PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại: MS, 1D, 2D-NMR... Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập được Quá trình

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY

AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ KIM MỴ

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG CÂY

AN XOA (HELICTERES HIRSUTA L.) Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt Nam bằng các phương pháp hóa lý hiện đại” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn của TS.Nguyễn Thanh Trà Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019

Học viên

Trần Thị Kim Mỵ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Nguyễn Thanh Trà – Phòng Hóa

sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt

Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi

hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Để hoàn thành bản luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ

kinh phí của đề tài cấp Viện HLKH & CN Việt Nam thuộc 7 hướng ưu tiên,

MSĐT: VAST 04.03/18.19

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm đào tạo Sau đại học Học Viện

Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Hóa học – Viện HLKH &

CN Việt Nam, Các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, Trung tâm nghiên cứu

các phương pháp Phổ ứng dụng

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn này bằng tất cả sự

nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu

sót Rất mong nhận được những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2019

Học viên

Trần Thị Kim Mỵ

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

CC Column Chromatography Sắc ký cột

TLC Thin layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

IR Infrared Spectrometry Phổ hồng ngoại

MS Mass Spectrometry Phổ khối lượng

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1

H-NMR 1H-Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Proton

13

C-NMR 13C-Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocoy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer

Tăng cường biến dạng bằng chuyển phân cực

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres 5

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres 7

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres 8

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.) 9

Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta) 9

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L thu hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016) 10

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L thu hái ở Bình Phước (Ngọc Quang, 2018) 11

Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf 13

Hình 1.9: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng 14

Hình 1.10: Các bước tiến hành sắc ký cột 15

Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại Thừa Thiên-Huế 20

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của 8 hợp chất phân lập từ thân cây An xoa 31

Hình 3.2: Phổ MS của hợp chất HH01 32

Hình 3.3: Phổ 1 H của hợp chất HH01 33

Hình 3.4: Phổ 13 C của hợp chất HH01 33

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất HH01 34

Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất HH01 34

Hình 3.7: Tương tác HMBC của hợp chất HH01 35

Hình 3.8: Phổ MS của hợp chất HH02 36

Hình 3.9: Phổ 1 H của hợp chất HH02 37

Hình 3.10: Phổ 13 C của hợp chất HH02 37

Hình 3.11: DEPT của hợp chất HH02 38

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH02 38

Hình 3.13: Phổ MS của hợp chất HH03 39

Hình 3.14: Phổ 1 H của hợp chất HH03 40

Hình 3.15: Phổ 13 C của hợp chất HH03 40

Hình 3.16: Phổ DEPT của hợp chất HH03 41

Hình 3.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất HH03 41

Hình 3.18: Phổ MS của hợp chất HH04 42

Hình 3.19: Phổ 1 H của hợp chất HH04 43

Hình 3.20: Phổ 13 C của hợp chất HH04 43

Hình 3.21: Phổ 13C của hợp chất HH04 44

Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất HH04 44

Hình 3.23: Phổ MS của hợp chất HH05 45

Hình 3.24: Phổ 1 H của hợp chất HH05 46

Hình 3.25: Phổ 13 C của hợp chất HH05 47

Hình 3.26: Cấu trúc hợp chất HH05 47

Hình 3.27: Phổ khối phân giải cao HRESI-MS của hợp chất HH06 48

Hình 3.28: Phổ 1 H-NMR của hợp chất HH06 48

Hình 3.29 : Phổ 13 C-NMR của hợp chất HH06 49

Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất HH06 49

Hình 3.31: Phổ HMBC của hợp chất HH06 50

Hình 3.32 : Tương tác HMBC của hợp chất HH06 50

Hình 3.33: Phổ 1 H-NMR của HH07 51

Hình 3.34: Phổ 13 C-NMR của HH07 52

Hình 3.35: Phổ DEPT của HH07 52

Hình 3.36: Phổ HMBC của HH07 53

Hình 3.37: Cấu trúc của hợp chất HH07 54

Hình 3.38: Phổ 1 H của hợp chất HH08 54

Hình 3.39: Phổ 13 C của hợp chất HH08 55

Hình 3.40: Phổ DEPT của hợp chất HH08 56

Hình 3.41: Cấu trúc của hợp chất HH08 56

Bảng 2.1: Dữ kiện phổ NMR ( 1 H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) của hợp chất HH06 và của chất tham khảo [49] (đo trong CD3OD) 29

