bộ h ớng dẫn:

TS Nguyễn Minh Chính

Bộ Quốc Phòng HọcViện Quân Y

******

Phạm văn V ợng

(Khoá luận tốt nghiệp d ợc sĩ đại học khoá 1999 – 2005)

Nội dung trình bày gồm:

1 Đặt vấn đề

2 Tổng quan tài liệu

3 Vật liệu và ph ơng pháp nghiên cứu

4 Kết quả và bàn luận

5 Kết luận

Đặt vấn đề

- Thuốc tâm thần kinh đóng vai trò quan trọng

- Thuốc có nguồn gốc hoá d ợc có nhiều tác dụng phụ

- Gần đây, Học Viện Quân Y đã điều chế đ ợc Rotundin sulfat

Đây là nguyên liệu cho nhiều dạng thuốc nh : thuốc tiêm, viên nén, viên nang, siro Trong đó dạng siro đ ợc bào chế tại

Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc - Học viện

Quân Y có tên là siro Laroxen

- So với dạng bào chế khác, siro là dạng thuốc phổ biến và nó thích hợp với ng ời già và trẻ nhỏ

Từ những ý nghĩa khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu sau:

1 Xây dựng tiêu chuẩn chất l ợng siro Laroxen

2 Xác định LD 50

3 xác định tác dụng giảm đau, gây ngủ, trấn tĩnh và chống

co giật của thuốc trên động vật thực nghiệm.

PhÇn i - Tæng quan

1.1 C©y b×nh v«i (stephania lour - Menispermaceae).

1.1.1 §Æc ®iÓm thùc vËt.

D©y leo, th©n xo¾n nh½n,

th êng xanh, sèng l©u n¨m,

1.1.2 Phân bố, trồng hái và chế biến.

- Việt Nam phân bố ở các tỉnh nh : Hà Tây, Hoà Bình, Hà

Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Phú Yên, Ninh Thuận v.v [17], [7], [6]

- Bình vôi bằng hạt hoặc bằng phần đầu của củ

- Khi thu củ về đem cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng, phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiết Rotundin

1.1.3 Bộ phận dùng và thành phần hoá học.

- Bộ phận dùng:

D ợc liệu là củ bình vôi đã đ ợc phơi hoặc sấy khô [7], [6]

- Thành phần hoá học:

Củ bình vôi có nhiều alcaloid trong đó có Rotundin

(L-tetrahydropalmatin) và các alcaloid khác nh : Stepharin,

Cycleanin, Ngoài ra còn có tinh bột, đ ờng khử

1.2 Hîp chÊt Rotundin vµ Rotundin

1.2.1.2 Các thông số hoá lý [23], [7].

- Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi không vị.

- Độ tan: Không tan trong n ớc, tan trong Cloroform, dễ tan trong acid loãng.

- Điểm chảy (mp): 141- 1440 C.

- - Phổ tử ngoại: có đỉnh hấp thụ tại 281nm

1.2.1.3 Chiết xuất và tinh chế Rotundin

Chiết xuất, tinh chế Rotundin đạt hàm l ợng 90 - 95% trong sản phẩm trung gian và tinh chế Rotundin tinh khiết đạt

hàm l ợng trên 99% [7], [20], [31].

1.2.1.4 Tác dụng sinh học.

Rotundin (L- tetrahydropalmatin) có tác dụng an thần,

gây ngủ v.v [20], [27].

1.2.2 Hợp chất Rotundin sulfat.

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- CTPT: C21 H25 NO4.H2 SO4

- CTCT:

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- KLPT: 453,51

1.2.2.2 Các thông số lý, hoá [7], [9], [10], [8].

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- Tinh thể màu trắng hoặc hơi ánh vàng, không mùi vị

hơi chát

- Độ tan: dễ tan trong n ớc, tan trong Methanol, ít tan

trong Ethanol cao độ, không tan trong Ether,

Chloroform.

- Điểm chảy ( t c) : 213  221 C

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- Năng xuất quay cực riêng (25

D): không d ới - 210 - Tạp chất liên quan: không quá 0,5%.

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- pH (dung dịch 1% trong n ớc): 1,5  2,5.

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- Phổ tử ngoại: có đỉnh cực đại tại 281nm.

