ẢNH HƯỞNG của THỜI GIAN ủ NOÃN TRƯỚC ICSI đến kết QUẢ THỤ TINH và CHẤT LƯỢNG PHÔI

BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ươngBTĐN : Buồng trứng đa nang CCs : Corona cells: Tế bào vành tia CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tươngCOC : Cumulus Oocyte Co

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa hoc:

PGS TS Nguyễn Khang Sơn

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Đảng ủy, ban giám hiệu, phòng quản lý đào tạo sau đại học, Bộ môn

Mô phôi thai học trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi chotôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường và bộ môn

- Đảng ủy, ban giám đốc, phòng Nghiên cứu khoa học, Trung tâm Hỗtrợ sinh sản Quốc gia - bệnh viện Phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện để tôithực hiện luận văn này

- Tập thể lãnh đạo, cán bộ, nhân viện Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốcgia - bệnh viện Phụ sản Trung ương đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ cho tôitrong quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Khang Sơn, là

người Thầy đã truyền đạt kiến thức, niềm say mê học tập, sát sao và tận tìnhchỉ bảo tôi trong toàn bộ quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đề cương

và Hội đồng chấm luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến vô cùng quý báu trongquá trình thực hiện luận văn này

Đặc biệt tôi xin kính trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ba mẹ tôi,chồng và các con tôi, và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, độngviên tôi học tập, phấn đấu và trưởng thành trong cuộc sống và sự nghiệp

Xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2016

Tôi là Đặng Thu Hằng học viên lớp Cao học khóa XXIII, Trường Đạihọc Y Hà Nội, chuyên ngành Mô phôi thai học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa PGS TS Nguyễn Khang Sơn

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2015

Đặng Thu Hằng

BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ương

BTĐN : Buồng trứng đa nang

CCs : Corona cells: Tế bào vành tia

CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tươngCOC : Cumulus Oocyte Complex: Phức hợp noãn - tế bào nangFSH : Follicle-stimulating Hormone: Hormone kích thích nang noãnGCs : Granulosa cells: Tế bào hạt

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone

(Hormone giải phóng gonadotropin)

Gran : Granularity: Độ mịn của bào tương

GV : Germinal Vesicle: Nang mầm

GVBD : Germinal Vesicle Break Down: Nang mầm tiêu biến

hCG : Human Chorionic Gonadotropin: Hormone rau thai ngườiICM : Inner Cell Mass: Khối tế bào nội phôi

ICSI : Intra-cytoplasmic Sperm Injection:

(Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn)

Incls : Inclusion hay refractile body: Thể vùi

IVF : In-vitro Fertillization: Thụ tinh trong ống nghiệm

KTBT : Kích thích buồng trứng

LH : Luteinizing Hormone: Hormone hoàng thể hóa

LNMTC : Lạc nội mạc tử cung

MI : Metaphase I: Kỳ giữa giảm phân I

MII : Metaphase II: Kỳ giữa giảm phân II

NP : Non – progressive Motility: Di động không tiến tới

NPB : Nucleolar Precursor Body: Thể hạt nhân

NST : Nhiễm sắc thể

PB : Polar Body: Thể cực

PM : Post mature: Quá trưởng thành

PN : Pro Nuclear: Tiền nhân

PR : Progressive motility: Di động tiến tới

TB : Tế bào

TE : Trophectoderm: Nguyên bào lá nuôi

TTTON : Thụ tinh trong ống nghiệm

VS : Vô sinh

VAC : Vacuole: Không bào

ZP : Zona pellucida: Màng trong suốt

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI 3

1.1.1 Sự hình thành của noãn 3

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn 5

1.2 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Các bước tiến hành trong TTTON 7

1.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN 9

1.3.1 Đánh giá phức hợp noãn - tế bào nang 9

1.3.2 Đánh giá chất lượng noãn 10

1.4 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TTTON 16

1.4.1 Đánh giá hợp tử 16

1.4.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 19

1.5 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN 19

1.5.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI 19

1.5.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 20

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI 20

1.5.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.3 CÁC CHỈ SỐ, BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 33

2.3.1 Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu 33

2.3.2 Các chỉ số về chất lượng noãn, kết quả thụ tinh và phân loại phôi.34 2.4 KHỐNG CHẾ SAI SỐ TRONG NGHIÊN CỨU 34

2.5 CÁC TIÊU CHUẨN CỦA NGHIÊN CỨU 35

2.5.1 Các chỉ số tinh dịch đồ bình thường 35

2.5.2 Đánh giá chất lượng của noãn 35

2.5.3 Đánh giá thụ tinh và hợp tử 37

2.5.4 Đánh giá chất lượng phôi 37

2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 38

2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 38

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 39

3.1.2 Đặc điểm về tinh dịch đồ 40

3.1.3 Thời điểm chọc hút noãn 40

3.1.4 Số noãn thu được sau tách noãn 41

3.1.5 Mức độ trưởng thành noãn 41

3.1.6 Đặc điểm hình thái noãn 42

3.1.7 Kết quả thụ tinh 44

3.1.8 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi 44

3.2 SO SÁNH CHẤT LƯỢNG NOÃN CỦA BA NHÓM NGHIÊN CỨU .45 3.2.1 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 45

3.2.2 Đặc điểm hình dạng và kích thước noãn 47

3.2.3 Đặc điểm về hình thái noãn 49

3.3 SO SÁNH KẾT QUẢ THỤ TINH CỦA BA NHÓM NGHIÊN CỨU 59

3.4 SO SÁNH CHẤT LƯỢNG PHÔI CỦA 3 NHÓM NGHIÊN CỨU 63

3.4.1 Tỷ lệ tạo phôi 63

3.4.2 Chất lượng phôi 64

Chương 4: BÀN LUẬN 68

4.1 BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 68

4.2 BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 70

4.2.1 Tuổi vợ 70

4.2.2 Đặc điểm về tinh dịch đồ 71

4.2.3 Thời điểm chọc hút noãn 71

4.2.4 Số noãn được nghiên cứu 71

4.2.5 Tỷ lệ noãn trưởng thành và một số yếu tố liên quan 72

4.3 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN CHẤT LƯỢNG NOÃN 74

4.3.1 Mức độ trưởng thành noãn 74

4.3.2 Đặc điểm hình thái của noãn 76

4.4 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN KHẢ NĂNG THỤ TINH 80

4.4.1 Kết quả thụ tinh chung 80

4.4.2 Kết quả thụ tinh theo nhóm 81

4.5 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN CHẤT LƯỢNG PHÔI 84

KẾT LUẬN 88

KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn tinh dịch đồ theo WHO 2010 35

