Mô bệnh học, hoá mô miễn dịch, đột biến gen braf v600e trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hoá tái phát, di căn

THÔNG TIN TÓM TẮT NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tên đề tài luận án: “Mô bệnh học, hoá mô miễn dịch, đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hoá tái phát, di căn” Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh Mã số: 62720105 Nghiên cứu sinh: Ngô Thị Minh Hạnh Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Trịnh Tuấn Dũng 2. TS. Hoàng Quốc Trường Cơ sở đào tạo: Trường Đại Học Y Hà Nội Những kết luận mới của luận án: Đây là một nghiên cứu cắt ngang mô tả đặc điểm mô bệnh học, hoá mô miễn dịch và tình trạng đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp (UTBMTG) biệt hoá tái phát, di căn thấy tỷ lệ di căn hay gặp nhất tại hạch (90,4%), tái phát tại giường tuyến giáp chiếm 17,7%; thể mô bệnh học gặp nhiều nhất là UTBMTG nhú (96,1%), các dấu ấn Thyroglobulin và Ki67 có giá trị trong chẩn phân biệt biến thể nhú triển triển và biến thể nhú trung gian; tỷ lệ đột biến BRAF V600E là 70,2% và đột biến gen BRAF V600E liên quan đến kích thước u, hay xảy ra trường hợp kháng I131, có mối liên quan với biến thể nhú tế bào cao, xâm nhập xơ mỡ ngoài hạch, chưa thấy có mối liên quan đến tuổi, giai đoạn bệnh, di căn hạch, di căn xa, xâm nhập mạch, hoại tử và đặc điểm canxi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGÔ THỊ MINH HẠNH

MÔ BỆNH HỌC, HÓA MÔ MIỄN DỊCH,

ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E TRONG

UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP BIỆT HÓA TÁI PHÁT, DI CĂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGÔ THỊ MINH HẠNH

MÔ BỆNH HỌC, HÓA MÔ MIỄN DỊCH,

ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E TRONG

UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP BIỆT HÓA TÁI PHÁT, DI CĂN

Chuyên ngành : Giải phẫu bệnh

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là: Ngô Thị Minh Hạnh, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại

học Y Hà Nội, chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Pháp y, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy Trịnh Tuấn Dũng và Hoàng Quốc Trường

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 29 tháng 4 năm 2020

Người viết cam đoan

Ngô Thị Minh Hạnh

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN: Axit deoxyribonucleic

AJCC: (American Joint Committee on Cancer)

Liên Uỷ ban về Ung thư Mỹ Anti-Tg: Kháng thể kháng thyroglobulin

ATA: (American Thyroid Association) Hiệp hội tuyến giáp Mỹ

Chụp xạ hình cắt lớp vi tính đơn photon RT-PCR: (RealTime - Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực

UTBMTG: Ung thư biểu mô tuyến giáp

UTBMTGBH: Ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa

SD: (Standard deviation) Độ lệch chuẩn

TSH: (Thyroid - Stimulating Hormone)

Hormon kích thích tuyến giáp XHTT: Xạ hình toàn thân

WHO: (World Heath Organization) Tổ chức Y tế Thế giới

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 3

1.1.1 Cơ chế tái phát, di căn của ung thư biểu mô tuyến giáp 3

1.1.2 Chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 7

1.2 Mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 11

1.2.1 Mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 11

1.2.2 Hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 18

1.3 Đột biến BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 20

1.3.1 Đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp 20

1.3.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BRAF V600E 24

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 28

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 28

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 31

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35

2.2.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 36

2.3 Các biến số và chỉ số nghiên cứu 36

2.3.1 Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu 36

2.3.2 Đặc điểm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 37

2.3.3 Xác định tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 38

2.4 Kỹ thuật và công cụ thu thập số liệu 40

2.4.1 Đánh giá lâm sàng 40

2.4.2 Xét nghiệm mô bệnh học 42

2.4.3 Xét nghiệm hóa mô miễn dịch 46

2.4.4 Xét nghiệm đột biến gen BRAF V600E bằng phương pháp RealTime-PCR 49

2.5 Xử lý số liệu 55

2.6 Sai số và cách khắc phục sai số 55

2.7 Đạo đức nghiên cứu 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58

3.1 Đặc điểm chung về đối tượng nghiên cứu 58

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 58

3.1.2 Đặc điểm về giới 59

3.1.3 Vị trí tái phát, di căn được phẫu thuật 59

3.1.4 Phân nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa theo nhóm kháng I131 61

3.1.5 Thời gian tái phát, di căn ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa 62

3.1.6 Phân bố giai đoạn TNM và nguy cơ tái phát ở thời điểm u nguyên phát 63

3.2 Đặc điểm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 64

3.2.1 Đặc điểm mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 64

3.2.2 Đặc điểm hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 71

3.3 Tình trạng đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 80

3.3.1 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E 80

3.3.2 Mối liên quan giữa đột biến gen BRAF V600E với một số đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 85

3.3.3 Mối liên quan giữa đột biến BRAF V600E xác định bằng phương pháp Realtime-PCR với đặc điểm mô bệnh học 89

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 92

4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 92

4.1.1 Tuổi và giới 92

4.1.2 Vị trí tái phát, di căn của ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa 93

4.1.3 Phân nhóm bệnh nhân theo nhóm kháng I131 93

4.1.4 Thời gian tái phát, di căn của ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa 94

4.1.5 Đánh giá giai đoạn TNM và nguy cơ tái phát 95

4.2 Đặc điểm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 98

4.2.1 Đặc điểm mô bệnh học 98

4.2.2 Đặc điểm hóa mô miễn dịch 105

4.3 Tình trạng đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 114

4.3.1 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E 114 4.3.2 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E xác định bằng

phương pháp Realtime-PCR với một số đặc điểm lâm sàng,

mô bệnh học 119

4.3.2.1 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E xác định bằng

phương pháp Realtime-PCR với một số đặc điểm lâm sàng 119

4.3.2.2 Mối liên quan đột biến gen BRAF V600E với một số đặc

điểm mô bệnh học 125

KẾT LUẬN 132 KIẾN NGHỊ 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Chẩn đoán giai đoạn TNM của ung thư biểu mô tuyến giáp

biệt hóa theo Liên ủy ban về Ung thư Mỹ năm 2010 40 Bảng 2.2 Chẩn đoán giai đoạn bệnh ung thư biểu mô tuyến giáp biệt

hóa theo Liên ủy ban về Ung thư Mỹ năm 2010 41 Bảng 2.3 Đánh giá nguy cơ tái phát của ung thư biểu mô tuyến giáp

biệt hóa theo Hiệp hội Tuyến giáp Mỹ năm 2009 42 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp biệt

hóa tái phát, di căn 58 Bảng 3.2 Vị trí tái phát, di căn được phẫu thuật 59 Bảng 3.3 Thời gian ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 62 Bảng 3.4 Phân bố giai đoạn TNM và nguy cơ tái phát ở thời điểm u

nguyên phát 63 Bảng 3.5 Các thể mô bệnh học của ung thư biểu mô tuyến giápbiệt hóa

tái phát, di căn 64 Bảng 3.6 Đặc điểm vi thể trong ung thư biểu mô tuyến giápbiệt hóa tái

phát, di căn 65 Bảng 3.7 Mối liên quan các biến thể nhú với các đặc điểm lâm sàng

trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 69 Bảng 3.8 Mối liên quan giữa biến thể nhú với các đặc điểm vi thể trong

ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 70 Bảng 3.9 Biểu lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 71 Bảng 3.10 Biểu lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch trong các biến thể nhú 72 Bảng 3.11 Mức độ và cường độ biểu hiện CK19, Thyroglobulin, TTF1,

HBME1 trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát,

di căn 74

Bảng 3.12 Mức độ và cường độ biểu hiện Ki67 trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 76 Bảng 3.13 Mức độ và cường độ biểu hiện P53 trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 76 Bảng 3.14 Mối liên quan giữa các dấu ấn hóa mô miễn dịch với các biến thể

nhú trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 79

Bảng 3.15 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E xác định bằng phương pháp