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- Định l ợng: Rotundin sulfat phải chứa từ 98,0 % đến

101,0% C24H25NO4.H2SO4

1.2.2.3 Điều chế Rotundin sulfat [7], [9], [10], [8]

Lần đầu tiên, qui trình sản xuất Rotundin sulfat đ ợc Học viện Quân Y công bố (2001):

Nguyên tắc:

Rotundin + Acid sulfuric Muối Rotundin sulfat

Sơ đồ qui trình:

Hệ dung môi H2 SO4 Lạnh, kết tinh

Rotundin dd đồng tan Phản ứng

đun nóng xúc tác, nhiệt độ Lọc

rửa, loại tạp

Tinh thể 1 Tinh thể 2

Sấy nhẹ

1.2.2.3 Tác dụng sinh học.

Rotundin sulfat có tác dụng an thần, làm dịu thần kinh,

gây ngủ, làm giảm vận động, chống co giật (trên động vật thực nghiệm) [7].

1.3.1 Định nghĩa:

Siro thuốc là dung dịch đậm đặc của đ ờng trắng

(succarose) trong n ớc, có chứa các d ợc chất hoặc dịch chiết từ d ợc liệu và các chất thơm.

1.3.2 Thành phần của siro thuốc.

Thành phần chính của siro thuốc bao gồm các d ợc chất,

dung môi n ớc và đ ờng Ngoài ra còn có một số thành

phần khác: Các chất làm tăng độ tan, tăng sinh khả dụng

và độ ổn định vv

1.3.3 Kĩ thuật điều chế

1.3.3.1 Điều chế siro thuốc bằng cách hoà tan d ợc chất,

dung dịch d ợc chất vào siro đơn.

Các giai đoạn tiến hành nh sau:

- Điều chế siro đơn:

- Chuẩn bị dung dịch d ợc chất (nếu có):

- Hoà tan d ợc chất, phối hợp dung dịch d ợc chất và siro

đơn.

- Hoàn chỉnh thành phẩm

Siro thuốc đ ợc lọc trong (lọc nóng), kiểm nghiệm phải

đạt các chỉ tiêu đề ra tr ớc khi đóng gói thành phẩm

1.3.3.2 Điều chế siro thuốc bằng cách hoà tan đ ờng vào

dung dịch d ợc chất

Các giai đoạn tiến hành nh sau:

Chuẩn bị dung dịch d ợc chất:

- Hoà tan đ ờng vào dung dịch d ợc chất:

- Đ a nồng độ đ ờng đến giới hạn qui định.

Để đ a đ ờng đến nồng độ qui định, dựa vào nhiệt độ sôi

Nồng độ

đ ờng (%)

Nhiệt độ sôi ( c C)

để tính l ợng n ớc cần thêm vào siro có nồng độ cao quá

quy định, ta có thể sử dụng các công thức sau (tính ra

1.4 kiÓm nghiÖm thuèc d¹ng siro.

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- TÝnh chÊt

Phần ii vật liệu và ph ơng pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên vật liệu, đối t ợng và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu:

- Siro Laroxen, công thức bào chế nh sau:

Rotundin sulfat: 600 mg Dầu thơm vđ

Siro đơn vđ : 100 ml

- Thuốc chuẩn là Seduxen, thuốc gây co giật Corazon 0,5%.

2.1.2 Đối t ợng: Chuột nhắt trắng, không phân biệt giống, đạt tiêu

chuẩn, trọng l ợng trung bình 20  2g/ con

2.1.3 Hoá chất, thuốc thử và dung môi

- Các thuốc thử: Kali dicromat (K2Cr2O7), Kali fericianid

(K3Fe(CN)6) 5%, Natri clorid bão hoà (NaCl), Bari clorid (BaCl2) 5%, dung dịch HCl, H2SO4 loãng

- Dung môi: Cồn 60 0 , 90 0 , 95 0 , n ớc cất.

Các hóa chất, thuốc thử, dung môi nói trên đều đạt tiêu chuẩn ghi trong DĐVN III, 2002.

2.1.4 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.

