ĐÁNH GIÁ một số CHỈ số GIÁM sát CHẤT LƯỢNG kỹ THUẬT NUÔI cấy MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS môi TRƯỜNG LỎNG MGIT tại BỆNH VIỆN PHỔI hà nội năm 2019 2020

[1] Phát hiện và định danh các loài MTBC vẫn là mục tiêu quan trọng nhấtcủa phòng xét nghiệm, tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng có đếnhai phần ba các chủng vi khuẩn phân lập

NGUYỄN THỊ HÀ

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ SỐ GIÁM SÁT CHẤT LƯỢNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS MÔI TRƯỜNG LỎNG MGIT TẠI BỆNH VIỆN PHỔI HÀ NỘI NĂM 2019-2020

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

NGUYỄN THỊ HÀ

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ SỐ GIÁM SÁT CHẤT LƯỢNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS MÔI TRƯỜNG LỎNG MGIT TẠI BỆNH VIỆN PHỔI HÀ NỘI NĂM 2019-2020

Chuyên ngành : Vi sinh y học

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Trần Minh Châu

HÀ NỘI - 2019

BD : Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD.

Mycobacteria khác không phải trực khuẩn lao

Phức hợp Mycobacterium tuberculosis.

Tuýp môi trường chỉ thị sự phát triển của Mycobacterium

Mycobacteria khác không phải trực khuẩn lao

PANTA : Polymycin B, Amphotericin B, Nalidixic acid, Trimethoprim,

Azlocillin

Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh vi khuẩn lao

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dịch tễ bệnh lao và bệnh do NTM 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Tại Việt Nam 4

1.2 Chi Mycobacteria 5

1.2.1 MTBc 6

1.2.2 Nontuberculous bacteria (NTM) 11

1.3 MTB nuôi cấy môi trường lỏng 15

1.3.1 Nguyên lý kỹ thuật 16

1.3.2 Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh MTB 20

1.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử 22

1.5 Ưu nhược điểm của các phương pháp định danh Mycobacteria 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.3 Thiết kế nghiên cứu 27

2.4 Cỡ mẫu và chọn mẫu 27

2.5 Vật liệu, thiết bị, quy trình kĩ thuật 27

2.5.1 Kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng MGIT 27

2.5.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger 30

2.8 Xử lí và phân tích số liệu 37

2.9 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 37

2.10 Kế hoạch nghiên cứu 37

CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Mục tiêu 1: 39

3.2 Mục tiêu 2: 39

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 42

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 43

DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1.1: Các loại bệnh phẩm và thể tích yêu cầu 19

Bảng 2.1: Diễn giải kết quả 29

Bảng 2.2: Trình tự các đoạn mồi sử dụng 31

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32

Bảng 2.4: Thành phẩn của phản ứng 33

Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của cycle sequencing 33

Bảng 2.6: Các chỉ số chất lượng nuôi cấy theo WHO 35

Bảng 2.7: Kế hoạch nghiên cứu 37

Bảng 3.1: Các chỉ số giám sát chất lượng nuôi cấy 39

Bảng 3.2: Bảng kết quả Sequencing của MTBc 39

Bảng 3.3: Bảng kết quả Sequencing của MTBc 40

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ kết quả Sequencing của MTBC 40Biểu đồ 3.2: Biểu đồ kết quả Sequencing của NTM 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mycobacterium tuberculosis mọc trên môi trường Lowenstein

Jensen 8Hình 1.2: Hình thái đặc trưng của một số loài Mycobacteria 10Hình 2.1: Hình ảnh AFB thuần, kết chặt vào nhau như búi thừng, hay cord

formation 30Hình 2.2: Vị trí (A) và trình tự (B) của các đoạn mồi trên gen rpoB 32Hình 2.3: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lao là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm xuất hiện từ lâu trong lịch sử loàingười, cuối thế kỉ XIX, bệnh gây tử vong cho 20- 25% người trưởng thành ởchâu Âu và Bắc Mĩ Đến những năm 1940, với sự ra đời của các thuốc khánglao, tỉ lệ mắc và chết của bệnh giảm xuống nhanh chóng Tuy nhiên, từ năm

2000 đến nay, bệnh lao trở lại với những con số thống kê báo động Theo báocáo của WHO, trong năm 2017, lao gây ra cái chết cho 1,6 triệu người trong

đó 1,3 triệu thuộc nhóm HIV âm tính, và 300 000 người thuộc nhóm HIVdương tính, cũng theo ước tính trên có khoảng 10 triệu ca mới mắc tươngđương với 133 trường hợp trên 100 000 dân Đáng lo ngại hơn nữa, có một tỉ

lệ khoảng 5- 10% trong 1,7 tỉ người nhiễm lao tiềm ẩn có thể sẽ biểu hiệnthành bệnh lao trong đời Việt Nam đứng thứ 16 trên 30 quốc gia có gánhnặng bệnh lao cao nhất thế giới trong năm 2018 Mỗi năm cả nước phát hiện

và đưa vào điều trị trên 100 nghìn trường hợp mắc lao mới [1]

Phát hiện và định danh các loài MTBC vẫn là mục tiêu quan trọng nhấtcủa phòng xét nghiệm, tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng có đếnhai phần ba các chủng vi khuẩn phân lập được là NTM, hơn thế nữa, số lượngcác loài NTM được tìm ra đã tăng từ 30 loài lên 150 loài, nhiều loài trong số

đó là căn nguyên gây bệnh quan trọng đã được ghi nhận [2], [3] Thời kì1880- 1980, người ta chủ yếu định danh Mycobacteria dựa trên phân tích kiểuhình, từ cuối thế kỉ XX đến nay, có sự chuyển hướng sang nghiên cứu kiểugen là chính [4] Mặc dù vậy, không xét nghiệm nào mất đi giá trị của mình

mà nuôi cấy và sinh học phân tử luôn song hành và hỗ trợ lẫn nhau Một sốloài nếu muốn định danh được bắt buộc phải sử dụng đến các phương phápsinh học phân tử, nhưng nuôi cấy đặc biệt là trên môi trường lỏng lại có lợithế là đáng tin cậy và rẻ tiền hơn, có thể áp dụng cho những nước có thu nhập

trung bình và thấp như Việt Nam Mục tiêu quan trọng cuối cùng là chẩn đoánchính xác và nhanh chóng căn nguyên vi sinh gây bệnh, định hướng cho cácnhà lâm sàng trong điều trị và kiểm soát bệnh lao nói riêng cũng như bệnh doMycobacteria nói chung.

