Luận văn sư phạm Nghiên cứu phân lập các hợp chất Alkaloid từ cây Hoàng Liên Ô Rô (Mahonia Nepalensis)

các hợp chất hữu cơ Ph-ơng pháp sắc kí chromatography là một ph-ơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đ-ợc sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và

Phùng V n Minh 1 L p K32C – Khoa Hóa h c

M U

Vi t Nam n m trong khu v c nhi t đ i, có khí h u nóng, m m cao

kho ng trên 80%, l ng m a l n, nh ng đi u ki n nh v y r t thích h p cho

th c v t phát tri n Do v y h th c v t Vi t Nam vô cùng phong phú, đa d ng

v i kho ng 12000 loài, trong đó có t i 4000 loài đ c nhân dân ta dùng làm th o

d c H th c v t phong phú trên là m t ti n đ cho s phát tri n ngành hoá h c

các h p ch t thiên nhi n n c ta

T ngàn x a cha ông ta đã s d ng nhi u ph ng thu c dân gian t cây

c đ ch a b nh, b i b c th , hay t o mùi th m… nh lá Tía tô gi i c m, Thì

là, X t o mùi th m và Nhân sâm t ng c ng s c đ kháng Các ph ng thu c y

h c c truy n đã th hi n nh ng m t m nh trong đi u tr b nh là ít đ c tính và

tác d ng ph Do đó ngày nay con ng i ngày càng quan tâm đ n các h p ch t

có ho t tính sinh h c trong th c v t và đ ng v t V lâu dài, đ i v i s phát tri n

các d c ph m m i, các h p ch t có ho t tính sinh h c đóng vai trò r t quan

tr ng, nó là ch t kh i đ u cho vi c t ng h p nên các lo i thu c m i có tác d ng

Theo h ng nghiên c u trên, Lu n v n này t p trung kh o sát thành ph n hoá

h c và c u trúc c a m t s alkaloid tách chi t t cây hoàng liên ô rô, m t cây thu c có giá tr , đ c s d ng làm thu c ch a b nh trong dân gian

Phùng V n Minh 2 L p K32C – Khoa Hóa h c

N i dung c a khóa lu n g m

1 S d ng các ph ng pháp chi t và s c ký đ phân l p đ c các alkaloid

s ch t cây hoàng liên ô rô

2 S d ng các ph ng pháp ph k t h p đ xác đ nh c u trúc hoá h c c a

các h p ch t đã phân l p đ c

Phùng V n Minh 3 L p K32C – Khoa Hóa h c

Ch ng 1 T NG QUAN

1 1 V Ơi nét chung v chi hoƠng liên Mahonia [3], [6], [7], [10]

1 1 1 V th c v t

Hoàng liên có nhi u lo i khác nhau tu thu c vào t ng vùng đ a lý khác

nhau Do tính ch t c a khí h u, đ t đai và đ c bi t là ch ng lo i khác nhau Sau đây là m t s phân lo i ch y u đã đ c bi t đ n c a lo i cây này

1 1 1 1 Mahonia bealei (Fort ) Carr

Là cây b i cao t m 2- 3m Thân và d có màu vàng, lá kép lông chim, m c

so le dài 15 đ n- 35cm, có 7- 15 lá chét không cu ng hình b u d c ho c hình

tr ng l ch dài 3- 9cm, r ng 2, 5- 4, 5cm dày và c ng, lá chét t n cùng to h n và

có cu ng, g c tròn ho c h i hình tim, đ u nh n s c, mép khía r ng nông nh gai

s c nh n, gân chính 3 và gân ph k t thành m ng n i rõ

C m hoa m c thành bông ng n h n lá ng n; lá b c nh ; hoa nhi u màu

vàng; lá đài chín s p thành ba vòng; cánh hoa sáu nh h n lá đài trong; nh sáu, bao ph n dài h n ch nh ; b u hình tr