- Cân phân tích điện tử Mettler AE240 (Đức)

- Máy đo pH Hana Instrument 8417 (Singapore)

- Máy đo quang phổ tử ngoại UV-Visible Spectrometer -

2.2.1 Ph ơng pháp xây dựng tiêu chuẩn chất l ợng.

Dựa vào các thông số hoá lý, sinh học nh : Tính chất, tỷ trọng,

phổ UV, pH, định tính, định l ợng, độ nhiễm khuẩn, sai số

đóng gói, cụ thể ph ơng pháp xác định từng thông số đó nh sau:

2.2.1.1 Ph ơng pháp xác định tính chất của Siro Laroxen.

Màu sắc, mùi vị: xác định bằng cảm quan

2.2.1.3 Ph ơng pháp định tính.

Dựa vào các phản ứng đặc tr ng của Rotundin sulfat:

- phản ứng với dd BaCl2 5%

- Chiết lấy tủa bằng NaOH 0,01N, hoà tan đun nóng tủa thu

đ ợc bằng 15ml dung dịch H2SO4 0,01 N Dung dịch thu đ ợc, tiến hành các phản ứng với dung dịch K2Cr2O7 5%, dd NaCl bão hoà, K3Fe(CN)6 5% (đun nóng nhẹ)

Khối l ợng Siro Laroxen

a) Khảo sát sự hấp thụ UV của dung dịch đ ờng

b) Xây dựng đ ờng chuẩn:

- Cân chính xác khoảng 0,5g Rotundin sulfat, pha dãy các nồng

độ 20g/ml, 30g/ml, 40g/ml, 50g/ml, 60g/ml, 70g/ml trong siro đơn pha loãng

- Đo dãy nồng độ trên ở b ớc sóng  = 281nm

Mẫu trắng là siro đơn pha loãng

b) Định l ợng Siro Laroxen.

- Lấy chính xác 1ml Siro Laroxen cho vào bình định mức

100ml, thêm n ớc cất vừa đủ đến vạch để đ ợc dung dịch A

- Đo mật độ quang của dung dịch A ở  = 281nm

Mẫu trắng là siro đơn pha loãng không có hoạt chất Rotundin sulfat

Tính hàm l ợng Rotundin sulfat có trong Siro Laroxen dựa vào đ ờng chuẩn đã xây dựng ở trên

2.2.1.4 Ph ơng pháp định l ợng.

2.2.1.5 Ph ơng pháp đo pH : Bằng máy đo pH và dựa theo

DĐVN III, mục 5.9, phụ lục 5

Theo DĐVN III, mục 1.5, Phụ lục 1

2.2.2 Ph ơng pháp nghiên cứu độc tính cấp (LD 50 ):

-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- Dựa theo ph ơng pháp xác định độc tính cấp của Abraham W.B

và Turner.R 1965 và theo qui định của Bộ y tế về nghiên cứu

độc tính cấp của các thuốc y học cổ truyền dân tộc

Chuột thí nghiệm đ ợc chia làm 5 lô, mỗi lô 10 con Từng lô

chuột đựơc uống Siro Laroxen với liều của Rotundin sulfat tăng dần: 120 mg; 240 mg; 360 mg; 480 mg; 600mg

Theo dõi tình trạng chung của chuột trong thời gian thí

- Lô chứng: 10 con: cho uống n ớc muối sinh lý

- Lô nghiên cứu: 12 con: cho uống Siro Laroxen 20ml/kg

- Lô chuẩn: 12 con: cho uống Seduxen 15mg/kg

Theo dõi thời gian sau uống thuốc đến khi chuột ngủ (mất phản xạ lật sấp) và thời gian kéo dài giác ngủ

2.2.3.2 Ph ơng pháp nghiên cứu tác dụng của Siro Laroxen lên trạng thái hung hãn của chuột nhắt trắng.

- Đ a chuột ra ngoài và cho uống:

+ Lô thử: Siro Laroxen với liều 20mg/kg

+ Lô so sánh: Seduxen với liều 5 mg/kg

+ Lô chứng: n ớc muối sinh lý (NMSL)

- Sau khi uống 30 phút, lần l ợt đ a các cặp chuột lại máy kích thích đau Quan sát trạng thái của chuột và ghi số trận đánh nhau trong 1 phút Tính tỷ lệ ức chế hành vi hung hãn của

chuột chịu tác động của Siro Laroxen sau khi uống 2.2.3.3

Ph ơng pháp nghiên cứu tác dụng giảm đau của Siro Laroxen.

Gây đau, xác định thời gian xuất hiện cảm giác đau bằng chỉ tiêu: chuột liếm chân sau Chỉ lựa chọn những chuột có

thời gian từ 6 đến 24 giây

- L« thö: cho uèng Siro Laroxen víi liÒu 30mg/kg.