Bảng 2.2 Tiêu chuẩn phân loại noãn 36

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá thụ tinh 37

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi 39

Bảng 3.2 Tinh dịch đồ 40

Bảng 3.3 Thời điểm chọc hút noãn (OR) sau tiêm hCG 40

Bảng 3.4 Số noãn thu được sau tách noãn 41

Bảng 3.5 Mức độ trưởng thành noãn 41

Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái noãn 42

Bảng 3.7 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 45

Bảng 3.8 Đặc điểm về hình dạng và kích thước của noãn 47

Bảng 3.9 Đặc điểm về hình thái noãn theo nhóm 49

Bảng 3.10 Đặc điểm độ mịn bào tương theo nhóm 57

Bảng 3.11 Đặc điểm khoang quanh noãn hẹp theo nhóm 58

Bảng 3.12 Đặc điểm thể cực thứ nhất phân mảnh theo nhóm 58

Bảng 3.13 Kết quả thụ tinh theo nhóm 59

Bảng 3.14 Phân loại hợp tử Z1-Z4 theo nhóm 60

Bảng 3.15 Tỷ lệ tạo phôi theo nhóm 63

Bảng 3.16 Chất lượng phôi theo nhóm 64

Biểu đồ 3.1 Kết quả thụ tinh chung 44

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ tạo phôi 44

Biểu đồ 3.3 Phân loại phôi 45

Biểu đồ 4.1 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 75

Biểu đồ 4.2 Kết quả thụ tinh theo nhóm 81

Biểu đồ 4.3 Kết quả thụ tinh và chất lượng phôi theo nhóm 85

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn 4

Hình 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm 8

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn 10

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau 11

Hình 1.5 Hình dạng noãn 11

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương 12

Hình 1.7 Không bào 13

Hình 1.8 Lưới nội bào 14

Hình 1.9 Thể vùi 14

Hình 1.10 Thể cực 15

Hình 1.11 Màng trong suốt 16

Hình 1.12 Hợp tử 16

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score 18

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score 18

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 2.2 Đĩa tách noãn 28

Hình 2.3 Đĩa test 29

Hình 2.4 Đĩa ICSI 29

Hình 2.5 Trắc vi vật kính 32

Hình 3.1 Hình ảnh noãn GV, MI, MII của bệnh nhân nghiên cứu 46

Hình 3.2 Noãn của BN Nguyễn Thị T, x250 47

Hình 3.3 Noãn bầu dục của BN Phạm Thị G, x250 48

Hình 3.4 Noãn khổng lồ của BN Đỗ Thị Thủy, x250 48

Hình 3.5 Noãn của BN Nguyễn Thị T, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 51

Hình 3.6 Noãn của BN Nguyễn Thị D, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 52

Hình 3.9 Noãn của BN Lê Thị H, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 53

Hình 3.10 Noãn của BN Lê Thị Trà M, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 54

Hình 3.11 Noãn của BN Nguyễn Thị Đ, ủ 2,5 giờ trước ICSI, x250 54

Hình 3.12 Noãn của BN Trương Thị N, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 55

Hình 3.13 Noãn của BN Trương Thị N, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 55

Hình 3.14 Noãn của BN Lê Thị Tra M, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 56

Hình 3.15 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Lê Thị H, ủ noãn 2,5 giờ trước ICSI, x250 61

Hình 3.16 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Nguyễn Thị N, ủ noãn 2,5 giờ và 3,5 giờ trước ICSI, x250 62

Hình 3.17 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Dương Thị A, ủ noãn 2,5 giờ trước ICSI, x250 62 Hình 3.18 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 2,5h, x120.65 Hình 3.19 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 3,5h, x120.66 Hình 3.20 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 4,5h, x120.67

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh là một vấn đề mang tính thời sự hiện nay Các dữ liệu thu đượccho thấy khoảng 30-40% các trường hợp vô sinh do nguyên nhân nam giớiđơn thuần, 40% do nữ giới, 10% do nguyên nhân kết hợp cả nam và nữ và10% là không rõ nguyên nhân [1]

Hơn 30 năm qua, thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) đã gặt hái rấtnhiều thành công trong điều trị vô sinh Tuy nhiên, tỷ lệ thành công củaTTTON với nguyên nhân do chồng thấp hơn so với trường hợp tinh trùngchồng bình thường Nhiều cố gắng nhằm cải thiện tỷ lệ thụ tinh cho nhữngtrường hợp tinh trùng yếu đã được thử nghiệm Kỹ thuật tiêm tinh trùng vàobào tương noãn (ICSI) đã ra đời vào những năm đầu thập niên 90 Với kỹthuật này, các nhà khoa học có thể tạo ra phôi mà chỉ cần một noãn trưởngthành với duy nhất một tinh trùng được lựa chọn tốt nhất về mặt hình tháicũng như khả năng di động ICSI đã mang lại niềm hy vọng và cơ hội lớn chocác cặp vợ chồng vô sinh mà nguyên nhân như chất lượng tinh trùng kém,thậm chí không xuất tinh được, kháng thể kháng tinh trùng, hoặc số lượngnoãn ít, chất lượng kém, hay IVF thất bại mặc dù kết quả tinh dịch đồ bìnhthường Cho đến nay kỹ thuật ICSI đã không ngừng được cải tiến và chiếm tỷ

lệ cao trong các chu kỳ hỗ trợ sinh sản.

ICSI là kỹ thuật vi thao tác được thực hiện trong phòng nuôi cấy đãđược chuẩn hóa hoàn toàn tuy nhiên không có tiêu chuẩn chung về thời gian ủnoãn trước khi thực hiện kỹ thuật ICSI Trong kỹ thuật IVF cổ điển các nhànghiên cứu đã chứng minh được rằng thời gian ủ noãn từ 2-6 giờ trước khiIVF làm cải thiện kết quả thụ tinh và tỷ lệ có thai lâm sàng [2],[3],[4],[5].Trên thế giới, đã có 9 nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của thời gian làmICSI lên kết quả thụ tinh ống nghiệm đã được báo cáo với những kết luận

không giống nhau Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này đượcthực hiện Mặc dù các nghiên cứu đã chứng minh rằng thời gian ủ noãn trong

tủ cấy sau khi chọc hút trứng đến khi làm ICSI làm cải thiện tỷ lệ noãn trưởngthành [10],[11], tỷ lệ thụ tinh [6],[11],[12],[13],[14], và chất lượng phôi [6],[11] Thời gian này kéo dài 9-11h trước khi ICSI được cho là có ảnh hưởngxấu đến chất lượng phôi [7] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại cho rằngkhông có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh [7],[8],[9],[10] cũng như kết quả cóthai [7],[11]