Qu th t ch a 1 h t

Mùa hoa : Tháng 10- 11; mùa qu : tháng 12-2

Mahonia Bealei

Phùng V n Minh 4 L p K32C – Khoa Hóa h c

1 1 1 2 Mahonia japonica (Thumb ) DC

Là cây b i cao kho ng 3- 5m Thân r m u vàng, cành màu nâu đen Lá kép lông chim m c so le, dài 20- 45cm, có 9 đ n 23 lá chét hình mác thuôn, dài

5- 15cm, r ng 2- 5cm, g c tròn đ u nh n nh gai, mép khía r ng nh n s c, gân chính 3 và gân ph thành m ng rõ

C m hoa m c đ ng ng n thành bông ng n h n lá; lá b c thuôn; hoa màu vàng nh t; lá đài s p 9 thành 3 vòng; cánh hoa 6 nh h n lá đài trong, đ u cánh

h i lõm; nh sáu, bao ph n dài b ng ho c dài h n ch nh , b u hình tr

Qu th t, hình tr ng, khi chín có màu tím đen

Mùa hoa : tháng 9- 11; mùa qu : tháng 12-2

Mahonia japonica

1 1 1 3 Mahonia nepalensis DC (M Annamica Gagnep )

Là cây b i, có th cao 6- 7m Thân và r màu vàng Lá kép lông chim l ,

m c so le, dài 20- 40cm, lá chét dài hình trái xoan ho c h i thuôn, không cu ng,

dài 6- 10cm, r ng 2- 4, 5cm, g c tròn ho c h i hình tim, đ u nh n nh gai, mép khía r ng to s c nh n, gân chính 3 và gân ph thành m ng rõ

Phùng V n Minh 5 L p K32C – Khoa Hóa h c

C m hoa m c ng n thành bông phân nhánh có khi dài h n lá; lá kh c hình b u d c hoa nhi u màu vàng nh t; lá đài 9 s p thành 3 vòng; cánh hoa 6 có tuy n g c, nh 6 đ i di n v i cánh hoa, bao ph n dài b ng n a ch nh ; b u hình tr

Qu th t hình c u, khi chín màu xanh l , đ u qu có núm nh n; h t màu nâu đen Mùa hoa: tháng 2- 4; mùa qu : tháng 5- 6

Mahonia nepalensis

1 1 2 Phân b và sinh thái

Chi Mahonia Nutt g m các đ i di n là cây b i hay g nh , phân b vùng

ôn đ i m ho c c n nhi t đ i châu Á, bao g m Trung Qu c, Nê Pan, n và

m t s n c khác vùng trung Á Vi t Nam có 3 loài (Nguy n t p, 1996)

- Mahonia bealei (Fort ) Carr: Qu n B (Hà Giang)

- Mahonia japonica (Thumb ) DC: Qu n B , ng V n (Hà Giang) : Sìn H

(Lai Châu); Hà Qu ng (Cao B ng); Sa Pa (Lào Cai)

- Mahonia nepalensis DC: L c D ng (Lâm ng) và Lai Châu

Phùng V n Minh 6 L p K32C – Khoa Hóa h c

Nói chung c ba loài đ u là nh ng cây a m, a sáng và có th ch u bóng,

th ng m c d i tán r ng kín th ng xanh hay trong các tr ng cây b i trên núi

đá vôi v i đ cao 1400- 1700m Cây sinh tr ng t t trong đi u ki n khí h u m mát quanh n m, nhi t đ trung bình 15- 160

C, l ng m a 1800- 2800mm/n m

m không khí trên 80% nh ng vùng có hoàng liên ô rô quanh n m có

s ng mù

Cây ra hoa qu nhi u hàng n m; quan sát loài Mahonia japonica (thumb)

