Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum

Mục đích của luận án nhằm điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb. fermentum hiệu quả nhất; Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

FF

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đỗ Thị Bích Thủy

HUẾ - NĂM 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Nghiên cứu sinh

Trần Thị Ái Luyến

ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BMM basal minimum medium Môi trường tối ưu cơ bản

CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL

COSY Correlated Spectroscopy

DMSO Dimethyl sulfoxide

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ

FTF fructosyltransferase

HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp

HMBC Heteronuclear multiple - Bond

Correlation HoPS homopolysaccharide Polysaccharide thuần

GlcA glucuronic acid

GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn

UDP Uridine diphosphate

WPC whey protein concentration

iv

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về polysaccharide 3

1.1.1 Giới thiệu chung về polysaccharide 3

1.1.2 Ứng dụng của polysaccharide 4

1.2 Tổng quan về Lactobacillus fermentum 5

1.3 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa 6

1.3.3 Tính chất chức năng và ứng dụng 14

1.4 Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB 20

1.4.1 Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS 20

1.4.2 Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS 23

1.4.3 Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc

24

1.4.4 Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe 34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đối tượng nghiên cứu 37

3.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 37

2.2.1 Hóa chất 37

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 37

3.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) 38

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] 38

2.3.3 Phương pháp thu nhận và tách EPS 39

2.3.4 Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum 40

2.3.5 Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] 43

2.3.6 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] 44

2.3.7 Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công

nghệ thực phẩm 45

2.3.8 Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS 47

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 52

3.1 Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum 52

3.1.1 Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb fermentum sinh tổng hợp EPS cao 52

3.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb fermentum tuyển chọn 54

3.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 66

3.1.4 Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 82

3.2.1 Khả năng hòa tan trong nước 89

3.2.2 Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu 91

3.2.3 Khả năng chống oxy hóa 95

3.3 Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum MC3 99

3.3.1 Khối lượng phân tử 99

3.3.2 Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128

1 Kết luận 128

2 Kiến nghị 130

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các

loài Lactobacillus đã được công bố 22

Bảng 1.2 Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng 27

Bảng 1.3 Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố 29

Bảng 1.4 Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố 35

Bảng 2.1 Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS 50

Bảng 3.1 Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb fermentum nghiên cứu trong luận án 81

Bảng 3.2 Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb fermentum trong luận án 89

Bảng 3.3 Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb fermentum 90

Bảng 3.4 Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb fermentum 92

Bảng 3.5 Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb fermentum 93

Bảng 3.6 Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) 96

Bảng 3.7 Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 103

Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 103

Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 110

Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO 118

Bảng 3.11 Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC 119

Bảng 3.12 Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án 123

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose 3

Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc Lb fermentum 5

Hình 1.3 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS 7

Hình 1.4 Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan 7

Hình 1.5 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB 9

Hình 1.6 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS 10

Hình 1.7 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB 11

Hình 1.8 Cấu tạo của glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-glactose 12

Hình 1.9 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB 14

Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB 15

Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối 38

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận và tách EPS 39

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS 40

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 45

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside 48

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS 49

Hình 3-1 Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic 53

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum 55

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum 61

Hình 3.4 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 66

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 69

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 72

viii

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các

chủng Lb fermentum 77

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC13 83

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC16 83

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC21 83

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum MC3 84

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS 87

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS 88

Hình 3.14 Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 100

Hình 3.15 Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR 111

Hình 3.16 Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 112

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 113

Hình 3.18 Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 116

Hình 3.19 Phổ đồ COSY của EPS-MC3 117

Hình 3020 Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 118

Hình 3.21 Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 119

Hình 3.22 Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần 120

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115] Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …

Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp Đây

là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ

vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59] Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat, Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác

Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…

Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên quan đến nguồn phân lập vi khuẩn, thành phần các chất dinh dưỡng trong quá trình

2

lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS

sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus

fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”

Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:

1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum hiệu quả nhất;

2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;

3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một

số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về polysaccharide

1.1.1 Giới thiệu chung về polysaccharide

Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật), [29]

Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside

Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan

Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở Các PS thường được tạo nên bởi các đơn

vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose) Các monosaccharide này có cấu trúc dạng

α và β Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất β-D-glucopyranose có

thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a) Ngoài ra, vòng 5 cạnh

(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật

(b) (a)

Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose [29]

4

Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học

và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học, Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể

kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]

1.1.2 Ứng dụng của polysaccharide

Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,…

Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia

được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt,

từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67]

Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến Chúng đang

đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm

và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]

Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,

tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công

cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất

chuẩn trong kỹ thuật phân tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký như sắc ký khối phổ (mass spectrometry (MS)), sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid

chromatography (HPLC)) [67], [114]

Nhìn chung, nhờ vào những tính chất chức năng công nghệ như khả năng tạo gel, tạo độ nhớt, làm bền nhũ tương cũng như khả năng tự phân giải nên các hợp chất

PS càng ngày càng được quan tâm nghiên cứu khai thác bởi các nhà khoa học trong

nước cũng như trên thế giới [10], [19], [39], [136] Một trong những nguồn cung cấp

các hợp chất PS đang được quan tâm nhiều nhất là LAB đặc biệt là các PS được chúng tiết ra ngoài môi trường và được gọi là EPS

1.2 Tổng quan về Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum là một loài vi khuẩn Gram dương thuộc chi Lactobacillus (Lb.), các vi khuẩn này thường được tìm thấy trong các sản phẩm lên

men từ động vật và thực vật Chúng là những vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường như glucose (glc), fructose (fruc), maltose, sucrose, lactose Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chịu các tác động không nhỏ bởi các yếu tố vật lý (pH, nhiệt độ, thời gian, …),

các yếu tố hóa học (nguồn carbon (C) nguồn nitrogen (N),…) Lb fermentum có thể

tạo thành các khuẩn lạc màu trắng xám với đường kính khoảng 1µm Hình dạng khuẩn lạc của chủng này có thể lồi lõm hoặc hơi lồi, bề mặt nhẵn (Hình 1.2a) Đặc điểm nổi

bật của khuẩn lạc Lb fermentum là có cấu trúc vòng tròn đồng tâm ở trung tâm khi

được quan sát dưới kính hiển vi (Hình 1.2b) Hầu hết các tế bào vi khuẩn được sắp xếp dưới dạng đơn lẻ hoặc theo cặp; chúng không có khả năng sinh bào tử và không

di động [143]

Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc Lb fermentum [143]

6

Từ lâu, Lb fermentum đã được sử dụng như là giống khởi đầu cho quá trình lên

men trong nhiều sản phẩm thực phẩm và đồ uống Bên cạnh đó, cũng giống như các loài thuộc LAB khác, trong quá trình lên men carbohydrate, ngoài sản phẩm chính là

acid lactic, Lb fermentum còn tạo ra các hợp chất tạo hương (diacetyl/acetoin) và đặc

biệt là các PS ngoại bào (EPS) [59] Chúng là những hợp chất có giá trị thương mại lớn với các tính chất hóa lý có lợi như khả năng tạo gel, tạo kết cấu, tạo độ đặc trong thực phẩm cùng những tác động có lợi liên quan đến sức khỏe như có tiềm năng probiotic, làm giảm cholesterol, kích thích miễn dịch, chống ung thư [81], [89], [132]

Kể từ các chủng vi khuẩn lactic (LAB-Lactic Acid Bacteria) được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA- Food and Drug Administration) công nhận

là vi khuẩn an toàn cho sức khỏe con người, sự quan tâm về EPS từ LAB nói chung

đặc biệt là từ các loài Lb fermentum nói riêng nhằm thay thế cho các PS từ thực vật

ngày càng tăng trong xu hướng sản xuất, lưu thông các sản phẩm có tính chất tự nhiên

và an toàn

Nhờ những tính chất ưu việt độc đáo và mới lạ riêng biệt, gần đây các chế phẩm

PS thương mại được khai thác từ vi sinh vật đã và đang nhận được sự quan tâm nhiều hơn Trong luận án này, chúng tôi tập trung nghiên cứu về EPS từ các chủng LAB

thuộc loài Lb fermentum

1.3 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.3.1 Khái niệm

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn có thể sinh tổng hợp nhiều loại PS khác nhau Tùy theo vị trí của chúng trên tế bào, các PS đó có thể là nội bào hoặc ngoại bào Những PS được tiết ra bên ngoài màng tế bào được gọi là PS ngoại bào Chúng có thể tạo thành một chất dính bám chặt và được gọi là PS dạng màng bao hoặc cũng có thể được gắn lỏng lẻo hoặc được bài tiết hoàn toàn ra môi trường như là các chất nhờn gọi là EPS [19], [87], [91]… Chúng là những PS chuỗi dài, phân nhánh với các đơn vị lặp đi lặp lại của các monosaccharide hoặc các dẫn xuất của chúng [87]

1.3.2 Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa

Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, các EPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và các homopolysaccharide (HoPS) [13], [91], [115] Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ở bên trong hoặc ở bên ngoài tế bào Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme [69], [90]

- Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS)

HoPS là những PS được cấu tạo từ một loại monosaccharide (dạng hexose) như

D-glc hoặc D-fruc (Hình 1.3) Các chi thuộc LAB như Lactobacillus, Leuconostoc (Leu.),

Streptococcus (S.) được biết đến như là nguồn sinh tổng hợp HoPS

Tín hiệu xuất Glc Fruc

Hình 1.3 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS [13]

Hình 1.4 Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan [13]

8

Quá trình tổng hợp HoPS xảy ra ở bên ngoài tế bào nhờ sự xúc tác của các enzyme đặc hiệu glycosyltransferase (GTF - glucansucrase) hoặc fructosyltransferase (FTF - fructansucrase) Các enzyme này từ nội bào di chuyển ra bên ngoài tế bào nhờ tín hiệu xuất Sau đó chúng xúc tác thủy phân sucrose thành glc và fruc và tạo ra liên kết glycoside của glc hoặc fruc với một phân tử chất nhận tạo nên chuỗi glucan hoặc fructan Đây chính là các HoPS ngoại bào (EPS) (Hình 1.4) [13], [59]

Như vậy, sucrose chính là cơ chất được LAB sử dụng để sinh tổng hợp EPS Trong quá trình này, sucrose được thủy phân thành glc và fruc như là những cơ chất mới Phản ứng này cũng có vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp nên các PS [27]

Các HoPS từ LAB thường có sự khác nhau về loại liên kết, mức độ phân nhánh,

độ dài của chuỗi glycan, khối lượng phân tử và cấu tạo của chúng [59], [106] Tùy vào thành phần monosaccharide tạo thành trong cấu trúc của HoPS là glc hoặc fruc

mà các HoPS có thể được phân thành hai nhóm chính: glucan và fructan (Hình 1.5) [13], [92], [106]

Tóm lại, hai phân nhóm glucan và fructan là các HoPS được cấu tạo bởi các monome là các phân tử glc và fruc Sự khác nhau giữa chúng được thể hiện qua các liên kết đặc trưng, khối lượng phân tử, độ dài và cấu tạo hóa học [28]

phân nhánh

- Lb reuteri

Levan: liên kết β-(2,6) Mạch thẳng

- Lb reuteri 121

- Lb sanfranciscensis

Hình 1.5 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB [13]

10

- Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS)

Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệ monosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểm cấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 1.6)

Các chủng vi khuẩn ưa ấm (mesophilic) Lactococcus (La) lactis subsp lactis,

La lactis subsp cremoris, Lb casei, Lb sake, Lb rhamnosus, v.v.) và các chủng ưa

nhiệt (Lb acidophilus, Lb delbrueckii subsp bulgaricus, Lb helveticus và S

thermophilus) được biết đến như là nguồn tổng hợp nên các HePS từ LAB [18], [27]

[29] Quá trình sinh tổng hợp của các HePS xảy ra trong tế bào (Hình 1.7) Đó là một chuỗi phức tạp của các phản ứng liên quan đến hệ enzyme nội bào của LAB và thường trải qua ba giai đoạn: (a) sự hấp thu cơ chất, (b) sự chuyển hóa đường trung gian và (c) quá trình tổng hợp PS [59], [66]

(1) Sự hấp thụ cơ chất từ môi trường vào trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.7a)

Đây là quá trình vận chuyển các nguồn C, chủ yếu là các monosaccharide và disaccharide, từ bên ngoài môi trường vào tế bào chất Sau khi vào trong tế bào, hầu hết các nguồn C đều được chuyển thành glc Quá trình này được thực hiện lặp đi lặp lại Tùy thuộc vào loại cơ chất mà nó có thể được đưa đến các tế bào thông qua một

hệ thống vận chuyển thụ động hoặc chủ động Các hệ thống tham gia vào quá trình

vận chuyển đường thường là phosphoenolpyruvate - phosphotransferase (PEP-PTS)

của LAB [98]