Realtime-PCR 80

Bảng 3.16 Tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E xác định bằng phương pháp

hóa mô miễn dịch 80

Bảng 3.17 Mức độ và cường độ biểu lộ BRAF V600E trong ung thư biểu

mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 81 Bảng 3.18 Giá trị phương pháp hóa mô miễn dịch so với Realtime-PCR

phát hiện đột biến gen BRAF V600E 81

Bảng 3.19 Các trường hợp không phù hợp chẩn đoán giữa hai phương

pháp xét nghiệm hóa mô miễn dịch và Realtime-PCR 82

Bảng 3.20 Tỷ lệ đột biến BRAF V600E xác định bằng phương pháp

Realtime-PCR trong các thể mô bệnh học 84

Bảng 3.21 Mối liên quan giữa BRAF V600E với tuổi, giới trong ung thư

biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 85

Bảng 3.22 Mối liên quan giữa BRAF V600E với TNM và giai đoạn bệnh

trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 86

Bảng 3.23 Mối liên quan giữa đột biến BRAF V600E với nguy cơ tái

phát tại thời điểm u nguyên phát 87

Bảng 3.24 Mối liên quan giữa BRAF V600E với di căn xa trong ung thư

biểu mô tuyến giáp biệt hóa 87

Bảng 3.25 Mối liên quan giữa BRAF V600E với nhóm kháng I131 trong

ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 88

Bảng 3.26 Mối liên quan giữa BRAF V600E với biến thể mô bệnh học

trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 89

Bảng 3.27 Mối liên quan giữa BRAF V600E với mẫu cấu trúc trong ung

thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 90

Bảng 3.28 Mối liên quan giữa BRAF V600E với đặc điểm vi thể trong

ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 91 Bảng 4.1 Biểu hiện CK19 trong các nghiên cứu trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa 109 Bảng 4.2 Biểu hiện HBME1 trong các nghiên cứu trong ung thư biểu

mô tuyến giáp biệt hóa 110 Bảng 4.3 Các dấu ấn hóa mô miễn dịch có giá trị trong chẩn đoán ung

thư biểu mô tuyến giáp thể nhú 113

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới 59 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóatheo

nhóm kháng I131 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ các bước di căn, xâm nhập mạch máu 4 Hình 1.2 Cơ chế lý thuyết di căn đông miên 5 Hình 1.3 Cơ chế bắt giữ i-ốt của tế bào tuyến giáp và ức chế dung nạp

i-ốt do đột biến gen BRAF V600E 23

Hình 2.1 Quy trình xét nghiệm mô bệnh học 44 Hình 2.3 Các bước nhuộm hóa mô miễn dịch theo máy BenchMark Ultra 48 Hình 3.1 Hình ảnh mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa

tái phát, di căn 60 Hình 3.2 Hình ảnh mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa

tái phát, di căn (tiếp theo) 61 Hình 3.3 Các biến thể mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến giáp biệt

hóa tái phát, di căn 66 Hình 3.4 Hình ảnh xâm nhập mạch máu trong ung thư biểu mô tuyến

giáp biệt hóa tái phát, di căn 67 Hình 3.5 Hình ảnh hoại tử u trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa

tái phát, di căn 68 Hình 3.6 Hình ảnh xâm nhập xơ mỡ ngoài hạch trong ung thư biểu mô

tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 68 Hình 3.7 Biểu hiện dương tính của các dấu ấn hóa mô miễn dịch 73 Hình 3.8 Hình ảnh mức độ và cường độ biểu hiện Galectin-3 trong ung

thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 75 Hình 3.9 Biểu hiện Ki67 trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái

phát, di căn 77 Hình 3.10 Biểu hiện P53 trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái

phát, di căn 77 Hình 3.11 Hình ảnh mô bệnh học và hóa mô miễn dịch giúp khẳng định

ung thư tuyến giáp thể nhú biến thể tế bào hình thoi di căn hạch 78 Hình 3.12 Hình ảnh Thyroglobulin biểu hiện trong các biến thể của ung

thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn 80 Hình 3.13 Hình ảnh minh hoạ kết quả không phù hợp giữa phương pháp

Realtime-PCR và hóa mô miễn dịch 83

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư biểu mô tuyến giáp (UTBMTG) có xu hướng gia tăng trên toàn cầu Năm 2018, theo số liệu công bố của GLOBOCAN, trên toàn thế giới có 567.000 ca UTBMTG mới mắc và UTBMTG đứng thứ 9 trong các loại ung thư nói chung [1] Ở Mỹ, năm 2014 có 63.000 ca mới mắc UTBMTG so với năm 2010 có 44.670 [2],[3] Ở khu vực Châu Á hiện nay, UTBMTG đang xếp thứ nhất trong các loại ung thư ở Hàn Quốc [1] Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê mới nhất của Chương trình mục tiêu quốc gia phòng chống ung thư năm 2010 - 2014, tỷ lệ mới mắc UTBMTG ở nữ năm 2010 là 821/100.000; năm 2014 số ca mắc mới tăng 3211/100.000 ca [4]

Ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa (UTBMTGBH) bắt nguồn từ các tế bào biểu mô nang tuyến giáp gồm UTBMTG nhú và UTBMTG nang [2] Bệnh có tiên lượng tốt, thời gian sống thêm sau 5 năm trên 90% [2],[5],[6] Tuy nhiên, bệnh có tỷ lệ tái phát, di căn xảy ra 5 - 30% các trường hợp [5],[7] Các bệnh nhân (BN) này thường có tiên lượng xấu, bệnh tồn tại dai dẳng, xâm lấn và di căn nhanh hơn, đặc biệt ở nhóm không đáp ứng với điều trị bằng I131 (kháng I131) [8],[9]

Các nghiên cứu nói nhiều đến vai trò của đột biến gen BRAF V600E

trong UTBMTG Đột biến gen này liên quan đến nguyên nhân sinh bệnh UTBMTG, nguy cơ cao về tiến triển lâm sàng [10],[11] và cơ chế kháng I131

[12] Xác định đột biến gen BRAF V600E dựa vào phương pháp sinh học

phân tử cũng như phương pháp hoá mô miễn dịch (HMMD) với kháng thể (KT) đặc hiệu đột biến (VE1) đã được Cục quản lý Thuốc và Dược phẩm Hoa

Kỳ cấp phép Mỗi phương pháp xét nghiệm phát hiện đột biến gen BRAF

V600E có những ưu nhược điểm riêng nhưng kết quả việc nghiên cứu tình

trạng đột biến gen BRAF V600E đang mở ra hướng điều trị đích cho nhóm

BN tái phát, di căn nhất là nhóm không đáp ứng với điều trị I131

Đột biến gen BRAF V600E có liên quan đến các thể mô bệnh học (MBH),

hay gặp trong UTBMTG nhú Trong UTBMTGBH có nhiều biến thể nhưng trên thực hành các nhà Giải phẫu bệnh (GPB) ít chú trọng đánh giá chi tiết các biến thể MBH Trong khi đó, Hiệp hội Tuyến giáp Hoa Kỳ (American Thyroid Association - ATA) đã đưa một số biến thể MBH tiến triển của UTBMTG như biến thể tế bào cao, biến thể “đinh mũ” (Hobnail) vào trong hướng dẫn đánh giá phân tầng nguy cơ tái phát [9] Trong hầu hết các trường hợp, các nhà GPB dễ dàng xác định thể MBH dựa trên tiêu bản cắt nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) thường quy, nhưng cũng có những trường hợp khó, các nhà GPB phải dựa vào phương pháp HMMD phát hiện kháng nguyên (KN) đặc hiệu của mô u gắn vào KT đã biết để khẳng định sự tái phát, di căn, xác định chính xác thể MBH, mức độ ác tính và sự xâm nhập

Xu hướng tăng sinh UTBMTG trên toàn cầu và những thông tin chi tiết

về các đặc điểm MBH, HMMD cũng như tình trạng đột biến gen BRAF

V600E cho phép các nhà lâm sàng, Y học hạt nhân hiểu biết thêm bệnh học

UTBMTGBH để lựa chọn phương pháp điều trị tối ưu, quản lý, theo dõi và tiên lượng BN được tốt hơn, đặc biệt nhóm BN UTBMTG tái phát, di căn Vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Mô bệnh học, hóa mô miễn dịch, đột biến

gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di

căn” với 2 mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

2 Xác định tỷ lệ đột biến gen BRAF V600E và tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen BRAF V600E với một số đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

