Luận văn sư phạm Ảnh hưởng của điều kiện hạn sâu tới hàm lượng Prolin và huỳnh quang diệp lục ở lá đậu tương

mục lục 1 ảnh hưởng của nước đến quá trình sinh trưởng và phát 2 Huỳnh quang diệp lục và những nghiên cứu về huỳnh 3.2 Những nghiên cứu về prolin đối với tính chống chịu ở... Hàm lượ

Lời cảm ơn

Để hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp của mình, em đã nhận được sự chỉ bảo, giúp đỡ nhiệt tình của PGS.TS Nguyễn Văn Mã, các thầy cô giáo trong tổ Sinh lý thực vật, cùng các thầy cô giáo khoa Hoá học, các bạn sinh viên khoa Sinh – KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của PGS.TS Nguyễn Văn Mã, các thầy cô giáo và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2009 Sinh viên

Hà Thị Phương Lan

Lời cam kết

Để đảm bảo tính trung thực của đề tài, tôi xin cam kết nh− sau:

1 Đề tài của tôi không hề sao chép từ bất kì đề tài có sẵn nào

2 Đề tài của tôi không trùng với một đề tài nào khác

3 Kết quả thu đ−ợc trong đề tài là do nghiên cứu thực tiễn đảm bảo tính chính xác, tính trung thực

Sinh viên

Hà Thị Ph −ơng Lan

mục lục

1 ảnh hưởng của nước đến quá trình sinh trưởng và phát

2 Huỳnh quang diệp lục và những nghiên cứu về huỳnh

3.2 Những nghiên cứu về prolin đối với tính chống chịu ở

1 Sự biến động huỳnh quang diệp lục trong điều kiện hạn

2 sự biến động của hàm l−ợng prolin trong điều kiện hạn

Hình 1 Sự biến đổi cường độ huỳnh quang ổn định ( Fo) trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

24

Hình 2 Sự biến đổi cường độ huỳnh quang cực đại (Fm) trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

27

Hình 3 Hiệu suất huỳnh quang biến đổi ( Fv/m) trong pha hạn

sâu và pha phục hồi

30

Hình 4 Sự biến động hàm lượng prolin ở thời kì cây non trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

34

Hình 5 Sự biến động hàm lượng prolin ở thời kì ra hoa trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

35

Hình 6 Sự biến động hàm lượng prolin ở thời kì quả non trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

37

Hình 7 Sự biến động hàm lượng prolin ở thời kì quả chắc trong

pha hạn sâu và pha phục hồi

38

mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max), thuộc bộ đậu (Fabales), họ Fabaceae có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại dạng thân leo, sống hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản Chúng có nhiều chủng loại khác nhau, thích nghi với các điều kiện khí hậu từ ôn đới tới nhiệt

đới [4]

Trong số các cây họ Đậu, đậu tương có sản lượng và diện tích đứng đầu thế giới Diện tích trồng đậu tương hàng năm trên thế giới đạt 53,6 triệu ha với sản lượng 96 triệu tấn Nếu năm 1940 tổng diện tích trồng đậu tương trên thế giới là 12,4 triệu ha thì năm 1995 đạt 57,73 triệu ha, năng suất bình quân 1690 kg/ha, sản lượng 97,5 triệu tấn [1]

Quê hương của đậu tương là Đông nam Châu á, nhưng 48% diện tích trồng đậu tương và 56% sản lượng đậu tương của thế giới nằm ở Mỹ Nước

Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu tương năm 2000, trong đó hơn một phần ba được xuất khẩu Các nước sản xuất đậu tương lớn khác là Braxin, Achentina, Trung Quốc và ấn Độ [6] Phần lớn sản lượng đậu tương của Mỹ hoặc để nuôi gia súc hoặc để xuất khẩu mặc dù tiêu thụ đậu tương ở người trên đất nước này

đang tăng lên Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu ăn được tiêu thụ ở Mỹ