Về lý thuyết, một số vấn đề có thể liên quan đến thời gian làm ICSI.Trong qui trình TTTON, trứng được chọc hút ra trước khi phóng noãn Theomột số báo cáo, noãn trước khi phóng noãn không hoàn toàn trưởng thành mặc

dù đã xuất hiện thể cực đầu tiên, nó được gọi là bào tương chưa trưởng thành[15],[16] Trong các chu kỳ kích thích buồng trứng thì sự trưởng thành của bàotương không đồng đều với sự trưởng thành của nhân [17],[18] Vì vậy thời gian

ủ noãn trước khi ICSI có thể giúp bào tương trưởng thành từ đó có thể làm tăng

tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt cũng như tỷ lệ có thai lâm sàng Hơn nữa, Balakier

và các cộng sự [16] đã kết luận rằng noãn người không ngừng trưởng thành vàhoàn thiện khả năng hoạt hóa trong giai đoạn nghỉ ở MII Hiện nay các trungtâm hỗ trợ sinh sản trong nước thực hiện kỹ thuật ICSI tại các thời điểm khácnhau và chưa có bằng chứng cụ thể chứng minh thời điểm nào là tối ưu Chính

vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Ảnh hưởng của thời gian ủ noãn trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi” trên những bệnh nhân

thụ tinh trong ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia – Bệnh việnPhụ sản Trung Ương với mục tiêu:

Đánh giá mối liên quan giữa thời gian ủ noãn trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI

Sự phát triển của noãn là một từ dùng để diễn tả sự hình thành, sự lớnlên và sự trưởng thành của noãn

1.1.1 Sự hình thành của noãn

Là quá trình diễn ra từ lúc bắt đầu hình thành noãn nguyên bào tới khihình thành noãn bào 1 Quá trình hình thành noãn kết thúc khi trẻ ra đời, saukhi kết thúc không một noãn nào được tạo thêm nữa, đây là điểm khác biệtvới quá trình tạo tinh trùng được tạo ra trong suốt cuộc đời người đàn ông

 Noãn nguyên bào

Noãn nguyên bào là tế bào đầu dòng của dòng noãn, phát sinh từ những

tế bào sinh dục nguyên thủy Sau khi hình thành, một số noãn nguyên bào biệthóa thành noãn bào 1 Ở buồng trứng thai 7 tháng, đại đa số noãn nguyên bàobiến mất do thoái triển hoặc biệt hóa thành noãn bào 1 Khi trẻ ra đời, nhữngnoãn nguyên bào hoàn toàn không thấy trong buồng trứng, chỉ có noãn bào 1

 Noãn bào 1

Từ tháng thứ 3- 5 của thai kỳ, noãn nguyên bào bắt đầu quá trình giảmphân, nhưng dừng lại ở cuối kỳ đầu của lần phân chia thứ nhất, tạo thành noãnbào 1, còn gọi là noãn sơ cấp giai đoạn GV (Germinal Vesicle) chứa bộ NST2n kép, màng nhân vẫn còn Từ khi sinh ra tới trước khi dậy thì, buồng trứng

bé gái chỉ chứa toàn noãn GV Tới khi có đỉnh LH đầu tiên lúc bắt đầu dậy thì,noãn bào 1 mới tiếp tục quá trình phân chia để tạo thành noãn bào 2

Quá trình giảm phân trong noãn rất dài, gồm có hai pha (giảm phân 1

và giảm phân 2) và có hai giai đoạn nghỉ Giai đoạn nghỉ thứ nhất dài hay

ngắn tùy từng noãn bào 1, ngắn nhất là đến tuổi dậy thì và dài nhất là tới khimãn kinh Giai đoạn nghỉ thứ 2 từ khi hình thành noãn bào 2 đến khi noãnđược thụ tinh [19],[20].

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn

(nguồn: http://www.huecrei.com )

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn

Cùng với sự phát triển của nang noãn, noãn bào 1 tăng trưởng về kíchthước, cho tới giai đoạn nang noãn có hốc điển hình, noãn bào 1 đạt kíchthước 120µm thì ngừng tăng trưởng Cơ sở cho sự tăng trưởng là hoạt độngtổng hợp tích cực ARN, protein của nhân, sự tích lũy các bào quan như: hạt

vỏ, ty thể, ribosome…nhằm chuẩn bị cho noãn có khả năng thụ tinh và sựphát triển làm tổ của phôi sau này

Sau khi có đỉnh LH, noãn bào 1 chứa trong nang noãn chín (nang deGraff) mới bắt đầu quá trình trưởng thành, bao gồm sự trưởng thành về nhân vàbào tương noãn Sự trưởng thành về nhân và bào tương phải diễn ra đồng bộ mớiđảm bảo khả năng thụ tinh của noãn, cũng như phát triển của phôi sau này

 Sự trưởng thành của nhân

Sự trưởng thành của nhân khởi động quá trình giảm phân tiếp tục củanoãn bào 1 Các sự kiện chính diễn ra trong quá trình trưởng thành của nhânbao gồm: sự vỡ màng nhân GV giải phóng bộ NST vào bào tương, tạo thànhthoi vô sắc, sự tập hợp và phân ly của NST, phân chia không đồng đều củabào tương

Noãn bào 1 hoàn thành lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân,

bộ NST được chia đôi, kết quả sinh ra 2 tế bào chứa bộ NST đơn bội: 1 tế bàolớn chứa phần lớn bào tương và toàn bộ bào quan có chức năng sinh dục,được gọi là noãn bào 2 hay noãn MII; 1 tế bào nhỏ gọi là thể cực thứ nhất,còn gọi là cực cầu 1 Noãn bào 2 tiếp tục quá trình phân bào giảm nhiễmnhưng dừng lại ở biến kỳ 2 cho đến khi được thụ tinh, quá trình giảm phânmới hoàn thành, giải phóng ra cực cầu thứ 2 [21],[22]

 Sự trưởng thành về bào tương

Sự trưởng thành của bào tương thể hiện trong việc thay đổi và sắp xếplại của một số bào quan trong bào tương noãn như: bộ khung tế bào, lớp hạt

vỏ, lưới nội bào; tổng hợp và điều chỉnh protein và ARN thông tin, tái hoạthóa các phản ứng hóa sinh và phản ứng phân tử nhằm cung cấp chất liệu cầnthiết cho thụ tinh, sự phát triển và làm tổ của phôi.

