ỨNG DỤNG kỹ THUẬT BOBS để PHÁT HIỆN một số hội CHỨNG LỆCH bội và mất đoạn NHỎ NHIỄM sắc THỂ của THAI TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH

PHAN THỊ THU GIANGứng dụng kỹ thuật Bobs để phát hiện một số hội chứng lệch bội và mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể của thai trong chẩn đoán trớc sinh LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ

PHAN THỊ THU GIANG

ứng dụng kỹ thuật Bobs để phát hiện

một số hội chứng lệch bội và mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể của thai trong chẩn đoán trớc sinh

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ứng dụng kỹ thuật Bobs để phát hiện

một số hội chứng lệch bội và mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể của thai trong chẩn đoán trớc sinh

Chuyờn ngành : Y sinh học - Di truyền

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đãnhận được sự hướng dẫn quý báu, sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, cácanh chị, bạn bè và gia đình.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lời cảm ơnchân thành tới:

Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Sauđại học, Bộ môn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội, Trung tâmChẩn đoán trước sinh – Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương đã tạo mọi điều kiện,giúp đỡ tôi tận tình trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hoàng ThịNgọc Lan người đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tôi trongsuốt quá trình làm luận văn cũng như quá trình nghiên cứu, học tập, truyềncho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tớicác anh chị kỹ thuật viên Trung tâm Chẩn đoán trước sinh – Bệnh viện PhụSản Trung Ương đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong quá trìnhnghiên cứu

Các Thầy cô trong hội đồng khoa học thông qua đề cương đã đóng gópnhiều ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn các bệnh nhân đã đồng ý tham gia vào nghiên cứu này.Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn động viên tôi,bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ khó khăn với tôi trong suốt quá trình hoàn thànhluận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 9 năm 2017

Phan Thị Thu Giang

Tôi là Phan Thị Thu Giang, học viên lớp Bác sỹ nội trú khóa 40, Trường

Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Y sinh học – Di truyền, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 18 tháng 09 năm 2017

Người viết cam đoan

Phan Thị Thu Giang

AFP : Alpha fetoprotein

AS : Angelman Syndrome LGS : Langer – Giedion Syndrome

BoBs : Bacterial artificial chromosome – on – beads

CGH : Microarray – based comparative genomic hybridization

MDS : Miller – Dieker Syndrome

MLPA : Multiplex ligation-dependent probe amplification

PAPP – A : Pregnancy – associated plasma protein A

PCR : Polymerase chain reaction

PWS : Prader – Willi Syndrome

QF – PCR : Quantitative fluorescent - polymerase chain reactionRAT : Rapid aneuploidy testing

SMS : Smith – Magenis Syndrome

TKSSG : Tăng khoảng sáng sau gáy

uE3 : Unconjugated Estriol

UPD : Maternal uniparental disomy 15

WBS : William – Beuren Syndrome

WHS : Wolf – Hirschhorn Syndrome

βhCGhCG : Beta – Human chronic gonadotropin

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Một số hội chứng vi mất đoạn NST được phát hiện bằng kỹ thuật BoBs 3

1.2 Tầm quan trọng của chẩn đoán trước sinh 17

1.3 Đối tượng cần làm chẩn đoán trước sinh 18

1.4 Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn 20

1.5 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh 23

1.5.1 Các phương pháp lấy tế bào thai 23

1.5.2 Những kỹ thuật di truyền đã được áp dụng trong chẩn đoán trước sinh 24

1.6 Kỹ thuật Bacs-on-Beads 28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 35

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36

2.2 Địa điểm nghiên cứu và địa điểm phân tích mẫu 36

2.3 Thời gian nghiên cứu 36

2.4 Phương tiện nghiên cứu 36

2.4.1 Dụng cụ 36

2.4.2 Hóa chất 37

2.5 Phương pháp nghiên cứu 37

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 37

2.5.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 37

2.6 Kỹ thuật sử dụng 37

2.6.1 Chuẩn bị mẫu DNA 39

2.6.4 Các bước của quy trình thực hiện kỹ thuật BoBs 40

2.7 Phân tích kết quả 45

2.8 Xử lý và phân tích số liệu 47

2.9 Đạo đức nghiên cứu 47

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Một số đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 48

3.1.1 Tuổi thai phụ 48

3.1.2 Tuổi thai 49

3.2 Kết quả kỹ thuật Bobs 50

3.3 Đánh giá giá trị của kỹ thuật BoBs 51

3.3.1 Hình ảnh siêu âm thai trong nghiên cứu 51

3.3.2 Kết quả siêu âm thai với những trường hợp có kết quả BoBs bất thường 52

3.3.3 Kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ trong nhóm nghiên cứu 53

3.3.4 Kết quả sàng lọc HTM với những trường hợp có kết quả BoBs bất thường 54

3.3.5 Sự tương đồng giữa kỹ thuật BoBs và kỹ thuật di truyền tế bào .55 3.3.6 Kết quả di truyền tế bào trong nhóm nghiên cứu 55

Chương 4: BÀN LUẬN 70

4.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 70

4.1.1 Về tuổi thai phụ 70

4.1.2.Về tuổi thai 72

4.2 Bàn luận về kết quả kỹ thuật BoBs 73

4.3 Đánh giá giá trị của kỹ thuật BoBs 74

4.3.1 Đối chiếu kết quả siêu âm thai với kết quả BoBs 74

tế bào 80

4.3.4 Đối chiếu kết quả kỹ thuật BoBs với kết quả di truyền tế bào 82

KẾT LUẬN 89

KIẾN NGHỊ 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 So sánh các đặc điểm trong chẩn đoán trước sinh làm bằng các

phương pháp khác nhau 31

Bảng 2.1 Bảng tính nồng độ DNA cần cho mỗi phản ứng Bobs 41

Bảng 2.2 Bảng tính thể tích dung dịch Labeling Mix 41

Bảng 2.3 Bảng tính thể tích dung dịch Hybridization Bead Mix 43

Bảng 2.4 Bảng tính thể tích dung dịch Reporter Mix 44

Bảng 2.5 Các loại đột biến tương ứng với tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang 45

Bảng 3.1 Tuổi trung bình thai phụ 48

Bảng 3.2 Tuổi thai tại thời điểm chọc hút nước ối 49

Bảng 3.3 Kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật BoBs 50

Bảng 3.4 Đối chiếu kết quả của BoBs với hình ảnh siêu âm thai 51

Bảng 3.5 Đối chiếu kết quả của siêu âm thai với những trường hợp có kết quả BoBs bất thường 52

Bảng 3.6 Đối chiếu kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ với kết quả BoBs 53

Bảng 3.7 Đối chiếu kết quả của sàng lọc huyết thanh mẹ với những trường hợp có kết quả BoBs bất thường 54

Bảng 3.8 Đối chiếu kết quả kỹ thuật BoBs với kết quả di truyền tế bào 55

Bảng 3.9 So sánh chi tiết những trường hợp bất thường của kỹ thuật BoBs và kỹ thuật di truyền tế bào 56

Biểu đồ 3.1 Phân bố thai phụ theo tuổi 48 Biểu đồ 3.2 Sự tương đồng giữa kết quả di truyền tế bào và kỹ thuật BoBs 55

Hình 1.2: Đối với thai phụ trẻ tuổi, khả năng mang thai mắc 5 hội chứng vi mất đoạn cao hơn khả năng mắc hội chứng Down 4

Hình 1.3: Vị trí mất đoạn trên NST 22 6

Hình 1.4: Một số kỹ thuật sử dụng chẩn đoán hội chứng vi mất đoạn 7

Hình 1.5: Vị trí đoạn mất trên NST 4 13

Hình 1.6: Vùng gen đặc hiệu tương ứng với DNA dò được gắn các hạt Bead có thể lai 29

Hình 1.7: Nguyên lý kỹ thuật BoBs 30

Hình 1.8: Phân tích kết quả trên hệ thống máy Luminex 100/200 30

Hình 2.1: Màn hình hiển thị kết quả 46, XY 46

Hình 2.2: Kết quả BoBs với đột biến vi mất đoạn 46

Hình 3.1: Kết quả BoBs của thai số 3 mắc hội chứng DiGeorge 58

Hình 3.2: Kết quả di truyền tế bào của thai số 3 bình thường 59

Hình 3.3: Kết quả BoBs của thai số 6 mắc hôi chứng Cri du chat 60

Hình 3.4: Kết quả di truyền tế bào của thai số 6 bình thường 61

Hình 3.5: Kết quả BoBs của thai số 8 mắc trisomy một phần NST 18 .62

Hình 3.6: Kết quả di truyền tế bào của thai số 16 có thêm một phần trên NST số 11 63

Hình 3.7: Kết quả BoBs của thai số 10 mắc hội chứng Down 64

Hình 3.8: Kết quả di truyền tế bào thai số 10 mắc hội chứng Down 65

Hình 3.9: Kết quả BoBs của thai số 20 mắc hội chứng Patau 66

Hình 3.10: Kết quả di truyền tế bào của thai mắc sô 20 hội chứng Patau do chuyển đoạn hòa hợp tâm 67