(2) Sự chuyển hóa tạo nên các loại đường trung gian (Hình 1.7b): Quá trình chuyển

hóa này gồm hai giai đoạn: giai đoạn tổng hợp glucose-1-phosphate (Glc-1P) và giai đoạn hoạt hóa, liên kết của các loại đường

Hình 1.6 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS [13]

Hình 1.7 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB [59]

12

- Sự tổng hợp glucose-1-phosphate

Khi vào tế bào chất, glc trải qua quá trình glycolysis và phosphoryl hóa Đây là chìa khóa trung gian quan trọng gắn kết các quá trình đồng hóa trong sự tổng hợp EPS và các quá trình dị hóa của sự phân giải đường Trước hết, dưới tác dụng của hexokinase, glc tạo thành glucose-6-phosphate (Glc-6P) Sau đó, dưới tác dụng của phosphoglucomutase (PGM), Glc-6P được chuyển thành Glc-1P

- Sự hoạt hóa và liên kết của các loại đường:

Glc-1P tiếp tục được chuyển hóa thành các nucleotide-đường (NDP) như Uridine diphosphate glucose (UDP-glc) và Thymidine diphosphate glucose (TDP-glc) (Hình 1.8) nhờ xúc tác của các enzyme tương ứng là UDP-glucose

pyrophosphorylase (UGP) và TDP-glucose pyrophosphorylase (TGP)

Sau đó, các loại đường này tiếp tục chuyển hóa tạo nên các NDP khác bao gồm Uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) do UDP-Glc chuyển thành dưới tác dụng của UDP-Gal-4-epimerase (UGE) và TDP Rhamnose (TDP-Rha) do sự chuyển hóa

từ TDP-Glc dưới tác dụng xúc tác bởi TDP-glc dehydratase Bên cạnh đó, Glc-1P cũng có thể được chuyển hóa theo hướng tạo thành Mannose-6P (Man-6P) nhờ xúc tác của enzyme phosphomannomutase (PMM) Từ Man-6P tiếp tục hình thành các

TDP-glucose UDP-glucose

Hình 1.8 Cấu tạo của glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và

UDP-glactose [27]

hợp chất Man-1P, GDP-Man và Guanosine di phosphate fructose (GDP-Fruc) nhờ sự xúc tác lần lượt của các enzyme tương ứng là, man-1P guanylyltransferase, GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP) và GDP-mannose dehydratase; hoặc từ Glc-1P thông qua bước gian là tạo thành fructose-6P (fruc-6P) dưới tác dụng của hexokinase Man-6P được hình thành từ fruc-6P nhờ sự xúc tác của enzyme phosphomannoisomerase (PMI) và cuối cùng là GDP-fructose

Sự tạo thành các NDP này (UDP-glc, TDP-Rha, UDP-Gal và GDP-Fruc) có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp EPS Chúng chính là tiền thân của các đơn

vị lặp lại góp phần tạo nên sự đa dạng trong cấu trúc của các PS từ vi khuẩn

Bên cạnh đó, Glc-6P còn được đồng phân hóa và hướng tới các sản phẩm của quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí Pyruvate này theo chu trình Kreps và hình thành ATP (Adenosin Triphosphate) để cung cấp năng lượng cho quá trình sinh tổng hợp các nucleotide-đường trong tế bào

(3) Quá trình tổng hợp EPS (Hình 1.7c) Đây là sự lắp ráp của các đơn vị lặp đi lặp lại monosaccharide Dưới sự xúc tác của hệ enzyme GTF, các NDP gồm UDP-glc, UDP-gal, TDP-rha, GDP-fruc kết hợp lại với nhau tạo thành một đơn vị lặp đi lặp lại trong phân tử HePS Các phân tử lặp đi lặp lại này được đẩy lên từ bề mặt tế bào sau đó được polyme hóa để tạo thành một chất nhờn lỏng hoặc PS dạng periplasmic gắn xung quanh các tế bào và chiết xuất ra bên ngoài

Như vậy, quá trình sinh tổng hợp các HePS trước hết đòi hỏi sự tổng hợp nên các tiền chất đã được kích hoạt Đó là các monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu

là các loại NDP [42] Các chủng thuộc LAB có thể sử dụng các monosaccharide và các disaccharide khác nhau như nguồn năng lượng trong quá trình sinh tổng hợp của chúng [27], [59]

Sự hình thành các HePS gồm một bộ khung của các đơn vị monosaccharide, các dẫn xuất của monosaccharide và luôn luôn có sự phân nhánh Nhìn chung, sự phân nhánh cao trong HePS một phần là do các đơn vị lặp đi lặp lại tạo nên, một phần là

do số lượng các monosaccharide ở các mạch bên tạo thành (có thể là một, hai, hoặc

ba monosaccharide) Các monosaccharide trong HePS thường phân nhánh rất lớn với các loại liên kết khác nhau (dạng α- hoặc β-) để tạo nên bộ khung khác nhau (có thể

14

là vòng 6 cạnh – pyranose hoặc vòng 5 cạnh – furanose) Trong đó, D-galactose (Gal)

có tần suất xuất hiện lớn nhất ở cả hai dạng pyranose và furanose D-Glc chỉ có ở dạng pyranose (Hình 1.9) [13], [27], [28], [29]

Như vậy, khác với các HoPS, ngoài glc và fruc, HePS còn được cấu tạo bởi các monome đa dạng hơn như D-gal, L-rham, man, dạng acetyl,… và có sự phân nhánh nhiều hơn Thành phần của các tiểu đơn vị monosaccharide và cấu trúc của các đơn

vị lặp lại thường không cố định, trong đó, D-gal, D-glc và L-rham hầu như luôn luôn

có mặt, nhưng ở tỷ lệ khác nhau [29] Sự khác biệt giữa HoPS và HePS không chỉ thể hiện qua tính chất hoá học, bản chất của các mối liên kết mà nó còn thể hiện thông qua các enzyme tổng hợp và vị trí tổng hợp nên chúng [18]