DC qu n b (Hà Giang cho th y, khi r ng b m tán (do khai thác g ) và

nh ng cây m c trong qu n h cây b i, b n ng d y do d c chi u sáng nhi u nên l ng hoa qu trên m i cây nhi u g p 2- 3 l n nh ng cây m c d i tán r ng

b che bóng M c dù có l ng hoa qu nhi u (100- 150 qu trên cây) nh ng s cây con m c t nhiên t h t r t ít Cây có kh n ng tái sinh cây tr i sau khi b

ch t

1 1 3 Tác d ng d c lý

M c dù trong hoàng liên ô rô có berberin, palmatin và m t s alcaloid

khác, nh ng nh ng nghiên c u tác d ng kháng khu n n đã không th y có tác d ng, c ng ch a th y có tác d ng kháng n m, kháng virus Th đ c tính c p cao khô chi t c n hoàng liên ô rô đã xác đ nh đ c LD50 = 175mg/kg khi tiêm

phúc m c cho chu t c ng tr ng

Trong dân gian cây hoàng liên ô rô đ c dùng đ ch a r t nhi u b nh, do

đ c tính mát, đ ng c a nó Nó có tác d ng thanh nhi t ph , v , gan, th n Qu

l i ti u và làm d u kích thích C cây hoàng liên ô rô ch a ki t l , tiêu ch y viêm

ru t, n không tiêu, đau m t đ viêm da d ng, m n ng a m n nh t

D i đây là m t s bài thu c trong dân gian có dùng cây hoàng liên ô rô:

Phùng V n Minh 7 L p K32C – Khoa Hóa h c

*Ch a viêm gan c p tính: Dùng thân ho c r hoàng liên ô rô 25g, r hoàng liên

gai 15g, nhân tr n 15g S c u ng: Tr ng h p hoàng đ n dùng đinh l ch t 4g, long đ m th o 4g, s n chi t 6g, nhân tr n 6g, hoàng c m 6g S c u ng

*Th ng dùng ch a ho lao, s t c n, kh c ra máu, l ng g i y u m i, chóng m t ù

tai, m t ng Dùng lá khô hay qu 8- 12g s c u ng hay ph i h p v i các v thu c

khác Ch a viêm ru t, a ch y, viêm da d ng, viêm gan vàng da, m t đau s ng

đ , dùng r hay cây khô 10- 20g s c u ng, dùng riêng hay ph i h p v i các v thu c khác n , ng i ta dùng qu tr ki t l Nhân dân th ng dùng ch a

l , n u ng không tiêu, vàng da, đau m t

*Ch a say n ng: N u kèm theo nôn m a, tiêu ch y, tim h i h p khát n c dùng

h ng nhu tía 10g, cát c n 10g, di p cá 10g, cây ban 10g, hoàng liên ô rô 10g,

th ch x ng b 6g, m c h ng 3g

*Ch a lao ph i, ho ra máu ho c kh c ra đ m l n máu: M qu 40g, Dây Rung

rúc 30g, Bách b và Hoàng liên ô rô, m i v 20g s c u ng

*Ch a ki t l , tiêu ch y, viêm ru t n không tiêu: R , thân ho c toàn cây hoàng

liên ô rô 15g, r c t khí c 15g, thái nh s c u ng làm 2 l n trong ngày Có th dùng d ng b t trong nhi u ngày

*Ch a đau m t đ , viêm gan vàng da: R ho c thân hoàng liên ô rô 20g, h khô

Phùng V n Minh 8 L p K32C – Khoa Hóa h c

có umbellatin (0 48%) và neprotin (0, 02%) {Theo The Wealth of India T VI, 226}

Loài M japonica có isotetrandrin 1, 566%, palmatin 0, 35% và jatrorrhizin 0, 087% Ngoài ra còn có magnoflorin và columbamin (Theo Trung

d c t h i I, 262) Trong các lo i h t hoàng liên ô rô có berberin và jatrorrhizin

M t s h p ch t đã phân l p t cây hoàng liên ô rô [11]

1 2 Các h p ch t Ankaloid [1], [2], [4], [5]