- L« so s¸nh : cho uèng Seduxen víi liÒu 10 mg/kg

- L« chøng: cho uèng n íc muèi sinh lý

2.2.3.4 Ph ¬ng ph¸p nghiªn cøu t¸c dông chèng co giËt trªn

m« h×nh g©y co giËt b»ng corazon 0,5 % cña Siro Laroxen.

Chuét nh¾t tr¾ng 30 con, chia lµm 2 l«:

- L« chøng: 10 con, g©y co giËt b»ng Corazon 0,5 % b»ng tiªm phóc m¹c víi liÒu 0,1 ml/10g thÓ träng chuét

Ghi kÕt qu¶ thÝ nghiÖm cña tõng chuét nghiªn cøu

- L« thö: 20 con, mçi con ® îc uèng 60 mg/kg thÓ träng chuét Sau 30 phót g©y co giËt b»ng Corazon 0,5 % víi liÒu 0,1

ml/10g thÓ träng Theo dâi thêi gian biÓu hiÖn tr¹ng th¸i co

giËt cña chuét thÝ nghiÖm

2 2.4 Ph ¬ng ph¸p xö lý sè liÖu:

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu ® îc xö lý b»ng ph ¬ng ph¸p thèng kª Y häc nh : T-test, TuyÕn tÝnh håi qui

Phần III: Kết quả và bàn luận

Bảng 1: Tính chất của Siro Laoxen

Các thông số Mẫu Thể chất Màu sắc Mùi vị

Nhận xét: Siro Laroxen là siro thuốc dạng lỏng, sánh có

màu vàng nâu, mùi thơm chanh, vị ngọt đắng

3.1.2 Kết qủa xác định tỷ trọng của Siro Laroxen bằng

picnomet.

B¶ng 2: Tû träng cña Siro Laroxen

ChØ

sè MÉu ®o

K/l îng Siro Laroxen

3.1.3 pH Bảng 3: pH của Siro Laroxen

Bảng 4: Kết qủa định tính Rotundin sulfat chuẩn

STT Phản ứng Kêt quả Màu sắc tủa

1 1 + Tủa màu vàng

2 2 + Tủa màu trắng

3

3

+ Tủa màu vàng, khi đun nóng nhẹ cho

màu xanh lá cây

4 4 + Tủa màu trắng , không tan trong HCl

loãng

Nh vậy các mẫu đều có chứa hoạt chất Rotundin sulfat và các

Bảng 5: Kết quả định tính Siro Laroxen

Kết quả quét phổ tử ngoại từ b ớc sóng 200 - 800 nm của Siro Laroxen pha loãng nh sau:

3.1.6 Phổ [UV] của Siro Laroxen.

0.0 0.25 0.5 0.75

1.0 Abs

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0

nm Quang Pho

281.2

3.1.7 Kết quả định l ợng Siro Laroxen.

3.1.7.1 Xây dựng đ ờng chuẩn.

Hình 2: Phổ tử ngoại [UV] của Siro Laroxen

Bảng 6: độ hấp thụ E của các dung dịch Rotundin sulfat trong siro pha loãng.

Nồng độ dung dịch (g/ml) Các

Từ kết quả này, tiến hành xây dựng đ ờng chuẩn

định Rotundin sulfat có trong Siro Larọxen

Hinh 3: đ ờng chuẩn Rotundin sulfat

trong siro pha loãng

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Kết quả ở bảng 6 và hình 3 cho thấy:

Độ hấp thụ và nồng độ dung dịch Rotundin sulfat trong siro pha loãng (khoảng nồng độ từ 20 đến 70 g/ml) có mối t ơng quan tuyến tính chặt chẽ với hệ số t ơng quan r bằng 0,998

3.1.7.2 Kết qủa định l ợng

Bảng 7: Hàm l ợng của Rotundin sulfat trong Siro Laroxen

Các mẫu đo Các thông

3.1.8 Kết qủa xác định sai số đóng gói.

Kết quả đ ợc thể hiện ở bảng sau:

Bảng 8: Thể tích 1 đơn vị đóng gói của Siro Laroxen

Nh vậy tiêu chuẩn về sai số đóng gói: thể tích của Siro

Laroxen trong mỗi lọ từ : 97 - 107ml

3.1.9 độ trong.