Hình 3.11: Kết quả BoBs của thai số 16 mắc hôi chứng Edwards 68

Hình 3.12: Kết quả di truyền tế bào của thai số 16 mắc hội chứng Edwards Locus gen sử dụng trong bộ kit 15

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gâychết chu sinh và gây ra nhiều gánh nặng cho gia đình cũng như xã hội Vìvậy, chẩn đoán và phát hiện sớm các bệnh lý di truyền ở thời kỳ phôi thai là

vô cùng thiết yếu để có biện pháp phòng và xử trí kịp thời [1]

Việc xác định nguyên nhân di truyền trong nhiều trường hợp bệnh lý là rấtcần thiết để tư vấn di truyền và can thiệp, nhất là đối với các hội chứng vi mấtđoạn nhiễm sắc thể (NST) với một số hội chứng có tỷ lệ gặp khá phổ biến(DiGeorge 1/4000) Các hội chứng liên quan với vi mất đoạn nhiễm sắc thểthường không liên quan đến tuổi mẹ, các triệu chứng gặp rất đa dạng nên khókhăn cho chẩn đoán lâm sàng Ngoài các bất thường về hình thái, các hộichứng này thường liên quan đến chậm phát triển tâm thần Vì vậy việc chẩnđoán sớm các hội chứng này là cần thiết Các kỹ thuật di truyền tế bào thôngthường như xét nghiệm NST khó có thể phát hiện được mất các đoạn nhỏNST dưới 5MB Người ta có thể sử dụng các kỹ thuật như FISH (Fluorescent

in stitu hybridization) hoặc các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện cácmấtđoạn nhỏ NST [2]

Hiện nay, tại các trung tâm chẩn đoán trước sinh, phương pháp ditruyền tế bào và QF-PCR (Quantitative fluororescen) là hai kỹ thuật đangđược sử dụng thường xuyên nhất Karyotype là tiêu chuẩn vàng sử dụng đểchẩn đoán các bất thường NST với khả năng đánh giá được toàn bộ NST vàtính chính xác cao Tuy nhiên, karyotype không xác định được các vi mấtđoạn NST Đối với chẩn đoán trước sinh, thì xét nghiệm NST từ tế bào ối hay

tế bào tua rau đều cần tối thiểu từ 10-14 ngày mới có kết quả nên kỹ thuật ditruyền tế bào được hỗ trợ bởi các kỹ thuật chẩn đoán nhanh như: QF-PCR,MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), để phát hiện các

bất thường nhiễm sắc thể (NST) phổ biến 13,18, 21, X, Y hoặc với kỹ thuậtCGH để khảo sát toàn bộ gen Các kỹ thuật này có nhiều ưu việt về khả năngphát hiện đột biến, nhưng còn khó áp dụng trong cộng đồng do tính phức tạpcủa kỹ thuật và giá thành cao [3],[4].

Để khắc phục được những hạn chế của các kỹ thuật này, kỹ thuật BoBs(Bacs-on-Beads) đã ra đời Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, BoBs có khả năngphát hiện nhanh bất thường liên quan đến NST 13, 18, 21, X, Y và một số hộichứng vi mất đoạn được chọn mà các hội chứng vi mất đoạn này có thể bị bỏ sótkhi xét nghiệm bằng kỹ thuật di truyền tế bào hay QF-PCR Kỹ thuật này chínhxác cao, tỷ lệ thất bại tương đối thấp khoảng 4% Ưu điểm của kỹ thuật là có thểđánh giá nhiều mẫu bệnh phẩm trong một lần xét nghiệm, kỹ thuật hiện đại, tính

tự động hóa cao, thời gian thực hiện kỹ thuật và đọc kết quả từ 24-48h, các probekiểm tra độ chính xác ngay trong phản ứng cũng như dễ dàng so sánh với đốichứng, giá thành phù hợp áp dụng tại cộng đồng [5] Với các ưu điểm đó, kỹthuật BoBs được sử dụng cho chẩn đoán trước sinh là rất phù hợp

Kỹ thuật này đã được áp dụng phổ biến trên thế giới, ở Việt Nam kỹ

thuật BoBs vẫn còn mới vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng kỹ

thuật Bobs để phát hiện một số hội chứng lệch bội và mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể của thai trong chẩn đoán trước sinh” với hai mục tiêu:

1 Mô tả một số lệch bội và mất đoạn nhỏ NST thai trong chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật Bobs.

2 Đánh giá giá trị của kỹ thuật Bobs trong chẩn đoán trước sinh một

số hội chứng lệch bội và mất đoạn nhỏ NST thai.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Một số hội chứng vi mất đoạn NST được phát hiện bằng kỹ thuật BoBs

Đột biến vi mất đoạn là gì?

• Đột biến vi mất đoạn NST có thể mất từ 100 kb đến vài MB

• Karyotype thường chỉ có khả năng phát hiện các mất đoạn >7-10 MB

Hình 1.1 Sơ đồ mô tả vi mất đoạn NST 22q11.2 và một

tim mạch, xương chi và vùng đầu mặt [6]

Hình 1.2 Đối với thai phụ trẻ tuổi, khả năng mang thai mắc 5 hội chứng

vi mất đoạn cao hơn khả năng mắc hội chứng Down [7]

Hộị chứng vi mất đoạn.

Hội chứng DiGeorge được biết đến do đột biến mất đoạn trên NST 22,đặc biệt là trên nhánh dài NST 22 Hội chứng này được báo cáo đầu tiên bởibác sỹ DiGeorge vào năm 1965

Tần suất: Tỉ lệ mắc bệnh trong quần thể là ~1/4000 [8] Tác giả Rauch

(2006) ghi nhận DGS chiếm 2,4% những trường hợp chậm phát triển trí tuệ,bên cạnh đó DGS còn đi kèm với một số bệnh khác có liên quan đến di truyềntrong gia đình như: hội chứng Marfan, bệnh xơ thần kinh (neurofibromatosis),bệnh khớp sọ đóng sớm (craniosynostosis) [9]

Nguyên nhân

Khoảng 90% bệnh nhân mắc hội chứng DiGeorge mang đột biến mấtđoạn nhỏ ở nhánh dài của nhiễm sắc thể 22 (22q11.2) Sự mất đi khoảng 30gen tại vùng này được cho là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triểnbất thường của một số mô trong quá trình phát triển phôi, từ tuần thứ 6 đến

tuần thứ 10 trong thai kỳ, khi mà tuyến cận giáp, tuyến ức, môi, tai và cungđộng mạch chủ đang được hình thành [10].

Di truyền

Hội chứng này di truyền theo cơ chế di truyền trội trên nhiễm sắcthể thường, vì chỉ cần mất đoạn xảy ra ở một trong hai chiếc NST của cặpNST 22 ở mỗi tế bào là đủ để gây ra hội chứng này Tuy nhiên, hầu hết cáctrường hợp mắc hội chứng này là do phát sinh ngẫu nhiên trong quá trình hìnhthành tế bào sinh sản (trứng hoặc tinh trùng), hoặc trong quá trình phát sinhphôi sớm [11]

Đặc điểm lâm sàng thường gặp của DGS là bệnh tim bẩm sinh, suygiảm miễn dịch, rối loạn nội tiết, hạ canxi huyết, các bất thường vòm miệng,bất thường thận, chậm phát triển tâm thần Bên cạnh tên DiGeorge, DGS cònđược biết đến với tên gọi “CATCH 22” được Wilson và cộng sự (1993) đặttên theo 5 nhóm triệu chứng thường gặp: Cardiac defects: bất thường tim,Abnormal facies: bất thường mặt, Thymic hypoplasia: thiểu sản tuyến ức,Cleft palate: chẻ vòm hầu, Hypocalcaemia: hạ canxi huyết [12]

Trong thai kỳ, những phát hiện trên siêu âm của DGS thường gặp là đa dịtật kết hợp: bất thường tim đa phần là bất thường vùng thân nón động mạch, khe

hở môi, khe hở vòm miệng Bất thường thận như loạn sản thận, bất sản thận,thận ứ nước một bên hoặc hai bên với tần suất lần lượt là 4%, 12%, 5% Tật thừangón tay hay ngón chân cũng hay được phát hiện trên siêu âm với tỷ lệ 1-4%,các bất thường khác có thể gặp như: tay chân khoèo, bất sản xương quay, xươngchày Các bất thường khác cũng có thể gặp với tần suất thấp hơn như: đốt sốngkém phát triển một bên, đốt sống hình cánh bướm, thoát vị hoành

Tuy nhiên, có 10% trường hợp không tìm thấy mất đoạn NST 22q11nhưng vẫn được xếp vào DGS vì biểu hiện lâm sàng có đầy đủ trong nhómCATCH Trong tình huống này, NST bị đột biến mất đoạn có thể là 10p13hoặc 18q21.23

Hình 1.3 Vị trí mất đoạn trên NST 22 [12]

Chẩn đoán

Hiện nay, việc chẩn đoán hội chứng DiGeorge được dựa trên biểu hiệnlâm sàng, hình ảnh siêu âm đối với trường hợp trước sinh, cùng với đó là xét

nghiệm di truyền để phát hiện mất đoạn trên NST 22 (MLPA, FISH, microarrayhoặc giải trình tự thế hệ mới), đặc biệt là Bobs Đối với phụ nữ mang thai, đặcbiệt là những người thuộc nhóm có nguy cơ cao, việc xét nghiệm, chẩn đoánsớm trẻ mang đột biến là yếu tố cực kì quan trọng giúp cha mẹ chuẩn bị kiếnthức, tâm lý, khắc phục kịp thời các khuyết tật, giảm thiểu nguy hiểm và tăngcường chất lượng sống sau này của trẻ [19], [20].