Đến năm 2005, tổng sản lượng đậu tương trên thế giới đạt 221,55 triệu tấn, tăng 3,85% so với năm 2004 (đạt 213,34 triệu tấn) Trong đó, sản lượng một số nước (đơn vị: triệu tấn) đạt như sau: Mỹ 82,82; Braxin 59,50; Achentina 40,5; Paragoay 4,8; Trung Quốc 17,0; ấn Độ 6,0

Sản phẩm đậu tương có nguồn protein, lipit, gluxit, vitamin…phong phú, làm thức ăn tốt cho người và gia súc, làm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi và chế biến Sản phẩm của đậu tương là mặt

hàng có kim ngạch xuất khẩu cao [10] Hàm lượng protein trong đậu tương chiếm tỉ lệ cao (40% - 46%), là thức ăn bổ sung cho khẩu phần hạt cốc Đây là nguồn protein thực vật quan trọng Dầu đậu tương chứa chủ yếu các axit không no, có khả năng đồng hoá cao, có tác dụng giảm lượng colesterol trong máu Đậu tương có chứa nhiều vitamin (A, B, E, F) nhất là vitamin nhóm B Ngoài ra đậu tương còn chứa các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S Cũng như các cây họ Đậu khác đậu tương cũng có tác dụng tốt trong việc cải tạo đất trồng chủ yếu là nhờ hoạt động cố định nitơ tự do của các loài vi khuẩn

Rhizobium cộng sinh trong nốt sần của cây họ Đậu, chúng có khả năng cố

định nitơ tự do, cung cấp lượng lớn đạm cho đất, cho cây

Đậu tương là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn, thích nghi với nhiều phương thức canh tác như: luân canh, xen canh nên có thể nâng cao hiệu quả sử dụng đất từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế

Chính vì vậy mà diện tích trồng đậu tương trên thế giới tăng nhanh trong những năm gần đây

Hiện nay trên thế giới diện tích đất hoang hoá ngày càng nhiều, riêng ở nước ta 3/4 diện tích là đồi núi, phần lớn đất bạc màu và thường bị khô hạn do khả năng giữ nước kém Những năm gần đây, hạn hán là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm giảm năng suất của cây trồng trong đó có đậu tương Viện sĩ Mắc - Ximốp đã nói: Hạn hán dẫu chỉ đi qua có tính chất tạm thời cũng không phải đi qua mà không để lại dấu vết gì tác hại cho cây Vì vậy, việc tìm ra những giống đậu tương có khả năng chịu hạn và các biện pháp nhằm nâng cao tính chịu hạn là vấn đề có ý nghĩa thực tiễn sâu sắc

Phương pháp nghiên cứu hàm lượng diệp lục và huỳnh quang diệp lục

đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, nhất là trong điều kiện bất lợi của môi trường Huỳnh quang diệp lục là thông số phản ánh trạng thái sinh lý của

bộ máy quang hợp trong điều kiện bất lợi của môi trường Phương pháp đo huỳnh quang diệp lục cho phép xác định khả năng chống chịu của thực vật đối

với tác động bất lợi của môi trường mà không gây tổn thương cho cây trồng trong quá trình nghiên cứu Vì vậy, phương pháp nghiên cứu huỳnh quang diệp lục đang được sử dụng như một công cụ có hiệu quả để đánh giá tính chống chịu ở một số loài cây trồng như: cà chua, lạc, nhãn, lúa…[8] [9][15][16] Kết quả những nghiên cứu này giúp chúng ta phân loại, chọn tạo những giống chống chịu hạn tốt một cách nhanh chóng

Prolin là một trong những chất có vai trò điều hoà áp suất thẩm thấu ở

tế bào thực vật, được xem như thành phần của hệ thống giữ gìn pH của tế bào

và điều chỉnh thế khử ở tế bào Hàm lượng prolin trong rễ và lá cây sống trong

điều kiện khô hạn tăng lên gấp nhiều lần so với cây sống trong điều kiện bình thường [21] [22], có thể xem axit amin này như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật

ở nước ta đậu tương là cây trồng quan trọng, có lịch sử phát triển lâu đời - một trong những cây lương thực chính sau lúa, ngô, được trồng nhiều ở vùng núi, trung du, đồng bằng của cả nước Tuy nhiên do ảnh hưởng của khí hậu thời tiết và kĩ thuật canh tác nên năng suất đậu còn thấp (trung bình chỉ đạt 10

- 12 tạ /ha vụ đông; 12 -15 tạ/ha vụ hè thu ) [6], công tác nghiên cứu khoa học vẫn chưa phát triển tương xứng với vị trí, khả năng, tiềm lực của cây đậu tương mệnh danh là “cây trồng kì lạ”, “vàng mọc trên đất” [7] Đậu nành mới chỉ

được quan tâm và bắt đầu được nghiên cứu từ thập niên 60 - 70 của thế kỷ

XX Có lẽ thí nghiệm tại trại Sông Lô (1953) của viện trồng trọt, do viện trưởng Bùi Huy Đáp chỉ đạo được xem là thí nghiệm chính quy đầu tiên về cây đậu nành ở Việt Nam Trong những năm tiếp theo đã có nhiều công trình nghiên cứu về các lĩnh vực khác nhau đối với đối tượng này như nghiên cứu về sinh trưởng, dinh dưỡng, kĩ thuật gieo trồng, năng suất, chống chịu Có thể

kể đến các nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng, Trần Đình Long, Ngô Đức Dương về việc đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương nhập nội [6], Sự hình thành nốt sần ở một số giống chịu hạn [4], Trần Phương Liên

và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn và thành phần điện

di protein hạt đậu tương Nguyễn Văn Mã đã nghiên cứu khả năng quang hợp, khả năng giữ nước và hút nước, khả năng tạo nốt sần ở rễ qua các thời kỳ sinh trưởng của một số giống đậu tương có năng suất cao trên đất bạc màu [9]

Việc nghiên cứu sâu sự biến động huỳnh quang diệp lục và hàm lượng prolin trong điều kiện hạn sâu ở các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của

đậu tương để tìm hiểu rõ hơn tác hại của hạn hán và phản ứng ở mức độ cao của cơ thể thực vật với môi trường bất lợi, để từ đó đánh giá đúng khả năng chịu hạn của các giống đậu tương giới thiệu cho sản xuất lại là vấn đề rất cần thiết đang cần được nghiên cứu Vì vậy, chúng tôi đã triển khai nghiên cứu về huỳnh quang diệp lục và hàm lượng prolin ở lá đậu tương qua 4 thời kì: cây non (3 lá), ra hoa, quả non, quả chắc

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định sự biến động huỳnh quang diệp lục, hàm lượng prolin trong pha hạn sâu và pha phục hồi ở 4 thời kì sinh trưởng và phát triển

- So sánh tác động của hạn tới huỳnh quang diệp lục và hàm lượng prolin giữa các thời kì đó

3 ý nghĩa thực tiễn

- Tìm hiểu sâu về huỳnh quang, hàm lượng prolin góp phần bổ sung nguồn tài liệu về nghiên cứu huỳnh quang, hàm lượng prolin của lá đậu tương trong quá trình gây hạn Khẳng định thêm vai trò của prolin đối với khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và của đậu tương nói riêng

- Kết quả nghiên cứu có thể cung cấp tư liệu cho việc xác định nhanh khả năng chống chịu với môi trường bất lợi của các giống đậu tương đang gieo trồng và các giống nhập nội để có lựa chọn và định hướng gieo trồng trong những vùng và mùa vụ thích hợp, góp phần nâng cao năng suất cây trồng

NộI DUNG CHƯƠNG 1: TổNG QUAN TμI LIệU

1 ảnh hưởng của nước đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

đậu tương

1.1 Các thời kì sinh trưởng của đậu tương

Quá trình sinh trưởng và phát triển ở đậu tương gồm 5 thời kì chính sau:

* Thời kì nảy mầm và mọc: Được tính từ khi gieo hạt giống xuống đất cho đến khi thân vươn lên khỏi mặt đất, hai lá mầm xoè ra Trong thời kì này cây đậu tương con sinh trưởng chủ yếu dựa vào chất dinh dưỡng do lá mầm cung cấp để phát triển thân non và bộ rễ