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa 22

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc 25

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES) 3

1.2 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES) 3

1.2.1 Các triterpenoid 4

1.2.2 Các coumarin 8

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO (STERCULIACEAE) 8

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN 12

1.4.1 Các phương pháp chiết xuất 12

1.4.2 Các phương pháp sắc ký 13

1.4.3 Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập được 15

1.4.3.1 Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy) 16

1.4.3.2 Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry) 17

1.4.3.3 Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Xử lý mẫu thực vật 21

2.3.2 Điều chế các cặn chiết 21

2.3.3 Phương pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên [35,36] 22

2.3.4 Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa 24

2.4 DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 25

2.4.1 Betulin (HH01) 25

2.4.2 Axit betulinic (HH02) 26

2.4.3 Axit alphitolic (HH03) 27

2.4.4 Axit oleanolic (HH04) 27

2.4.5 Hibiscolactone A (HH05) 28

2.4.6 Heliclactone (HH06) 28

2.4.7 Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH07) 29

2.4.8 β-sitostenone (HH08): 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH01 (betulin) 31

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH02 (axit betulinic) 35

3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH04 (axit oleanolic) 41

3.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH05 (3, 9 –dihydroxy-1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide hay hibiscolactone A) 44

3.6.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH06 (heliclacton) 47

3.7.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HH07 (6β-hydroxyenone) 51 3.8 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT HH08 β-SITOSTENONE 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Vinblastine và Vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don),

họ Trúc đào (Apocynaceae) và Taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia), họ

Thông (Pinaceae) Cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ deacetyl bacatin III, hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư

10-Việt Nam là quốc gia nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có

hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Trong số này, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt nam đã được thực hiện và đã có những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Những loài thực vật có tác dụng chữa bệnh là nguồn dược liệu quý giá bởi chúng có khả năng chữa bệnh cho con người và để lại ít tác dụng phụ hơn các thuốc có nguồn gốc tổng hợp Ngày nay, với mối hiểm họa về tình trạng gia tăng bệnh tật đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạch…thì việc nghiên cứu tác dụng làm thuốc của các loài thực vật mang tính ý nghĩa khoa

học và thời sự [2]

Cây An xoa đã được nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam

và trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như cảm cúm, sởi, ung nhọt, kiết lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan Ở nước ta, cây mọc nhiều ở Bình Phước, ven các sông suối, ngoài ra còn tìm thấy ở Lâm Đồng và các tỉnh miền núi phía Bắc Theo y học cổ truyền, từ xa xưa, cây An xoa được xem như là một bài thuốc gia truyền hỗ trợ điều trị xơ gan của người dân tộc thiểu số Camphuchia Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học hoàn

chỉnh và tác dụng dược lý của cây An Xoa ở Việt Nam và trên thế giới vẫn còn rất hạn chế Chính vì thế, chúng tôi đề xuất đề tài luận văn: “Phân tích

cấu trúc một số hợp chất trong cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) ở Việt

Nam bằng các phương pháp hóa lý hiện đại” với mục tiêu nghiên cứu

thành phần hóa học trong cây An xoa nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc một cách hợp lý và hiệu quả

*Mục tiêu nghiên cứu:

Nghiên cứu thành phần hóa học của thân cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái ở Việt Nam

*Nội dung nghiên cứu:

- Thu hái mẫu cây An xoa tại Thừa Thiên, Huế

- Phân lập các hợp chất tử thân cây An xoa bằng các phương pháp sắc ký

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại: MS, 1D, 2D-NMR

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CHI DÓ (HELICTERES)

Thành phần loài: Chi Dó (Helicteres) là một chi thuộc họ Trôm

(Sterculiaceae) bao gồm khoảng 40 loài được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới thuộc châu Á và châu Mỹ Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ [3], chi Dó

(Helicteres) ở Việt Nam bao gồm 9 loài, đó là: Helicteres viscida Bl…(dó trỉn, dó chuột), H angustifolia L (dó hẹp, ổ kén), H angustifolia var glaucoides Pierre (dó mốc), H angustifolia var obtusa Pierre (ổ kén hẹp), H angustifolia glabriuscula Wall (ổ kén không lông), H isora L (dó tròn), H lanceolata DC (dó thon), H plebeja Kurz (dó thường) và dó lông hay An xoa H hirsuta Lour