Kết quả: Các mẫu đều có độ trong t ơng đ ơng với hỗn dịch

chuẩn đối chiếu số I

3.2 Kết quả nghiên cứu LD 50 của Siro Laroxen

Bảng 9: Kết quả xác định LD 50

Lô n

Liều (mg/kg)

Số chuột chết (72 giờ)

Số chuột sống (72 giờ)

3.3 KÊT qủa xác định các tác dụng d ợc lý của Siro Laroxen

3.3.1 Tác dụng gây ngủ của Siro Laroxen trên chuột nhắt trắng.

Chuột nhắt trắng đ ợc chia làm 3 lô: Lô chứng, lô thử và lô sánh,kết qủa nh sau:

Bảng 10: Thời gian gây ngủ và kéo dài giấc ngủ của các lô nghiên cứu

- Siro Laroxen có tác dụng gây ngủ rõ rệt và kéo dài giấc ngủ

- Tác dụng gây ngủ và kéo dài giấc khi so sánh với Seduxen ở liều sử dụng có tác dụng t ơng tự, nh ng hiệu lực có phần yếu hơn, sự khác biệt có ý nghĩa: p 0,05

Số trận đánh

XP

Số trận đánh sau 30 phút

Tỷ lệ % ức chế Hành vi hung hãn

Số trận

đánh XP

Số trận đánh sau 30 phút

Tỷ lệ % ức chế hành vi hung hãn Siro

Laroxen

Nhận xét

3.3.3 Tác dụng giảm đau.

Bảng 13,14: Tác dụng giảm đau khi so sánh giữa các lô nghiên cứu

Lôthí nghiệm n Xuất phát Sau 30 phút

- Thời gian chịu nóng tăng nên rõ rệt ở nhóm uống Siro Laroxen so với nhóm uống

n ớc muối sinh lý (gấp 1,56 lần), sự khác biệt có ý nghĩa: p  0,05 Chứng tỏ Siro Laroxen có tác dụng giảm đau

- ở liều đã sử dụng, khi so sánh với Seduxen, tác dụng giảm đau của Siro Laroxen, không có sự khác biệt với p > 0,05

3.3.4 T¸c dông chèng co giËt trªn m« h×nh g©y co giËt b»ng corazon 0,5%

B¶ng 15: T¸c dông chèng co giËt cña Siro Laroxen

Thêi gian tiÒn

co giËt (phót)

Thêi gian co giËt (phót)

Tû lÖ chÕt (%)

Phần iv - Kết luận

4.1 kết luận

Từ những kết quả thu đ ợc, chúng tôi có một số kết luận sau:

4.1.1 Tiêu chuẩn chất l ợng Siro Laroxen

mùi thơm chanh

+ Độ trong: dung dịch phải có độ trong t ơng đ ơng với hỗn dịch

chuẩn đối chiếu số I

+ Tỷ trọng : 1,31 - 1,33

+ pH : 2,1 - 2,5

+ Định tính: phải có phản ứng của rotundin sulfat

4.1.2 LD50

chuột nhắt trắng thí nghiệm

- Siro Laroxen dạng lọ 100 ml, trong đó l ợng Rotundin sulfat

là 600 mg do Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc

- Học viện Quân Y bào chế ít độc

4.1.3 Tác dụng d ợc lý của siro Laroxen

Siro Laroxen có tác dụng:

- Gây ngủ và kéo dài giấc ngủ ở liều 120 mg/kg thể trọng

chuột Thời gian kéo dài giấc ngủ là 48,67  16,50 Tác dụng này t ơng tự nh Seduxen ở liều 15mg/kg thể trọng chuột

- Chống hung hãn ở liều 20 mg/kg thể trọng chuột, tác dụng

này có phần mạnh hơn Seduxen ở liều 5mg/kg thể trọng chuột (gấp 1,12 lần)

4.2 kiến nghị

- Giảm đau ở liều 30 mg/kg thể trọng chuột, tác dụng này t ơng

tự Seduxen ở liều 10mg/kg thể trọng chuột

- Chống co giật trên mô hình gây co giật bằng corazon 0,5% ở liều 60 mg/kg thể trọng chuột

Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định, để từ đó hoàn thiện tiêu chuẩn cơ sở của Siro Laroxen