1.1.1 Cơ chế tái phát, di căn của ung thư biểu mô tuyến giáp

Di căn là nguyên nhân gây tử vong trong bệnh lý ung thư Hơn 100 năm trước, Paget đã giải thích các thành phần đặc hiệu của mô ung thư di căn Đầu tiên ông đưa ra giả thuyết gieo rắc tế bào ung thư (seed and soil) (dẫn theo [13]) Tác giả suy đoán khả năng di căn xảy ra tùy thuộc vào sự phát triển tự nhiên của khối u nguyên phát và môi trường xung quanh Bốn mươi năm sau, Ewing đưa ra giả thuyết di căn chỉ đơn thuần là do yếu tố mạch máu Các nhà khoa học chấp nhận giả thuyết này cho đến khi thấy điều đó không đúng trong một số trường hợp; không chỉ là do sự khác biệt giữa các tế bào nội mô mạch máu ở các cơ quan khác nhau mà còn do sự tương tác phức tạp giữa vi môi trường của tế bào “cơ quan chủ” và tế bào ung thư [14]

Di căn gồm các giai đoạn và kết quả là cấy ghép các tế bào u đang phát triển vào vị trí, cơ quan khác Mô hình cổ điển của quá trình di căn gồm các bước: các tế bào u tách rời khỏi khối u để xâm nhập mạch máu, theo hệ tuần hoàn vào cơ quan rồi thóat mạch, cuối cùng tăng sinh ở mô đích (Hình 1.1) Sau khi cấy ghép, các tế bào u phát triển và được cung cấp bởi các mạch máu mới và tiếp tục tăng sinh Quá trình đó là giai đoạn muộn của ung thư tiến triển Tuy nhiên, hiện nay có những bằng chứng di căn sớm ở một số loại ung thư hoặc di căn ở giai đoạn muộn hơn nhưng không cần khối u nguyên phát giảm biệt hóa Phức tạp hơn nữa, khi các tế bào u trong lúc lưu hành lại thâm nhập vào chính khối u nguyên phát và tiếp tục tăng sinh tại đó [15] Những nghiên cứu gần đây giải thích thêm về hiện tượng di căn bao gồm di căn đông miên (metastatic dormancy) và các tế bào gốc ung thư (cancer stem cell)

Hình 1.1 Sơ đồ các bước di căn, xâm nhập mạch máu [16]

1.1.1.1 Di căn đông miên

Tình trạng di căn đông miên được xác định khi từng tế bào đơn lẻ hoặc từng đám tế bào ung thư di chuyển đến vị trí xa và tồn tại yên lặng trong suốt một thời gian dài không phát triển [17] UTBMTGBH và UTBMTG tuỷ là 2 thể ác tính của UTBMTG có hiện tượng di căn đông miên phổ biến [18] Nhiều BN sau khi phẫu thuật khối u ác tính nguyên phát nhưng bệnh vẫn tồn tại dai dẳng trong nhiều năm thể hiện xét nghiệm sinh hóa (Tg hoặc anti-Tg cao) trước khi di căn hoặc bệnh tiến triển được khẳng định trên chẩn đoán hình ảnh Trong những trường hợp này, các tế bào di căn có thể đã hiện diện tại thời điểm chẩn đoán nhưng đơn giản là chúng quá nhỏ để phát hiện Hơn nữa, có những BN được khẳng định di căn xa nhưng bệnh ổn định, không phải điều trị thêm trong nhiều năm tiếp theo

Rupert Will (1934), một nhà GBP, người đầu tiên nói tới hiện tượng “tế bào u đông miên” khi mô tả khối u di căn ở giai đoạn muộn trong những trường hợp bệnh không tái phát tại chỗ sau khi đã loại bỏ khối ung thư nguyên phát (dẫn theo [19]) Di căn đông miên trên lâm sàng được xác định sau khi lấy bỏ khối u nguyên phát và đã hòan thành điều trị, thời gian sống thêm dài hơn dự kiến bệnh tiến triển di căn Hiện tượng này xuất hiện phổ biến trong các loại như ung thư vú, thận, tiền liệt tuyến, u hắc tố, u lympho B

và UTBMTGBH [20] Hiện tượng đông miên trên lâm sàng được nói đến trong nhiều năm trước trong khi “tế bào u đông miên” mới được đánh giá trong những năm gần đây nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực miễn dịch học, sự chia tách tế bào, kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) Các tế bào ung thư duy trì đông miên trong môi trường vi

di căn như thế nào? Cơ chế này gồm có sự tác động vật lý, chất đệm ngoài tế bào (ECM - exetracellular matrix), con đường tín hiệu gen sinh ung thư, yếu

tố ức chế di căn, tăng sinh mạch và miễn dịch

Hình 1.2 Cơ chế lý thuyết di căn đông miên [21]

1.1.1.2 Các tế bào gốc ung thư

Một khái niệm quan trọng khác có thể liên quan đến di căn đông miên là ung thư có thể bắt nguồn từ các tế bào gốc đa năng Khi các tế bào này gieo rắc đến vị trí di căn xa, chúng có thể vẫn nằm im trong giai đoạn yên lặng và

tỷ lệ tăng sinh chậm cho đến khi được kích thích bởi vi môi trường của chúng hoặc các yếu tố thứ phát khác [19]

Các tế bào gốc là những tế bào không biệt hóa, có khả năng tự tăng sinh không giới hạn và biệt hóa thành tất cả các dòng tế bào Các tế bào gốc ung thư là một nhóm tế bào ung thư có đặc tính tự tăng sinh với khả năng biệt hóa thành các loại tế bào u và di căn [22] Trái với các tế bào u biệt hóa, các tế bào gốc ung thư tương đối yên lặng, tỷ lệ lưu hành thấp và thường tồn tại trong môi trường riêng của tế bào gốc, có vai trò điều hòa sự biệt hóa và tự tăng sinh tế bào gốc [23] Môi trường của tế bào gốc bao gồm các loại tế bào khác nhau của mô đệm, tế bào trung mô và các tế bào miễn dịch, chất đệm ngoài tế bào và các yếu tố hòa tan Những tế bào mô đệm duy trì các tế bào gốc ở trạng thái yên lặng và điều hòa tự tăng sinh và biệt hóa theo một số con đường tín hiệu

Các tế bào phát sinh ung thư tuyến giáp từ thời kỳ bào thai gồm các tế bào gốc tuyến giáp (thyroid stem cell), nguyên bào tuyến giáp (thyroblast) và

tế bào tiền tuyến giáp (prethyrocyte) Các tế bào gốc ung thư tuyến giáp có chức năng quan trọng trong cơ chế gây tiến triển ác tính, kháng điều trị và tái phát Todaro và cộng sự đã tách các tế bào gốc ung thư tuyến giáp từ ung thư tuyến giáp nguyên phát và thấy hay gặp nhất ở UTBMTG không biệt hóa (5%), UTBMTG nhú (2%) và UTBMTG nang (1 - 2%) [24] Mặc dù còn tranh luận nhưng tế bào gốc ung thư được coi là sự khởi phát và di căn ung thư

1.1.2 Chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

1.1.2.1 Triệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng thường nghèo nàn, ít có giá trị:

- BN có thể sờ thấy hạch vùng cổ hoặc khối sưng ở vùng cổ phát triển nhanh, đau vùng cổ bắt đầu từ vùng trước cổ và đôi khi lan đến tai, đau lưng hay đau nhức xương, khó thở hoặc nuốt khó khăn, khàn tiếng, ho liên tục

- Các triệu chứng tái phát sớm có thể không biểu hiện trên lâm sàng Vì thế, BN nên được theo dõi thường xuyên bằng khám lâm sàng, xét nghiệm máu Tg huyết thanh, xạ hình toàn thân (XHTT), các xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh như siêu âm, chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp cộng hưởng từ (MRI)

1.1.2.2 Xét nghiệm Tg huyết thanh

Tg là một protein được sản xuất từ các tế bào biểu mô nang tuyến giáp

Sự tồn tại Tg chứng tỏ còn hoạt động chức năng của mô tuyến giáp Đối với những BN đã phẫu thuật cắt toàn bộ tuyến giáp và xoá mô giáp việc xuất hiện

Tg tăng được coi là một trong những dấu hiệu bệnh tái phát, di căn

Xét nghiệm Tg thường được định lượng định kỳ theo thời gian sau phẫu thuật tuyến giáp và trị liệu bằng I131 ≥ 3 tuần để đánh giá hiệu quả điều trị Nếu đã loại bỏ hết mô ung thư, Tg sớm giảm về gần mức 0 và duy trì ở mức

độ bình thường hay vẫn còn sót mô ung thư (lượng Tg ở mức vừa phải) [25] Trong quá trình theo dõi, cứ 6 - 12 tháng, BN được xét nghiệm Tg huyết thanh Việc định lượng Tg thường xuyên hơn ở những BN có yếu tố nguy cơ cao hoặc khi có bất cứ sự nghi ngờ biểu hiện tái phát, di căn [9]