+ Mannose, fructose, glucuronic acid + Phosphate, glucosamine, dạng acetyl, galactosamine

Hình 1.9 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ

LAB [13]

Do có sự đa dạng trong cấu trúc, các EPS từ vi sinh vật, đặc biệt là từ LAB đã tạo ra được những tiềm năng ứng dụng có giá trị cao, chất lượng sản phẩm hoàn toàn vượt trội so với các PS từ thực vật, tảo [87] Bên cạnh những tác dụng nổi bật liên quan đến việc hỗ trợ về sức khỏe, các tính chất chức năng công nghệ, các ứng dụng của EPS ngày càng được mở rộng trong các lĩnh vực khác như dược phẩm, dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm Chính vì vậy, chúng có tiềm năng để phát triển và khai thác làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần của thực phẩm chức năng

về cả sức khỏe và lợi ích kinh tế [27]

1.3.3.1 Chức năng liên quan đến sức khỏe

Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợp nên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau Trong phạm vi tổng quan của luận

án này, một số chức năng liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB được giới thiệu chủ yếu như có tính probiotic và prebiotic; hoặc có hoạt tính chống ung thư, chống viêm loét dạ dày, kích thích miễn dịch, hoặc các hoạt động làm giảm cholesterol (Hình 1.10) [106], [107]

- EPS có chức năng như là prebiotic và probiotic

Ruột Prebiotic và probiotic

Hoạt động chống khối u (ung thư)

Tham gia hệ miễn dịch

- Kích thích hoạt động của đại thực bào

- Giúp tăng nhanh tế bào bạch huyết

- Sản sinh tế bào

Chống viêm, loét

dạ dày

Làm giảm cholesterol trong máu

Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB [106]

16

Prebiotic được biết đến là những thành phần không phải dạng sống và không tiêu hóa được, có tác dụng kích thích vi khuẩn trong ruột Chúng thường là các oligosaccharide với mức độ polyme hóa trong phạm vi giữa 2 và 20 monome; được chuyển hóa bởi các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe và cải thiện khả năng miễn dịch để chống lại những mầm bệnh [13] EPS là hợp chất PS Vì vậy sự có mặt của EPS trong đường ruột có vai trò như là prebiotic Bên cạnh tính năng prebiotic, nhiều chủng vi khuẩn thuộc LAB cũng đã được nghiên cứu và công bố về tiềm năng probiotic của

chúng bao gồm Lb acidophilus, Lb bulgaricus, Lb lactis, Lb plantarum, Lb casei,

Lb reuteri, Lb rhamnosus, Lb parasei, Lb fermentum và Lb helveticus Đây cũng

chính là nguồn sinh tổng hợp nên các EPS [13], [90]

Như vậy, khi sử dụng các chủng LAB trong các sản phẩm lên men lactic, một mặt chúng sinh ra EPS để làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm, mặt khác chúng cũng góp phần tạo nên tính probiotic cho sản phẩm Bên cạnh đó, sự có mặt của các EPS này còn mang lại tính năng prebiotic giúp hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa [131]

- Chống viêm, loét dạ dày và tác động làm giảm cholesterol

Tác động chống viêm loét dạ dày trên chuột của các sản phẩm sữa lên men từ

các chủng S thermophilus (CRL 1190 và CRL 804) có khả năng sinh tổng hợp EPS

đã được công bố khi so sánh với sản phẩm lên men bởi các chủng không sinh tổng hợp EPS [105] Tương tự, khả năng chống loét nhất định của EPS được sinh tổng hợp

từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacilli, và Streptococcus cũng được công bố bởi Nagaoka và cộng sự (1994) [84]; EPS tổng hợp từ Lb rhamnosus GG có tác dụng

chống lại các yếu tố miễn dịch bẩm sinh trong ruột [70]

Sự hấp thụ cholesterol của các PS đã được ghi nhận trong điều kiện in vitro bởi

nhiều nhóm nghiên cứu độc lập khác nhau như Soh và cộng sự (2003) [113]; Tok và Aslim (2010) [117]…

- Hoạt tính chống ung thư (kháng u), kích thích hệ miễn dịch

Một số LAB và các hợp chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của chúng được chứng minh là có tác động làm tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhờ khả năng sản sinh

tế bào T (là tế bào trung gian của miễn dịch tế bào) và hoạt động tiêu diệt khối u [24], [50] Tác động điều hòa hệ miễn dịch của các phân đoạn EPS gồm EPS trung tính và

EPS acid (APS) sinh tổng hợp bởi La delbrueckii ssp bulgaricus OLL1073R-1 lên

chuột đã được Makino và cộng sự (2006) nghiên cứu [78] Oda và cộng sự (1983) đã

kết luận rằng EPS sinh tổng hợp bởi Lb helveticus ssp jugurti có khả năng chống

ung thư khi thực hiện thử nghiệm trên chuột bằng cách tiêm các chế phẩm EPS vào màng bụng của chuột đã xuất hiện tế bào ung thư Kết quả cho thấy, tuổi thọ của loài chuột này đã được tăng lên 144% khi tiêm 20 mg EPS/kg trong chín ngày liên tiếp Khi tăng liều lượng EPS tiêm tương ứng với 40 hoặc 80 mg EPS/kg, tuổi thọ của chuột đã tăng lên hơn 233% [88] Tương tự, kết quả nghiên cứu của Kitazawa và

cộng sự (1992) đã cho thấy rằng chất nhờn được tổng hợp từ La Lactis ssp cremoris KVS20 có hoạt tính chống ung thư [64]

Như vậy, thông qua một số nghiên cứu trên động vật và trong thử nghiệm in

vitro đã gợi ý về tác dụng có lợi đến sức khỏe liên quan đến việc sử dụng thường

xuyên các EPS sinh tổng hợp từ LAB Những nghiên cứu này đã cho thấy EPS xứng đáng là mục tiêu nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng nhằm phục vụ về sức khỏe của con người cũng như các ứng dụng liên quan như về y tế, mỹ phẩm và dược phẩm,… Đồng thời, các EPS từ LAB có thể mở ra một hướng mới cho việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng góp phần mở rộng thị trường tiêu thụ các thực phẩm với những đặc tính tự nhiên do chính các vi khuẩn này mang lại