Về mặt hình thái: Cây gỗ hay cây bụi, có lông hình sao Lá đơn, có

cuống Cụm hoa ở nách lá; nhiều hoa Đài hình ống có 5 răng, thường chia 2 môi Cánh hoa 5, hình dải thuôn, thẳng hay gấp khúc, thon thành hình móng dài ở nửa dưới, thường có tai ở trên móng, không giống nhau Nhị 10, đính trên một cột hay nhụy dài, chỉ nhị 10, dính nhau nhiều hay ít; bao phấn lắc lư, thường ngoại hướng, rồi nội hướng, 2 ô Nhị lép 5, ở trong xen kẽ với nhị Bầu đính ở giữa các nhị; 5 ô; lá noãn 5, phân cách bởi các rãnh quả; noãn nhiều, đảo, xếp thành 2 dãy dọc; vòi thành cột; đầu nhụy không rõ Qủa nang,

có lông, hạt nhiều, hình tháp

Thành phần hóa học và tác dụng dược lý: Một số loài của chi này được

sử dụng trong y học dân tộc, như: rễ của loài Helicteres isora được dùng để trị chứng mưng mủ, viêm dạ dày, nhiễm trùng ruột, tiểu đường Loài H ovata

và H sacarolha được dùng để trị bệnh giang mai, và rễ của loài H hirsuta

được dùng để trị đau dạ con

1.2 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CHI DÓ (HELICTERES)

Các nghiên cứu sinh học của một số loài thuộc chi này đã chứng tỏ

rằng dịch chiết của loài H isora có hoạt tính chống tiểu đường, giảm mỡ máu

[4-6]; dịch chiết của H hirsuta có hoạt tính độc tế bào [7] và dịch chiết của H gardneriana thể hiện hoạt tính kháng ký sinh trùng gây bệnh sốt rét,

leishmania…[8]

Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài Helicteres đã chỉ ra được

việc phân lập các hợp chất: triterpenoid, flavonoid, lignan, neolignan và các dẫn xuất của axit rosmarinic

1.2.1 Các triterpenoid

Từ rễ của loài H angustifolia Các nhà khoa học Đài Loan [9] đã tách và

định lượng bằng phương pháp HPLC ba triterpenoid có khung lupan đó là:

acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid methyl ester (1), acetoxy-27-benzoyloxylup-20(29)-en-28-oic acid (2) và 3β-acetoxy-27- (p-

3β-hydroxyl) benzoyloxylup -20(29)-en-28-oic acid methyl ester (3)

Tiếp theo nghiên cứu trên, vào năm 2008, khi nghiên cứu rễ của loài H angustifolia, nhóm tác giả Min-Hsiung Pan và cộng sự [10] đã công bố các kết quả phân lập, và xác định cấu trúc của 3 triterpen mới đó là 3β-acetoxy-

27-[(E)-cinamoyloxy]lup-20(29)-en-28-oic acid methyl este (4), 27-[4-hydroxybezoyl)oxy]lup-20(29)-en-28-oic acid (5), 3β-acetoxy-27-[(4-

3β-acetoxy-hydroxybezoyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid methyl este (6), cùng với 8

triterpen có cấu trúc đã biết là

3β-acetoxy-27-(benzoyloxy)_olean-12-en-28-oic acid methyl este (7), cylicodiscic acid oic acid) (8), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulinic acid (9), pyracrenic acid (3β- O-(trans-caffeoyl)_betulinic acid) (10), 3β-O-(trans-feruloyl)betulinic acid (11), 3β-O-(trans-coumaroyl)_betulin (12), 3β-O-(cis-coumaroyl)_betulin (13), 3β-O-(trans-caffeoyl)_betulin (14), và 3β-O-(trans-feruloyl)_betulin

(3β,27-dihydroxylup-20(29)-en-28-(15)

Ngoài ra, một số triterpenoid có khung lupan cũng được công bố bởi

các nhóm tác giả khác nhau khi nghiên cứu loài H angustifolia như

3β-acetoxylup-20 (29)-en-28-ol (16) [10], 3β-hydroxylup-20(29)-en-28-oic acid

3-caffeate (17) [12], axit betulinic (18)