Các sự kiện diễn ra trong nhân trong quá trình giảm phân phụ thuộc vàotính toàn vẹn và sự thay đổi mạnh mẽ của khung xương tế bào (cytoskeleton).Trong quá trình phân bào, các ống siêu vi rời khỏi vỏ tế bào, ngắn lại tạo thànhthoi vô sắc Thoi vô sắc tạo thành trong quá trình phân chia của noãn có hình tháikhác so với thoi vô sắc hình thành trong các quá trình phân chia khác, nó khôngkéo tới đầu xa của tế bào tạo thành sự định vị lệch tâm của thoi vô sắc, kết quảdẫn đến sự phân chia không đồng đều của bào tương [21],[22]

Trong quá trình trưởng thành, các hạt vỏ (cortical granules) được tíchlũy, di chuyển đến dưới vỏ noãn bào, và ở tại vị trí này cho đến khi quá trìnhthụ tinh xảy ra Các hạt vỏ có vai trò quan trọng trong việc ngăn cản hiệntượng đa thụ tinh nhờ việc làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi có mộttinh trùng xâm nhập được qua màng Sự di chuyển của các hạt vỏ là một trongcác sự kiện lớn nhất của quá trình trưởng thành của noãn Một số nghiên cứuchỉ ra việc phân tích độ phân tán của các hạt vỏ có thể đánh giá được chấtlượng noãn, ví dụ như những noãn có bất thường thoi vô sắc đều không thấy

sự di chuyển cuả các hạt vỏ như những noãn MII bình thường khác [21],[23]

Hình thái, số lượng và kích thước các ty thể khác nhau qua các giai đoạnphát triển của noãn Ty thể chứa DNA khác với DNA ở nhân, đồng thời sảnxuất năng lượng cho hoạt động của tế bào Ở giai đoạn noãn GV, ty thể có sốlượng ít, nhỏ hơn các giai đoạn khác, và thường có hình tròn Ở noãn trưởngthành, ty thể tăng số lượng, kéo dài, tập trung ở vùng trung tâm của tế bào [23]

Lưới nội bào trong tế bào cũng có sự biến đổi lớn Sự thay đổi về cấutrúc, kích thước và phân bố của hệ lưới nội bào có liên quan đến khả năng giảiphóng ion canxi nhằm hoạt hóa noãn trong quá trình thụ tinh Noãn ở giai

đoạn GV chủ yếu chỉ quan sát thấy số lượng ít lưới nội bào có hình túi nhỏ,trong khi đến giai đoạn sau tăng về số lượng và hình thái, thấy cả những lướinội bào hình ống, lưới nội bào phồng lên ở vùng chu vi của noãn [23].

 Vai trò của nang trứng và trưởng thành của noãn

Sự trưởng thành của noãn có liên quan chặt chẽ với sự phát triển củanang trứng chứa nó Noãn tăng kích thước cùng với sự phát triển của nangnoãn, nhưng chỉ những noãn chứa trong nang noãn chín mới có thể tiếp tụcquá trình giảm phân

Dịch nang chứa các yếu tố vi môi trường cung cấp cho quá trình tăngtrưởng của noãn Tế bào hạt đáp ứng với các kích thích hormone được biệthóa về hình thái và chức năng, qua đó có vai trò quan trọng trong sự trưởngthành của noãn Tế bào hạt bao quanh noãn thông qua các liên kết khe cungcấp cho noãn các chất dinh dưỡng, truyền tín hiệu hóa học và phân tử điềuchỉnh quá trình trưởng thành của noãn: một là duy trì tình trạng ngừng phânbào của noãn trong suốt thời kỳ phát triển của nang noãn, hai là khởi độngquá trình phân bào giảm nhiễm của noãn ở nang noãn chín, ba là hỗ trợ cho sựtrưởng thành của các bào quan trong noãn [22],[24],[25]

1.2 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1.2.1 Định nghĩa

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF – In vitro fertilization): là chọc hútmột hay nhiều noãn đã trưởng thành từ buồng trứng, cho thụ tinh với tinhtrùng (đã được lọc rửa) trong ống nghiệm Sau khi noãn thụ tinh phát triểnthành phôi, chuyển phôi tốt vào buồng tử cung để phôi làm tổ và phát triểnthành thai nhi [26],[27]

1.2.2 Các bước tiến hành trong TTTON

Một chu kỳ TTTON bao gồm: Kích thích buồng trứng, chọc hút lấytrứng ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấythành phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung

Có 3 phác đồ kích thích buồng trứng thường được sử dụng: Phác đồdài, phác đồ ngắn và phác đồ sử dụng GnRH đối vận (GnRH antagonist).

Từ ngày thứ 8 - 13 của FSH, chỉ định cho thuốc phóng noãn (thường dùnghCG) khi siêu âm có ≥ 1 nang 18 mm hoặc ≥ 3 nang noãn kích thước ≥ 16 mm

Hình 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm

(Nguồn http://ivfvietnam.net)

Chọc hút nang noãn qua đường âm đạo dưới hướng dẫn của siêu âmsau tiêm hCG 34-36 giờ Thu lượm noãn và đánh giá chất lượng noãn tronglabo Noãn thu được sẽ ủ ấm trong tủ cấy CO2, 37ºC trước khi được cấy vớitinh trùng đã được lọc rửa hoặc cho thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vàobào tương noãn

Đánh giá thụ tinh được tiến hành 16 – 18 giờ sau cấy với tinh trùngtrong kỹ thuật IVF cổ điển hoặc sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn.Đánh giá thụ tinh bình thường khi quan sát thấy hai tiền nhân Sau khi đánhgiá thụ tinh, phôi sẽ được nuôi cấy tiếp và theo dõi, đánh giá chất lượng phôi

ở giai đoạn phôi phân chia sớm hoặc giai đoạn phôi nang

Đánh giá chất lượng phôi chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chiacủa phôi Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựavào các chỉ tiêu chính là số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào và

tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) Các chỉ tiêu phụ gồm có mật độ hạttrong bào tương - độ chiết quang, số lượng hạt nhân, tỷ lệ không bào trongphôi bào Đánh giá hình thái phôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi, hình tháicủa khối tế bào nội phôi (ICM) và nguyên bào lá nuôi (TE)

Các phôi tốt nhất sẽ được chọn để chuyển phôi Chuyển 2 - 3 phôi ngày

3 hoặc chuyển 1 - 2 phôi ngày 5, số phôi còn lại được trữ lạnh

Định lượng βhCG huyết thanh sau chuyển phôi 14 ngày Nếu kết quả

≥ 25 UI/l là có thai sinh hóa

Siêu âm đầu dò âm đạo sau chuyển phôi 28 ngày Kết quả có thai lâmsàng khi siêu âm thấy túi ối và tim thai

1.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN

1.3.1 Đánh giá phức hợp noãn tế bào nang (COC cumulus oocyte complex)

-Ở các chu kỳ kích thích buồng trứng, phức hợp COC thường được thunhận sau 34 -36 giờ tiêm thuốc phóng noãn, trạng thái điển hình của khốiCOC được mô tả bởi lớp tế bào hạt và tế bào vành tia bao quanh một cáchlỏng lẻo Phần lớn khối COC nở rộng thường là noãn trưởng thành ở giaiđoạn MII (metaphase II), tuy nhiên một số noãn thu được vẫn ở giai đoạn GV(Germinal Vesicle) hoặc MI (metaphase I) [28]