1.3.3.2 Tính chất chức năng công nghệ của EPS trong thực phẩm

Các polyme từ thực vật, động vật là những thành phần không thể thiếu trong một số loại thực phẩm Từ lâu, chúng đã được sử dụng như là những thành phần giúp hoàn thiện kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm như sự tạo gel, sự ổn định, sự nhũ tương hóa, ngăn ngừa sự kết tinh So với các PS phân lập từ nguồn thực vật (như carrageenan, guar gum, tinh bột biến tính, glucan v.v), các PS từ vi sinh vật có lợi thế hơn với quy trình kiểm soát tốt, được sản xuất với một quy mô lớn trong một không gian và thời gian tương đối hạn chế, các đặc tính hóa học thu được ổn định và đặc biệt là đáp ứng được những yêu cầu về tính an toàn của thị trường Việc định hướng

sử dụng EPS từ LAB với mục đích làm phụ gia bổ sung vào thực phẩm hay sử dụng trực tiếp LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS làm giống khởi động cho quá trình sản xuất sản phẩm thực phẩm lên men được coi là an toàn, thành phẩm thu được là tự

18

nhiên [90] Bên cạnh đó, các EPS cũng có những tác động quan trọng đến sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm mới (cả về thực phẩm lên men và không lên men), trong đó phải kể đến các sản phẩm thực phẩm cần được tăng cường các đặc tính lưu biến, cải thiện kết cấu và sự ổn định cũng như khả năng giữ nước [29] Đây là những vấn đề cần giải quyết trong cấu trúc của thực phẩm và EPS từ LAB có thể giải quyết được các vấn đề này

- EPS là tác nhân tạo kết cấu

Các EPS được sử dụng trong thực phẩm với chức năng chính là tác nhân làm đặc sinh học tạo nên sự ổn định và hạn chế hiện tượng tách nước của các thành phẩm trong thực phẩm lỏng phổ biến nhất là sữa chua Khả năng này của EPS có được là nhờ sự tương tác của chúng với protein, các ion và những thành phần khác trong sản phẩm do đó giúp làm giảm hiện tượng tách nước, tăng tính ổn định cho sản phẩm, từ

đó giúp thực phẩm có tính đồng nhất cao và tăng giá trị cảm quan Bên cạnh đó, các EPS từ một số chủng LAB cũng được kết luận là góp phần cải thiện kết cấu của bột nhào trong quá trình chế biến các loại bánh sản xuất từ bột mì [16], [90] Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu một số tính chất hóa lý của EPS có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo nên tính chất lưu biến cho sản phẩm thực phẩm

- EPS giúp hoàn thiện tính lưu biến của các sản phẩm lên men [13]

Độ đàn hồi và độ nhớt là hai biến quan trọng trong tính chất lưu biến của thực phẩm Chúng có ảnh hưởng lớn đến các tính chất lý hóa của sản phẩm thực phẩm đặc biệt là sản phẩm lên men Việc sử dụng EPS nhằm cải thiện các tính chất lưu biến của sản phẩm là điều rất cần thiết Trong các chủng vi khuẩn sử dụng làm giống khởi

động quá trình lên men sữa, nhiều chủng LAB đặc biệt là các loài Lactobacilli được

biết đến là có khả năng sinh tổng hợp EPS Do đó, dù lượng EPS sinh tổng hợp bởi LAB là không cao, tuy nhiên chúng cũng đủ để tạo kết cấu cho sản phẩm sữa lên men

mà không cần bổ sung thêm các chất ổn định trong quá trình sản xuất [29]

Tác động hỗ trợ tích cực trong việc cải thiện kết cấu và giảm khả năng tách nước của sản phẩm sữa chua tạo thành bởi các EPS sinh tổng hợp từ các chủng LAB sử

dụng để lên men sữa đã được kết luận như EPS từ Lb delbrueckii bulgaricus và S

thermophilus [14]; EPS từ L lactis subsp cremoris LC330 [79]; EPS từ Lb

delbrueckii ssp bulgaricus [60] Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra

rằng, các EPS được giải phóng ra bởi các loài Lactobacilli như Lb delbrueckii

bulgaricus, Lb helveticus và Lb casei có tác dụng thúc đẩy khả năng giữ nước và cải

thiện kết cấu tổng thể của các loại pho mát khác nhau trong giai đoạn chín tới do đó giúp cấu trúc sản phẩm tạo thành ổn định hơn [13], [92], [144] Coeuret và cộng sự (2003) kết luận rằng, quá trình hình thành pho mát phụ thuộc vào sự liên hệ giữa các

chủng Lactobacilli với nhau cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của các EPS sinh

tổng hợp được [23]

Từ các công bố trên cho thấy rằng, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp EPS cao làm tác nhân vi sinh vật gây lên men trong chế biến thực

phẩm Quá trình này được thực hiện trong điều kiện in situ EPS được sử dụng theo

điều kiện này sẽ có tác động như là các tác nhân ổn định tự nhiên, có khả năng làm đặc, tạo độ nhớt cao và giảm khả năng tách nước Công nghệ này sẽ tạo ra những sản phẩm bảo đảm tính an toàn thực phẩm cao do đó sẽ không cần sử dụng các chất phụ gia tổng hợp từ bên ngoài vào

1.3.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa

Các gốc tự do như O.-, OH và ROS được coi là các tác nhân oxy hóa mạnh, chúng có thể phản ứng với tất cả các phân tử lớn trong tế bào dẫn đến gây ra các đột biến và ung thư Đặc tính chống oxy hóa của các PS từ thực vật, nấm đã được nghiên cứu khá phổ biến và được sử dụng như các chất chống oxy hóa tự nhiên Trong những năm gần đây, EPS từ các vi khuẩn thuộc LAB đã nhận được nhiều sự quan tâm hơn

về tính chống oxy hóa Các vi khuẩn có tiềm năng probiotic sinh tổng hợp EPS có thể làm giảm ung thư bằng nhiều cơ chế khác nhau thông qua hoạt động quét các gốc tự

do và một phần của cơ chế đó có thể liên quan đến các EPS tổng hợp được

Chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tổng hợp các PS ngoại bào (EPS) với những tác động sinh lý khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp Hoạt tính sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏ các phản ứng oxy hóa (ROS) - là dạng được hình thành trong ruột bởi các phản ứng trao đổi chất khác nhau, chính vì vậy chúng đã thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của EPS từ chủng vi khuẩn này được so sánh với chất chống oxy hóa