Hình 1.1: Một số triterpenoid phân lập từ chi Dó Helicteres

Ngoài ra, các hợp chất cucurbitacin cũng được tìm thấy trong một số loài

của chi Helicteres Về mặt hóa học, các cucurbitacin được xếp vào lớp chất

triterpenoid, các cucurbitacin thường có nhiều ở các cây trong họ Cucurbitaceae (họ bầu bí)

Từ rễ của loài H angustifolia thu hái ở Đài Loan, các nhà khoa học Đài

Loan đã phân lập được 2 cucurbitacin mới là cucurbitacin B2-sunfate (19) và

cucurbitacin glucoside (20) cùng với 2 cucurbitacin glucoside đã biết là arvenin I (21) và arvenin III (22) [14]

Một nghiên cứu khác từ rễ của loài H angustifolia của nhóm tác giả

Trung Quốc [15] đã công bố việc phân lập và xác định cấu trúc của

cucurbitacin D (23) và cucurbitacin J (24) vào năm 2006, hai chất này có hoạt

tính tốt đối với cả hai dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư gan BEL-7402 (với giá trị IC50 của hai chất lần lượt là 1,41 và 1,37 µM) và ung thư sắc tố da SK-MEL-28 (với IC50 tương ứng là 1,22 và 1,28 µM)

Từ loài H isora, nhóm tác giả Bean, M F và cộng sự [16] đã phân lập

được cucurbitacin B (25) và isocucurbitacin B (26), đây là hai hợp chất được

phát hiện là có độc tính trên dòng tế bào ung thư KB với giá trị ED50= <10-5µg/ml (cucurbitacin B), và ED50= 7.6×10-5 µg/ml (isocucurbitacin B)

Hình 1.2: Một số cucurbitacin phân lập từ chi Dó Helicteres

Cũng từ rễ của loài H angustifolia [15], các tác giả Trung Quốc đã phân lập đƣợc một steroit có khung pregnan tên là 2α,7β,20α-trihydroxy-3β,21-

dimethoxy-5-pregnanene (27)

1.2.2 Các coumarin

Từ rễ loài H angustifolia, nhóm tác giả Wenliang Chen và cộng sự đã phân lập được một coumarin mới có tên là 6,7,9α-trihydroxy-3,8,11α-

trimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin (28) [15] Cũng từ loài H angustifolia,

Wang và cộng sự [17] đã phân lập ra một hợp chất coumarin mới và đặt tên là

heliclacton (29)

Hình 1.3: Một số coumarin phân lập từ chi Dó Helicteres

Ngoải ra, chi Helicteres còn có chứa các hợp chất khác như

sesquiterpenoid quinon [19, 20], lignan [21], neolignan [22, 23], acid rosmarinic [24] và flavonoid [25,26]

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA HELICTERES HIRSUTA LOUREIRO

(STERCULIACEAE)

Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là

Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae An xoa là cây bụi,

cao khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông Lá hình trái xoan, dài 5-17cm, rộng 2,5-7,5cm Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn Mép có răng không đều Mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5, cuống lá dài 0,8-4cm, lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có nhiều gợn, chứa 25-30 noãn trong mỗi lá noãn Quả nang hình trụ nhọn, hạt nhiều, hình lăng trụ Ra hoa kết quả từ tháng 7 đến tháng 11 [27]

Hình 1.4: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.)

Cây An xoa phân bố ở Nam Trung Quốc và nhiều nước Nam Á như Ấn

Độ, Camphuchia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippine Ở Việt Nam, cây thường gặp trên các đồi cây bụi, rừng thưa, ven rừng, phổ biến từ Bắc tới Nam, như ở Bình Phước, Lâm Đồng và các tỉnh miền núi phía Bắc [28] Cây

An xoa đã được nhắc đến trong danh mục Thực vật chí ở Việt Nam và trên thế giới, dùng để chữa nhiều bệnh khác nhau như cảm cúm, sởi, ung nhọt, kiết

lỵ, trong đó có tác dụng với các bệnh về gan [29,30]

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Khi nghiên cứu loài An xoa Helicteres hirsuta có nguồn gốc từ