Theo đồng thuận của tổ chức Alpha – ESHRE, hiện nay chưa đủ cơ sở

để khẳng định mối tương quan giữa hình thái khối COC với khả năng pháttriển phôi, nhưng vẫn có thể sử dụng thang điểm nhị phân (0 hoặc 1) để đánhgiá Điểm số 1 cho phức hợp COC được xem là tốt khi lớp tế bào hạt (GCs –granulosa cells) và tế bào vành tia (CCs - corona cells) giãn rộng (Alpha

Scientist in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group ofEmbryology, 2011) [29] (Hình 1.3)

(a) COC chưa trưởng thành (b) COC trưởng thành

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)

1.3.2 Đánh giá chất lượng noãn

* Đặc điểm noãn trưởng thành [30],[31],[32]:

- Noãn trưởng thành cả về nhân và tế bào chất

- Hình cầu

- Kích thước 100 – 150 µm

- Màng trong suốt đồng nhất, đều màu, sáng

- Khoang quanh noãn chứa thể cực thứ nhất

Tế bào hạt và tế bào vành

Tế bào vành tia

các chu kỳ kích thích buồng trứng dường như không có hiện tượng này Noãn

ở giai đoạn GV (germinal vesicle): trạng thái nhân vẫn còn ở dạng túi hìnhcầu có chứa 1 hạt nhân to Noãn MI: không có sự hiện diện của túi nhân (GV)

và chưa xuất hiện thể cực đầu tiên Noãn trưởng thành MII khi có thể cực đầutiên (PB I) xuất hiện trong khoang quanh noãn (PVS)

Noãn GV với túi mầm Noãn MI Noãn MII với PBI ở 7h

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[28]

- Trưởng thành bào tương: Noãn được xem là trưởng thành về bàotương thường sẽ không xuất hiện các bất thường trong bào tương noãn

* Hình dạng và kích thước noãn

- Hình dạng: Noãn bình thường có hình cầu Noãn có hình dạng bấtthường như hình trứng (oval) hay bị kéo dài (elongation) (Hình 1.5), Ebner vàcộng sự (2008) cho rằng không có mối tương quan nào giữa tỷ lệ thụ tinh

cũng như chất lượng phôi với hình dạng bất thường của noãn [33].

Hình 1.5 Hình dạng noãn

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[28]

- Kích thước: Noãn khổng lồ (giant oocyte) có kích thước noãn khi đo

cả màng zona từ 200µm Noãn khổng lồ là noãn thường có thêm một bộnhiễm sắc thể do sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quá trìnhnguyên phân của các noãn nguyên bào Noãn khổng lồ cho kết hợp với tinhtrùng cũng có khả năng thụ tinh tạo hợp tử đa bội và vẫn có thể phân chiathành phôi, thậm chí đạt đến giai đoạn phôi nang Vì vậy, noãn khổng lồ đượckhuyến cáo không sử dụng để ICSI [34]

* Chất lượng bào tương

- Độ mịn của bào tương (granularity) được đánh giá thông qua đám hạttập trung ở trung tâm bào tương (CLG – centrally located granular) về kíchthước, độ sẫm màu, chia noãn thành 4 độ [35].(Hình 1.6)

Gran 1: Bào tương mịn và sáng màu (a)

Gran 2: Có hạt hơi thô và sáng màu (b)

Gran 3: Quầng hạt thô, sẫm màu (c)

Gran 4: Quầng hạt thô chiếm từ ¾ diện tích bề mặt trở lên, tập trung ởvùng trung tâm noãn va các dạng bất thường khác (d)

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [28]

- Không bào (vacuole) (Hình 1.7): Không bào là một dạng thể vùi củabào tương có màng bao quanh, ở dạng túi hình cầu chứa đầy chất dịch cặn bã

Tỷ lệ thụ tinh ở noãn có không bảo giảm (40%) so với noãn bình thường(69,6%) trong ICSI [36] Khi noãn có một không bào lớn hay nhiều khôngbào sẽ gây bất lợi cho noãn vì cấu trúc bộ xương tế bào không thể thực hiệnchức năng, ví dụ như vi ống Các không bào lớn làm thay đổi vị trí thoi vô sắc

so với thể cực của noãn làm tăng nguy cơ gây tổn thương thoi vô sắc khi ICSI[37] Noãn không thụ tinh khi đường kính không bào trên 14 µm [38]

VAC 1: noãn không có không bào (a)

VAC 2: noãn có 1 không bào nhỏ (5-10 µm) (b)

VAC 3: noãn có 1 không bào trung bình (10-14 µm) (c)

VAC 4: noãn có 1 không bào lớn (>14 µm) hay nhiều không bào nhỏhoặc trung bình (d)

Hình 1.7 Không bào

(Nguồn: Thomas ebner, 2008) [33]

- Lưới nội bào (SER – smooth endoplasmic reticulum) (Hình 1.8):Noãn bào có sự hiện diện của SER thường cho tỷ lệ thụ tinh thấp, đặc biệt là

tỷ lệ sảy thai rất cao, cũng như chết non và nhẹ cân nếu chuyển phôi có nguồn

gốc từ các noãn này [33] Hạn chế hoặc tránh chọn phôi chuyển có nguồn gốc

từ noãn mang SER [39]

SER 1: noãn không có SER (a)

SER 2: noãn có 1 SER nhỏ (b)

SER 3: noãn có nhiều hơn 1 SER hoặc 1 SER trung bình (c)

SER 4: noãn có nhiều SER trung bình hoặc 1 SER lớn (d)

(a) (b) (c) (d)

Hình 1.8 Lưới nội bào

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[28]

- Thể vùi (inclusion hay refractile body) (Hình 1.9): Sự hiện diện của

thể vùi thường đi đôi với việc giảm tỷ lệ thụ tinh cũng như sự hình thành phát

triển của phôi [40] Thể vùi còn được gọi là thể khúc xạ, chứa chủ yếu các

lipid và các hạt vật chất dày đặc, có đường kính nhỏ (<10µm) Thể vùi ảnhhưởng xấu đến tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phát triển của phôi [41]

Incls 1: Không hiện diện thể vùi trong bào tương (a)

Incls 2: Bào tương có 1 thể vùi nhỏ (≤ 2-3µm) (b)

Incls 3: Bào tương có 1 thể vùi to hoặc nhiều thể vùi nhỏ (>5µm) (c)

Incls 4: Bào tương có từ 2 thể vùi to trở lên và dạng phức tạp (mắt bò) (d)

* Khoang quanh noãn (PVS – Perivitelline Space: Theo Vutyavanich (2003),

Veeck (1999), Xia P (1997) và Hassan - Ali H (1998) thì noãn có khoảngquanh noãn rộng đi kèm với các thể hạt sẽ làm tỷ lệ thụ tinh giảm đáng kể

[42],[43],[41],[44].