20

là vitamin C Kết quả cho thấy, EPS sinh từ chủng này có hoạt tính loại bỏ gốc tự do

và chống oxy hóa đáng kể [65] Khả năng loại bỏ gốc tự do picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp

1,1-diphenyl-2-bởi hai chủng Bifidobacterium bifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus

plantarum R315 (L-EPS) và cả sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá

Kết quả cho thấy, cả B-EPS và L-EPS đều có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được ghi nhận Với các khả năng này, cả hai EPS tổng hợp được đều có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như là các tác nhân chống oxy hóa tự nhiên [72] Như vậy, bên cạnh khả năng chống ung thư, giảm cholesterol, chống viêm loét

dạ dày cùng các chức năng tạo cấu trúc, giúp hoàn thiện tính lưu biến đối với các sản phẩm lên men từ sữa, các EPS từ LAB cũng được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao Với các tính chất chức năng quan trọng này, EPS sinh tổng hợp từ LAB xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn trong các ứng dụng công nghiệp trọng yếu liên quan đến sức khỏe con người

1.4 Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB

Trong những thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về EPS sinh tổng hợp từ LAB được công bố [18], [22], [29] Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp và điều kiện thu nhận EPS; một số đặc tính

lý hóa của EPS như khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu trúc cũng như một số tính chất chức năng liên quan đến ứng dụng của chúng trong công nghiệp

1.4.1 Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS

Mặc dù có vai trò quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn còn có nhược điểm là năng suất tạo thành thấp Đây là lý do khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ LAB nói riêng còn khá hạn chế Một phương pháp hữu ích để quá trình sinh tổng hợp EPS đáp ứng về phương diện ứng dụng trong thực phẩm nếu LAB có thể được lên men trong môi trường ăn được và an toàn là cải thiện quá trình lên men sinh tổng hợp EPS [59] Năng suất của EPS từ LAB chịu tác động bởi các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH, thời gian lên men,…), các yếu tố hóa

học (nguồn C, N, tỉ lệ C/N,…) do đó có thể điều chỉnh các điều kiện lên men nhằm tăng quá trình hình thành các polyme sinh học này [19], [31], [66]

Grobben và cộng sự (1996) đã kết luận rằng, hàm lượng và thành phần của các

EPS sinh tổng hợp bởi Lb delbruckii subsp bulgaricus NCFB 2772 trong các môi

trường chứa nguồn C khác nhau là không giống nhau [55] Trong khi đó, công bố của

Degeest và De Vuyst (1999) chỉ ra rằng, thành phần EPS tổng hợp từ S thermophilis

không có sự thay đổi khi chủng này được nuôi cấy trên các nguồn carbohydrate khác nhau [32] Quá trình phát triển và sinh tổng hợp EPS của LAB cũng được tăng lên khi bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitrogen (N) khác nhau Việc

sử dụng các nguồn N hữu cơ dẫn đến những tác động tích cực trong việc tạo EPS có thể liên quan đến tỷ lệ carbon /nitrogen (C / N) [83]

Bên cạnh những nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn C và N lên quá trình sinh tổng hợp EPS của LAB, nhiều công bố liên quan đến sự tác động của nhiệt độ và pH lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn khác nhau cũng được đề cập Garcia-Garibay và Marshall (1991) đã kết luận rằng, sự tổng hợp EPS

bởi Lb delbrueckii subsp bulgaricus tăng lên khi tăng nhiệt độ [48] Ngược lại, quá trình sinh tổng hợp EPS bởi chủng S thermophilus BN1 đạt được ở 37oC là cao hơn

so với 42oC [99] Đã có nhiều công bố về giá trị pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng LAB khác nhau là không giống nhau, tuy nhiên đa phần quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng này đều xảy ra tốt hơn ở khoảng pH gần 6,0 [44], [51], [140], [141]

Trong những năm gần đây, số lượng các nghiên cứu về điều kiện lên men sinh tổng hợp EPS có xu hướng tăng Các nghiên cứu chủ yếu tập trung cải thiện sản lượng EPS sinh tổng hợp từ LAB và tối ưu hóa các điều kiện lên men tương ứng với các nguồn vi khuẩn từ LAB có khả năng sinh tổng hợp EPS cao [44], [52], [124], [136], [139],… Đây cũng được coi là cơ sở quan trọng để làm nền tảng cho việc sử dụng chúng một cách rộng rãi vào các mục đích công nghiệp khác nhau [115] Các thông tin về kết quả nghiên cứu cụ thể liên quan đến sự tác động của các yếu tố như thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ loài thuộc

chi Lactobacillus thuộc LAB được tóm tắt ở Bảng 1.1

22

Bảng 1.1 Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ

các loài Lactobacillus đã được công bố

Nhiệt

độ và

pH của môi trường

Thời gian nuôi cấy (giờ)

Hàm lượng EPS (µg/ml)

Tác giả (năm) [TLTK]

ATCC 15807

MRS có bổ sung đường lactose

pH=4,5 30 280

Torino và cộng

sự (2005) [118]

TDS030603

MRS có chứa frucose 1%

30oC, pH=6,5 72 97,1

Fukuda và cộng sự (2010) [44]

oC

48

Gorska và cộng sự (2010) [52]

KF5

MRS bổ sung whey

30oC, pH=6,3 30 95,58

Wang và cộng

sự (2010) [130]

MRS bổ sung 10%

sữa gầy, 2% glucose

370C pH=6,5 32 44,49

Zhang và cộng

sự (2011) [141]

370C, pH=6,7 24 28820

Yadav và cộng

sự (2011) [136]

TISTR 1498

nước dừa,

20 g/L sucrose, 5 g/L pepton, 2,5 g/L cao thịt, 2,5 g/L cao nấm

350C, pH=5,5 24 38200

Seesuriyachan

và cộng sự (2011) [111]

[54]

Nhiệt

độ và

pH của môi trường

Thời gian nuôi cấy (giờ)

Hàm lượng EPS (µg/ml)

Tác giả (năm) [TLTK]

oC

48

Gorska và cộng sự (2013) [53]

37oC, pH=6,6 32

90 Wang và cộng

sự (2015) [124]

sữa gầy

37oC 18

Calsteren và cộng sự (2015) [17]