1.1.2.3 Xét nghiệm anti-Tg

Bình thường anti-Tg < 4 IU/mL ở tất cả các lứa tuổi Sự xuất hiện kháng thể kháng Tg có thể xảy ra khoảng 25% ở những BN ung thư tuyến giáp và 10% ở quần thể [26] Anti-Tg không nguy hại nhưng khi tăng cao sẽ làm sai lệch giá trị thật của Tg Định lượng anti-Tg sau phẫu thuật tuyến giáp hoặc sau khi điều trị xoá mô giáp có ý nghĩa bởi vì mức anti-Tg tăng cao có thể dự

báo khả năng tái phát ở BN không có viêm tuyến giáp mạn tính [26]

1.1.2.4 Siêu âm

Siêu âm vùng cổ sử dụng đầu dò có tần số cao (≥ 10 MHz) có độ nhạy cao để phát hiện hạch cổ di căn ở BN UTBMTGBH Siêu âm vùng cổ nên được khảo sát tất cả các nhóm hạch và giường tuyến giáp Siêu âm vùng cổ có thể phát hiện hạch N1 nhỏ (đường kính 2 - 3 mm) trong nhóm BN Tg huyết thanh thấp hoặc âm tính [27] Tuy nhiên, siêu âm không phân biệt được tổn thương tái phát ở giường tuyến giáp với khối nhân lành tính hay hạch nhóm

VI Siêu âm hướng dẫn cho chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (Fine Needle Aspiration - FNA) cho kết quả chính xác hơn, đặc biệt những trường hợp hạch nhỏ và hạch nằm ở vị trí sâu

1.1.2.5 Chụp xạ hình i-ốt phóng xạ toàn thân

Chụp XHTT chẩn đoán có thể được chỉ định chủ yếu trong 3 tình huống trên lâm sàng: (i): BN có bắt i-ốt bất thường ngoài giường tuyến giáp trên XHTT sau điều trị, (ii) khi mô giáp còn nhiều sau phẫu thuật sẽ bắt giữ nhiều i-ốt (> 2%) và gây khó khăn cho việc phát hiện hạch cổ di căn, (iii) BN có kháng thể anti-Tg nguy cơ gây Tg âm tính giả, ngay cả khi siêu âm vùng cổ không thấy bất kỳ dấu hiệu nào nghi ngờ Chụp XHTT là phương pháp phát hiện di căn xa tốt nhất ở BN UTBMTGBH sau phẫu thuật cắt toàn bộ tuyến giáp [28] Do hạn chế xác định các mốc giải phẫu trên hình ảnh xạ hình thường nên khó phân biệt bắt i-ốt ở mô giáp còn lại hay di căn (đặc biệt khi

mô giáp còn lại nhiều), di căn phổi hay bắt xạ ở xương sườn SPECT/CT cho phép ghi hình chuyển hóa chức năng và hình ảnh giải phẫu, cho phép phát hiện những tổn thương không bắt i-ốt

PET (Position Emission Tomography) là một công cụ chẩn đoán có trị trong chẩn đoán ung thư vì PET ghi lại hình ảnh định tính và định lượng quá

trình sinh bệnh lý thông qua dược chất phóng xạ được đánh dấu Kết quả chụp PET/CT có thể thay đổi chỉ định cho điều trị I131 hoặc quyết định phẫu thuật cắt bỏ những tổn thương nhỏ bắt 18FDG (18F-2-fluro-deoxy-D-glucose) Siêu

âm vùng cổ cho độ nhạy cao hơn trong việc phát hiện những hạch nhỏ di căn còn PET có độ nhạy cao hơn trong việc phát hiện vị trí tổn thương vùng sau hầu hoặc sau xương đòn [9] Hiện nay, PET/CT được chỉ định trong những trường hợp UTBMTGBH có Tg cao (> 10 ng/mL) và XHTT âm tính [8],[9]

1.1.2.7 Chụp cắt lớp vi tính và cộng hưởng từ

Những BN có mức Tg và anti-Tg tăng dần (> 10ng/mL), siêu âm hạch cổ

và chụp XHTT với I131 âm tính được chỉ định chụp CT [9] Chụp CT và chụp MRI vùng cổ-ngực được chỉ định trong trường hợp: (i) có sự di căn nhiều hạch và kích thước lớn mà siêu âm không khảo sát hết được sự xâm lấn xung quanh, (ii) trường hợp bệnh tái phát nghi ngờ xâm nhập đường thở và tiêu hóa, (iii) khi nghi ngờ di căn hạch cổ với Tg cao mà siêu âm không phát hiện được MRI hỗ trợ chẩn đoán di căn vùng cổ và trung thất Hình ảnh MRI cho phép xác định các tổn thương liên quan đến đường thở, đường tiêu hóa hay

mô mềm [29] MRI có độ nhạy thấp hơn CT để phát hiện những nốt tổn thương nhỏ ở phổi

1.1.2.8 Xét nghiệm chọc hút tế bào bằng kim nhỏ

Phương pháp xét nghiệm FNA được Giáo sư Nguyễn Vượng (1972) thực hiện đầu tiên ở Việt Nam trong chẩn đoán một số bệnh thường gặp trong đó

có UTBMTG Xét nghiệm FNA giảm bớt nguy cơ phẫu thuật ở một số BN nghi ngờ tái phát, di căn trên chẩn đoán hình ảnh Kết hợp FNA dưới hướng dẫn siêu âm là một phương pháp được lựa chọn để khẳng định tái phát, di căn sau phẫu thuật ung thư tuyến giáp Các nghiên cứu đã báo cáo độ nhạy của phương pháp này lên đến 100% và độ đặc hiệu gần 90% [30]

1.1.2.9 Tiêu chuẩn chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát,

di căn

UTBMTG phát triển từ mô tuyến giáp và ngay sau khi kết thúc điều trị khối u có thể phát triển trở lại Tái phát được xác định dựa trên bằng chứng về lâm sàng, kết quả sinh hóa và/hoặc chẩn đoán hình ảnh Vị trí tái phát có thể được chia thành tái phát ở giường tuyến giáp (tái phát tại chỗ) (local recurrence) hoặc tái phát hạch hay mô mềm (tái phát vùng) (regional recurrence) và di căn xa (distant metastasis) [31]

Trong nghiên cứu của Coburn, tái phát được xem là tại chỗ nếu các tế bào u phát triển ở giường tuyến giáp; tái phát vùng nếu di căn hạch cổ và di căn xa nếu các tế bào u phát triển ngoài hạch và ngoài giường tuyến giáp Tái phát được xác định khi phát hiện tổn thương mới trên xạ hình hoặc tăng giữ bắt I131 so với lần chụp trước khi không phát hiện tổn thương bằng thăm khám lâm sàng và phim chụp Xquang [32]

Nghiên cứu của Frasoldati chẩn đoán tái phát hạch cổ trong UTBMTGBH khi hạch nghi ngờ trên siêu âm được khẳng định di căn bằng kết quả xét nghiệm tế bào học hoặc MBH ở những BN mà trước đó đã được xem là không còn khối u tồn dư sau khi phẫu thuật tuyến giáp và điều trị xoá

mô giáp còn lại [33]

Nghiên cứu của Moo Tracy-Ann, UTBMTG nhú tuyến giáp sau phẫu thuật cắt toàn bộ tuyến giáp và không có bằng chứng di căn hạch trên lâm sàng cũng như hình ảnh siêu âm, bệnh tái phát được xác định khi Tg hoặc anti-Tg tăng; có bằng chứng trên chẩn đoán hình ảnh (siêu âm, CT hoặc XHTT) hoặc kết quả GPB khẳng định ác tính [34]

Nghiên cứu của Mazzaferri đưa tiêu chuẩn tái phát bao gồm: (i) khi có bằng chứng sinh thiết khẳng định ác tính ở những BN đã được đánh giá khỏi bệnh trên lâm sàng 6 tháng sau điều trị I131 lần đầu, (ii) bắt I131 ở vị trí di căn

xa và vị trí vùng cổ ngoài giường tuyến giáp mà trước đó không bắt I131 [7]