Quản lí và đảm bảo chất lượng là thiết yếu để phòng xét nghiệm giữvững được vai trò quan trọng, giúp cho các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán và điềutrị đúng phác đồ trong bối cảnh phân loại của Mycobacteria vô cùng đa dạng

và phức tạp Nhằm mục đích nâng cao chất lượng xét nghiệm nuôi cấy MTBtrên môi trường lỏng MGIT nói riêng và phát triển các kỹ thuật phòng xét

nghiệm chẩn đoán lao nói chung, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Đánh giá

các chỉ số giám sát chất lượng xét nghiệm Mycobacterium tuberculosis

nuôi cấy môi trường lỏng tại Bệnh viện Phổi Hà Nội năm 2019-2020”.

Với 2 mục tiêu cơ bản sau:

1 Đánh giá chất lượng xét nghiệm MTB nuôi cấy môi trường lỏng theo

6 chỉ số được đưa ra trong quy trình thực hành chuẩn xét nghiệm vi khuẩn lao.

2 Định danh một số loài NTM bằng kỹ thuật giải trình tự gen Sanger trên các mẫu nuôi cấy lỏng MGIT dương tính và TBcID âm tính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ bệnh lao và bệnh do NTM.

1.1.1 Trên thế giới.

Trên thế giới, lao nằm trong top 10 nguyên nhân gây tử vong, đứng đầunhóm tác nhân truyền nhiễm (xếp trên HIV) Hàng triệu người nhiễm phải cănbệnh này mỗi năm Trong năm 2017, bênh lao đã gây ra khoảng 1,6 triệu ca

tử vong trong đó 1,3 triệu người có HIV âm tính và thêm 300 000 nghìnngười có HIV dương tính Có khoảng 10 triệu trường hợp mắc lao mới tươngđương 133 ca trên 100 000 dân

Lao có mặt ở tất cả các quốc gia và bệnh nhân mắc ở mọi lứa tuổi, nhìnchung 90% là người trưởng thành (>15 tuổi), 64% là nam giới, 9% là ngườinhiễm HIV (72% trong số đó ở châu Phi) Hai phần ba số bệnh nhân lao cómặt tại tám quốc gia: Ấn Độ (27%), Trung Quốc (9%), Indonesia (8%),Philippin (6%), Pakistan (5%), Nigeria (4%), Bangladesh (4%), Nam Phi(3%), chỉ có khoảng 6% bệnh nhân ở châu Âu và Mỹ

Mức độ nghiêm trọng của bệnh ở các quốc gia cũng rất khác nhau, trongnăm 2017 có dưới 10 trường hợp/ 100 000 dân ở các quốc gia có mức sốngcao, 150- 400/ 100 000 dân ở các quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao, và trên500/ 100 000 dân ở một vài nước như Mozambique, Philippin và Nam Phi Trong năm 2017, có khoảng 558 000 ca lao kháng rifampicin mới (RR-TB), trong đó gần một nửa ở ba quốc gia: Ấn Độ (24%), Trung Quốc (13%),Liên bang Nga (10%) Trong số các trường hợp RR-TB, có khoảng 82% làlao đa kháng (MDR- TB) Số những người sống chung với HIV mắc lao là

khoảng 9%, tỉ lệ đồng nhiễm lao và HIV cao nhất ở các nước thuộc châu Phivới trên 50% ở một số vùng thuộc phía nam châu Phi [1]

NTM phân bố rộng rãi ngoài môi trường và có thể được phân lập ở mọivùng trên thế giới, vi khuẩn chủ yếu ở trong đất và nước, có thể xuất hiệntrong nước tự nhiên hoặc nước đã qua xử lí Bệnh do NTM gây ra xuất hiện ởhầu hết các nước công nghiệp, với tỉ lệ mới mắc vào khoảng 1- 1,8 trườnghợp/ 100 000 dân Biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất của NTM là biểu hiện ởphổi, ngoài ra bệnh của hạch bạch huyết, da, mô mềm và nhiễm trùng lan tỏacũng có ý nghĩa quan trọng Ở Mỹ, theo báo cáo của CDC có khoảng 75%trường hợp bệnh ở phổi, 5% nhiễm khuẩn huyết, 2% ở da, mô mềm và 0,4% ởhạch bạch huyết (nghiên cứu trong giai đoạn 1994-1996), trong đó phổ biến

nhất là các loài MAC, M kansasii và M fortuitum [3] Ở Canada, tỉ lệ mắc

NTM là 41,3/ 100 000 dân (giai đoạn 2006-2010) [5] Ở Anh, tỉ lệ mắc là

2,9/ 100 000 dân, hay gặp nhất là các nhiễm trùng do MAC, M kansasii và

M malmoense (năm 2006) [6] Năm 2009, ở Nhật Bản tỉ lệ mắc là 10,1/ 100

000 dân, phân lập được chủ yếu là MAC [7]