Hình 1.4: Một số kỹ thuật sử dụng chẩn đoán hội chứng vi mất đoạn [4]

Nguyên nhân: Hội chứng Williams-Beuren (WS, Williams syndrome)

là một dạng rối loạn chức năng nhiều hệ thống do mất đoạn trên NST số 7,khoảng từ 1,5 đến 1,8Mb với khoảng 26-28 gen (7q11.2) Trong đó, genElastin nằm giữ vùng mất đoạn được cho rằng có vai trò rất quan trọng trongchức năng của cơ thể [21]

Tần suất: 1/10.000 ca sinh với sự mất đoạn điển hình trên 1,55Mbchiếm phần lớn [22]

Ðặc điểm lâm sàng.

WS kiểu hình có thể thay đổi, gây ra bệnh cảnh nhiều cơ quan nên cầnthiết có tiêu chuẩn chẩn đoán Hội chứng WS bị nghi ngờ với bệnh nhân có bấtthường hệ tim mạch: hẹp trên van động mạch chủ gây tổn thương tim mạchđáng kể nhất về mặt lâm sàng và phổ biến nhất, nó xảy ra trong 75% của các cabệnh, hẹp động mạch phổi ngoại vi, bất thường của động mạch nuôi cơ, tănghuyết áp Bộ mặt khác thường: mũi hơi hếch, miệng rộng, môi dưới đầy đặnhơi trễ xuống, nhân trung dài, cằm nhỏ, má bầu, răng không đều và thưa, càng

lớn những đặc điểm nhận dạng này càng rõ, dái tai lớn được quan sát thấy ở

mọi lứa tuổi [23] Bất thường mô liên kết, thoát vị bẹn, rốn, ruột, túi thừa bàngquang, sa trực tràng, da mềm, lỏng lẻo [24] Giảm trương lực cơ, khớp duỗiquá mức, bất thường nội tiết (tăng calci huyết, tăng calci niệu, suy giáp, và dậythì sớm) Chậm phát triển trí tuệ, chỉ số IQ thường thấp dưới 70

Chẩn đoán

Đa số dựa vào chẩn đoán lâm sàng, do vậy rất dễ bỏ sót các trường hợpkhông điển hình, đặc biệt người mắc hội chứng này không biết mình mắcbệnh do vẫn hoạt động thể lực như người bình thường, nhưng có thể đột tửhay vẫn kết hôn, sinh con và có xác suất di truyền cho thế hệ sau Vì vậy,chẩn đoán phân tử không những nâng cao khả năng phát hiện bệnh, thiết lập

cơ sở cho việc theo dõi lâu dài mà còn hỗ trợ thông tin cho bác sỹ nhằm tưvấn chính xác cho bệnh nhân Mấu chốt trong việc chẩn đoán là phát hiện mấtgen WBSCR, vùng có chứa gen Elastin (ELN) [25] Hơn 90% bệnh nhân vớichẩn đoán Williams-Beuren có mang đột biến gen này

chứng Prader Willi (Prader Willi Syndrome-PWS)

Tỷ lệ mắc trung bình trong quần thể ước tính 1/10000-1/30000 [26], [27]

Nguyên nhân

Hội chứng Prader-Willi (PWS) và hội chứng Angelma (AS) là hai hộichứng có cùng cơ chế di truyền, liên quan đến những bất thường về cấu trúctại vị trí 15q11-q13.

Vùng này được cấu trúc như sau [28], [29]:

 Vùng 1: giữa hai điểm BP1 và BP2 gồm 4 gen: NIPA1, NIPA2,CYF1P1, GCP5

 Vùng 2: là vùng gen Prader-Willi, chỉ biểu hiện chức năng trên NST

có nguồn bố, gồm 5 gen: MKRN3, MAGEL2, NDN, C15ORF12,SNRPN

 Vùng 3: là vùng Angelman, chỉ biểu hiện chức năng trên NST cónguồn mẹ, gồm 2 gen: UBE3A, ATP10C

 Vùng 4: gồm một nhóm gen mã hóa thụ thể GABA: GABRB3,GABRA5, GABRG3[30]

Về cơ chế bệnh sinh của hội chứng Prader-Willi do mất chức năngđoạn gen 15q11-q13 [31], [32] trên nhiễm sắc thể số 15 nguồn gốc từ bố,trong đó nguyên nhân hay gặp nhất (70-75%) do mất đoạn lớn ở nhánh dàivùng gần tâm nhiễm sắc thể 15 vị trí 15q11-q13 có nguồn gốc từ bố, ngườibệnh thường có đặc điểm lâm sàng nặng nề hơn các nhóm khác 25-29%nguyên nhân do người bệnh có hai nhiễm sắc thể 15 có nguồn gốc từ mẹ,không có nhiễm sắc thể 15 nguồn gốc từ bố (maternal uniparental disomy 15-UPD) Khoảng dưới 1% do khiếm khuyết dấu ấn di truyền (imprinting defect-ID) hoặc do mất đoạn rất nhỏ hoặc do đột biến ở vị trí trung tâm dấu ấn ditruyền (imprinting centre-IC) tại vị trí nhiễm sắc thể 15q11-q13 Số rất ít cònlại là do bất thường nhiễm sắc thể số 15 dạng chuyển đoạn hay các dạng bấtthường khác về cấu trúc nhiễm sắc thể [30], [33], [34]

Triệu chứng lâm sàng

Biểu hiện lâm sàng đa dạng, nặng nề Các triệu chứng lâm sàng thường

gặp trong hội chứng này là khuôn mặt đặc trưng của PWS như trán hẹp, mắthình quả hạnh nhân, môi trên mỏng, môi dưới trễ, giảm trương lực cơ, béophì, chậm phát triển tâm thần vận động, thiểu năng sinh dục, tầm vóc thấp,chân tay nhỏ ở nhóm trẻ lớn Hầu hết các bệnh nhân PWS vô sinh [35], [36].

Về cơ chế bệnh sinh của hội chứng Angelman gây ra bởi mất hoặc ngừnghoạt động của gen 15q11-q13 trên NST 15 nguồn gốc từ mẹ trong khi các bảnsao từ bố có thể trình tự bình thường hoặc im lặng, phổ biến nhất là mất đoạnNST 15 từ mẹ, người bệnh thường có đặc điểm lâm sàng nặng nề hơn các nhómkhác Nguyên nhân khác bao gồm do người bệnh có hai nhiễm sắc thể 15 cónguồn gốc từ bố, không có nhiễm sắc thể 15 nguồn gốc từ mẹ (paternaluniparental disomy 15-UPD), do khiếm khuyết sự dấu ấn di truyền (imprintingdefect-ID) hoặc do đột biến ở vị trí trung tâm dấu ấn di truyền (imprintingcentre-IC) [37] Số rất ít còn lại là do bất thường nhiễm sắc thể số 15 dạngchuyển đoạn hay các dạng bất thường khác về cấu trúc nhiễm sắc thể [29],[38]

Các triệu chứng lâm sàng đặc trưng trong hội chứng này là vẻ mặt và

cử chỉ phấn khích, hạnh phúc như thường mỉm cười, cười lớn, vỗ tay, tănghoạt động và kém tập trung, khó ngủ và ngủ ít [39] Chậm phát triển thể hiện

rõ ở 6-12 tháng, chậm phát triển tâm thần, khả năng ngôn ngữ kém, tự kỷ,động kinh, rối loạn đi và thăng bằng, đầu nhỏ, vẹo cột sống [40]

Để chẩn đoán hội chứng Prader-Willi/Angelman có thể sử dụng các kỹthuật di truyền tế bào hoặc phân tử Kỹ thuật di truyền tế bào có thể sử dụng

là phân tích nhiễm sắc thể kéo dài băng để phát hiện mất đoạn 15q11-q13 vàcác bất thường nhiễm sắc thể khác kèm theo Các kỹ thuật sinh học phân tửnhư DNA methylation, giải trình tự gen cũng được áp dụng phổ biến trongcác trường hợp UPD, đột biến vùng IC [41] Kỹ thuật FISH (Fluorescence InSitu Hybridization) [42] là kỹ thuật lai giữa di truyền tế bào và phân tử

thường được dùng để phát hiện mất đoạn nhiễm sắc thể số 15 vùng băng q13 nguồn gốc bố hoặc từ mẹ Gần đây kỹ thuật BoBs (Bacs-on-Bead) [43]được sử dụng để phát hiện các trường hợp mất đoạn nhỏ trong đó có các vị trítrên NST 15 tương ứng với hai hội chứng này.