Theo tiêu chuẩn của Liên uỷ ban Mỹ về ung thư (American Joint Committee on Cancer - AJCC) năm 2017 đánh giá di căn hạch, di căn xa và giai đoạn bệnh ở BN UTBMTG nguyên phát chỉ hoàn thành sau khi chụp XHTT với I131, thông thường mất từ 1 - 3 tháng sau phẫu thuật Do đó, bệnh tái phát, di căn được xác định (bằng bất kỳ phương pháp nào) ngoài 4 tháng sau phẫu thuật tuyến giáp [35]

Một số BN được xem như là khỏi bệnh nếu chỉ khám lâm sàng không còn khối u trong khi những BN khác bắt buộc dựa trên chẩn đoán hình ảnh Định lượng Tg huyết thanh được thực hiện thường quy ở hầu hết BN nhưng không

sử dụng khẳng định tái phát, di căn trừ khi phát hiện tổn thương trên các phương pháp chẩn đoán hình ảnh hoặc sinh thiết

1.2 Mô bệnh học và hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

1.2.1 Mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

Phân loại MBH tổn thương tuyến giáp theo Tổ chức Y tế thế giới (World Heath Organization - WHO) được áp dụng rộng rãi Năm 1964, lần đầu tiên WHO đưa ra phân loại MBH các u tuyến giáp và chính thức xuất bản vào năm 1974 với 5 thể MBH đơn giản: UTBMTG nhú, UTBMTG nang, UTBMTG tuỷ, UTBMTG không biệt hóa và UTBMTG vảy Đến năm 1988, bảng phân loại này sửa đổi chi tiết hơn gồm có UTBMTG nang xâm nhập tối thiểu và xâm nhập rộng Sau vài lần sửa đổi cho phù hợp với tiến triển và tiên lượng, bảng phân loại mới hiện đang được áp dụng là bảng phân loại của WHO năm 2004 Sự ra đời của phân loại UTBMTG của WHO 2004 đã đáp ứng cơ bản nhu cầu xác định chẩn đoán nhưng còn một số vấn đề cần làm sáng tỏ Phân loại mới nhất của WHO năm 2017 bổ sung thêm một số biến

thể mới của UTBMTG nhú và liên quan đặc điểm MBH với sinh học phân tử Xâm nhập mạch và xâm nhập vỏ vẫn là tiêu chuẩn chính trong chẩn đoán UTBMTG nang nhưng được phân loại chi tiết hơn Điều quan trọng không phải phân loại UTBMTG nhú hay UTBMTG nang mà thay vào đó cần phải

chú ý những đặc điểm hình thái kém biệt hóa [36]

Phân loại ung thư biểu mô tuyến giáp thể biệt hóa theo WHO 2017 [37]

v UTBMTG nhú

• Ung thư nhú thể thông thường 8260/3

• Ung thư nhú biến thể nang 8340/3

• Ung thư nhú biến thể có vỏ 8343/3

• Ung thư biểu mô vi nhú 8341/3

• Ung thư nhú biến thể tế bào trụ 8344/3

• Ung thư nhú biến thể tế bào ưa axit 8342/3

• Ung thư nhú biến thể tế bào cao

• Ung thư nhú biến thể dạng sàng - phôi dâu

• Ung thư nhú có thành phần mô đệm dạng viêm xơ/ cân cục

• Ung thư nhú biến thể giống Warthin

• Ung thư nhú biến thể tế bào sáng

• Ung thư nhú biến thể đặc/bè

• Ung thư nhú biến thể xơ hóa

• Ung thư nhú biến thể tế bào “đinh mũ”

• Ung thư nhú biến thể tế bào hình thoi

v UTBMTG nang

• Ung thư nang xâm nhập tối thiểu 8330/3

• Ung thư nang có vỏ xâm nhập mạch máu 8339/3

• Ung thư nang xâm nhập rộng 8330/3

1.2.1.1 Ung thư biểu mô nhú tuyến giáp

UTBMTG nhú là u biểu mô ác tính biệt hóa từ tế bào biểu mô nang tuyến giáp và có những đặc trưng riêng về nhân Hai đặc điểm đặc trưng của UTBMTG nhú là cấu trúc nhú và đặc tính nhân

- Cấu trúc nhú: nhú được hình thành bởi lõi xơ mạch và phủ ngoài bởi

các tế bào biểu mô u Nhú phát triển kéo dài và chia nhánh phức tạp hay xếp dạng song song hoặc tập hợp thành đám Trục nhú thường được tạo bởi mô liên kết thưa và mạch máu thành mỏng

- Đặc điểm nhân: có ý nghĩa xác định chẩn đoán hơn cấu trúc nhú

+ Đặc điểm quan trọng nhất là thay đổi viền nhân rõ ràng tách biệt với bào tương và màng nhân không đều, có vết lõm, có khía hay nếp gấp, tạo hình ảnh giả thể vùi hoặc hình bao tay

+ Đặc điểm thứ hai của nhân là hình ảnh “nhân rỗng”, mất hoàn toàn chất nhiễm sắc Biểu hiện bên trong của màng nhân dày bất thường do ép dẹt chất nhiễm sắc về phía màng nhân, có hình ảnh “mắt trẻ mồ côi” hay “rổ trứng”

a Ung thư nhú biến thể vi ung thư nhú

Vi ung thư nhú khi u có kích thước < 1cm U được bao xung quanh bởi

mô xơ và có hình dạng giống sẹo Hầu hết các tế bào u xếp hình nang hoặc thể đặc nằm trong vùng mô xơ hóa nhiều, đôi khi có hình nhú rõ

b Ung thư nhú biến thể có vỏ

Biến thể có vỏ là trường hợp u có vỏ xơ nguyên vẹn bao quanh hoặc xâm nhập thành ổ Chẩn đoán phân biệt với u tuyến thể nang có thành phần tăng sản nhú là thiếu đặc điểm nhân thể nhú Biến thể này có tiên lượng tốt, di căn hạch vùng có thể gặp nhưng hiếm di căn xương, tỷ lệ sống gần 100%

c Ung thư nhú biến thể nang

Phân loại biến thể này khi UTBMTG nhú có thành phần nang chiếm gần toàn bộ khối u (nhiều hơn thành phần nhú) Mật độ mạch máu trong

UTBMTG thể biến thể nang cao hơn UTBMTG nang và u tuyến nang [38] Biến thể này hiếm khi có các nang giãn mà chủ yếu là tăng sản dạng nốt

d Ung thư nhú biến thể bè/đặc

Chẩn đoán biến thể này khi toàn bộ hoặc gần như toàn bộ u không thuộc bất kỳ biến thể nào khác có thành phần đặc và/hoặc bè Dấu hiệu nhận biết quan trọng khi có sự hiện diện của các bè xơ hyaline hóa hoặc bè xơ bất thường bên trong khối u Biến thể này cần phân biệt với thể kém biệt hóa nhưng thiếu đặc điểm nhân thể nhú và/hoặc hoại tử u hoặc nhân chia cao

e Ung thư nhú biến thể xơ hóa lan toả

Khối u tuyến giáp lớn, lan toả, chắc đặc tương tự như viêm tuyến giáp Riedel Ngoài những đặc điểm của thể nhú thông thường biến thể này có các đặc điểm sau: tổn thương lan toả một hoặc cả hai thuỳ, hình thành nhiều nhú nhỏ nằm trong các khoảng rộng như là mạch bạch huyết, nhiều vùng dị sản vảy, thể cát kích thước lớn, thâm nhiễm nhiều tế bào viêm, xơ hóa

f Ung thư nhú biến thể tế bào ưa axit

Biến thể tế bào ưa axit có đặc điểm nhân thể nhú và bào tương ưa axit Biến thể này có dạng nhú, dạng đặc, dạng nang tuyến hoặc bè hay kết hợp hai hoặc nhiều thể Chẩn đoán phân biệt (đặc biệt u có thành phần nang) với u thể nang tế bào ưa axit lành tính và ác tính và cũng cần phân biệt với biến thể tế bào cao của ung thư thể nhú

g Ung thư nhú biến thể giống u Warthin

Biến thể này giống u Warthin của tuyến nước bọt, có ranh giới rõ nhưng hiếm khi có vỏ Biến thể giống u Warthin liên quan với biến thể ưa axit về đặc điểm gen Tiên lượng tương tự như thể nhú thông thường

h Ung thư nhú biến thể tế bào cao

Chẩn đoán biến thể này khi chiều cao tế bào gấp 2 - 3 lần chiều rộng tế bào và thành phần tế bào cao chiếm > 30% khối u Thành phần nhú phát triển

thường kéo dài, giống dây và đám nối nhau Những tế bào u thường có bào tương ưa toan nhưng chưa đến mức như đặc điểm tế bào ưa axit

i Ung thư nhú biến thể tế bào trụ

Biến thể này có đặc điểm nhân phân tầng nhưng nhân không rõ đặc điểm thể nhú thông thường Bào tương có không bào sáng dưới nhân tương tự như

tế bào nội mạc tử cung chế tiết

j Ung thư nhú biến thể dạng sàng/biến thể phôi dâu

Đây là biến thể mới trong phân loại UTBMTG Khối u thường có vỏ, biểu hiện hỗn hợp dạng sàng, dạng nang, thể bè và thành phần đặc với cấu trúc dạng vảy hình tròn giống phôi dâu Vùng dạng sàng có các dây tế bào nối với nhau không có mô đệm xen vào Các bè tế bào u tương tự như u tuyến thể

bè hyalin hóa Biến thể liên quan đột biến gen theo con đường Wnt/β-catenin

k Ung thư nhú biến thể tế bào “đinh mũ” (Hobnail)