1.1.2 Tại Việt Nam.

Việt Nam nằm trong nhóm 30 nước có gánh nặng bệnh lao cao nhất thếgiới, đồng thời cũng nằm trong nhóm 30 nước có gánh nặng lao đa kháng(MDR- TB) lớn nhất thế giới Năm 2017, Việt Nam có 12 nghìn người chết

do lao thuộc nhóm HIV âm tính và 840 người chết thuộc nhóm HIV dươngtính, tỉ lệ mắc là 129 ca/ 100 000 dân Số trường hợp được chẩn đoán lao phổiMDR/ RR- TB là 4 900 người [1]

Một nghiên cứu tại khu vực Đông Á bao gồm Việt Nam cho thấy tỉ lệphân lập được NTM từ bệnh phẩm đường hô hấp là 31%, MAC là vi khuẩn

phân lập được phổ biến nhất (43-81%) sau đó là nhóm các Mycobacteria phát

triển nhanh (M chelonae, M fortuitum, M abscessus) [8]

1.2 Chi Mycobacteria.

Chi Mycobacteria là chi duy nhất trong họ Mycobacteriaceae, và cóliên quan đến một vài chi khác cũng có thành phần acid mycolic trên vách Tỉ

lệ G+C cao trong DNA của các loài Mycobacteria, dao động từ 61- 71%

(ngoại trừ M leprae, 55%), tương tự như một số chi Gordonia, Tsukamurella,

Norcadia, Rhodococcus… Mycobacteria thuộc loại vi khuẩn hiếu khí tuyệtđối, không di động và không sinh nha bào Hình thái trên nhuộm soi là cáctrực khuẩn mảnh, hơi cong hoặc thẳng, hình que, có kích thước 0.2- 0.6x1- 10

µm, có thể phân nhánh Hình thái khuẩn lạc cũng rất thay đổi, tùy thuộc vàoloài; có loài khuẩn lạc nhẵn, có loài xù xì, có thể sinh hoặc không sinh sắc tố.Các loài sinh sắc tố thường có màu vàng, cam (màu hồng hiếm hơn) do sinhsắc tố carotenoid, có loài cần ánh sáng mới tạo được sắc tố, có loài ở trongbóng tối mới tạo được sắc tố Lớp peptidoglycolipid của vách tế bào vi khuẩnbao gồm các thành phần: meso-diaminopimelic axit, alanine, glutamic acid,glucosamine, muramic acid, arabinose, and galactose Mycolic acid (sốnguyên tử C dao động từ 70 đến 90) cùng với lipid tự do (trehalose- 6, 6’-dimycolate) tạo nên một hàng rào kỵ nước Các axit béo quan trọng khác làsáp, phospholipid, axit mycoserosic và axit phthienoic Hàm lượng cao cáclipid tạp trên vách tế bào ngăn cản sự bắt màu của thuốc nhuộm thông thường

mà phải nhuộm bằng phương pháp nhuộm đặc biệt như phương pháp Neelsen Mycobacteria bắt màu thuốc nhuộm khi tăng thời gian nhuộm lên vàđun nóng nhưng vẫn không bị tẩy màu bởi cồn- axit Điểm đặc trưng nàykhiến cho chi Mycobacreria còn được gọi là vi khuẩn kháng cồn kháng axit

Ziehl-Ở một số loài phát triển nhanh tính kháng axit có thể giảm hoặc mất ở một sốgiai đoạn So với các loài vi khuẩn khác, Mycobacteria thường mọc rất chậm,

thời gian phân chia thường lên tới 20 giờ (M.ulcerans lên tới 36 giờ) Giữa

các loài còn có sự phân chia thành nhóm phát triển nhanh và nhóm phát triểnchậm Nhóm phát triển chậm là nhóm cần trên 7 ngày mới hình thành khuẩnlạc trên môi trường đặc [4], [9]

Về nhu cầu dinh dưỡng, hầu hết các loài thích nghi tốt trên các môitrường dinh dưỡng cơ bản, sử dụng ammoniac hay axit amin làm nguồn nitơ;glycerol là nguồn cacbon cùng các muối vô cơ Sự tăng trưởng của vi khuẩn

trứng hoặc axit oleic, mặc dù sau này độc ở nồng độ cao (>1%) và cần đượctrung hòa bởi albumin Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng rất khác nhau giữacác loài (từ 30-45oC) [4], [9]

Các loài Mycobacterium không gây bệnh cho người thường tồn tạitrong môi trường tự nhiên và được gọi là NTM hay MOTT [9]

1.2.1 MTBc.

M tuberculosis complex (MTBc) là một phức hợp gồm các loài sau:

Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG (bacillus Calmette-Guerin), Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii, Mycobacterium pinnipedi [4], [10]

Mặc dù các thành viên của MTBC có kiểu hình và phạm vi vật chủkhác nhau, chúng thể hiện tính đồng nhất di truyền rất cao với khoảng 0.01-0.03% khác biệt nucleotide và không có dấu hiệu trao đổi vật chất di truyềnnào giữa chúng [11]

cứu đã chỉ ra rằng các loài M tuberculosis hiện đại có mức độ biến đổi di

truyền cực kỳ thấp [13]

Các tính chất sinh vật hóa học: M tuberculosis đặc trưng bởi sự tích

lũy niacin trong quá trình phát triển, khử nitrat thành nitrit, sản xuất catalase

bị phá hủy bởi nhiệt (các chủng kháng isoniazid có thể không sản xuất

catalase) M tuberculosis bị ức chế bởi nitroimidazopyran (hay

p-nitroacetylamino-β-propiophenon, NAP) [9]

Bệnh lao ở người trưởng thành đặc trưng bởi tình trạng viêm mãn tính

và hoại tử và hình thành hang lao Hang lao có thể vỡ vào phế quản làm cho

vi khuẩn lây lan sang các khu vực khác của phổi và theo các hạt mù khi hocủa bệnh nhân làm lây lan cho ngươi khác Các biểu hiện lâm sàng quan trọngcủa lao bao gồm ho, sút cân, ra mồ hôi trộm ban đêm, sốt nhẹ, khó thở và đaungực Các biểu hiện ngoài phổi của lao bao gồm lao màng phổi, lao màngngoài tim, lao khớp, lao màng não, lao hạch, nhiễm trùng da, xương, cơ