Được biết như hội chứng 5p- là một rối loạn di truyền hiếm gặp dotình trạng mất một phần nhánh ngắn NST số 5 (5p15.3-p15.2) [44] Cáctriệu chứng khác nhau rất nhiều tùy thuộc vào kích thước và vị trí vùng gen

bị mất, mất rộng có xu hướng dẫn đến chậm phát triển trí tuệ và thể chấtnhiều hơn so với mất đoạn nhỏ Triệu chứng chung là trẻ phát ra tiếng khócvới âm vực cao như tiếng mèo kêu do bất thường ở thanh quản [45]

Nguyên nhân

Hội chứng Cri du chat do mất một phần nhánh ngắn NST số 5, cũngđược gọi là monosomy 5p hoặc monosomy một phần Khoảng 90% do độtbiến mới phát sinh, nhưng vẫn có khoảng 10-15% là NST số 5 mất đoạn cónguồn gốc từ bố hoặc mẹ là người mang NST chuyển đoạn cân bằng

Hầu hết các trường hợp liên quan đến mất khoảng 10-20% lượng vậtchất di truyền trên nhánh ngắn Mất một vùng gen nhỏ có kích thước khoảng2Mb thuộc băng 5p15.2 (vùng có tính chất quyết định Cri du chat) chi phốiđến tất cả đặc điểm của hội chứng này ngoại trừ triệu chứng tiếng khóc nhưtiếng mèo kêu Trong khi vùng gen quyết định triệu chứng tiếng khóc nhưtiếng mèo kêu được định vị ở băng 5p15.3 (catlike critical region) Kết quảcho thấy, hai vùng có tính chất quyết định bao gồm những gen liên quan đếncác triệu chứng của bệnh Hai gen thuộc vùng này là Semaphorine F(SEMA5A) và Delta catenin (CTNND2) liên quan đến sự phát triển của não

và sự phát triển tâm thần Mất gen telomerase reverse transcriptase (hTERT)

ở băng 5p15.33 có thể gây thay đổi kiểu hình trong hội chứng này [46]

Tần suất: Gặp với tỷ lệ 1/20000-1/50000 trẻ sơ sinh, trẻ gái nhiều hơn

trẻ trai [47]

Triệu chứng lâm sàng đặc trưng là tiếng khóc đơn điệu yếu ớt âm vực

cao giống tiếng mèo kêu (khoảng 1/3 trẻ không còn tiếng khóc chói tai này khibước sang tuổi lên hai) Đầu và cằm nhỏ, mặt tròn, mắt cách xa nhau, sống mũithấp, mí mắt trên có các nếp hình rẻ quạt… Khó cho ăn do gặp vấn đề với việcnuốt và bú cũng như trào ngược thực quản Một số đặc điểm có thể thay đổi khitrẻ trưởng thành: mặt dài ra, sống mũi cao lên, nếp gấp ở mí mắt trên mờ dần.Tuy nhiên, đầu vẫn nhỏ hơn so với kích cỡ bình thường Chậm phát triển trítuệ, khó khăn trong diễn đạt ngôn ngữ, chậm phát triển các kỹ năng vận động,khó có khả năng tập trung, hiếu động thái quá, bất thường hành vi [47]

Chẩn đoán trước sinh được thực hiện để phát hiện mất đoạn trênnhánh ngắn NST số 5 liên quan đến hội chứng CdCS được chẩn đoán bằng

kỹ thuật BoBs, kỹ thuật di truyền tế bào cũng có thể chẩn đoán được CdCStrong một số trường hợp mất đoạn với kích thước đoạn mất lớn [48]

Hội chứng WHS gồm nhiều triệu chứng, ảnh hưởng đến nhiều bộ phậncủa cơ thể Các đặc điểm chính gồm đặc trưng trên khuôn mặt, chậm tăngtrưởng và phát triển, khuyết tật trí tuệ, và co giật

Tần suất: 1/50.000, xảy ra ở nữ gấp đôi nam giới

Nguyên nhân: gây ra bởi mất vật liệu di truyền ở gần cuối nhánh ngắn củaNST 4 (4p16.3), đặc biệt ở vùng WHSC1 và WHSC2 Kích thước đoạn mấtkhác nhau giữa các cá thể, nghiên cứu cho rằng mất đoạn lớn có xu hướng dẫnđến khuyết tật trí tuệ và bất thường về thể chất trầm trọng hơn [49]

Khoảng 85%-90% các trường hợp là do phát sinh ngẫu nhiên, khoảng13% các trường hợp là do nhận NST chuyển đoạn từ bố hoặc mẹ Một tỷ lệnhỏ của tất cả những người có hội chứng WHS có bất thường về NST nhưNST nhẫn, trong trường hợp này, các gen ở đầu cuối của NST bị mất

Tổn thương các cơ quan và thay đổi kiểu hình phụ thuộc vào lượng vậtchất di truyền bị mất Mất gen WHSC1, LETM1và MSX1 gây ra dấu hiệuđiển hình và các triệu chứng của hội chứng này, những gen này đóng vai tròquan trọng trong phát triển ban đầu [50] Gen WHSC1 liên quan đến sự xuấthiện các đặc điểm trên khuôn mặt và chậm phát triển Mất các gen LETM1liên quan đến co giật hoặc hoạt động điện bất thường khác trong não Mất genMSX1 gây ra các bất thường về răng và hở môi và hoặc vòm miệng

Hình 1.5: Vị trí đoạn mất trên NST 4 [50]

Bệnh nhân thường có khuôn mặt đặc biệt: sống mũi phẳng, rộng vàvầng trán cao, mắt cách xa nhau và có thể nhô ra, nhân trung ngắn, miệng đixuống, cằm nhỏ Ngoài ra, có thể có khuôn mặt không đối xứng và đầu nhỏbất thường (đầu nhỏ) Yếu cơ (giảm trương lực), cơ bắp kém phát triển Hạnchế vận động, co giật có thể kiểm soát và điều trị, co giật có xu hướng biếnmất cùng với tuổi tác, khuyết tật trí tuệ dao động từ nhẹ đến nặng, khả năngngôn ngữ và kỹ năng giao tiếp kém Ngoài ra, còn bất thường các cơ quan và

bộ phận khác: thay đổi về da như da lốm đốm hoặc khô, bất thường về xương:vẹo cột sống và gù cột sống, răng bị mất, hở vòm miệng và sứt môi, cũng cóthể gây ra các bất thường về mắt, tim, đường sinh dục và não [51]

Để chẩn đoán thực hiện phát hiện mất đoạn trên nhánh ngắn NST số 4liên quan đến hội chứng WHS được thực hiện bằng các kỹ thuật phân tửmicroarray, kỹ thuật BoBs [52], [53]

Hội chứng Langer-Giedion (Langer-Giedion Syndrome-LGS).

Là tình trạng gây ra bất thường của xương và khuôn mặt Nhữngngười có hội chứng này có tổn thương xương lành tính gọi là u xương sụn.Tình trạng này gây ra đau, hạn chế vận động, tổn thương hệ thần kinh,mạch máu, tủy sống, mô xung quanh xương sụn

Tần suất: Hội chứng LGS rất hiếm gặp, tỷ lệ chưa rõ

Nguyên nhân

Hội chứng LGS do mất đoạn nhỏ trên nhánh dài NST số 8, thườngmất nhiều gen trên cùng một NST và việc mất các gen này gây ra các triệuchứng của hội chứng LGS Vùng bị mất đoạn trên NST là 8q23.2-q24.1 baogồm gen TPRS1, EXT1 và RAD21 [54] Các nhà nghiên cứu đã xác địnhrằng gen EXT1 giúp tổng hợp protein cần thiết để hình thành mạch máumới, đột biến gen này gây ra gai xương ở nhiều vị trí như cánh tay, cẳngchân, cột sống… Gai xương đè ép vào mạch máu, thần kinh và mô xungquanh khiến cho bệnh nhân đau đớn, mức độ đau từ nhẹ đến nặng tùy thuộcvào vị trí, kích thước và hình dạng của gai xương Mất gen TRPS1 gây ra bấtthường trên khuôn mặt và bất thường hình thái như tóc thưa, tai to, mắt, mũi

to, môi trên mỏng, nhân trung dài Mất gen RAD21 gây chậm phát triển trítuệ, mất các gen trên vùng lân cận gây ra các triệu chứng như não nhỏ, khảnăng ngôn ngữ kém, thính lực giảm, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng đường hôhấp và tiết niệu [55]

Triệu chứng lâm sàng đặc trưng bao gồm: bộ mặt bất thường, sốngmũi phẳng, mũi hình củ hành, lông mày rậm, xương hàm dưới kém pháttriển, nhân trung sâu dài, mắt lõm, đầu nhỏ, tóc thưa thớt, thừa răng, răngkhông đều Tổn thương xương lành tính là u xương sụn, gây đau, hạn chếvận động, bất thường xương đùi, đầu xương của các đốt ngón tay hình nón,viêm khớp háng, khớp gối biến dạng, khoèo chân, tầm vóc thấp [56].Nhiễm trùng đường hô hấp trên tái phát, chậm phát triển trí tuệ, dị tật bẩmsinh hệ thần kinh Dị tật sinh dục, bất thường tăng trưởng [57]

Để chẩn đoán hội chứng LGS có thể sử dụng phương pháp tế bào hoặcphân tử Phương pháp tế bào được sử dụng khi kích thước đoạn mất có kíchthước khoảng 5Mb Ngày nay, các kỹ thuật phân tử như aCGH, BoBs [58]giúp chẩn đoán chính xác hội chứng này.