Biến thể này được chẩn đoán khi có đặc điểm tế bào “đinh mũ” > 30% Cấu trúc nhú hoặc vi nhú được phủ bởi các tế bào biểu mô nang tuyến giáp có bào tương ưa toan, hạt nhân ưu thế, giảm độ gắn kết tế bào Hoại tử, nhân chia, xâm nhập mạch, xâm nhập ngoài tuyến giáp thường thấy

l Ung thư nhú với mô đệm giống viêm cân cục/xơ hóa

Biến thể này hiếm gặp, có thành phần mô đệm giàu tế bào tương tự như viêm cân cục, viêm xơ hoặc biểu hiện nguyên bào xơ cơ tăng sinh

m Ung thư nhú biến thể tế bào sáng

Biến thể này hiếm gặp và thường kết hợp với tế bào ưa axit Cần phân biến thể này với UTBMTG thể tuỷ tế bào sáng, tăng sinh tuyến cận giáp và di căn ung thư biểu mô tế bào thận Các dấu ấn HMMD như TTF1, EMA, Chomogranin, Synap, PAX8 có thể giúp chẩn đoán phân biệt

n Ung thư nhú biến thể tế bào hình thoi

UTBMTG nhú có thể gặp dị sản tế bào hình thoi với tỷ lệ < 5% đến 95%

khối u Các tế bào hình thoi không liên quan đến chảy máu và không có dạng hình bản đồ Cần phân biệt biến thể này với UTBMTG giảm biệt hóa có thành phần tế bào hình thoi với đặc điểm không có hoại tử và nhân chia

1.2.1.2 Ung thư biểu mô tuyến giáp nang

UTBMTG nang là khối u ác tính xuất phát từ tế bào biểu mô nang tuyến giáp không có đặc điểm nhân thể nhú và không thuộc bất kỳ loại ung thư đặc biệt khác của tuyến giáp Khối u này thường có vỏ và xâm nhập Chẩn đoán

ác tính phụ thuộc vào tình trạng xâm nhập mạch và xâm nhập vỏ

- Thể xâm nhập tối thiểu

Xâm nhập vỏ khi có các đám tế bào u phát triển ra phía ngoài nằm trong lớp vỏ xơ nguyên vẹn Hình ảnh các đám tế bào u lan rộng vào lớp vỏ tạo dạng “nấm” Các tế bào u có thể xâm nhập xuyên qua lớp vỏ, thường không xâm nhập vào nhu mô xung quanh, thay vào đó hình thành vỏ xơ mới tạo hình ảnh “quả tạ” giống như khối u được chia làm hai phần bởi vách xơ Các ổ xâm nhập vỏ cần phân biệt với vỏ bị đứt rách do FNA, thay đổi xơ trong mô đệm, chảy máu mới và cũ [38]

- Thể xâm nhập mạch

Xâm nhập mạch được xác định khi các tế bào u gắn vào thành mạch hoặc được phủ bởi nội mô, hoặc có huyết tắc, hoặc tơ huyết Các mạch máu được đánh giá ở bên trong vỏ u hoặc ngay sát bên ngoài vỏ u hơn là bên trong khối u Các tế bào u phát triển lồi vào trong lòng mạch giống huyết tắc có thể bít tắc một phần hay hoàn toàn lòng mạch Các khối u có đặc điểm xâm nhập mạch giới hạn (< 4 mạch) có tiên lượng tốt hơn với những u có xâm nhập mạch nhiều

- Thể xâm nhập rộng

Như tên gọi, khối u này phát triển xâm nhập ở mức đại thể và vi thể Thể này có xâm nhập mạch chiếm ưu thế và nếu chỉ có xâm nhập mạch thì không

chẩn đoán là xâm nhập rộng Về hình ảnh MBH khối u có thành phần tương

tự như UTBMTG nang xâm nhập tối thiểu nhưng có tỷ lệ nhân chia cao, nhân tăng sắc và hoại tử Những trường hợp xâm nhập rộng thường kèm theo di căn xa (chủ yếu di căn phổi, di căn xương nhưng cũng di căn não và gan)

* Các biến thể ung thư biểu mô tuyến giáp nang

- Biến thể tế bào sáng: thành phần tế bào sáng > 50% khối u Bào tương

sáng do tích trữ glycogen, lipid, chất nhầy và thyroglobulin hoặc có thể do giãn hoặc tăng ty lạp thể hoặc bộ Golgi Chẩn đoán phân biệt với di căn tế bào

sáng của thận, UTBMTG tuỷ và UTBMTG nhú

- UTBMTG nang có thành phần tế bào nhẫn với bào tương chứa đầy chất nhầy, hoặc khoang nhầy trong mô đệm liên kết Chẩn đoán phân biệt với

ung thư biểu mô tuyến di căn từ cơ quan khác

- UTBMTG nang có thành phần dạng cầu thận khi các tế bào biểu mô nang cuộn xung quanh nang giống cầu thận

- UTBMTG nang với các tế bào dạng thoi

Trong hướng dẫn phân loại giai đoạn bệnh mới nhất UTBMTG của Liên

uỷ ban Mỹ về ung thư (American Joint Committee on Cancer - AJCC) năm

2017, các thể MBH của UTBMTG được chia làm 4 thể chính Trong đó, đáng lưu ý đến các biến thể tiến triển của UTBMTG nhú gồm có biến thể tế bào và biến thể đảo là những biến thể của UTBMTGBH [35]:

- UTBMTG nhú (gồm các biến thể của UTBMTG nhú)

- UTBMTG nang (gồm UTBMTG tế bào ái toan)

- UTBMTG tuỷ

- UTBMTG không biệt hóa (UTBMTG giảm biệt hóa)

Trong hướng dẫn quản lý và điều trị BN UTBMTG của ATA năm 2015, các biến thể tiến triển của UTBMTG nhú gồm có biến thể tế bào cao, biến thể

tế bào “đinh mũ”, biến thể tế bào trụ được đưa vào tiêu chí đánh giá mức độ

nguy cơ tái phát sau phẫu thuật [9] Khi có những biến thể này, phân loại nguy cơ tái phát được xếp loại cao hơn và do đó hướng dẫn các phương pháp theo dõi chặt chẽ hơn cũng như điều trị triệt để hơn

1.2.2 Hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

Dựa trên hình thái MBH nhuộm HE thường quy, các nhà GPB có thể khẳng định được chẩn đoán khối u tuyến giáp, nhưng khi thực hành, do tính chất khối u cũng như quá trình xử lý bệnh phẩm mà đặc điểm nhân của UTBMTG nhú bị thay đổi UTBMTG nhú biến thể nang có thể rất khó chẩn đoán khi các tế bào u thiếu đặc điểm nhân thể nhú và cấu trúc nhú không rõ ràng UTBMTG nhú biến thể tế bào ưa axit vẫn còn tranh cãi Hầu hết những trường hợp này biểu hiện các nang bất thường chứa chất keo sẫm màu ái toan

mà nhân có những đặc điểm thể nhú nhưng bị mờ nhạt do tế bào ưa axit biến đổi tăng chất nhiễm sắc và hạt nhân ưu thế [39] Nhiều trường hợp các nhà GPB khó phân biệt UTBMTGBH hay kém biệt hóa nhất là những trường hợp tái phát, di căn cũng như đánh giá tình trạng xâm nhập Chính vì vậy, các nhà GPB cần dựa thêm công cụ hỗ trợ là HMMD