1.2.1.2 Mycobacterium bovis.

Mycobacterium bovis gây bệnh chủ yếu trên gia súc và các động vật

nhai lại khác, ngoài ra cũng gây bệnh cả cho chó, mèo, lợn, vẹt và người

Bệnh ở người gần giống với bệnh lao do M tuberculosis gây ra và được điều

trị tương tự Vi khuẩn phát triển rất chậm trên các môi trường nền trứng, tạocác khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng hạt, không tạo sắc tố, bờ không đều sau 21 ngày

ủ ở 37 độ C Trên môi trường Middlebrook 7H10, hình thái khuẩn lạc tương

tự như của M tuberculosis nhưng mọc chậm hơn Hầu hết các chủng M.bovis

âm tính với thử nghiệm niacin, không khử nitrat và không mọc nếu có mặt

T2H, giúp phân biệt M.bovis với M.tuberculosis [4] Bộ gen của M bovis

kích thước 4,345,492 bp

Tỉ lệ G+C là 65.6 % Trình tự giống >99.9% với M.tuberculosis Có

một vài đột biến mất đoạn trong bộ gen dẫn đến giảm kích thước bộ gen [14]

Hình 1.1: Mycobacterium tuberculosis mọc trên môi trường Lowenstein

Jensen

1.2.1.3 Mycobacterium bovis BCG.

Nhiều nơi trên thế giới vẫn đang sử dụng BCG để làm vắc-xin Vàonăm 1924 Calmette phân phối chủng vi khuẩn này tới các phòng thí nghiệmkhác nhau, sau đó chủng này được duy trì in vitro bằng cách cấy chuyển liêntiếp Ngày nay người ta thấy các chủng BCG tồn tại như một tập hợp không

đồng nhất về mặt di truyền, phù hợp với các đặc tính được mô tả cho M bovis, ngoại trừ việc chúng bị suy giảm độc lực Bộ gen của BCG có kích

thước 4,374,522-bp, bao gồm gần 4000 gen mã hóa cho protein, trong đó có

58 gen có 2 đoạn bản sao là kết quả của sự nhân lên song song riêng rẽ, DU1

và DU2 [15] Nhiều loại đột biến khác cũng được tìm ra ở các chủng BCG

khác nhau Phân tích đa hình đơn nucleotide (SNPs) có thể phân biệt được M bovis BCG với các chủng M bovis có độc lực [16]

1.2.1.4 Mycobacterium africanum.

M africanum có kích thước bộ gen là 4,389,314 bp, tỉ lệ G+C là

65,6%, gây ra tới một nửa số lượng mắc bệnh lao trên người ở khu vực Tây

Phi M africanum thể hiện sự khác biệt với M tuberculosis ở đặc điểm bệnh

nhân và đặc điểm dịch tễ học miễn dịch [17]Các chủng của vi khuẩn này

cũng phân lập được ở các châu lục khác, như châu Mỹ, nhưng chủ yếu trên

các bệnh nhân đã từng sống ở châu Phi [18] Hình dạng khuẩn lạc của M africanum giống như khuẩn lạc của M tuberculosis, còn tính chất sinh vật hóa học tương tự với cả M tuberculosis và M bovis Các chủng M africanum được chia thành 2 nhóm dựa trên cơ sở nguồn gốc địa lý và các tính chất sinh vật hóa học, M africanum tuýp 1 có ở Tây Phi và M africanum

tuýp 2 có ở Đông Phi Loài này đặc trưng bởi sự thiếu vắng một vùng khác

biệt là RD9 nhưngcó mặt RD12 và một đa hình gen gyrB đặc hiệu [11]

1.2.1.5 Mycobacterium microti.

Ban đầu loài này được phân lập từ loài gặm nhấm, như chuột đồng và

chuột chù, M microti cũng gây ra bệnh lao tự nhiên ở chuột lang, thỏ, lạc đà

không bướu, mèo [19], [20]… và cho cả người bị suy giảm miễn dịch hoặcđang dùng chất ức chế miễn dịch [21] Trên tiêu bản nhuộm soi, vi khuẩn cóhình “chiếc bánh sừng bò” rất đặc trưng, vi khuẩn thường không mọc đượckhi nuôi cấy Khi phân tích kiểu gen của vi khuẩn này, nhiều đột biến mất

đoạn đã được tìm ra có liên quan với M tuberculosis [22]

ở châu Phi và các báo cáo sau đó của Djibouti [24]trên các bệnh nhân viêm

hạch vùng hố chậu ủng hộ cho giả thuyết M canettii có nhiều ở châu Phi hơn các châu lục khác Năm 2002, trường hợp lao phổi do M canettii đã được báo cáo ở châu Phi [25]và năm 2009, một ca viêm màng não đầu tiên do M canettii được ghi nhận trên một bệnh nhân tị nạn người Sudan ở Mỹ [26]Khuẩn lạc của M canettii có dạng tròn, bóng, nhẵn làm cho chúng khác

biệt đáng kể so với các thành viên khác của MTBC và thậm chí có thể bị

nhầm lẫn với NTM Trên thực tế người ta cho rằng M canettii đã xuất hiện từ

2.8 triệu năm trước, và do đó có thể là tổ tiên của tất cả các loài còn lại củaMTBc ngày nay [13]