Hội chứng Miller-Dieker là một rối loạn hiếm gặp bao gồm bất thườngbẩm sinh nhiều có quan bộ phân não, tim, phổi, gan xương và ruột Trong đó,đặc trưng bởi sự phát triển bất thường của não được gọi là não phẳng(Lissencephaly) Thông thường vỏ não có rất nhiều nếp gấp và rãnh cuộn não,những người mắc hội chứng này có não mịn bất thường với nếp gấp và rãnhcuộn não ít hơn, các hồi não lớn hơn Các bất thường ở não là do sự di trú của

tế bào thần kinh ở vỏ não và các nơi khác bị ngưng lại từ tuần thứ 10-14 trongquá trình phát triển của phôi [59] Dị tật não này gây tổn thương trí tuệnghiêm trọng, chậm phát triển, co giật, co cứng, giảm trương lực, khó khăntrong việc ăn uống Động kinh thường bắt đầu trước sáu tháng tuổi, và một sốxảy ra từ khi sinh

Tần suất: đây là hội chứng hiếm, tỷ lệ gặp chưa rõ [60]

Nguyên nhân

Hội chứng Miller-Dieker được gây ra bởi mất vật liệu di truyền ở gầncuối nhánh ngắn NST 17 (17p13.3), bao gồm gen LIS1 và gen 14-3-3 epsilon.Các dấu hiệu và triệu chứng của hội chứng Miller-Dieker liên quan đến mấtcủa nhiều gen vùng này và tính nghiêm trọng của hội chứng phụ thuộc vàokich thước đoạn gen bị mất

Các nhà khoa học đã xác định mất một gen đặc biệt trên NST 17 làPAFAH1B1 gây ra triệu chứng tật khuyết hồi não Mất gen PAFAH1B1 trênNST gây nên triệu chứng não phẳng, mất gen YWHAE làm nặng thêm triệu

chứng này ở những người bị hội chứng Miller-Dieker Hội chứng được di truyềntheo đột biến gen trội, khoảng 12% người mắc hội chứng này nhận một NST bấtthường từ bố hoặc mẹ, mà bản thân bố hoặc mẹ không bị ảnh hưởng Trongtrường hợp này bố hoặc mẹ có kiểu hình bình thường nhưng mang NST đột biếndạng chuyển đoạn cân bằng, đảo đoạn Hoặc trường hợp NST 17 hình vòngcũng dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của hội chứng này [61].

Triệu chứng lâm sàng đặc trưng là não phẳng, não ít nếp gấp và các rãnhcuộn não, các hồi não lớn hơn bình thường Các bất thường khác: dị tật tim,thận, thoát vị rốn, các vấn đề về hô hấp đe dọa tính mạng [59]

Hình ảnh siêu âm có thể phát hiện được bất thương não trong khi mangthai tuy nhiên vẫn có thể bỏ sót MRI não: hình ảnh não phẳng, trẻ bị hộichứng này có thể không được chẩn đoán vì rất hiếm gặp Chẩn đoán xác địnhbằng các kỹ thuật phân tử phát hiện vi mất đoạn [55], [62]

Hội chứng Smith-Magenis là rối loạn ảnh hưởng đến toàn bộ cơ thể.Các triệu chứng chính bao gồm chậm phát triển trí tuệ, kỹ năng nói và ngônngữ bị trì hoãn, khuôn mặt đặc biệt, rối loạn giấc ngủ, và rối loạn hành vi

Tần suất: bệnh có tỷ lệ xuất hiện rất thấp khoảng 1/15.000-1/25.000 [63]

Nguyên nhân.

Mất vật liệu di truyền ở một vùng trên NST 17 (17p11.2) Mặc dù khuvực này chứa nhiều gen, các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng mất gen RAI1(retinoic acid induced 1) [64] gây ra các triệu chứng lâm sàng của hội chứngnày Mất các gen khác trong vùng này cũng gây ra các đặc điểm lâm sàngkhác nhau, giups giải thích tại sao triệu chứng lâm sàng khác nhau ở những cáthể bị ảnh hưởng Một tỷ lệ nhỏ những người mắc bệnh có đột biến ở genRAI1 thay vì đột biến mất đoạn Việc đột biến hoặc mất đoạn dẫn đến sảnxuất protein RAI1 không bình thường hoặc không có chức năng, RAI1 là yếu

tố phiên mã điều chỉnh sự biểu hiện của nhiều gen, bao gồm một số yếu tốliên quan đến kiểm soát nhịp sinh học như CLOCK [65]

SMS thường không di truyền, hầu hết là đột biến mới phát sinh, nhữngngười mắc hội chứng này thường không có tiền sử gia đình

Triệu chứng lâm sàng lâm sàng bao gồm: đầu ngắn và rộng, hàm dướinhô ra trước, phần giữa mặt kém phát triển, chậm biết nói có hoặc không kèmtheo mất thính lực, rối loạn hành vi và chậm phát triển tâm thần, vận động.Người mắc SMS dễ cáu giận, tính khí hung hăng, hay lo lắng, khó tập trung

Họ có những hành vi bất thường như tự ôm, tự gây thương tích cho chínhmình Một số triệu chứng ít gặp của SMS như tầm vóc nhỏ bé, vẹo cột sống,giảm đáp ứng với kích thích đau và nhiệt độ, khàn giọng, mất thính lực, hiếmgặp dị tật tim mạch và thận tiết niệu [66]

Chẩn đoán

SMS được xác định thông qua xét nghiệm máu và phân tích gen: pháthiện mất của 17p11.2 [67]

1.2 Tầm quan trọng của chẩn đoán trước sinh

Bất thường bẩm sinh hay còn gọi là dị tật bẩm sinh (DTBS) là nhữngbất thường của thai nhi khi còn nằm trong tử cung. Các bất thường này có thểthể hiện ở mức độ cơ thể, mức độ tế bào hoặc phân tử, thể hiện ngay khi mớisinh hay ở những giai đoạn muộn hơn Một số trường hợp thai nhi sẽ chếtngay trong tử cung, một số phát triển đến đủ tháng và ở những trẻ mang bấtthường này một số chết ngay sau sinh, đa phần chết ngay trong năm đầu tiêncuộc sống, số trẻ còn sống thì thiểu năng trí tuệ, bất thường nhiều cơ quan, bộphận hoặc kém phát triển thể lực, hoặc kết hợp cả hai

Để nâng cao chất lượng dân số, ngày nay không chỉ chú ý đến chămsóc cho những người mẹ mà còn chú trọng đến việc chăm sóc cho trẻ sơ sinh

để có được những đứa trẻ khỏe mạnh cả về thể chất lẫn tinh thần Theo

nghiên cứu của Đinh Thị Phương Hòa năm 2005 thì tỷ lệ tử vong do dị tậtbẩm sinh chiếm đến 12,9% các nguyên nhân tử vong ở trẻ sơ sinh Theonghiên cứu của Lưu Thị Hồng tỷ lệ DTBS là 4,55%, kết quả của Bạch QuốcTuyên là 0,39% [68] khi nghiên cứu về dị dạng sơ sinh ở Việt Nam và ĐàoThị Chút có tỷ lệ 0,41% khi nghiên cứu 30 trường hợp dị dạng sơ sinh ở bệnhviện Phụ Sản Hải Phòng [69], [70] Nghiên cứu về DTBS của Nguyễn ThịPhượng là 3,6% trong 10 năm tại bệnh viện Bảo vệ sức khỏe trẻ em [71].Theo Trần Danh Cường thì tỷ lệ DTBS trên siêu âm tại phòng siêu âm 3D củabệnh viện Phụ Sản Trung Ương là 5,4%, trong đó cao nhất là dị tật ống thầnkinh, tiếp đó là dị tật đầu mặt cổ và vùng bụng, xương chi, dị tật ở hệ tuầnhoàn, tiêu hóa, tiết niệu [72] Trẻ có thể có một hoặc nhiều dị tật như tứ chứngFallot gồm: dày thất phải, hẹp động mạch phổi, động mạch chủ mở vào cả 2tâm thất và thông liên thất, phức hợp Eisenmenger động mạch chủ lệch sangphải, thông liên thất, phì đại thất phải Khi có nhiều bất thường đi kèm vớinhau gây tổn thương nhiều cơ quan bộ phận nghĩ nhiều đến các hội chứng dobất thường NST như hội chứng Down, Patau Với tỷ lệ như vậy thì ước tínhmỗi năm Việt Nam sẽ có từ 22.000 đến 30.000 trẻ đẻ ra có DTBS Với sốlượng trẻ có DTBS lớn như vậy sẽ để lại những hậu quả và gánh nặng lớn chogia đình trẻ nói riêng và xã hội nói chung.