1 2 1 Khái ni m và đ nh ngh a

Phùng V n Minh 9 L p K32C – Khoa Hóa h c

Alkaloid đã đ c bi t đ n t r t lâu, nó có ý nh là Alkali D c s W Meissner đã đ a ra thu t ng Alkaloid n m 1819: Alkaloid là nh ng h p ch t baz có ch a nit có ngu n g c t th c v t, chúng có c u trúc phân t ph c t p

và chúng có ho t tính d c lý Còn theo Landenberg Alkaloid đ c xem nh là

nh ng h p ch t t nhiên t th c v t mà có đ c tính baz và ch a đ ng ít nh t

m t nguyên t N trong nh ng d vòng trong phân t và có ho t tính sinh h c

Theo nh ng miêu t đ c tr ng thì Alkaloid là nh ng h p ch t có ngu n

g c th c v t ch a N có ho t tính quang h c r t cao và ch a nh ng nguyên t

n m các d vòng mang ho t tính sinh lý h c

Trong t t c nh ng khái ni m trên không hoàn

toàn là đúng cho t t c các Alkaloid Ví d :

- Colchicine: c xem nh là Alkaloid m c

dù nó không ph i là h p ch t d vòng N và h u

nh không có tính baz :

- Thiamine: Là h p ch t d vòng ch a N có tính

baz nh ng không ph i là Alkaloid b i vì nó

không đ c phân b ph bi n trong v t th

Muscarine

hordenine

Phùng V n Minh 10 L p K32C – Khoa Hóa h c

Nh ng h p ch t m ch th ng xu t hi n trong t nhiên có ho t tính sinh lý

h c nh ng không đ c phân lo i là Alkaloid nh là: Chlonine, aminoacid,

phenylethylamine

- Piperine: Không có tính bazo hay ho t tính sinh

lý h c nh ng nó là Alkaloid

- Nh ng h p ch t tho mãn nh ng đi u ki n nêu trên nh là ho t tính sinh lý, có

d vòng N nh ng không đ c coi là Alkaloid ví d : Thiamine, caffeine, purine,

theobromine, xanthenes

Nh v y đ đ nh ngh a Alkaloid th t chính xác là m t vi c r t khó th c

hi n Ng i ta ch có th nói t ng quát v Alaloid nh sau:

Alkaloid là nh ng h p ch t h u c ch a Nit có nh h ng d c lý lên c th con ng i và đ ng v t

1 2 2 Tr ng thái thiên nhiên

Alkaloid có trong r t nhi u sinh v t bao g m vi khu n, th c v t và đ ng

v t Trong đ ng v t nh loài có v nh trai, sò, tôm, cua…Trong th c v t có nhi u khoai tây, cà chua, chè, cafe… Chúng th ng có m t d i d ng nh ng

mu i c a acid h u c nh là acid acetic, oxalic acid, malic, lactic, tartaric,

Phùng V n Minh 11 L p K32C – Khoa Hóa h c

tannic, aconitic acid và m t s ít là v i đ ng: Nh ng nhóm solanum và

Alkaloid đ c phân lo i nh sau:

- Phân lo i c b n: Theo h c a chúng, ví d : solanaceous, papilionaceous

- D a trên tính ch t d c lý: Chính là su h ng hay ho t tính d c lý c a chúng

Ví d :

* Nh ng alkaloid gi m đau

* Nh ng alkaloid có tác d ng ph tr

- D a trên s sinh t ng h p: Chúng đ oc phân lo i d a trên n n t ng c b n là

nh ng h p ch t ti n đ hay nh ng h p ch t n n t ng xây d ng lên chúng đã

đ c th c v t s d ng đ t ng h p hoá h c các c u trúc phúc t p ví d :

Morphine, papaverine, narcotin

- D a trên nh ng loài th c v t hay đ ng v t mà chúng đ c phân tách ra

- Cách thông th ng nh t alkaloid đ c phân lo i là d a trên nh ng ti n phân t thông th ng c a chúng, đ c d a trên con đ ng sinh h c đ xây d ng lên phân t Còn khi không bi t nhi u v sinh t ng h p c a nh ng alkaloid chúng