1.2.1.7 Mycobacterium pinnipedii.

Dựa vào phạm vi của vật chủ, cũng như đặc điểm kiểu gen và kiểu

hình, M pinnipedii, một thành viên khác của MTBC được tìm ra bởi Cousins

và cộng sự vào năm 2003 [27] Hải cẩu có vẻ là vật chủ tự nhiên, nhưng loàinày cũng có thể gây bệnh cho chuột lang, thỏ và cả gia súc Vi khuẩn có thểlan truyền từ động vật này sang động vật khác cũng như có thể lan truyền từđộng vật (hải cẩu) sang người đã được chứng minh gần đây [28], [29] Bệnh

do M pinnipedii biểu hiện phổ biến là các tổn thương dạng u hạt ở hạch bạch

huyết, phổi, màng phổi và lách

Hình 1.2: Hình thái đặc trưng của một số loài Mycobacteria A: Khuẩn lạc của M turbeculosis trên Middlebrook 7H10; B: Khuẩn lạc của M bovis BCG trên Middlebrook 7H10; C: hình ảnh “bánh sừng bò” của M.microti trên tiêu bản nhuộm; D: Khuẩn lạc nhẵn của M canettii trên Middlebrook 7H10.

1.2.2 Nontuberculous bacteria (NTM).

Hầu hết các NTM được tìm thấy trong đất và nước, chúng thường đượccoi là các căn nguyên gây bệnh cơ hội ở những bệnh nhân có bệnh nền làbệnh phổi, bệnh nhân ức chế miễn dịch hoặc có tổn thương da Nghiên cứutrên các bệnh nhân AIDS cũng góp phần lớn trong việc nhận thức về các bệnh

lý do NTM gây ra và đo lường tỷ lệ mắc Biểu hiện thường gặp của nhiễmtrùng do NTM thường là bệnh phổi mãn tính giống như lao, mặc dù một sốloài thường liên quan đến các nhiễm trùng ngoài da Bệnh do NTM khônglây từ người sang người [4] Một nghiên cứu ở khu vực Đông Á cho thấy tỉ

lệ phân lập được NTM từ bệnh phẩm đường hô hấp có ý nghĩa lâm sàng là31% [8]

lạc khô và dẹt giống với khuẩn lạc của M tuberculosis Để lâu, khuẩn lạc của

MAC có thể sinh sắc tố màu vàng Do hai loài trong MAC rất giống nhau

người ta thường không định danh đến loài mà chỉ định danh là phức hợpMAC [9]

Mycobacterium kansasii là căn nguyên đứng thứ hai sau MAC gây các bệnh ở phổi trong NTM [3], [8] Biểu hiện ở phổi do M kansasii cũng tương

tự như lao Nhiễm trùng ngoài phổi gồm viêm hạch vùng hố chậu ở trẻ em,viêm da và mô mềm, viêm màng hoạt dịch, viêm màng bồ đào và gần đây

nhất là viêm ngoại tâm mạc [31] Khuẩn lạc của M kansasii có thể bóng hoặc

xù xì, bờ không đều trên thạch Middlebrook 7H110 Khuẩn lạc của loài đặctrưng ở chỗ sinh sắc tố khi tiếp xúc với ánh sáng và không sinh sắc tố khi ởtrong bóng tối [4], [9]

Mycobacterium genavense là một loại NTM mọc chậm và khó nuôi

cấy, được phân lập vào năm 1991 trong máu của một bệnh nhân AIDS ởGeneva, Thụy Sĩ [32] Loài này có liên quan đến các tình trạng viêm ruột,viêm nhiễm cơ quan sinh dục, viêm da mô mềm và viêm hạch bạch huyết ởcác bệnh nhân dương tính với HIV Những bệnh này thường khá giống với

bệnh do MAC gây ra nhưng có thể tìm thấy M genavense trên các tiêu bản

soi phân [33]

Mycobacterium haemophilum được phân lập lần đầu tiên vào năm 1978

ở nhiễm trùng da của một bệnh nhân Hogdkin Viêm hạch bạch huyết dưới davới sưng, nóng, đỏ, đau sau đó tiến triển thành áp xe rồi rò ra ngoài da là biểuhiện thường gặp Điểm khác biệt của loài này là nó cần có hemolobin hoặchemin trong môi trường nuôi cấy thì mới phát triển được, nhiệt độ tối ưu cho

sự phát triển là từ 28- 32o C [34]

Mycobacterium malmoense được gọi theo tên của thành phố Malmo,

Thụy Điển, nơi lần đầu tiên phân lập được loài này vào năm 1977 Các chủng

phân lập được có ý nghĩa lâm sàng ở 70- 80% bệnh nhân Bệnh nhân mắc M malmoense thường là người lớn bị bệnh phổi mãn tính khó điều trị (như bệnh

bụi phổi ở bệnh nhân nam trung niên), hoặc trẻ nhỏ bị viêm hạch vùng hố

chậu M malmoense thường mọc sau 8 đến 12 tuần nuôi cấy, lâu hơn nhiều so

với thời gian trả âm tính kết quả nuôi cấy là sau 6 tuần [35]

Mycobacterium marinum gây ra các nhiễm trùng da sau khi da bị xây

xước và tiếp xúc với nước hồ cá cảnh hoặc nước mặn Điển hình là một tổnthương đơn lẻ khu trú ở một chi, thường ở khuỷu tay, đầu gối, bàn chân, ngónchân hoặc ngón tay Tổn thương xuất hiện sau 2- 3 tuần ủ bệnh, có thể tiếntriển thành loét hoặc ác tính hóa [36]

Mycobacterium simiae lần đầu tiên được phân lập từ khỉ macaques năm

1965, loài này có liên quan mật thiết đến các bệnh nhân HIV dương tính, gâybệnh chủ yếu ở phổi và hệ thống liên võng nội mô Trên bệnh nhân HIV âmtính, biểu hiện ở phổi là chủ yếu nhưng cũng có những tổn thương ở hạchbạch huyết, ở cơ quan sinh dục, ở da, ở mắt Loài này đứng đầu trong các loài

gây bệnh ở bệnh nhân xơ nang phổi M simiae là một trong rất ít các loài NTM tạo niacin và có thể chẩn đoán nhầm với M tuberculosis [37]