1.2.2.1 Nguyên lý của phương pháp hóa mô miễn dịch

HMMD là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, phát hiện KN đặc hiệu trên lát cắt mô nhờ gắn KT Khi phủ KT đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có KN cần tìm sẽ xảy ra phản ứng kết hợp KN-KT Ba thành phần chính tham gia vào quá trình phản ứng và nhận biết trong HMMD là KN (mô học), KT (miễn dịch học), hệ thống nhận biết (hóa học) [40],[41]

- Kháng nguyên: KN thường có bản chất là protein hoặc lipid,

carbonhydrat nằm trên màng tế bào, trong bào tương hoặc trong nhân tế bào Mỗi KN đều có những vị trí nhất định tiếp xúc với KT gọi epitope (quyết định KN) Một KN có thể có nhiều epitope Mỗi một epitope được nhận biết bởi

một KT riêng biệt

- Kháng thể: KT là protein nhận biết, bản chất là immunoglobulin, được

hình thành do tương bào sản xuất khi tiếp nhận KN ngoại lai trong đáp ứng miễn dịch dịch thể Mỗi KT gồm 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ và ít nhất có 2

vị trí gắn với KN Có 5 loại KT nhưng chỉ IgG và IgM được sử dụng trong HMMD

- Hệ thống nhận biết: phức hợp KN-KT không quan sát được dưới kính

hiển vi quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng KN-KT

Có 2 cách để quan sát phức hợp này:

+ Miễn dịch huỳnh quang: KT đặc hiệu gắn trực tiếp hoặc gián tiếp với chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

+ Miễn dịch enzym: Cho KT đặc hiệu gắn trực tiếp hoặc gián tiếp (qua

KT phụ) với một loại enzym (Peroxidase hoặc Alkaline phosphatase) và chất gắn màu (Chromogen), quan sát dưới kính hiển vi quang học

1.2.2.2 Ứng dụng của hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái phát, di căn

- HMMD có giá trị để xác định nguồn gốc các tế bào nang tuyến giáp để củng cố thêm cho chẩn đoán ung thư như đồng thời xác định nguồn gốc tuyến giáp nhất là trường hợp ung thư không biệt hóa hay tái phát, di căn dựa vào các dấu ấn TTF1, Thyroglobulin, PAX8

- Chẩn đoán phân biệt khối u tuyến giáp lành hay ác tính dựa trên phân tích đặc điểm bắt màu của các dấu ấn hóa mô có giá trị trong tuyến giáp như Galectin-3, CD56, HBME1…

- Chẩn đoán mức độ ác tính của u như tăng chỉ số tăng sinh nhân, mất bộc lộ của Bcl-2, bộc lộ của P53

- Các dấu ấn HMMD liên quan đến chức năng chuyển hóa của nang

tuyến giáp biểu hiện ở vị trí khác nhau của màng tế bào như màng đáy, màng bên, màng đỉnh có ý nghĩa tiên lượng khả năng vận chuyển i-ốt như NIS…

- Xác định các UTBMTG vi xâm nhập, phân biệt với tổn thương thâm nhiễm giả xâm nhập cũng như xác định các vi di căn dựa vào CK, CKAE1/AE3, CK19, CK7, CK8

- Xác định tình trạng đột biến gen BRAF V600E thông qua KT BRAF

V600E (VE1) đặc hiệu phát hiện đột biến

1.3 Đột biến BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp biệt hóa tái

phát, di căn

1.3.1 Đột biến gen BRAF V600E trong ung thư biểu mô tuyến giáp

Năm 2002, Davies đã khảo sát mức độ đột biến gen BRAF trên nhiều

dòng tế bào ung thư khác nhau ở người; kết quả phát hiện 3 đột biến khác nhau Hai đột biến trên exon 15: T1799A dẫn đến việc thay thế valine bằng glutamic ở vị trí 600 (V600E) đối với ung thư da ác tính dòng tế bào Colo-

829 và đột biến C1786G biến đổi L596V trong ung thư phổi không tế bào nhỏ dòng tế bào NCI-H2087 Ngoài ra, đột biến điểm trên exon 11 của gen

BRAF, G1403C cũng được phát hiện trong ung thư phổi không phải loại tế

bào nhỏ dòng tế bào NCI-H1395 [10]

Gen BRAF (B-type Raf kinase) nằm trên nhiễm sắc thể số 7 với vùng

mang mã chứa 18 exon, kích thước 2478 bp mã hóa cho protein gồm 766 amino acid có trọng lượng phân tử 84436 Dalton Đột biến vị trí T1799A trên

trình tự gen BRAF làm tăng hoạt tính enzyme kinase và hoạt hóa con đường

(Growth Factor: GF), rồi đi vào nhân tế bào sẽ khởi đầu cho một loạt các phản ứng dây chuyền qua các protein thuộc con đường tín hiệu MAPK bên trong tế bào bao gồm RAS-RAF-MEK-ERK Qua con đường này RAS được cho là để thúc đẩy sự thay đổi về khung và hình dạng tế bào, sự kết dính và di chuyển tế bào [42] Trong hoạt tính chuyển dạng của các gen sinh ung thư nguồn gốc virus (v-oncogen) thì RAS và RAF là chìa khóa và chính RAF là yếu tố hiệu ứng đầu tiên được xác định của dòng tín hiệu được hoạt hóa từ RAS RAF có 3 đồng dạng protein là A-RAF, B-RAF và C-RAF BRAF là đồng dạng chính ở các tế bào nang giáp Mặc dù tất cả các đồng dạng RAF đều hoạt hóa MEK nhưng chúng được hoạt hóa một cách khác nhau bởi RAS Theo Peyssonnaux và cộng sự thì BRAF có ái tính cao hơn với MEK và có nhiều khả năng phosphoryl hóa MEK hơn các đồng dạng RAF khác [43]

Đột biến T1799A ban đầu có tên là T1796A, dựa vào trình tự nucleotide của ngân hàng gen NCBI (NCBI - The National Center for Biotechnology Information - GenBank nucleotide sequence) NM_004333 được xác định thiếu một codon (3 nucleotid) trong 1 exon của gen BRAF Phiên bản chính xác của trình tự nucleotide ngân hàng gen NCBI là NT 007914 và hiện giờ

đột biến gen BRAF được xác định đột biến điểm T1799A

Hoạt hóa gen BRAF trong UTBMTG được báo cáo lần đầu tiên vào năm

2003 và các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh đột biến BRAF V600E liên quan với UTBMTG nhú [44] Đột biến gen BRAF V600E có tốc độ sinh

trưởng nhanh hơn nhiều lần so với dòng tế bào tuyến giáp kiểu dại (wild-type),

cho rằng đột biến BRAF có vai trò như một gen gây ung thư

Đột biến BRAF V600E xuất hiện trong UTBMTG gồm UTBMTG nhú,

UTBMTG kém biệt hóa và giảm biệt hóa tiến triển từ UTBMTG nhú [45]

Đột biến BRAF K601E và đột biến hiếm gặp khác với BRAF V600E thường

chỉ được báo cáo trong UTBMTG nhú biến thể nang [46]

BRAF V600E đóng vai trò quan trọng không chỉ gây UTBMTG mà còn

có vai trò thúc đẩy sự xâm nhập và tiến triển Xâm nhập trong UTBMTG nhú

liên quan với sự chuyển đổi Đột biến BRAF V600E liên quan đến sửa chữa

mô đệm ngoài tế bào, điều hòa ngược việc gắn kết tế bào và thay đổi độ đặc chắc khối u, chuyển đổi biểu mô - trung mô trong suốt quá trình UTBMTG

nhú có đột biến BRAF V600E thành UTBMTG kém biệt hóa [47]

Nhiều nghiên cứu cho thấy mối liên quan đột biến với lâm sàng tiến triển

và tiên lượng kém Ở những BN UTBMTG tái phát, di căn, việc điều trị chủ yếu vẫn bằng i-ốt phóng xạ Tuy nhiên, một số các tế bào UTBMTG có thể mất đi khả năng bắt i-ốt Đây là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến

thất bại trong điều trị bằng i-ốt phóng xạ UTBMTG nhú có đột biến BRAF

V600E liên quan đến việc giảm biểu hiện tổng hợp hormon tuyến giáp (ví dụ

thyroid peroxidase và thyroglobulin) và giảm biểu hiện NIS (sodium-iodide symporter) NIS có vai trò quan trọng trong tổng hợp hormon tuyến giáp nhờ

vận chuyển i-ốt vào tế bào nang tuyến giáp [48] BRAF V600E có thể gây mất

biệt hóa tế bào khiến khối u trở nên kháng trị i-ốt và điều này được khẳng

định rõ ràng những trường hợp UTBMTG kháng i-ốt có tỷ lệ đột biến BRAF

V600E cao [49] Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra sự khôi phục khả năng

bắt i-ốt của tế bào UTBMTG đã kháng với điều trị I131 với mức độ khác nhau khi điều trị bằng các thuốc nhắm trúng đích [50]