đ c g p thành nhóm d i nh ng tên c a h p ch t đã bi t Thông th ng l y tên

m t amine quan tr ng sinh h c n i b t trong quá trình t ng h p S phân lo i

Phùng V n Minh 12 L p K32C – Khoa Hóa h c

này còn g i là phân lo i hoá h c, nó đ c ch p nh n r ng rãi và ph thu c vào

c u trúc vòng c b n Theo s phân lo i này nó đ c chia thành hai nhóm chính:

A Alkaloid không ch a nhân d vòng

Trong nhóm này alkaloid không ch a b t k m t nhân d vòng nào trong

c u trúc ví d :

Hordinine, ephedrine… Chúng còn đ c g i là các alkaloid phenyl alkyl

amine Nh ng alkaloid này có nguyên t nit m ch th ng Chúng đ c t o thành thu c viên do chúng có kh n ng kích thích th n kinh và làm t ng áp su t

máu

ephedrine

B Nh ng Alkaloid ch a nhân d vòng

S phân lo i này đ c ph bi n r ng rãi, d a trên c u trúc vòng c a d

vòng các alkaloid Nó đ c chia nh thành các lo i sau đây:

1 Nhóm Pyrrolidine: Mang c u trúc vòng c a

Pyrrolidine, m t d vòng amin v i 4 nguyên t các

2 Nhóm Pyridine: Nh ng alkaloid thu c nhóm này ch a d vòng Pyridine trong phân t M t s lo i alkaloid thu c nhóm nay là: Piperine, coniine, trigonelline,

arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytosine, nicotine, sparteine, pelletierine

Pyridine

Phùng V n Minh 13 L p K32C – Khoa Hóa h c

3 Nhóm Tropanne: Nh ng alkaloid này ch a vòng tropanne trong phân t

th ng xu t hi n trong nh ng lo i th c v t h Erythroxylaceae (g m c cây

coca) và Solanaceae (g m mandrake, henbane, deadly nightshade, datura, khoai

tây, cà chua) G m m t s alkaloid sau: atropine, cocaine, ecgonine,

scopolamine, catuabine

4 Nhóm Quinoline: Bao g m nh ng alkaloid mà trong

phân t có ch a vòng c a phân t quinoline:

*Quinine: Là m t ch t tinh th m u tr ng, có tác d ng h

s t, ch ng s t rét, gi m đau và ch ng viêm quinoline

Nó có v h i đ ng, là m t d ng đ ng phân quang h c c a

quinidine Quinine có ch y u trong cây Cinchona, lo i cây

này có kho ng 25 loài trong h Rubiaceae có vùng nhi t

5 Nhóm Isoquinoline: Là nh ng alkaloid trong phân t có ch a d vòng c a phân t Isoquinoline là m t d vòng th m ch a nit Nó là nh ng alkaloid thu c phi n g m các alkaloid sau: Morphine, codeine, thebaine, Isopapa- dimethoxy-

aniline, papaverine, narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine

Và m t s alkaloid khác: emetine, berbamine, oxyacanthine

Isoquinoline

6 Nhóm Phenethylamine: G m nh ng alkaloid mà trong c u trúc phân t có

ch a d vòng c a phân t Phenethylamine

Phùng V n Minh 14 L p K32C – Khoa Hóa h c

Nh ng alkaloid thu c nhóm này g m: Mescaline, ephedrine,

dopamine, amphetamine

Phenethylamine

*Mescaline (3, 4, 5- trimethoxyphenethylamine) là m t alkaloid có tính ch t t o

o giác, làm t ng kh n ng t p trung Nó có trong t nhiên loài x ng r ng

Peyote (Lophophora williamsii), x ng r ng San Padro (Echinopsis pachanoi),

Peruvian Torch (Echinopsis peruviana) và m t s lo i

x ng r ng khác Nó c ng đ c tìm th y v i hàm l ng nh

Fabaceae (thu c h đ u)