PVS 1: bình thường, độ rộng vừa phải, không có hạt (a)

PVS 2: rộng ở 1 phần quanh noãn, không có hạt (b)

PVS 3: rộng hết toàn bộ chu vi quanh noãn (c)

PVS 4: rộng và xuất hiện hạt trong khoang PVS (d)

* Thể cực (PB – polar body) (Hình 1.10): Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất ở

khoang quanh noãn là dấu hiệu cho thấy noãn trưởng thành về nhân Thể cựcthứ nhất là kết quả của sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quátrình giảm phân tạo noãn Noãn có thể cực nhỏ hoặc dẹt có xu hương tạo phôitam bội vì phần nhiễm sắc thể có lẽ không được trục xuất ra ngoài mà bị giữlại trong tế bào chất trong quá trình giảm phân [42],[43] Thể cực phân mảnh

là một trong những biểu hiện noãn quá trưởng thành, thường có tỷ lệ thụ tinhthấp, chất lượng phôi và tỷ lệ làm tổ thấp [43]

PB 1: dạng tròn hoặc oval, bề mặt trơn láng (a)

PB 2: dạng tròn hoặc bầu dục, bề mặt nhăn (b)

PB 3: thể cực phân mảnh (c)

PB 4: to, bất thường, thoái hóa hoặc có nhiều hơn 2 thể cực (d)

Hình 1.10 Thể cực

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [28]

* Màng trong suốt (ZP – Zona pellucia) (Hình 1.11)

Một số hình dạng hay gặp ở ZP là dạng màng hình bầu dục

ZP 1: độ dày và màu sắc bình thường (13-15µm) (a)

ZP 2: màng trong suốt mỏng (b)

ZP 3: dày, hai lớp hoặc dày mỏng không đều (c)

ZP 4: dày hoặc sậm màu hoặc bất thường (d)

* Đặc điểm noãn thụ tinh: noãn thường có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền nhân

có màng bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trung tâm củanoãn Mỗi tiền nhân có số lượng và kích thước của các thể hạt nhân tương đươngnhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của màng 2 PN [35] (Hình 1.12)

Hình 1.12 Hợp tử

(Nguồn: IVFAS)

* Đánh giá số lượng tiền nhân (ProNuclear – PN)

- Không có tiền nhân: không thụ tinh hoặc noãn thụ tinh nhưng đãchuyển sang giai đoạn syngamy (màng của các tiền nhân biến mất, 2 tiềnnhân hòa vào nhau)

- Một tiền nhân:

+ Do nhân tinh trùng đã xâm nhập vào noãn nhưng không được giải phóng

+ Hoặc do noãn tự hoạt hóa, xuất hiện không đồng thời tiền nhân của

noãn và tinh trùng, sự hòa nhập tiền nhân của tinh trùng và tiền nhân của noãnvào một tiền nhân lớn

- Hai tiền nhân: noãn thụ tinh bình thường

- Ba hoặc nhiều tiền nhân: do nhiều tinh trùng xâm nhập hoặc do noãnhay tinh trùng là thể đa bội

* Đánh giá kích thước, vị trí của tiền nhân

- Bình thường: kích thước hai tiền nhân bằng nhau, nằm đối diện, sátnhau ở giữa noãn

- Kích thước hai tiền nhân không bằng nhau thường mang bất thường

về di truyền [45], các tiền nhân có kích thước quá khác biệt nhau mang bấtthường NST [46]

- Kích thước tiền nhân quá nhỏ hoặc bị phân mảnh: thường mang bấtthường NST hoặc phát triển chậm [29]

- Vị trí: tiền nhân không nằm đối diện có thể dẫn đến không hòa nhậptiền nhân hoặc bất thường trong quá trình thụ tinh Nếu tiền nhân nằm ở vùngngoại biên của noãn ở phần bán cầu không chứa thể cực thì được đánh giá làbất thường [46]

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Textbook of ART, 2009)

- Z1: Những hợp tử có 2 PN có kích thước và số lượng các NPB tương đươngnhau (3-7 NPB), các NPB xếp thẳng hàng ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN (Hình 1.14a)

- Z2: Những hợp tử có 2 PN có kích thước và số lượng các NPB tươngđương nhau (3-7 NPB), nhưng các NPB không xếp thẳng hàng ở vùng tiếpgiáp giữa 2 PN mà phân bố rải rác trong mỗi PN (Hình 1.14b)

-Z3: Những hợp tử không đồng đều nhau về kích thước, số lượng củacác NPB ở mỗi PN hoặc các NPB ở mỗi PN không đồng thời xếp thẳng hàng

ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN (Hình 1.14c)

- Z4: Những hợp tử bất thường, xuất hiện với 2 PN có kích thước khácbiệt nhau rõ rệt, 2 PN không tiến sát nhau (Hình 1.14d)

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong HTSS)[35]

1.4.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 (Early cleavage)

Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phâncắt Tuy nhiên, nguyên tắc chung để đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phâncắt là dựa trên tốc độ phân chia của phôi, độ đồng đều của các phôi bào và tỷ

lệ mảnh vỡ bào tương là những chỉ tiêu chính Chỉ tiêu phụ như mật độ hạttrong bào tương, sự phân chia đồng bộ của phôi bào, tỷ lệ phôi bào đa nhân,

sự có mặt của không bào, lưới nội bào… cũng được xem xét

Phôi tốt là phôi có tốc độ phân chia phù hợp, các phôi bào đồng đều,

có ít hoặc không phân mảnh Cụ thể, các phôi tốt có 4 đến 6 phôi bào vàongày 2 và ít nhất 7 phôi bào vào ngày 3 sau thụ tinh, các phôi bào đồng đều,đơn nhân, tỷ lệ phân mảnh không quá 10% thể tích phôi Do đó, phôi thườngđược đánh giá vào thời điểm 42- 44 giờ (ngày 2) hoặc 66-68 giờ (ngày 3) sauICSI Phôi được phân loại thành các nhóm dựa trên các thông số về hình thái(số phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương) vàothời điểm đánh giá

1.5 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN

1.5.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI

Kể từ khi Louis Brown – đứa bé đầu tiên từ kỹ thuật thụ tinh trong ốngnghiệm – ra đời năm 1978, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã không ngừng pháttriển Tuy nhiên kỹ thuật IVF cổ điển còn một số mặt hạn chế như đòi hỏi chấtlượng tinh trùng của chồng phải tương đối tốt, bất thường nhẹ hay trung bình