Indonexia, nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) đã phân lập được 6 lignan

có tên là (±)-pinoresinol (30); (±)-medioresinol (31); (±)- syringaresinol (32); (-)-boehmenan (33); (-)-boehmenan H (34) và (±)-trans-dihydro diconiferyl alcohol (35) [21]

Hình 1.5: Các lignan phân lập từ cây An xoa (Helicteres hirsuta)

Trong số 6 lignan tách ra từ loài này thì có 3 chất là 1, 4 và 5 là có hoạt

tính ức chế 3 dòng tế bào ung thư là: ung thư phổi (Lu1), ung thư tuyến tiền

liệt (LNCaP) và ung thư vú (MCF-7), trong đó, (±)-pinoresinol (30) thể hiện

khả năng gây độc tế bào mạnh trên dòng ung thư phổi Lu1, ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP), ung thư vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml

Gần đây, cây An xoa cũng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong nước Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015, 2016) đã công bố cặn chiết nước

và cặn chiết methanol từ lá và thân cây An xoa thu hái ở Khánh Hòa, Việt

Nam giàu nhóm chất phenol và flavonoid có tác dụng chống oxy hóa invitro

trên hệ DPPH, ABTS, FRAP [31, 32] Nhóm tác giả Hữu Duyên (2016) đã phân lập được 4 hợp chất từ cặn petroleum ether (PE) cây An xoa thu hái ở

Kiên Giang: lupeol (36), stigmasterol (37), tiliroside (38) và apigenin (39), kết

quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao chiết PE và cao chiết dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan HepG2 với IC50

lần lượt là 28,29 và 30,30 µg/ml [33]

Hình 1.6: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L thu

hái ở Kiên Giang (Hữu Duyên, 2016)

Ngoài ra, nhóm tác giả Ngọc Quang (2018) đã phân lập được 12 hợp

chất từ loài An xoa H.hirsuta thu hái ở Bình Phước bao gồm:

3-O-transcaffeoylbetulinic acid (40), 3b-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid

methyl ester (42), betulinic acid (43), lupeol (44), 4-hydroxybenzoic acid (45), 3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester

(46), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (47), 5,8-dihydroxy-7,40-

dimethoxyflavone (48), isoscutellarein 4’-methyl ether

8-O-b-Dglucopyranoside (49), methyl caffeate (50) and stigmasterol (51) [34]

Hình 1.7: Một số hợp chất phân lập từ cây An xoa Helicteres hirsuta L thu

hái ở Bình Phước (Ngọc Quang, 2018)

Từ tổng quan tài liệu trên đây, chúng ta thấy chi Dó (Helicteres ) có

phong phú các lớp chất giàu hoạt tính sinh học như: terpenoid, lignan, polyphenol, flavone, courmarin trong đó các công trình công bố cho tới nay

về cây An xoa còn khá ít ỏi Vì vậy, các nghiên cứu sâu rộng hơn nữa là việc làm cần thiết để chứng minh tác dụng chữa bệnh của loài thực vật này

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC

CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

1.4.1 Các phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra Mỗi loại hợp chất có

độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dược liệu

Phương pháp chiết có hai phương pháp chiết:

Phương pháp 1: Phương pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu

sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp

cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh

để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: ether dầu, ether, chloroform, cồn và cuối cùng là nước

Phương pháp 2: Phương pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ

thành phần trong dược liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc ethanol (80%) Nhất là methanol được xem như là dung môi vạn năng, nó hòa tan được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh Ví dụ dãy dung môi: ether

dầu, ether, chloroform, ethyl axetate, n-buthanol

Về cách chiết có hai cách chiết:

- Chiết ngâm lạnh: là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa Sau khi chuẩn bị dược liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết

Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ lên trên Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần

- Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất

cần chiết xuất Phương pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phương pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhưng có nhược điểm là chỉ áp dụng được với quy mô nhỏ

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 1.8) Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf

Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf

 Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 1.9):

Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trước khi dùng phải hoạt hóa trong tủ

sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ Để nguội và bảo quản trong bình hút

ẩm Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng Vạch đường chấm chất phân tích (cách

mép dưới của bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm)

Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc

micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử

Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy

kín và đáy phải bằng Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết

Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng

254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2)

có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh

Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong

quá trình sắc ký Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột

 Kỹ thuật sắc ký cột (Hình 1.10):

Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C

trong 4 giờ trước khi đưa lên cột Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc

Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột Có 2

cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột

và không được để khô dung môi trong cột

Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất

phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng Có nhiều cách đưa chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…

Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột

mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích

Hình 1.10: Các bước tiến hành sắc ký cột 1.4.3 Các phương pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập được

Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một quá trình tập hợp và phân tích các dữ liệu từ nhiều nguồn khác nhau, mỗi nguồn cung cấp một số thông tin về cấu trúc của chất Cấu trúc của chất được xác định phải phù hợp với tất

cả các thông tin cấu trúc từ các nguồn trên Hiện nay, các phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại đã được sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các phương pháp phổ hấp thụ như phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng ngoại (IR), các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng (MS) Ngoài ra, sự phát triển và ứng dụng các phương pháp “ghép-nối" giữa sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các phương pháp khác như HPLC-MS, HPLC-NMR,… đã làm tăng tốc độ và độ nhạy của các phương pháp xác định cấu trúc

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất là các phương pháp đo phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1

tử

Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10000 đến 100 cm-1

và biến thành năng lượng của dao động phân tử

Sự biến đổi năng lượng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lượng quay Sự hấp thụ này có định lượng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với cường độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) Mỗi loại dao động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối lượng tương đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình

học của nguyên tử Do đó, phổ hồng ngoại cho phép xác định thông tin về cấu trúc hóa học như cấu dạng và nhóm chức đặc trưng của hợp chất hữu cơ

Đơn vị trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1) Sự hấp thụ có nhiều ý nghĩa trong việc ứng dụng phổ hồng ngoại để phân tích câu trúc các hợp chất hữu cơ là sự hấp thụ trong vùng 4000 – 660 cm-1

1.4.3.2 Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu Cơ sở của phương pháp này là sử dụng

từ trường và điện trường để bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ thành ion phân

tử hoặc các mảnh ion mang điện tích trong chân không Phương pháp MS khác với các phương pháp phân tích phổ khác là nó không phụ thuộc vào độ hấp thụ của bức xạ điện từ mà dựa trên quá trình phân tử bị bắn phá bởi chùm electron mang năng lượng cao Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+ Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa Vì khối lượng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lượng của

M+ chính là khối lượng của phân tử Dựa trên số khối của ion phân tử (M+

) có thể xây dựng được công thức phân tử của hợp chất

1.4.3.3 Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance ), là một phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1

H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học Trong phổ NMR

có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của 1 phân tử là độ dịch chuyển hóa học () và hằng số tương tác spin – spin (J)

tương tác J để có thể cung cấp các thông tin giúp xác định cấu trúc hóa học của

hợp chất

Phổ 13

C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch carbon Mỗi nguyên tử

carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo cho phổ 13

C-NMR cũng được tính bằng ppm nhưng với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm) Ngoài ra phổ 13C còn được ghi theo phương pháp DEPT (Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer)

Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phân loại các bậc carbon khác

nhau Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của

CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH Kết hợp phổ 13

C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Phổ HSQC cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của 1

H và 13C Phổ HSQC cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và cacbon

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Đây là phổ thể hiện tương tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa cacbon

và proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phần của phân tử cũng như toàn

bộ phân tử được xác định Phổ này đặc biệt thích hợp trong trường hợp phân

tử chứa cacbon bậc bốn vì nó thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của 13C khác ở cách xa nó 2-3 liên kết thậm chí trong một số trường hợp là bốn liên kết

Phổ COSY (Correlation spectroscopy)

Phổ COSY biểu diễn các tương tác giữa proton – proton Các proton tương tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một cacbon hoặc với cacbon liền kề Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được xác định

Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)

Phổ NOESY biểu diễn các tương tác không gian của các proton không

kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách không gian của chúng được phân bố trong phân tử (khoảng 4A0) Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mẫu lá, thân loài cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) được thu hái tại

Thừa Thiên-Huế tháng 9 năm 2017 Mẫu tiêu bản ký hiệu là TRA020917

Tên khoa học của các loài thực vật này được PGS.TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định Các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại

- Thuốc hiện trong phân tích TLC: sắc ký lớp mỏng được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng 254nm và 365nm, và được hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy cô quay chân không Buchi 3120

- Điểm nóng chảy được đo trên máy melting point meter Buchi B545

- Phổ hồng ngoại được đo trên máy Spectrum Two PerkinElmer bằng phương pháp viên nén KBr hoặc bao film P

- Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500,13 MHz spectrometer với TMS là chất nội chuẩn

Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học và Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xử lý mẫu thực vật

Cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) sau khi thu hái được chia thành hai

bộ phận riêng biệt là lá và thân cây Từng bộ phận này được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45o C, sau đó đem nghiền nhỏ riêng rẽ

2.3.2 Điều chế các cặn chiết

3,2kg bột khô thân cây An xoa được ngâm chiết với ethanol 70o

(2L/lần) bằng siêu âm ở 40-450C Quá trình chiết được lặp lại 3-4 lần Gộp chung dịch của 3 lần ngâm chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết ethanol tổng Tiếp đó, hòa cao chiết tổng bằng dung dịch ethanol: H2O (1:1) và chiết phân bố lần lượt với dung môi n- hexane, ethyl

acetate Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần sử dụng 500 ml dung môi Gộp chung dịch chiết của các lần chiết và làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được cặn cặn chiết tương ứng gồm

cặn n- hexane (12g) và cặn ethyl acetate (40,5g) Phần dịch nước còn lại được

cất loại hết dung môi thu được cặn chiết nước (45g)

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa

2.3.3 Phương pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các

hợp chất tự nhiên [35,36]

Việc phân lập, tinh chế các hợp chất từ các cặn chiết được thực hiện bằng các phương pháp kết tinh và sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát, điều chế lượng nhỏ), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck) và sephadex LH-20 Dung môi rửa giải chủ yếu dùng

các hệ dung môi như n-hexan/CH2Cl2, n-hexan/EtOAc, n-hexan/axetone,

CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp

Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là

sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý như điểm nóng cháy, độ quay cực []D… với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một

chiều (1

H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập)

Phổ hồng ngoại (Infrared - IR)

Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức đó

Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)

Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử

Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ khối lượng MS (Mass spectrometry)

Phổ khối lượng dựa trên sự phân tách chất tương ứng khối lượng phân

tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trường và điện trường để tác động lên các hạt tích điện (ion) trong chân không Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi

la ion mẹ) M+ Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa Vì khối lượng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử

δ và hằng số tương tác spin – spin J Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D

NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo

Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc kí sẽ được tiến hành đo phổ NMR Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton

H-NMR Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon 13C-NMR và DEPT Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

H-NMR, 13C-NMR và DEPT) Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ

IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc Hợp chất sau khi đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HR-

MS

2.3.4 Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa

Tiến hành sắc ký cột silica gel cặn EtOAc (50g) với hệ dung môi

n-Hexan/EtOAc gradien (100:0-0:100), thu được 12 phân đoạn chính, kí hiệu

F1-F12

Từ phân đoạn F1(1,95g), sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung

môi n-hexan/EtOAc gradien, thu được 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F1.1- F1.3 Tinh chế tiếp F1.2 (300mg) trên cột Sephadex LH-20 và cột silica gel (n-

hexan/aceton) thu được hợp chất HH08 (11mg) và hợp chất HH06 (9mg)

Phân đoạn F3 (2,5g) được tinh chế trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi

n-hexan/aceton gradient (95:5-0:100) thu được 3 phân đoạn nhỏ F3.1-F3.3 Hợp

chất HH04 (12mg) thu được từ phân đoạn nhỏ F3.1 sau khi kết tinh trong

axetone Phân đoạn nhỏ F3.3 (450mg) được phân tách trên cột silica gel

(n-hexan/aceton 93:7-0:100) thu được hợp chất HH07 (30mg) Phân đoạn

F4(1,75g) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH) thu được 3 phân đoạn nhỏ F4.1-F4.3 Tiếp tục tinh chế F4.3 bằng cột silica gel

(diclometane/aceton 98:1-0:100) thu được hợp chất HH05 (15mg) Từ phân

đoạn F6 (3,7g) tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton

gradient (0-100%) thu được 5 phân đoạn nhỏ ký hiệu F5.1-F5.5 Phân đoạn nhỏ F6.3 (700mg) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi

MeOH/diclometane: 9/1) thu được hợp chất HH02 Phân đoạn nhỏ F6.5

(900mg) được tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH/diclometane: 9/1) sau đó rửa giải trong hệ dung môi aceton thu được

hợp chất HH03 Phân đoạn F9 (3,8g) được phân tách trên cột silica gel với hệ

dung môi rửa giải là diclometan/methanol gradient (0-70%) thu đƣợc 3 phân

đoạn nhỏ ký hiệu F9.1- F9.3 Phân đoạn nhỏ F9.3 tinh chế bằng sắc ký bản

mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan/aceton 8/2 thu đƣợc hợp chất

HH01 (15mg)

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc

2.4 DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN

LẬP ĐƢỢC

2.4.1 Betulin (HH01)

CẶN CHIẾT EtOAc

Sephadex LH-20

và cột silica gel

n-He/Aceton

Điều chế bản mỏng hệ dm

CH2Cl2/aceton 8/2

27.5mg

CH2Cl2/aceton 98:1-0:100

700mg Sephadex LH-20 MeOH/CH2Cl2 9/1

HH02

21mg

F6.5 900mg Sephadex LH-20 hệ MeOH/CH2Cl29/1

HH03

13mg

CH2Cl2/MeOH gradient 0-70% F9.3

900mg

HH01

15mg

F1.1-F1.3 F3.1-F3.3 F4.1-F4.3 F6.1-F6.5 F9.1-F9.3

C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ ppm 14,77 27); 15,35 24); 16,0

25); 16,1 26); 18,3 6); 19,1 30); 20,8 11); 25,2 12); 27,1 2); 27,4 (C-15); 28,0 (C-23); 29,2 (C-21); 29,8 (C-16); 34,0 (C-7); 34,2 (C-10); 37,2 (C-22); 37,3 (C-13); 38,7 (C-1); 38,9 (C-4); 39,9 (C-8); 42,7 (C-14); 47,8 (C-19); 48,8 (C-18), 50,4 (C-9); 50,8 (C-17), 55,3 (C-5); 60,6 (C-28); 79,0 (C-3); 109,7 (C-29); 150,5(C-20)

30); 3,15 (1H, dd, J 5,0 và 11,5 Hz, 3); 3,03 (1H, dt, J= 4,5 và 11,0Hz, 19); 4,61 (1H, dd, J 2,0 và 3,5 Hz, H-29); 4,73 (1H, br d, J = 2,0 Hz, H-

H-29)

13

C-NMR (125,76 MHz, CD3OD): δ 15,1 (C-27); 16,0 (C-24); 16,6 (C-25); 16,7 (C-26); 19,5 (C-6); 19,6 (C-30); 22,1 (C-11); 27,0 (C-12); 28,1 (C-2); 28,6 (C-23); 30,9 (C-15); 31,8 (C-21); 33,4 (C-16); 35,7 (C-7); 38,1 (C-10); 38,4 (C-22); 39,8 (C-13); 40,0 (C-1); 40,2 (C-4); 42,1 (C-8); 43,7 (C-14);

49,8 (C-19); 50,7 (C-18), 52,1 (C-9); 57,0 (C-5); 57,5 (C-17); 79,8 (C-3); 110,0 (C-29); 152,0 (C-20); 180,0 (C-28, COOH)

s, 30); 2,91 (1H, d, J=1,0 Hz, 3); 3,03 (1H, dt, 18); 3,63 (1H, dt, 2); 4,62 (1H, s, H-29); 4,73 (1H, br d, J=2,0 Hz, H-29)

H-13

C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 15,1 (C-27), 16,6 (C-26), 17,2 (C-24), 17,8(C-25), 19,5 (C-6), 19,6 (C-30), 22,2 (C-11), 26,8 (C-12), 29,1 (C-21); 30,8 (C-15), 31,7 (C-16), 33,3 (C-7); 35,5 (C-22); 38,1 (C-13), 39,5 (C-10); 39,6 (C-8); 40,5 (C-4); 41,9 (C-14); 43,6 (C-1); 48,3 (C-2); 48,4 (C-24); 50,4 (C-18), 51,9 (C-19), 56,8 (C-9); 57,5 (C-5); 69,7 (C-17); 84,4 (C-3), 110,2 (C-29), 151,9 (C-20), 180,0 (C-28)

2.4.4 Axit oleanolic (HH04)

Chất rắn màu trắng, đnc: >300o

C

ESI-MS (m/z): 457 [M+H]+; C30H48O3