Mycobacterium szulgai được mô tả lần đầu tiên năm 1972, loài này

hiếm khi phân lập được từ môi trường nên thường có ý nghĩa lâm sàng nếunuôi cấy ra Bệnh nhân chủ yếu là nam trung niên mắc các bệnh phổi mãntính ngoài lao Các bệnh khác có thể gặp bao gồm viêm khớp, viêm cổ tử

cung, viêm tủy xương và nhiễm trùng da Dựa trên 16S RNA, M szulgai có liên quan rất gần với M malmoense [3], [4]

Mycobacterium ulcerans là một căn nguyên khó nuôi cấy nên tần suất

phát hiện được thấp Ngày nay người ta thấy rằng nó là căn nguyên gây bệnhthuộc chi Mycobacteria phổ biến thứ ba sau lao và phong Loài này có liênquan chặt chẽ với các vùng đất ngập nhiệt đới, sinh sôi ở những vùng bùn lầyngập nước [38] Mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng hay gặp nhất ở trẻ

em dưới 15 tuổi Biểu hiện lâm sàng là một khối không đau dưới da ở chi

dưới sau một tổn thương xây xước trước đó M ulcerans tiết ra một loại độc

tố tế bào (mycolactone) có khả năng điều hòa miễn dịch gây ra hoại tử Cáckhối không đau có thể tiến triển thành loét nông, loét rộng hoặc viêm tủyxương Tổn thương thường để lại sẹo co kéo [39]

Mycobaterium xenopi được phân lập lần đầu tiên năm từ năm 1957 từ

tổn thương da của cóc, đến năm 1965 nó được ghi nhận là căn nguyên gâybệnh trên người Hầu hết các nhiễm trùng biểu hiện ở phổi đặc biệt là trênbệnh nhân nam trưởng thành có bệnh nền ở phổi như bệnh phổi tắc nghẽnmãn tính hoặc giãn phế quản Một số nhiễm trùng ngoài phổi như viêm khớpnhiễm khuẩn, viêm cột sống có thể phát hiện ở bệnh nhân bị suy giảm miễn

các hệ thống nước nóng [37]

1.2.2.2 Nhóm các loài phát triển nhanh.

Nhóm Mycobacteria chelonae và Mycobacterium abscessus là một

trong ba nhóm Mycobacteria phát triển nhanh, gây bệnh trên người quantrọng Hai loài này thường liên quan đến các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở da,xương, phổi, hệ thần kinh trung ương và van tim giả trên các bệnh nhân suygiảm miễn dịch Khoảng 80% các nhiễm trùng ở phổi do các Mycobacteria

phát triển nhanh là do M abscessus, và nước vòi là một ổ chứa quan trọng của M abscessus M chelonae có liên quan gần gũi với một số dưới loài của

M abscessus Khuẩn lạc có thể xuất hiện sau 3- 5 ngày ủ ở 37oC [40]

Nhóm Mycobacterium fortuitum bao gồm 3 loài là M fortuitum và M peregrinum và một loài thứ ba chưa đặt tên Gần đây, bảy loài mới được thêm

vào nhóm Nhóm này có mặt phổ biến ở môi trường và có thể phân lập được

từ đất, nước, bụi nhà Nhóm này thường gây bệnh trên da, mô mềm và khu trútại vết thương do đâm xuyên Nhiễm trùng liên quan đến sử dụng lâu các loại

catheter tĩnh mạch, lọc màng bụng, vị trí tiêm, vết mổ sau các phẫu thuật cắt

bỏ vú và phẫu thuật bắc cầu chủ vành đã được báo cáo [41]

Nhóm Mycobacterium smegmatis gồm 2 loài là M smegmatis và M goodie,

hiếm gây bệnh trên người, nhưng có báo cáo về các trường hợp bị nhiễmkhuẩn phổi, da và mô mềm và xương do nhóm này [42]

1.3 MTB nuôi cấy môi trường lỏng.

Nhuộm soi tìm AFB trên tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm cung cấp chẩnđoán sơ bộ bệnh do Mycobacteria, trong khi đó nuôi cấy cung cấp chẩn đoánxác định bệnh do trực khuẩn lao hay là Mycobacteria khác không phải lao(NTM) Có đến 50- 60% lượng bệnh phẩm dương tính trên nuôi cấy màkhông phát hiện được AFB trên nhuộm soi, do đó nuôi cấy đóng vai trò chínhtrong chẩn đoán bệnh do Mycobacteria

Các môi trường nuôi cấy nền trứng như Lowenstein- Jensen hoặcOgawa được sử dụng để nuôi cấy Mycobacteria trong vài thập kỉ; đến năm

1958, Middlebrook và Cohn đã tạo được môi trường nền thạch cho phép pháthiện nhanh hơn sự phát triển của Mycobacteria, tuy nhiên vẫn cần 3- 4 tuầnmới phát hiện được sự có mặt của Mycobacteria trong bệnh phẩm

Năm 1969, Deland và Wagner phát triển một kĩ thuật bán tự động pháthiện sự chuyển hóa của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy Kĩ thuật sử dụngmôi trường lỏng để phân lập Mycobacteria và làm kháng sinh đồ cho MTBnày sau đó được thương mại hóa vào năm 1980 với tên gọi là hệ thống đophóng xạ BACTEC 460 (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks,

cứu đã cho thấy nuôi cấy trên môi trường lỏng giúp phát hiện sự có mặt của vikhuẩn trung bình trong 8- 14 ngày so với môi trường đặc là 3- 5 tuần và sốlượng mẫu cấy dương tính tăng lên 15- 20%, đặc biệt trên các mẫu soi AFB