Có nhiều phương pháp được sử dụng để sàng lọc trước sinh như:

- Xét nghiệm sinh hóa các chất trong máu mẹ

- Siêu âm sàng lọc để phát hiện sớm DTBS cho thai khi còn trong tử cung

- Sàng lọc bằng tuổi mẹ

Các trường hợp nghi ngờ được làm chẩn đoán trước sinh, có rất nhiều kỹthuật đặc hiệu được sử dụng giúp cho việc định hướng chẩn đoán của các bác sỹ

và đưa ra lời khuyên cho các gia đình

1.3 Đối tượng cần làm chẩn đoán trước sinh

Các biện pháp sàng lọc sẽ được thực hiện để xác định những đối tượng

có nguy cơ cao mang thai dị tật, nhóm này sẽ được ưu tiên thực hiện các kỹthuật chẩn đoán trước sinh

Các cặp vợ chồng có nguy cơ cao được xác định như sau:

 Phụ nữ mang thai từ 35 tuổi trở lên:

Đây là yếu tố nguy cơ hay gặp nhất và là chỉ định phổ biến của chẩnđoán trước sinh Tuổi mẹ càng cao, trứng càng chịu nhiều tác động với cácyếu tố phơi nhiễm làm tăng nguy cơ của sự không phân chia NST trong quátrình phân bào Người ta cũng nhận thấy ở những bà mẹ quá trẻ (< 20 tuổi) thìnguy cơ sinh con bị Down lớn hơn các bà mẹ 20-29 tuổi, các bà mẹ ≥ 35 tuổicũng tăng tỉ lệ sinh con Down [73], [74]

Một số nghiên cứu đề cập đến tuổi của cha quá cao cũng là yếu tố làmtăng nguy cơ sinh con DTBS [75]

 Thai phụ có tiền sử bị sảy thai tự nhiên, thai chết lưu hoặc có con chếtsớm sau sinh hoặc tiền sử sinh con dị tật

 Tiền sử gia đình thai phụ hoặc chồng đã có người được xác định bị dịtật bẩm sinh hoặc bất thường NST như hội chứng Down, Edwards, Patau,Turner… hoặc mắc các bệnh di truyền như Thalassemia, tăng sản thượng thậnbẩm sinh, loạn dưỡng cơ Duchenne, teo cơ tủy

 Bản thân bố hoặc mẹ hoặc cả hai là người có rối loạn vật chất di truyền.

 Hình ảnh siêu âm bất thường

Một số hình ảnh siêu âm gợi ý đến bất thường NST như hình ảnh siêu

âm không phân chia não trước được coi là đa dị dạng, các nghiên cứu trên thếgiới cho rằng tỷ lệ bất thường NST ở những trẻ này rất cao từ 24-45%, trong

đó trên 50% là trisomy 13, nhiều nghiên cứu cho rằng không phân chia nãotrước là dấu hiệu gợi ý trên siêu âm của ba NST 13 Ngoài ra bệnh lý này còn

do tổn thương gen và gen liên quan đó là HPE1 (21q22.3), HPE2 (2p21),

HPE3 (7q36), HPE4 (18p) Nghiên cứu của Trần Danh Cường cho thấy tỷ lệbất thường NST là 70% trong đó trisomy 13 là 60% [76] Tiên lượng chonhững trường hợp này rất xấu, trẻ sinh ra thường không thể tồn tại, trên 80%chết trong năm đầu [77], [78].

 Sàng lọc trước sinh có nguy cơ cao

Siêu âm kết hợp với các dấu hiệu sinh hóa trong máu mẹ đang được sửdụng rộng rãi để sàng lọc ra các đối tượng có nguy cơ cao sinh con trisomy

13, 18, 21 và tật nứt đốt sống bẩm sinh Vào ba tháng đầu, khi kết hợp đochiều dày da gáy bằng siêu âm cùng với định lượng hai chất trong huyết thanh

mẹ là PAPP-A và fbhCG thì tỷ lệ phát hiện thai Down lên đến 90% với tỷ lệdương tính giả 5% [79] Trong quý hai của thai kỳ, việc sàng lọc tiếp tục đượcthực hiện nhờ siêu âm và định lượng ba chất trong huyết thanh mẹ Sử dụngtest lồng ghép kết hợp ba tháng đầu và ba tháng giữa sẽ tăng tỷ lệ phát hiệnhơn các test riêng rẽ Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Ngọc Lan (2005) [80]

sự kết hợp giữa các test sàng lọc để phát hiện tỷ lệ thai Down kết quả là giảm78,79% thai phụ ≥ 35 tuổi không phải thực hiện các test xâm phạm thai

Theo Giovanni C và cs (2005) [81], nếu kết hợp giữa các test sàng lọc

sẽ giảm 94% thai phụ ở tuổi 35 và giảm 50% thai phụ ở tuổi 40-41 phải thựchiện các test xâm phạm thai

 Tiếp xúc với các tác nhân vật lý, hóa học, sinh vật học trước và trongthời gian mang thai [75]

 Mẹ mắc các bệnh rối loạn quá trình trao đổi chất: mẹ bị đái tháo đường,

mẹ bị nghiện rượu, thuốc lá, ma túy

 Thụ tinh ống nghiệm

 Cặp vợ chồng kết hôn cận huyết

1.4 Xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (Non-invasive prenatal testing/ NIPT) [82]

Cell-free DNA (circulatinh cell-free fetal DNA/cffDNA) khảo sát đoạn

ngắn DNA trong máu mẹ và có thể dùng sàng lọc nhiều tình trạng của thai.Cell-free DNA có thể được dùng để xác định giới tính thai, nhóm máu Rhtrong trường hợp mẹ Rh âm và bất thường di truyền qua gen trội Sàng lọc cóthể được thực hiện từ tuần 10 của thai cho đến thai trưởng thành và có tỷ lệphát hiện HC Down cao nhất: trên 98% Tỷ lệ phát hiện trisomy 13 và 18 thìthấp hơn Những nghiên cứu đã loại ra những trường hợp có kết quả khôngđọc được (những trường hợp này có nguy cơ cao lệch bội)

ADN tự do trong máu mẹ (circulatinh cell-free fetal DNA/cffDNA)chủ yếu có nguồn gốc từ lá nuôi phôi (trophoblast) Thành phần thai củacell-free DNA được phóng thích vào tuần hoàn mẹ ngay từ khi tế bào nhauthai đi vào quá trình tự chết, chiếm khoảng 3-13% tổng cell-free DNA trongmáu mẹ Tỷ lệ này tăng lên khi thai lớn và biến mất vài giờ sau sinh Vì thờigian bán hủy rất ngắn nên loại trừ khả năng ccffDNA của các lần mang thaitrước Vì vậy, các xét nghiệm NIPT hiện nay chủ yếu dựa vào ccffDNA chứkhông dựa vào các tế bào tự do của thai trong máu mẹ nữa Nhiều chuyêngia đề nghị sử dụng NIPT như một phương pháp sàng lọc, không phải chẩnđoán, bởi độ nhạy (tỷ lệ dương tính thật) và độ đặc hiệu (tỷ lệ âm tính thật)cao làm cho NIPT trở thành sự lựa chọn hấp hẫn hơn các xét nghiệm sànglọc trong huyết thanh mẹ đang được sử dụng Do vậy, các thai phụ cần được

tư vấn di truyền trước khi làm xét nghiệm NIPT để hiểu rõ về xét nghiệmmình đã lựa chọn [83]

Ứng dụng của xét nghiệm trước sinh không xâm lấn (NIPT)

Phát hiện các lệch bội NST và các mất đoạn nhỏ trên NST

Các lệch bội NST hay gặp ở thai nhi: hội chứng Down, Edwards, Patau, rốiloạn NST giới tính, các rối loạn số lượng NST khác, thể tam bội

Các mất đoạn nhỏ hay gặp ở thai nhi: hội chứng DiGeorge, Beuren, Cri-du-chat, Wolf-Hirschhon, Smith-Magenis, Langer-Giedion, Prader-

William-Willi/Angelman và Miller-Dieker, mất đoạn nhánh ngắn NST số 1 (1p36),mất đoạn nhánh dài NST số 2 (2q33.1), hội chứng Jacobsen [84].