* Những biến đổi di truyền làm thay đổi cơ chế bắt giữ i-ốt của tế bào nang tuyến giáp

Chức năng đặc biệt quan trọng của tế bào nang tuyến giáp là sử dụng i-ốt

để tổng hợp hormon tuyến giáp (Hình 1.5) I-ốt được vận chuyển vào bên trong tế bào qua protein NIS (sodium-iodide symporter) Tại đỉnh màng tế bào biểu mô nang tuyến giáp, protein pendrin vận chuyển i-ốt ra khỏi nang tuyến giáp I-ốt được oxi hóa bởi TPO và chúng liên kết với tyrosine của

thyroglobulin, sau đó được cắt bởi thủy phân protein để tạo thành hormon tuyến giáp Quá trình tổng hợp hormon tuyến giáp được tăng điều hòa bởi TSH hoạt hóa gián tiếp TSHR Đây là nguyên lý cơ bản sử dụng i-ốt phóng

xạ trong điều trị UTBMTG Tuy vậy, cơ chế bắt giữ i-ốt bị phá vỡ trong các trường hợp UTBMTG tiến triển khiến việc điều trị i-ốt kém hiệu quả Hoạt hóa bất thường của con đường truyền tín hiệu MAPK là nguyên nhân làm

thay đổi cơ chế bắt giữ i-ốt của tế bào nang tuyến giáp Đột biến BRAF

V600E, thông qua việc kích hoạt con đường truyền tín hiệu MAPK trong

UTBMTG, làm ức chế sự biểu hiện của các gen đặc hiệu cho chức năng của tuyến giáp và làm mất cơ chế dung nạp i-ốt của tế bào tuyến giáp Hậu quả là

I- chỉ được dung nạp một phần trong các tế bào tuyến giáp có mang đột biến

BRAF V600E và i-ốt được tích lũy thưa thớt trong lòng nang tuyến giáp

Hình 1.3 Cơ chế bắt giữ i-ốt của tế bào tuyến giáp và ức chế dung nạp

i-ốt do đột biến gen BRAF V600E [12]

1.3.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BRAF V600E

Nhiều phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định đột biến gen trên cơ sở tỷ lệ tế bào ung thư trong mô phân tích Hầu hết các phương pháp phát hiện đột biến đều dựa trên phản ứng PCR nhưng phần lớn các kỹ thuật PCR tự nó không thể phát hiện được đột biến thực sự Thay vào đó, PCR chỉ đơn thuần khuếch đại gen thành rất nhiều bản sao, sau đó, được phân tích bằng một số phương pháp khác để tìm ra các đột biến có thể xảy ra trong

bộ khuếch đại, chẳng hạn có thể kể đến các kỹ thuật Amplification refractory mutation system (ARMS-PCR), quantitative fluorescent PCR (QF-PCR) hay

multiplex ligation-dependent probe ampification (MLPA)…

1.3.2.1 Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS)

Kỹ thuật Scorpions ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng Realtime PCR để phát hiện các đột biến Nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chỉ khuếch đại hòan chỉnh 1 phân tử ADN một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hòan toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hòan toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn ADN (độ nhạy phát hiện 1%) [51] Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một đầu dò Fluorophore phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn với quencher có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu của fluorophore Trong phản ứng PCR khi đầu dò bám với đoạn trình tự khuếch đại, Fluorophore được giải

phóng khỏi quencher, phát tín hiệu đến cảm biến của máy PCR (RT-PCR)

Realtime-1.3.2.2 Kỹ thuật khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực (Realtime-PCR)

Ứng dụng công nghệ RT-PCR cho phép định lượng các sản phẩm khuếch đại của gen sau mỗi chu kì gia nhiệt nhờ việc ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với sản phẩm khuếch đại mà thiết bị phát hiện được RT-PCR sử dụng SyberGreen hiện là kỹ thuật có độ nhạy cao để xác định lượng ADN đích có trong mẫu sinh học Cobas® 4800 cũng dựa trên nguyên

lý này, khuếch đại PCR ADN đích bằng cách sử dụng một cặp mồi bổ sung

và hai đoạn đầu dò oligonucleotide được đánh dấu bằng các thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau Một đoạn dò được thiết kế nhằm phát hiện trình tự

gen BRAF V600E thể dại và một đoạn dò được thiết kế nhằm phát hiện trình

tự đột biến V600E Hai mẫu ngoại kiểm được cung cấp và alen thể dại đóng vai trò như một mẫu chứng nội toàn quy trình

1.3.2.3 Kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết hợp Blocker (Allele specific blocker Realtime PCR)

Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên việc thiết kế các nucleotide ở đầu tận cùng 3' của mồi xuôi hoặc mồi ngược sử dụng trong phản ứng PCR, các nucleotide này được thiết kế sao cho chúng bắt cặp đặc hiệu với nucleotide bị biến đổi trên trình tự ADN bị đột biến Như vậy, phản ứng khuếch đại gen sẽ không xảy ra trên sợi ADN khuôn kiểu dại do đầu 3' của đoạn mồi không bắt cặp “mismatch” với sợi ADN khuôn và do quá trình kéo dài chuỗi ADN dưới

sự xúc tác của enzyme Taq polymerase bị cản trở Tuy nhiên, do thực tế vẫn xảy ra phản ứng khuếch đại gen không mang đột biến nên một blocker (oligonucleotide) được thiết kế để bắt cặp bổ sung với sợi khuôn AND kiểu

dại và tại đầu 3’của chúng được gắn thêm gốc 3’phosphate Kết quả, phản ứng khuếch đại gen chỉ nhân đoạn gen mang đột biến mà không nhân các đoạn gen kiểu dại (do sợi khuôn ADN kiểu dại đã bị chặn một phần hoặc hòan toàn bởi trình tự oligonucleotide Blocker) Việc kết hợp kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen, RT-PCR với Blocker (ASB RealTimePCR, Allele-Specific Blocker RealTime PCR) cho phép phát hiện chính xác các đột biến thể soma trong mẫu mô với số lượng tế bào u ≥10% [52]

1.3.2.4 Kỹ thuật Realtime PCR kết hợp với các blocker loại PNA, XNA

Để phát hiện các ADN đột biến trong một quần thể các alen kiểu dại đòi hỏi các kỹ thuật cao hơn, phụ trợ cho phản ứng Realtime PCR (RT-PCR) Sử dụng cùng phản ứng RT-PCR có thêm các acid nucleic peptide (PNA) hoặc các xenonucleiacid (XNA) kẹp và liên kết với các trình tự ADN thể dại nhưng liên kết với thể đột biến có nghĩa là ức chế khuếch đại phản ứng PCR của các alen kiểu dại mà không can thiệp vào quá trình khuếch đại ADN thể đột biến Các đầu dò huỳnh quang, hoặc sybrgren của phản ứng RT-PCR sẽ nhận biết phản ứng PCR có diễn ra hay không, thể đột biến có hay không? XNA là các oligome phân tích acid nucleic cải tiến, ghép cặp với các trình tự ADN, XNA liên kết chặt chẽ với trình tự kiểu dại bổ sung 100% và ngăn chặn ADN polymerase khỏi sự kéo dài ADN, chỉ chuỗi có dạng đột biến được khuếch đại

vì XNA Việc sử dụng PNA, XNA được báo cáo là tăng độ nhạy so với chỉ sử dụng đơn thuần RT-PCR TaqMan thông thường lên đến 96% Phản ứng RT-PCR có PNA, XNA có độ nhạy cao đối với sinh thiết lỏng và khối nến đúc parrafin Giới hạn phát hiện (LoD) có thể đạt tới mức thấp 0,1%, sử dụng 5 ng ctADN [53]

1.3.2.5 Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện đột biến gen BRAF V600E sử dụng đầu dò thuỷ phân kép, bộ sinh phẩm THDNA-RT64

Thành phần của bộ sinh phẩm xác định đột biến gen BRAF V600E gồm