Từ kết quả tổng hợp ở Bảng 1.1 chúng tôi nhận thấy rằng, thành phần môi trường

và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp EPS của các chủng vi khuẩn thuộc LAB Hàm lượng EPS tổng hợp từ LAB phụ thuộc vào thành phần môi trường (nguồn C, N) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB đều có khả năng phát triển và sinh tổng hợp EPS trong những điều kiện khác nhau Với sự đa dạng của các nguồn

cơ chất khác nhau được bổ sung thêm vào môi trường MRS thì tương ứng sẽ có sự thay đổi tương ứng về các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và thời gian Bên cạnh

đó, các chủng vi khuẩn có thể giống nhau về loài nhưng được phân lập từ các nguồn khác nhau thì quá trình thu nhận EPS cũng được thực hiện với các nguồn dinh dưỡng

và các điều kiện nuôi cấy không giống nhau Như vậy, không có quy trình với những chỉ số duy nhất về điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hiệu suất thu nhận EPS cao

1.4.2 Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS

Quá trình thu nhận các PS ngoại bào của vi khuẩn từ môi trường lỏng thường được thực hiện qua nhiều công đoạn:

(1) Loại bỏ protein, tế bào bằng cách ly tâm hoặc lọc Việc sử dụng acid tricloroacetic (TCA) để loại bỏ protein hoặc peptide trong môi trường lên men đã

24

được đề xuất bởi Garcia- Garibay và Marshall (1991) [48] Phương pháp này có ưu điểm là nhanh hơn so với các kỹ thuật đã đề cập trước đó Tuy nhiên, một tỷ lệ lớn của EPS sẽ đồng kết tủa trong TCA và do đó cần phải rửa kết tủa ít nhất một hoặc hai lần để thu nhận EPS được tốt nhất [19];

(2) Các polyme kết tủa từ dịch nổi được thu nhận bằng cách cho thêm tác nhân kết tủa Đó là một dung môi hòa tan được trong nước trong đó các polyme là không hòa tan (chẳng hạn như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetone) Tỉ lệ dung môi

sử dụng có thể là một, hai hoặc ba so với dịch nuôi cấy;

(3) Thu polyme kết tủa bằng cách sấy đông khô (quy mô phòng thí nghiệm) hoặc sấy trống (quy mô công nghiệp) Đầu tiên, các EPS kết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm, sau đó hòa tan lại với nước cất và tiến hành thẩm tích để loại bỏ các loại đường còn lại hoặc các thành phần hòa tan khác trong môi trường Các EPS này sau

đó được đông khô ở nhiệt độ lạnh và bảo quản ở 4 °C [66] Các phương pháp tinh chế EPS này có thể làm giảm hiệu suất thu nhận sản phẩm, vì thế việc lựa chọn quy trình thu nhận thích hợp đặc biệt là các hóa chất cần dựa vào mối tương quan giữa mức độ thu nhận sản phẩm, độ tinh khiết của sản phẩm và các tác động đến tính chất của nó [42] Các thông số liên quan cụ thể áp dụng trong từng phương pháp tách chiết

và tinh chế EPS từ LAB đã được nhiều nhóm tác giả sử dụng để thu nhận nhằm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp, về các đặc điểm lý hóa và cấu trúc của EPS như Doco

và cộng sự (1990) [36], Harding và cộng sự (2005) [58], Yuksekdag và cộng sự (2008) [138], Rabha và cộng sự (2011) [99], Seesuriyachan và cộng sự (2011) [111]

1.4.3 Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc

Để xác định một cách đầy đủ về các đặc tính lý hóa của một PS cụ thể, việc xác định các thông tin về khối lượng phân tử, thành phần hóa học, cấu hình các monomer

và các dạng liên kết của các monome đó trong phân tử đó là điều rất cần thiết Đây được xem là yếu tố quan trọng để hiểu rõ hơn về hoạt tính của các polyme sinh học trong các môi trường khác nhau [42], [68]

Về khối lượng phân tử trung bình

Do tính chất đa phân tán, khối lượng phân tử của PS thường chỉ thể hiện là giá trị trung bình của khối lượng phân tử Có rất nhiều kỹ thuật khác nhau đã được sử

dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của các polymer thuộc PS như phương pháp sắc ký trao đổi ion [21], sắc ký rây phân tử [91], phương pháp sắc ký thẩm thấu gel [10], [32],… Nguyên tắc chung của các phương pháp là dựa vào thời gian lưu của các PS được rửa giải kết hợp với mức độ khúc xạ của nó Những phương pháp này cũng tạo điều kiện cho việc ước tính được ngay khối lượng phân tử của PS

Về thành phần hóa học

Việc đánh giá thành phần hóa học của EPS liên quan đến việc xác định các phân

tử đường, sự lặp lại của chúng và các nhóm phức đi kèm (nhóm acyl, nhóm phosphate,…) Sắc ký khí là phương pháp truyền thống đã được sử dụng để xác định thành phần monosaccharide, trong đó bao gồm các quá trình methyl hóa của tất cả các nhóm hydroxyl, sau đó là sự thủy phân PS thành các monosaccharide, tiếp đến quá trình alditol và acetyl hóa để tạo thành dẫn xuất alditol acetate và phân tích bằng GC-MS [58], [126]

26

glycoside khác nhau Những phân đoạn có khối lượng phân tử thấp này sau đó có thể được phân tích bằng một số kỹ thuật như GC-MS, MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight - Mass Spectometry) và NMR [42] Trong tất cả các phương pháp phân tích cấu trúc của các oligosaccharide, NMR là phương pháp rất nhạy và có khả năng đưa ra những thông tin chi tiết về cấu trúc của chất cần phân tích Do đó, đây cũng là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định về cấu hình anome của monosaccharide, loại liên kết, nhóm thế và cả những thành phần có bản chất phi-carbohydrate mà cho đến nay chưa có một phương pháp nào có thể so sánh được [9]

Phổ 1D-1H và 13C NMR thường được ghi lại ở nhiệt độ khoảng từ 70oC trở lên với các PS hòa tan trong D2O hoặc trong DMSO Độ chuyển dịch hóa học được biểu diễn theo ppm với việc sử dụng acetone làm chất nội chuẩn ( của 1H là 2,225 và của