âm tính Tuy nhiên, do những lo ngại về vấn đề sử dụng vật liệu phóng xạcũng như xử lí chất thải phóng xạ, một hệ thống nuôi cấy tự động mới ra đờikhông sử dụng chất phóng xạ là BACTEC MGIT 960 [10]

1.3.1 Nguyên lý kỹ thuật

Môi trường MGIT cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển củaMycobacteria, được chứng minh là hỗ trợ tốt hơn cho sự phát triển của vikhuẩn Hợp chất huỳnh quang gắn dưới đáy tuýp là tris- 4, 7- diphenyl- 1, 10-phenolthronile ruthelium chloride pentahydrate nhạy cảm với oxy hòa tantrong môi trường Số lượng lớn oxy hoà tan trong môi trường ức chế sự phátquang của hợp chất huỳnh quang Khi vi khuẩn sinh trưởng sẽ tiêu thụ oxy,hợp chất huỳnh quang thoát ức chế sẽ phát quang khi được chiếu UV, mức độphát quang tương ứng với mật độ vi khuẩn có trong môi trường Máy liên tụctheo dõi cường độ phát quang trong ống và lưu lại dưới dạng đơn vị tăngtrưởng GU (Growth Unit), máy báo dương khi mật độ vi khuẩn vượt quá

quả dương tính tùy thuộc số lượng vi khuẩn có trong mẫu bệnh phẩm, sớmnhất khoảng 3 ngày, thời gian cho kết quả âm tính sau 42 ngày Việc pháthiện sự tăng trưởng của vi khuẩn cũng có thể phát hiện bằng mắt thường,chính là sự xuất hiện của các hạt to nhỏ không đều làm đục môi trường nuôicấy Một số NTM đặc biệt là nhóm các loài phát triển nhanh thường tạo độđục ít hơn trong khi bội nhiễm các vi khuẩn khác thường tạo độ đục lớn hơn

Máy BACTEC báo kết quả tự động 60 phút/lần bằng tín hiệu đèn sáng

và âm thanh [43]

Hệ thống tự động này sử dụng ống môi trường nuôi cấy lỏng MGITloại tuýp BBL MGIT 7ml gắn chất phát quang ở đáy, chứa canh thangMiddlebrook 7H9 đã được cải tiến, bổ sung chất hỗ trợ sự phát triển của vikhuẩn lao (hay còn gọi là Growth Supplement- OADC) được đóng gói riêng

rẽ, hỗn hợp kháng sinh chống bội nhiễm BBL MGIT PANTA, OADC vàPANTA chỉ được cho vào các ống MGIT không quá 30 phút trước khi cấy

MGIT Growth Supplement (OADC) cung cấp các chất thiết yếu giúpcho Mycobacteria phát triển, bao gồm: axit oleic đóng vai trò quan trọngtrong việc chuyển hóa của vi khuẩn, albumin gắn vào các acid béo tự do cóthể gây hại tới một số loài Mycobacterium, dextrose cung cấp năng lượng,catalase tiêu hủy peroxit độc hại

Hỗn hợp kháng sinh PANTA (Polymicin B, Amphotericin B, Naldixicacid, Trimethoprim, Azlocillin) bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm ứcchế sự phát triển của nấm và vi khuẩn không phải Mycobacteria, giảm tỉ lệngoại nhiễm.Việc sử dụng hỗn hợp PANTA là cần thiết cho tất cả các bệnhphẩm từ vị trí không vô trùng nhưng người ta nhận thấy nó cũng có thể có tácdụng ức chế cả một số loại Mycobacteria [43]

Các bệnh phẩm lấy từ đường hô hấp thường bội nhiễm số lượng lớn vikhuẩn thuộc vi hệ Để đảm bảo cho các trực khuẩn kháng cồn kháng axit với

số lượng tương đối ít có thể mọc tốt trong môi trường nuôi cấy, ta cần tối ưuhóa bằng cách làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn thuộc vi hệ đường hô hấptrước khi cấy bệnh phẩm vào ống MGIT, đó chính là bước xử lí bệnh phẩm

Có 3 phương pháp có thể dùng để xử lí bệnh phẩm: phương pháp NaOH; phương pháp NaOH; phương pháp axit oxalic Phương pháp hay đượcdùng hơn cả là NALC-NaOH

NALC-Nguyên lí của phương pháp NALC-NaOH: Natri hydroxit (NaOH) làmột tác nhân khử nhiễm rất độc, đồng thời cũng có tác dụng làm lỏng, làmloãng nhầy Khi sử dụng NaOH cần rất chú ý đến nồng độ vì chất này cũng cóthể ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn lao N-acetyl L-cysteine (NALC) cóthể thủy phân cầu nối disulfua trong các mucoprotein nên có tác dụng làm tannhầy Bản thân NALC không có tác dụng khử nhiễm nhưng khi kết hợp với

NaOH, tác dụng làm loãng nhầy của NALC giúp cho NaOH tiếp xúc đồngđều với các vi khuẩn bội nhiễm từ đó có thể giảm thiểu nồng độ và thời giankhử nhiễm của NaOH Natri citrate có tác dụng cố định các ion kim loại nặng

có mặt trong mẫu gây ức chế hoạt động của NALC NaOH làm loãng nhầyhiệu quả nhất ở nồng độ 2% nhưng nồng độ này cũng gây độc cho cácMycobacteria Chính vì vậy kit thương mại BD BBL MycoPrep pha sẵnNaOH ở nồng độ 2%, khi tiến hành khử nhiễm ta cho dung dịch khử nhiễmvào bệnh phẩm với tỉ lệ 1:1 thì nồng độ NaOH lúc này là 1% và ít gây ảnhhưởng đến Mycobacteria Thời gian xử lí với NaOH không quá 15 phút chođến khi trung hòa bằng đệm phosphate