Do vậy, những bệnh nhân nam có chất lượng tinh trùng kém, rất kém, hoặcbất thường nặng hay thậm chí không có tinh trùng thì cơ hội có con gần nhưkhông có Một loạt các kỹ thuật hỗ trợ thụ tinh đã được báo cáo, đầu tiên là kỹthuật vi thao tác phẫu tích một phần màng trong suốt (PZD – partial zonadissection), sau đó là kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt(SUZI – subzonal sperm injection) nhưng kết quả đều không khả quan vàngày nay không còn được thực hiện

Đến năm 1992, trường hợp đầu tiên ra đời từ kỹ thuật tiêm tinh trùngvào bào tương noãn (ICSI) được báo cáo đã mở ra một kỷ nguyên mới củađiều trị vô sinh Từ đó đến nay kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi tại cáctrung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới Chỉ định của kỹ thuật này cũng được

mở rộng nhiều [48], [49]

Theo báo cáo của Nyboe và cộng sự (2009), số chu kỳ thực hiện ICSI vàonăm 2006 chiếm trên 60% tổng chu kỳ hỗ trợ sinh sản của toàn bộ châu Âu [50].Hiện nay tại các trung tâm IVF lớn trên thế giới số chu kỳ thực hiện ICSI chiếm

tỷ lệ trên 70%, có những trung tâm thực hiện 100% kỹ thuật ICSI [51]

1.5.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

- Vô sinh do chồng: các trường hợp tinh trùng ít, tinh trùng bất thườnghay tinh trùng di động trong mẫu tinh trùng ít

- Tinh trùng lấy từ mào tinh, tinh hoàn

- Các trường hợp xuất tinh ngược dòng có thể lấy nước tiểu sau khixuất tinh, ly tâm để lọc lấy tinh trùng

- Các trường hợp chu kỳ IVF trước đó tỷ lệ thụ tinh thấp

- Các trường hợp vợ lớn tuổi

- Các trường hợp vô sinh không rõ nguyên nhân

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI

* Yếu tố chất lượng tinh trùng

Trong thời gian đầu phát triển, một nghiên cứu được thực hiện ở 996 chu kỳ

bởi Nagy và cộng sự (1995) về mối liên quan giữa ba thông số cơ bản của tinhtrùng (số lượng tinh trùng, khả năng di động và hình thái học của tinh trùng) với kếtquả của ICSI cho thấy rằng chỉ cần có sự hiện diện ít nhất một tinh trùng di độngthu được sau lọc rửa tinh trùng để đảm bảo thành công của kỹ thuật ICSI [52]

Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x400, khó cóthể tiên đoán tinh trùng bình thường về cấu trúc di truyền hay không, bao gồm

bất thường số lượng nhiễm sắc thể hay tổn thương ADN Chỉ định chính củaICSI là cho những trường hợp có bất thường tinh trùng nặng, với nhữngtrường hợp này, bất thường về hình dạng thường đi kèm với bất thường về ditruyền [53] Ngoài ra, Nars-Esfahani và cộng sự (2005) cũng cho thấy có mốiliên hệ giữa bất thường hình dạng tinh trùng và tỷ lệ ADN phân mảnh [54].

Do đó, việc lựa chọn được tinh trùng trưởng thành, có khả năng thụ tinh cao

và không bất thường về di truyền đóng vai trò quan trọng trong ICSI

* Chất lượng noãn

Tỷ lệ noãn trưởng thành thu được sau khi kích thích buồng trứng vàokhoảng 80% Tuy nhiên có khoảng 8 - 9% các chu kỳ có <50% noãn trưởngthành sau chọc hút Trong nghiên cứu của Palermo và cộng sự (2012) tác giả

đã chia làm 3 nhóm với tỷ lệ noãn trưởng thành giảm dần lần lượt là 67–99%,

34 – 66%, 0 – 33% Kết quả là tỷ lệ thụ tinh thấp nhất ở nhóm 3 với tỷ lệ noãntrưởng thành là 0–33% [49] Kết quả nghiên cứu cho thấy rõ ràng tỷ lệ noãnchưa trưởng thành có tác động xấu đến kết quả của một chu kỳ ICSI

Noãn trưởng thành khi trưởng thành cả về nhân cũng như trưởng thành

về bào tương Trưởng thành về nhân khi có sự hiện diện của thể cực thứ nhấttrong khoang quanh noãn Sự trưởng thành về bào tương thường đi kèm vớiviệc không xuất hiện các hình thái bất thường trong bào tương noãn

1.5.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI

Từ 1998 đến 2012 đã có 9 nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSIđược xuất bản với những kết luận khác nhau

Các nghiên cứu cho thấy giai đoạn ủ noãn sau khi chọc hút đến khi làmICSI lên kết quả ICSIlàm cải thiện tỷ lệ noãn trưởng thành [10],[11], tỷ lệ thụtinh [6],[11],[12],[13],[14] và chất lượng phôi [6],[11] Thời gian ủ noãn cóthể làm tăng tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi nhưng không nhất thiếtphải tăng số lượng noãn trưởng thành

Các nghiên cứu cũng đưa ra các khoảng thời gian ủ noãn tối ưu như 1-9giờ [7], 2–4 giờ [11] và 5–6 giờ [13], tuy nhiên chỉ có 2 nghiên cứu đưa rachính xác thời gian mang lại kết quả tốt nhất sau 3 giờ ủ noãn [12],[14].

Thời gian ủ noãn trước ICSI không nên vượt quá một giới hạn hợp lýnhất định Theo J.Y.Ho và cộng sự (2013) thời gian này dưới 2,5 giờ sẽ làmgiảm tỷ lệ noãn trưởng thành [10] còn A Isiklar và cộng sự (2004) thấy nếutiến hành ICSI ngay sau khi chọc hút noãn sẽ làm giảm tỷ lệ noãn trưởngthành, tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi [11] Như vậy dựa trên nhữngkhoảng hay mốc thời gian của các nghiên cứu đưa ra thì noãn nên được ủtrong tủ cấy ít nhất là 2,5 giờ từ sau khi chọc hút đến khi làm ICSI

Trong một số nghiên cứu, noãn được tiêm ICSI sau chọc hút lên đến 11giờ [6],[7] hay thậm chí 12 giờ [13] đã ảnh hưởng xấu đến kết quả ICSI.Nghiên cứu của K.Yanagida và cộng sự (1998) khi ủ noãn từ 9-11 giờ sẽ làmgiảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ có thai [7], không những vậy còn làm giảm

tỷ lệ thụ tinh trong nghiên cứu của P Falcone (2008) với thời gian ủ noãn 6

-12 giờ [13] Với những ảnh hưởng tiêu cực này, thời gian ủ noãn không nênvượt quá 6 giờ sau chọc hút