13C là 31,55) hoặc TMS làm chất nội chuẩn ( 0 ppm) Trong phổ proton, vùng từ trường thấp bao gồm các cộng hưởng từ của các nguyên tử anomer và các proton khác trong cấu trúc dạng vòng ở vùng có từ trường cao [68] Sự kết hợp các kết quả

từ phổ 1H và 13C – NMR cho phép xác định số lượng các phân tử monosaccharide trong cấu trúc phân tử Các phổ 2D-NMR cho phép đánh giá mức độ tương tác của mỗi C hoặc H với các nguyên tử lẫn cận hoặc xa nhau trong không gian và xác định được các vị trí liên kết của chúng trong cấu trúc PS Phổ COSY và TOCSY được sử dụng để gán các hạt nhân proton trong cấu trúc vòng Trong khi đó, với phổ 2D HSQC

và HMBC, 13C – 1H lại được sử dụng để gán các nguyên tử C và cung cấp các thông tin về dạng liên kết trong cấu trúc của phân tử, cấu hình anomer (như phổ HMBC, NOESY, ROESY)

Mô hình liên kết của các monome được xác định bằng sự kết hợp của quá trình methyl hóa và sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân Kết quả về cấu trúc của các PS này được xác định bằng cách đối chiếu với các dữ liệu phổ thư viện đã được công bố [42], [68] Thông tin về cấu trúc và các phổ tương ứng giúp xác định chi tiết về cấu trúc PS được cụ thể hóa ở Bảng 1.2 [9]

Bảng 1.2 Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng

Phổ tương tác hai chiều 1H – 1H giúp phân tích kết nối Phổ tương quan hai chiều 1H – 13C

Độ chuyển dịch hóa học của 13C – NMR Phổ tương quan giữa 1H – 13C

Cấu hình anomer Độ chuyển dịch hóa học 1H – NMR và hằng số ghép cặp

Độ chuyển dịch hóa học 13C – NMR và hằng số ghép cặp JH,H Tương tác trong phổ NOESY

Sự tương quan gần hoặc xa của các nguyên tử

Có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng kết hợp quá trình methyl hóa và NMR trong quá trình phân tích các đặc điểm cấu trúc của PS [11], [39], [74], [104],… Kết quả công bố về các đơn vị monosaccharide chủ yếu thường gặp trong thành phần của EPS là glc, gal và rha với tỷ lệ khác nhau [29], [87], [91] Sự liên kết giữa các đơn vị monome trong EPS đã tạo nên bộ khung của các polyme với sự thay đổi của các loại liên kết 1,4-β- hay liên kết 1,3-β- và 1,2-α- hay các liên kết 1,6-α-glycoside Đây cũng

là cơ sở chủ yếu được sử dụng để phân loại EPS [87]

Bằng phương pháp kết hợp phân tích các mối liên kết và giải phổ NMR 1D/2D (1H và 13C), cấu trúc của một số EPS sinh tổng hợp bởi các chủng khác nhau thuộc

loài Lb helveticus là khác nhau là kết quả được công bố bởi Yang và cộng sự (2000) [137], Robijn và cộng sự (1995) [103] EPS sinh tổng hợp bởi các chủng Lb

helveticus 776 có cấu trúc lặp lại của các hexasaccharide D-gal và D-glc với tỷ lệ

28

phân tử là 1:2 Trong khi đó, EPS của chủng TY1-2 là một heptamer có chứa

N-acetyl-D-glucasamine Nhóm tác giả này cũng đã công bố rằng EPS của Lb

helveticus Aki4 và Lb161 chứa các hexa- và heptasaccharide và có lần lượt 1 và 2

mạch nhánh Nhóm tác giả này cũng cho thấy rằng chủng Lb helveticus K16 sinh

tổng hợp EPS ngoại bào là một hexasaccharide lặp lại và là một hetero-EPS của các đường gal và glc và có cấu tạo mạch nhánh

EPS từ LAB có thể là sự tổng hợp của các hỗn hợp và có cấu trúc khác nhau Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp các phổ 1H, 13C, 1D và 2D NMR,

cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lactobacillus spp G-77 được kết luận gồm hai PS có

cấu trúc đơn vị monosaccharide lặp lại khác nhau [38] Grobben và cộng sự (1996)

đã sử dụng một môi trường xác định để nuôi cấy Lb delbrueckii ssp bulgaricus

NCFB 2772 Khi nuôi cấy với glc hoặc fruc, có hai EPS đã được tách chiết: một PS

có khối lượng phân tử cao và một PS có khối lượng phân tử thấp nhờ phương pháp sắc ký trao đổi ion Thành phần monome và các liên kết trong PS có khối lượng phân

tử lớn thu nhận từ glc và fruc đều tương tự và xấp xỉ nhau (± 5%) đã được xác định nhờ phương pháp GC-MS Tuy nhiên, các PS có khối lượng phân tử thấp, được sinh tổng hợp với số lượng nhỏ, và xuất hiện một thành phần monome khác nhau [55] Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, quá trình sinh tổng hợp các EPS có cấu trúc tương tự nhau nhưng có khối lượng phân tử khác nhau Degeest và de Vuyst (1999) công bố kết quả về việc sinh tổng hợp một phân tử EPS có khối lượng cao (1,8x 106)

và một phân tử EPS có khối lượng thấp (4,1x105) từ S thermophilus LY03 [32] Quá trình sinh tổng hợp hai PS bởi Lb rhamnosus cũng đã được công bố bởi Pham và

cộng sự (2000) Các EPS có khối lượng phân tử thấp tạo thành được lý giải là từ quá trình thủy phân các sản phẩm có khối lượng phân tử cao do enzyme glycosyl-hydrolase xúc tác [95]

Sự đa dạng về đặc điểm lý hóa của các EPS từ các chủng vi khuẩn khác nhau thuộc LAB từ các công trình nghiên cứu đã công bố được tóm tắt ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố Chủng vi

Thành phần, tỉ lệ phân tử tương

Tác giả (năm) [TLTK]

:2-2:1:1:1

β-D-GlcpNAc

4)-β-D-GlcpA-(16)-α-D-Glcp-(14)- β-D-Galp-(14)-

β-D-Glcp-(1

Robijn và cộng sự (1996) [102]

Thành phần, tỉ lệ phân tử tương ứng

Cấu trúc (bộ khung, loại liên kết,…) Tác giả (năm)