Mỗi phòng xét nghiệm nên duy trì một sự cân bằng hợp lí giữa việcnuôi cấy dương tính và ống cấy bị tạp nhiễm Tỉ lệ tạp nhiễm quá cao hay quáthấp cũng làm giảm tỉ lệ nuôi cấy dương tính và tăng thời gian trả kết quả.Khi bệnh nhân có dấu hiệu và triệu chứng điển hình của lao mà nuôi cấy âmtính có thể do xử lí quá mạnh, vi khuẩn lao bị giết chết trong quá trình xử lý.Khi có quá nhiều ống cấy bị bội nhiễm vi khuẩn khác chứng tỏ xử lí chưa đủ.Tác dụng của hóa chất xử lí bị ảnh hưởng bởi nồng độ, thời gian tiếp xúc vànhiệt độ, thay đổi bất kì yếu tố nào trong các yếu tố trên đều ảnh hưởng đếnchất lượng xử lí Trong một số trường hợp đặc biệt có thể tăng thể tích hoặcnồng độ hóa chất nhưng không kéo dài thời gian khử nhiễm

Phương pháp khử nhiễm bằng axit oxalic được dùng để xử trí ban đầucho bệnh phẩm của bệnh nhân xơ nang (cystic fibrosis) Phương pháp nàycũng có thể được dùng để xử lí lại những ống nuôi cấy bị bội nhiễm với

Pseudomonas aeruginosa Cần chú ý là phương pháp này chưa được chứng

minh dùng được cho MGIT, nhưng Azlocillin có tác dụng ức chế mạnh

Pseudomonas aeruginosa nên trong trường hợp bội nhiễm có thể tăng lượng

PANTA

Các loại bệnh phẩm yêu cầu phải khử nhiễm trước khi đưa vào cấy baogồm: đờm khạc, đờm hút, dịch rửa phế quản, da và mô mềm, dịch rửa dạ dày,nước tiểu, dịch cổ chướng Các loại bệnh phẩm không cần khử nhiễm trướckhi cấy thường lấy từ các vị trí vô trùng như dịch não tủy, dịch màng tim,mảnh sinh thiết…

Bảng 1.1: Các loại bệnh phẩm và thể tích yêu cầu.

Phải phân loại mẫu trước khi xử lí để có quy trình thích hợp Sau khi

48 giờ, đảm bảo từ khi lấy mẫu đến khi cấy vào môi trường không quá 72 giờ.Dịch dạ dày, nước tiểu xử lí sớm trước 4 giờ kể từ khi lấy mẫu, phải ly tâmloại bỏ pH axit trước khi xử lí

Quá trình ly tâm: trọng lượng riêng của trực khuẩn lao dao động trongkhoảng từ 0.79 đến 1.07, bởi trọng lượng riêng thấp như vậy, nếu lực ly tâmthấp sẽ làm cho vi khuẩn có xu hướng nổi lên hơn là lắng xuống Quá nhiềuchất nhầy trong mẫu cũng làm gia tăng hiện tượng trên Xử lí với NALC sẽ

làm cho vi khuẩn dễ lắng xuống hơn Tốc độ ly tâm phải đạt tối thiểu 3000xg mới là tối ưu, nếu lực g thấp hơn phải ly tâm thời trong thời gian lâu hơn, kéo

dài thời gian ly tâm cũng làm tăng thời gian tiếp xúc với hóa chất xử lí cũng

như tăng nhiệt độ khi không sử dụng máy ly tâm lạnh, đều ảnh hưởng đến sựsống của vi khuẩn lao [44]

Nếu bệnh nhân bị nghi ngờ nhiễm các loại Mycobacteria có nhiệt độ tối

ulcerans yêu cầu 30oC) cần cấy ra 2 tuýp MGIT, một tuýp ủ ở 37oC và một

Wood) Các tuýp MGIT cần được ủ trong thiết bị cho đến khi máy báodương, sau tối đa 6 tuần các tuýp MGIT sẽ đươc máy báo âm, Một số loài như

M ulcerans và M genavense cần thời gian ủ lâu hơn 2- 3 tuần nữa [43], [44]

1.3.2 Thử nghiệm sắc ký miễn dịch định danh MTB.

Trong nhóm những xét nghiệm phát hiện kháng nguyên của M tuberculosis, WHO khuyến cáo nên dùng thử nghiệm sắc ký miễn dịch định

danh vi khuẩn lao ( BD MGIT™ TBc Identification Test) để phát hiện khángnguyên của MTBc từ các tuýp MGIT máy báo dương sau đó nhuộm Ziehl-Neelsen thấy có AFB

Nguyên lý của xét nghiệm: TBcID phát hiện kháng nguyên MPT64,một loại protein trọng lượng phân tử 24 kDa được tiết ra từ các tế bào củaMTBC trong quá trình nuôi cấy Khi nhỏ huyền dịch vi khuẩn trong tuýp cấy

có AFB, kháng nguyên MPT64 nếu có sẽ kết hợp với kháng thể khángMPT64 tạo thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể Nếu trong ống cấy có

đủ kháng nguyên MPT64, vùng phản ứng sẽ xuất hiện vạch màu hồng- đỏ.Thử nghiệm sắc kí miễn dịch là một thử nghiệm đơn giản không cần phải xử

lý mẫu mà chỉ cần nhỏ trực tiếp dung dịch trong tuýp nuôi cấy lên giếng thử,đọc kết quả trong vòng 15 phút, không đọc kết quả sau 60 phút Thử nghiệm

có thể xác định sự có mặt của một trong các loài sau trong MTBC:

M.turbeculosis, M bovis, M africanum, M microti.