Trong số 7 nghiên cứu về thời gian ủ noãn, không có nghiên cứu nàophân tích tác động của cả hai khoảng thời gian từ khi chọc hút noãn đến khitách bỏ tế bào hạt và từ khi tách bỏ tế bào hạt đến khi tiêm ICSI [6],[7],[9],[10],[11],[12],[13] Hầu hết các tác giả cho rằng noãn nên được bao bọc bởilớp tế bào hạt và tế bào vành tia khi ủ trong tủ cấy [5],[7],[11],[12] nhưngkhông đưa ra số liệu chứng minh Chỉ có H Van de Velde và cộng sự (1998)

đã chia 2 nhóm noãn và ủ noãn ở hai điều kiện, một là giữ nguyên phức hợp

tế bào hạt, hai là tách bỏ hoàn toàn và thực hiện ICSI ở 2 thời điểm sớm (1-2giờ sau lấy noãn) và muộn (5-6 giờ) [8] Kết quả cho thấy sự khác biệt không

có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ thụ tinh cũng như sự phân chia của phôi Đểnghiên cứu sâu hơn về vấn đề này, Catherine Patrat và cộng sự (2012) đã phân

biệt 2 khoảng thời gian T1 và T2 (T1: thời gian từ khi chọc hút noãn đến khitách bỏ tế bào hạt và T2 là thời gian từ khi tách bỏ tế bào hạt đến khi tiêmICSI) Kết quả đưa ra là noãn nên ủ ít nhất 2-3 giờ sau khi chọc hút noãn (T1:2–3 giờ) và ICSI nên được thực hiện ngay sau khi tách bỏ tế bào hạt [14]

Nghiên cứu của Catherine (2012) cho thấy không có bất kỳ ảnh hưởngnào của T1 hay T2 lên tỷ lệ noãn trưởng thành, mà tỷ lệ thụ tinh tăng có ýnghĩa thống kê khi T1 tăng, tăng cao nhất ở thời điểm T1=3 giờ [14] Điều nàycho thấy thời gian ủ noãn không phải làm tăng số lượng noãn trưởng thành màcần thiết để làm trưởng thành bào tương Trưởng thành về nhân có thể dễ dàngđược đánh giá trước khi ICSI khi có mặt thể cực đầu tiên ở khoang quanh noãnnhưng sự trưởng thành của bào tương lại khó nhận biết Trong chu kỳ kíchthích buồng trứng, sự trưởng thành của bào tương không đồng thời với sựtrưởng thành của nhân [17],[18] Do đó một số noãn được lấy ra sau chọc hútmặc dù ở giai đoạn MII có thể vẫn chưa trưởng thành bào tương Điều này cóthể lý giải thời gian T1 ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ thụ tinh liên quan chặt chẽđến sự trưởng thành của noãn cả về nhân và bào tương

Các nghiên cứu đều thực hiện chọc hút noãn tại thời điểm 36-37 giờsau mũi tiêm hCG Có duy nhất một nghiên cứu của D Dozortsev và cộng sự(2004) là dựa trên thời điểm tiêm hCG cho tỷ lệ thụ tinh tăng liên tục theothời gian sau mũi tiêm hCG, tới đỉnh điểm là 84% khi ICSI được làm hơn 41giờ sau mũi tiêm hCG Tuy nhiên, tỷ lệ làm tổ cao nhất (24%) đạt được khilàm ICSI 37 - 41 giờ sau mũi tiêm hCG [12]

Qua các nghiên cứu trên cho thấy giới hạn hợp lý của thời gian ủ noãntrước ICSI là 2,5 giờ – 6 giờ sau khi chọc hút noãn (thời điểm chọc hút noãn 36 -

37 giờ sau mũi tiêm hCG), giữ lại tế bào hạt bao quanh noãn khi ủ noãn là cầnthiết và ICSI được thực hiện ngay sau tách bỏ tế bào hạt Dựa trên kết quả của cácnghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn những mốc thời gian ủ noãn là 2,5 giờ, 3,5 giờ

và 4,5 giờ để khảo sát kết quả thụ tinh và chất lượng phôi trong IVF/ICSI Nhữngnghiên cứu tương tự, chúng tôi chưa đọc được trong y văn hiện có

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là noãn MII được thụ tinh với tinh trùng bằng kỹthuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn và nuôi cấy tạo thành phôi của bệnhnhân được điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ sinhsản Quốc gia - Bệnh viện Phụ sản Trung ương trong thời gian 6 tháng từtháng 4 đến tháng 10 năm 2016

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Toàn bộ noãn trưởng thành MII của các cặp vợ chồng điều trị bằng thụtinh trong ống nghiệm thỏa mãn các điều kiện sau:

+ Tuổi vợ ≤ 35 tuổi

+ Vợ được kích thích buồng trứng bằng phác đồ Antagonist

+ Số lượng noãn sau chọc hút từ 10 - 15 noãn

+ Được chỉ định tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

+ Thời gian chọc hút trứng 36 giờ ± 15 phút sau tiêm hCG

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Những trường hợp vô sinh do chồng:

+ Bất thường tinh dịch đồ nặng

+ Tinh trùng được chọc hút từ mào tinh, tinh hoàn

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc gia –Bệnh viện Phụ Sản Trung ương trong thời gian 6 tháng từ tháng 4 đến tháng

10 năm 2016

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu: Tiến cứu, so sánh ngẫu nhiên có đối chứng

Số noãn của mỗi bệnh nhân sau khi chọc hút noãn được phân ngẫu nhiên vào

ba nhóm (Hình 2.1):

+ Nhóm 1: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 2,5 giờ trước khi tách noãn.+ Nhóm 2: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 3,5 giờ trước khi tách noãn.+ Nhóm 3: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 4,5 giờ trước khi tách noãn

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên 514 noãn của 30 chu kỳ thụ tinh trongống nghiệm của 30 bệnh nhân làm thụ tinh ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợsinh sản Quốc gia – Bệnh viện Phụ sản Trung ương

2.2.3 Quy trình thực hiện

2.2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Mẫu tinh dịch

BN IVF đượckích thích buồng trứng

đủ tiêu chuẩn lựa chọn nghiên cứu

Chọc hút noãn sau mũi tiêm hCG khoảng 36 giờ

Lựa chọn ngẫu nhiên

Tách noãn & đánh giá

ICSI ngay sau khi tách noãn

Kiểm tra thụ tinh & đánh giá hợp tử (16 – 18 giờ sau ICSI)

Kiểm tra phôi & đánh giá chất lượng phôi ngày 2 (42 – 44 giờ sau ICSI)

Xử lý số liệu, phân tích kết quả theo

mục tiêu 3 nhóm