Hạn chế của NIPT

Xét nghiệm NIPT là một test sàng lọc có thể cho kết quả dương tính giả

và âm tính giả, do đó không thay thế được test chẩn đoán Vì test này thườngkhông phân biệt được DNA của mẹ và thai nên một kết quả dương tính có thể

là từ thể khảm của bánh nhau, từ một thai đã lưu trong song thai và trong một

số trường hợp hiếm là từ khối ung thư của mẹ hoặc mẹ bị lệch bội Việc xácđịnh lệch bội sẽ hiệu quả hơn nếu có số lượng lớn phân mảnh DNA của thai(fetal fractions) Ở 11-13 tuần, tỷ lệ phân mảnh DNA của thai của cell-freeDNA trong máu mẹ là khoảng 10% Ở một số phòng xét nghiệm thì tỷ lệ phânmảnh thai < 4% được xem là quá ít để đọc kết quả Do đó kết quả trả về làkhông đọc được Yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ phân mảnh DNA của thai là:tuổi thai < 10 tuần, mẹ béo phì, và thai bị lệch bội Các nghiên cứu gần đâychỉ ra rằng tỷ lệ phân mảnh DNA của thai thấp cho thấy nguy cơ cao lệch bội.Những thai có tỷ lệ thấp có thể lặp lại test lần 2 hoặc làm test chẩn đoán Tuynhiên nếu lặp lại test có thể làm chậm trễ chẩn đoán và ảnh hưởng đến việcchọn lựa điều trị nếu kết quả bất thường

Một số có thể chọn lựa cell-free DNA sau khi có kết quả sàng lọctruyền thống trước đó là dương tính Chọn lựa này có thể làm chậm trễ chẩnđoán và xử trí và có thể thất bại trong việc xác định thai có bị lệch bội haykhông Ngay cả khi kết quả dương tính thật sự thì cell-free DNA cũng khôngphân biệt được lệch bội là do chuyển đoạn hay không phân ly, và điều này cóthể gây khó khăn trong tư vấn và đánh giá nguy cơ tái phát Những BN có kếtquả cell-free DNA không đọc được nên được tư vấn di truyền và nên đượcsiêu âm đánh giá cũng như test chẩn đoán do những trường hợp này có nguy

cơ lệch bội cao

Cell-free DNA cung cấp thông tin về 3 dạng lệch bội thường gặp nhất

và giới tính thai nhưng thường không cung cấp thông tin về các dạng lệchbội khác Một vài phòng xét nghiệm đã dùng cell-free DNA để sàng lọcnhững dạng lệch bội khác (trisomy 16 và trisomy 22) và một số hội chứng vimất đoạn (microdeletion syndromes) Tuy nhiên những hội chứng chưa đượckiểm chứng lâm sàng Do đó không được khuyến cáo ở thời điểm hiện tại.Những BN nếu muốn biết thai mình có bị vi mất đoạn NST hay không thìcách tốt nhất là làm test chẩn đoán với sinh thiết gai nhau (CVS) hoặc chọc

ối Cell-free DNA không cung cấp thông tin về nguy cơ dị tật ống thần kinh

Do đó những BN đã làm cell-free DNA nên được sàng lọc dị tật ống thầnkinh với siêu âm hoặc cả hai [85]

1.5 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh

Kết quả của các xét nghiệm sàng lọc chỉ là bước khởi đầu xác định thai

có nguy cơ cao bất thường Để chẩn đoán xác định phải tiến hành làm các xétnghiệm di truyền Tất cả các xét nghiệm di truyền này chỉ thực hiện được khi

có được tế bào có nguồn gốc từ thai

Mục đích: Phân tích vật chất di truyền của thai nhi để chẩn đoán cácbệnh do rối loạn nhiễm sắc thể (NST) hoặc phát hiện một số bệnh di truyềncủa thai ở mức độ phân tử (gen, DNA)

1.5.1 Các phương pháp lấy tế bào thai

1.5.1.1 Chọc hút dịch ối.

Chọc hút dịch ối ở ba tháng giữa của thai được thực hiện từ những năm

1970 và ngày càng trở thành phổ biến cho chẩn đoán trước sinh Kỹ thuật này

có hiệu quả cao trong chẩn đoán những thai có nguy cơ cao bị bất thườngNST (hội chứng Down, Trisomy 18, Trisomy 13, Turner…)

Chọc ối tuần thứ 15-18 là tiêu chuẩn vàng áp dụng cho chẩn đoán ditruyền tế bào trước sinh với độ chính xác cao (99,4-99,8%) và có tỷ lệ sẩythai 0,5-1% [86] Phân tích karyotyp của tế bào ối có kết quả sau khoảng10-12 ngày [80]

Chọc ối được thực hiện ở thời điểm này vì:

 Lúc này tử cung to, lượng dịch ối 100-180ml, cho phép rút một lượngnhỏ dịch ối mà không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của thai

 Thời điểm này số lượng tế bào thai bong ra và có mặt trong dịch ối

đủ để làm xét nghiệm và nuôi cấy tế bào thành công

 Tỷ lệ sảy thai tự nhiên sau 16 tuần bắt đầu giảm

Sau khi lấy được tế bào thai theo phương pháp trên, các tế bào thai đóđược dùng để chẩn đoán xác định thai có bị dị tật bẩm sinh hay không ở mức

độ tế bào hoặc mức độ phân tử

1.5.1.2 Sinh thiết tua rau

Hạn chế của sinh thiết tua rau là tỷ lệ sẩy thai cao (khoảng 9%) tăng0,8% so với chọc hút ối kinh điển Theo Dunn và Godmilow, tỷ lệ này là 1,9-2,1% [87], cho nên chỉ định sử dụng rất hạn chế Chỉ định chủ yếu cho cáctrường hợp thai nhi có những bất thường lớn phát hiện sớm trong các quý đầucủa thai nghén Phương pháp sinh thiết gai rau được làm dưới hướng dẫn củasiêu âm Kết quả sau 5 đến 7 ngày [88]

1.5.1.3 Chọc hút máu cuống rốn

Chọc hút máu cuống rốn được thực hiện từ tuần thai 18 dưới hướng dẫncủa siêu âm, một kim chọc tủy chọc qua thành bụng thai phụ vào mạch máudây rốn để lấy khoảng 15ml máu Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật này là chokết quả trong vòng 48-72h Tuy nhiên, những chỉ định cho kỹ thuật này ngàycàng hạn chế vì có tai biến cao như: Sẩy thai (1,4%), chết trước sinh (1,4%),chảy máu kéo dài, chảy máu từ thai sang mẹ [89]

1.5.1.4 Sinh thiết mô thai và nội soi phôi thai.

Tỷ lệ tai biến của kỹ thuật nội soi thai vẫn ở mức cao: Sẩy thai 5-7%, đẻnon khoảng 10%, rỉ ối, nhiễm trùng ối, chảy máu, tổn thương bàng quang,ruột… Vì vậy chỉ áp dụng kỹ thuật này khi cần sinh thiết thai lấy mẫu cho nhữngxét nghiệm đặc biệt như bệnh ngoài da [90]

1.5.2 Những kỹ thuật di truyền đã được áp dụng trong chẩn đoán trước sinh

1.5.2.1 Phương pháp di truyền học tế bào (phương pháp xét nghiệm NST)

Để xét nghiệm NST người ta có thể sử dụng phương pháp trực tiếp, tức

là từ tế bào đang phân chia mạnh, không qua nuôi cấy như từ tế bào tua rauhoặc gián tiếp qua nuôi cấy

Ở đây chúng tôi chỉ trình bày cách nuôi cấy tế bào dịch ối

* Nuôi cấy tế bào dịch ối.

Phân tích NST của tế bào nuôi cấy từ dịch ối được xem như là phươngpháp thuận tiện nhất, tin cậy cho chẩn đoán trước sinh

Cơ sở của mọi kỹ thuật nhuộm băng là dựa vào cấu trúc và hoạt động củaDNA trong NST, trên NST có những vùng nhiễm sắc thực và vùng dị nhiễm sắc.Khi nhuộm bằng những phương pháp khác nhau, các vùng sẽ bắt màu thuốc

nhuộm khác nhau và thể hiện bằng những băng sẫm và băng nhạt ở từng đoạn của NST Nhuộm băng G cho phép phân biệt rõ từng vùng của từng chiếc NST, qua

đó các đột biến dạng chuyển đoạn, đứt đoạn, trisomy hay monosomy từng phầnđều được phát hiện Tuy nhiên, cho đến ngày nay, mất đoạn nhỏ (microdeletion)tức những mất đoạn dưới 2Mb (x106 bases) vẫn chưa thể phát hiện

Phương pháp kinh điển này có hai hạn chế:

- Thời gian trung bình để có kết quả phân tích NST từ 10-12 ngày

- Các quy trình thực hành từ chọc ối đến nuôi cấy, đọc kết quả đều cầnngười trực tiếp thực hiện, không sử dụng máy móc, do vậy cần nguồn nhânlực lớn và có kinh nghiệm

1.5.2.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào – phân tử,

kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (Fluorescent in stitu hybridization – FISH)

FISH là kỹ thuật lai giữa kỹ thuật tế bào và kỹ thuật phân tử, dùng mộttrình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, được gọi là mẫu DNA dò (các mẫuDNA dò này được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ) Các mẫu DNA dònày được lai với trình tự của DNA trên tiêu bản NST ở kỳ giữa, kỳ đầu hoặc

gian kỳ Qua sự lai của mẫu DNA dò với trình tự bổ sung ta có thể phát hiện,định vị được chuỗi DNA đặc hiệu qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnhquang để xác định các bất thường của NST Ưu điểm của kỹ thuật FISH làphát hiện nhanh chóng những bất thường NST trong vòng 24-48 giờ do sửdụng trực tiếp tế bào ối, tế bào tua rau không cần qua nuôi cấy FISH có thểphát hiện các rối loạn NST nhỏ, các đột biến gen mà phương pháp phân tíchNST không phát hiện được [91], [92].