Mescaline

7 Nhóm Idol: Là nh ng alkaloid trong c u trúc

phân t có mang c u trúc c a phân t Idol

*Tryptamine: Là alkaloid amine tìm th y trong

th c v t và đ ng v t Trong đ ng v t nó có tác

d ng đi u ch nh và lan truy n th n kinh, tìm

v t trong não c a đ ng v t có vú Trong th c v t nó có tác

d ng nh là m t lo i thu c sâu t nhiên, nó có trong m t

Phùng V n Minh 15 L p K32C – Khoa Hóa h c

8 Nhóm Purine: Nh ng alkaloid thu c nhóm này có ch a vòng Purine trong phân t :

Purine

Trong s nh ng alkaloid thu c nhóm này n i b t là

nh ng ankaloid t d n xu t c a Xanthine là m t baso

Purine, nó là s n ph m c a s phân hu Purine do

các enzyme ti n hành, có trong d ch l ng và các mô

Nh ng alkaloid Xanthine, n i b t là các d n xu t Methyl hoá c a nó bao

g m: Caffeine, paraxanthine, theophylline và theobromine là quan tr ng nh t Chúng có tác d ng mang l i kích thích nh , đ c s d ng trong đi u tr b nh hen xuy n, b nh v hô h p

Caffeine

Phựng V n Minh 16 L p K32C – Khoa Húa h c

9 Nhúm Terpenoid: Là nh ng alkaloid trong phõn t

nh ng alkaloid terpen là h n t p cỏc h p ch t nh n đ c thụng qua cỏc s n

ph m t ng h p sinh h c khỏc nhau Ngoài ra nú cũn tỡm th y r t nhi u trong cỏc loài th c v t, nh ng terpenoid này đ c s d ng r ng dói b i tớnh th m c a nú

các hợp chất hữu cơ

Ph-ơng pháp sắc kí (chromatography) là một ph-ơng pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, đ-ợc sử dụng

rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

Sắc kí là ph-ơng pháp tách các chất dựa vào sự

khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh

Phựng V n Minh 17 L p K32C – Khoa Húa h c

Sắc kí gồm có pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh t-ơng ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) Các chất khác nhau sẽ có

ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất

có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua

hệ thống sắc kí so với các chất t-ơng tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này mà ng-ời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí

1.3.2 Cơ sở của ph-ơng pháp sắc kí

Ph-ơng pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau

của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của l-ợng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

Phựng V n Minh 18 L p K32C – Khoa Húa h c

b - hằng số

C - nồng độ của chất bị hấp phụ

1.3.3 Phân loại các ph-ơng pháp sắc kí

Trong ph-ơng pháp sắc kí pha động là các l-u thể

(các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ng-ời ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: Sắc kí khí và sắc kí lỏng Dựa vào cách tiến hành sắc ký, ng-ời ta chia ra thành các

ph-ơng pháp sắc ký chủ yếu sau

1.3.3.1 Sắc kí cột

Đây là ph-ơng pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp

phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích th-ớc hạt khác nhau) pha th-ờng và pha đảo YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì

số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ng-ợc lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích th-ớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số tr-ờng hợp nếu lực trọng tr-ờng không đủ lớn thì gây

ra hiện t-ợng tắc cột (dung môi không chảy đ-ợc), khi

Phựng V n Minh 19 L p K32C – Khoa Húa h c

đó ng-ời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỷ lệ đ-ờng kính cột (D) so với

chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể Trong sắc

kí, tỷ lệ giữa quãng đ-ờng đi của chất cần tách so với quãng đ-ờng đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về

Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp Tỉ

lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng

và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách Nếu tách thô thì tỉ lệ

này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào

sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30

Trong sắc kí cột, việc đ-a chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào l-ợng chất và dạng chất mà

ng-ời ta có thể đ-a chất lên cột bằng các ph-ơng pháp

khác nhau Nếu l-ợng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đ-a lên cột Nếu tách tinh, thì đ-a trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với l-ợng tối thiểu

Có hai cách đ-a chất hấp phụ lên cột:

Phựng V n Minh 20 L p K32C – Khoa Húa h c

- Cách 1: Nhồi cột khô Theo cách này, chất hấp phụ

đ-ợc đ-a trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

- Cách 2: Nhồi cột -ớt, tức là chất hấp phụ đ-ợc hoà tan trong dung môi chạy cột tr-ớc với l-ợng dung môi tối thiểu Sau đó đ-a dần vào cột đến khi đủ l-ợng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải l-u ý không đ-ợc để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện t-ợng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách) và cột không đ-ợc nứt, gẫy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh h-ởng đến hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì

sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh h-ởng đến tiến độ công việc

1.3.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) th-ờng đ-ợc sử dụng để

kiểm tra và định h-ớng cho sắc kí cột SKLM đ-ợc tiến

hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản đ-ợc tráng silica gel dày hơn), có thể đ-a

Phựng V n Minh 21 L p K32C – Khoa Húa h c

l-ợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, ng-ời ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu đ-ợc từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu

đặc tr-ng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch

H2SO4 10%

1.4 ng dụng một số ph-ơng pháp hoá lý để xác định

cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ đ-ợc xác

định nhờ vào các ph-ơng pháp phổ kết hợp Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà ng-ời ta sử dụng

ph-ơng pháp phổ cụ thể nào Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các ph-ơng pháp phổ càng cao Trong

một số tr-ờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, ng-ời ta phải dựa vào các ph-ơng

pháp bổ xung khác nh- chuyển hoá hoá học, kết hợp với các ph-ơng pháp sắc kí so sánh…

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại đ-ợc xây dựng dựa vào sự khác nhau

về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất d-ới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết đ-ợc đặc tr-ng bởi một vùng b-ớc sóng khác nhau

Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định đ-ợc các nhóm chức đặc tr-ng trong hợp chất, ví dụ nh- dao động

Phựng V n Minh 22 L p K32C – Khoa Húa h c

hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm-1…

1.4.2 Phổ khối l-ợng (Mass spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của ph-ơng pháp phổ này là dựa vào sự

phân mảnh ion của phân tử chất d-ới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó ng-ời ta có thể xác định đ-ợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đ-ợc cấu trúc hoá học các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối l-ợng,

những ph-ơng pháp chủ yếu đ-ợc nêu ra d-ới đây:

spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion d-ới tác dụng

của chùm ion bắn phá năng l-ợng khác nhau, phổ biến là 70eV

spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này đ-ợc

thực hiện với năng l-ợng bắn pha thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu đ-ợc chủ yếu là pic ion phân

tử và các píc đặc tr-ng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng l-ợng thấp, dễ bị phá vỡ

- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ

bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh

ở năng l-ợng thấp, do đó phổ thu đ-ợc cũng dễ thu đ-ợc pic ion phân tử

Phựng V n Minh 23 L p K32C – Khoa Húa h c

- Phổ khối l-ợng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định píc ion phân tử hoặc

ion mảnh với độ chính xác cao

- Ngoài ra, hiện nay ng-òi ta còn sử dụng kết hợp các

ph-ơng pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác nh-:

GC-MS (sắc kí khí -khối phổ), LC-GC-MS (sắc kí lỏng-khối phổ) Các ph-ơng pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu

hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất

là phân tích thuốc trong ngành d-ợc)

1.4.3 Phổ cộng h-ởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

Phổ cộng h-ởng từ hạt nhân là một ph-ơng pháp phổ

hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử

Nguyên lý chung của các ph-ơng pháp phổ NMR (phổ

proton và cacbon) là sự cộng h-ởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) d-ới tác dụng của từ tr-ờng ngoài Sự cộng h-ởng khác nhau này đ-ợc biểu diễn bằng

độ chuyển dịch hoá học (chemical shift) Ngoài ra, đặc tr-ng của phân tử còn đ-ợc xác định dựa vào t-ơng tác

spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling)

- Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ chuyển dịch hoá học ( ) của các proton đ-ợc xác định trong thang ppm