1.5.2.3 Các kỹ thuật di truyền phân tử

Kỹ thuật QF-PCR sử dụng các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cáctrình tự lặp nối tiếp ngắn (STR: short tandem repeat sequences) của các NSTđặc hiệu và của các vùng có tính đa hình cao Bằng cách kết hợp màu huỳnhquang trong quá trình khuếch đại nên kỹ thuật này cho phép định lượng các sảnphẩm cho mỗi STR đặc hiệu của từng NST Dựa trên nguyên tắc này QF-PCR

có thể phát hiện các dạng lệch bội phổ biến và các bất thường số lượng NSTgiới tính một cách nhanh chóng thông qua chỉ một phản ứng [92] Đã có nhiềunghiên cứu cho thấy đây là một kỹ thuật chẩn đoán có độ tin cậy cao [93], [94].Một điểm thuận lợi nữa của kỹ thuật QF-PCR là không đòi hỏi phải thực hiệnviệc nuôi cấy tế bào và tự động hóa do đó cho phép trả kết quả chẩn đoán trướcsinh chỉ trong vòng từ 24 đến 48 giờ

Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này so với kỹ thuật lậpkaryotype truyền thống là QF-PCR không cho phép đánh giá toàn bộ genome và

do đó không thể phát hiện hết được tất cả các bất thường của các NST trong bộNST như khi đánh giá bằng phân tích karyotype [95] QF-PCR vẫn chưa thểphát hiện được các NST tái cấu trúc như chuyển đoạn, mất đoạn, nhân đoạn, đảođoạn, thêm đoạn, NST hình vòng hay các trường hợp thể khảm với tỷ lệ thấp.Hơn nữa, cũng giống như kỹ thuật di truyền tế bào, QF-PCR không phát hiện

được các trường hợp vi mất đoạn NST với đoạn mất có kích thước dưới 2Mb.

Kỹ thuật array CGH thực hiện việc so sánh mẫu DNA cần phân tíchvới mẫu DNA chứng và thông qua sự khác biệt giữa 2 DNA này để phát hiệncác trường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn nếu có trên DNA

Nguyên lý của kỹ thuật array CGH được dựa trên khả năng bắt cặp(base pair) hoặc còn được gọi một cách khác là lai (hybridise) giữa một mạchđơn của DNA này và một mạch đơn của DNA khác theo nguyên tắc bổ sung

Kỹ thuật array CGH là khả năng đánh giá trên toàn bộ 46 NST chỉ trong mộtxét nghiệm duy nhất và phát hiện các bất thường mất cân bằng của NST baogồm các trường hợp lệch bội, mất hoặc nhân đoạn của NST chính xác hơnnhiều so với phương pháp lập karyotype Kỹ thuật array CGH cho phép pháthiện các bất thường của NST ngay cả khi không có định hướng trong chẩnđoán, đây là một ưu thế của array CGH so với kỹ thuật FISH Array CGHcũng phát hiện được các trường hợp khảm (mosaic) tuy nhiên sự chính xáctrong chẩn đoán còn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa dòng tế bào bình thường và tếbào đột biến [96], [97] Trong trường hợp khảm với dòng tế bào đột biến dạnglệch bội, array CGH cho phép phát hiện được ở mức khảm từ 10% trở lêntrong khi đó tình trạng khảm với dòng tế bào đột biến mang nhân đoạn hoặcmất đoạn của một NST được phát hiện ở mức khảm từ 20-30% trở lên Hiệnnay có thể nói array CGH là kỹ thuật hiệu quả nhất cho phép phân tích mộtcách toàn diện bộ NST, cho phép xác định một cách chính xác các bất thườngkhông cân bằng của NST, phát hiện các gen liên quan đến những bệnh cảnhđiển hình giúp cho việc đánh giá, theo dõi và điều trị hiệu quả hơn Tuy nhiênyêu cầu trình độ kỹ thuật cao, và giá thành khó đáp ứng ở cộng đồng [98]

Kỹ thuật MLPA hay kỹ thuật khuếch đại đầu dò đa mồi dựa vào phảnứng nối- là một biến thể của phản ứng PCR đa mồi (Multiplex Polymerase

Chain Reaction) cho phép khuếch đại nhiều đích chỉ với một cặp mồi duynhất [99], [100] Mỗi đầu dò bao gồm hai oligonucleotide, mỗi đoạn đều chứamột trình tự mồi cho phản ứng PCR và một trình tự bổ sung với trình tự đích(được gọi là trình tự lai) Khi các đầu dò được lai chính xác vào trình tự đích,chúng sẽ được nối lại bởi enzym ligase bền nhiệt Phản ứng PCR sẽ chỉkhuếch đại các đầu dò đã được nối lại hoàn chỉnh Vì mỗi đầu dò đều đượcđánh dấu huỳnh quang và có kích thước riêng biệt, nên có thể thu được tínhiệu của mỗi đầu dò đã được phân tách và xác định trên hệ thống điện di maoquản Kỹ thuật MLPA có thể định lượng số bản sao của nhiều trình tự trongmột gen với năng suất lên tới 40 trình tự đích trong một phản ứng [101],[102] MLPA là một kỹ thuật có độ chính xác cao được ứng dụng để phát hiệnđột biến xóa đoạn và lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD/BMD.Tuy nhiên, giá thành cao hơn so với một số kỹ thuật thông thường khác.

1.6 Kỹ thuật Bacs-on-Beads (BoBs)

(Đây cũng là một kỹ thuật di truyền phân tử, nhưng do mục tiêu của nghiêncứu của đề tài này nên chúng tôi xếp riêng ra một thư mục)

Chẩn đoán sự vắng mặt hay có mặt (đủ hay thừa) của một vùng gen đặchiệu Phát hiện các trường hợp mất hoặc thêm vật liệu di truyền trong các vùngNST liên quan đến 9 hội chứng vi mất đoạn bao gồm: Wolf-Hirschhorn, Cri duChat, Smith-Magenis, DiGeorge, William-Beuren, Langer-Giedion, Prader-Willi/Angelman và Miller-Dieker (microdeletion syndromes) và các NST 13,

18, 21, X, và Y trên DNA của người, sử dụng hệ thống thiết bị Luminex100/200 nhờ việc so sánh mẫu DNA cần phân tích với mẫu DNA chứng [20]

Nguyên lý.

Kỹ thuật Bobs thực hiện việc so sánh mẫu ADN cần phân tích với mẫuADN chứng và thông qua sự khác biệt giữa 2 ADN này để phát hiện cáctrường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn nếu có trên ADN Nguyên lý của kỹthuật Bobs được dựa trên khả năng bắt cặp giữa ADN dò với một mạch đơncủa ADN mẫu theo nguyên tắc bổ sung giữa các base adenine (A) với tymine

(T) và guanine (G) với cytosine (C) khi phản ứng lai xảy ra Trong kỹ thuậtBobs mẫu dò là các dòng nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (Bacterial artificialchromosome - BAC) chứa các đoạn ngắn ADN của người được sử dụng đểphát hiện các thay đổi trong gene với độ nhạy khá cao Đoạn ADN được lựachọn để nhân bản là đoạn ADN đặc trưng cho các hội chứng cần khảo sát.Tuy nhiên, BACs có nhược điểm là không cho phép đánh giá những bấtthường có kích thước bé hơn kích thước của các đoạn dò 5 đầu dò khác nhau

sử dụng cho mỗi NST 13, 18, 21, X và Y cùng với 4 đến 8 đầu dò khác nhaucho mỗi vùng liên quan đến vi mất đoạn ADN dò sau đó sẽ được gắn lên cáchạt microsphere (bead) cho phép nhận dạng các hạt được khảo sát và các beadkhác nhau được gắn DNA dò khác nhau Người ta sử dụng hai màu là hồngngoại và đỏ để nhuộm các bead Bằng cách sử dụng nồng độ khác nhau củahai chất gắn huỳnh quang này, một dãy chất lỏng được tạo ra bao gồm đến

100 loại hạt điển hình cho dấu hiệu quang phổ đặc trưng Trong kỹ thuật này,sản phẩm PCR tạo ra từ việc chọn các dòng BAC được cố định như các mẫu

dò lai trên hạt với ký hiệu huỳnh quang đặc biệt [5], [103]

Hình 1.6 Vùng gen đặc hiệu tương ứng với DNA dò được gắn

các hạt Bead có thể lai [5]

Kỹ thuật phát hiện lặp và mất đoạn trong vùng genome mà các dòngNST vi khuẩn nhân tạo (BACs) có thể lai Cường độ huỳnh quang trung bìnhcủa mẫu DNA lai với mẫu dò BAC đặc trưng được so sánh với cường độhuỳnh quang trung bình của DNA chứng được gắn mẫu dò BAC tương tự Tỷ

lệ của mẫu chứng nam và mẫu chứng nữ được tính toán cho mỗi mẫu dò