* Thời kì cây non: Được tính từ khi cây mọc cho đến khi cây nở nụ hoa

đầu tiên, đây là thời kì sinh trưởng mạnh của rễ, thân, lá

* Thời kì nở hoa: Được tính từ khi cây ra hoa đầu tiên cho đến khi ra hoa cuối cùng Cây ra hoa sớm hay muộn tuỳ giống, thời vụ gieo trồng, vĩ độ trái đất Hoa thường bắt đầu từ đốt thứ tư đến đốt thứ tám trở lên Đây là thời kì rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến năng suất của giống

* Thời kì hình thành quả và hạt: Được tính từ giai đoạn ra hoa Quả đầu tiên được hình thành trong vòng 7 - 8 ngày kể từ lúc hoa nở Các yếu tố nhiệt

độ, độ ẩm có tác động rất lớn đến tốc độ phát triển của quả và hạt

* Thời kì chín: Được tính từ khi hạt đã phát triển đạt đến kích thước tối

đa và đạt đến độ chín sinh lý, vỏ hạt có màu sắc đặc trưng của giống, vỏ quả chuyển dần sang màu vàng, màu tro, đen xám

Trong thời gian hoa nở thì thân, cành, lá, rễ của cây đậu tương vẫn phát triển mạnh Giai đoạn này cây cần tiêu thụ nhiều chất dinh dưỡng, vì vậy cần

đáp ứng đủ nước và phân bón cho cây

1.2 Vai trò của nước đối với thực vật

Mỗi loài thực vật có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng… ở ngoài giới hạn của các yếu tố đó thực vật sẽ gặp điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng phát triển của chúng Khả năng ngăn ngừa tổn thương khi bị tác động hay sự thích ứng đối với các nhân tố bất lợi khi điều kiện sống thay đổi của thực vật gọi là tính chống chịu của thực vật

Nước là nhân tố quan trọng bậc nhất đối với tất cả các sinh vật Trong cơ thể nước là thành phần chính chiếm 60 - 90% khối lượng Với thực vật, nước chiếm 90 - 95% khối lượng tươi của cơ thể Nước là dung môi hoà tan các chất, là môi trường cho các phản ứng sinh hoá Nước còn có vai trò hydrat hoá, nước hấp phụ trên bề mặt các hạt keo và màng tế bào tạo nên một lớp mỏng bảo vệ cho các cấu trúc sống Nó còn là một nguyên tố nối liền cây với môi trường bên ngoài, có vai trò quan trọng trong việc điều hoà nhiệt của cây

1.3 ảnh hưởng của nước đối với cây đậu tương

Đậu tương có nhu cầu đặc biệt về độ ẩm do có đặc điểm riêng là rễ ăn sâu vào đất, thuộc loại rễ trụ, có nhiều rễ con và phân nhánh mạnh Nhu cầu nước của đậu tương thay đổi tuỳ theo thời gian sinh trưởng Trong quá trình sinh trưởng nhu cầu nước tăng dần Hàng loạt các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất như: chiều cao thân, số hoa, tỷ lệ đậu quả, số hạt và khối lượng hạt đều

có tương quan thuận với độ ẩm đất, do đó cung cấp nước đầy đủ đảm bảo sức căng cho tế bào và tốc độ sinh trưởng của cây, tăng khả năng tích luỹ chất khô của chúng Thiếu nước hạt không có khả năng nảy mầm, cây con bị héo, tạo quả kém, giảm năng suất

Hiện tượng mất nước của cây có thể do nhiều nguyên nhân: nhiệt độ thấp, nóng, hạn hán… Trong đó hạn hán là nguyên nhân chủ yếu gây nên sự mất nước ở thực vật

Hạn là phức hệ các điều kiện khí tượng bất lợi gây ra sự thiếu nước, mất nước ở thực vật, bao gồm: hạn trong đất và hạn trong không khí Hạn trong đất

có thể do nhiệt độ thấp hoặc nồng độ dịch đất cao Hạn trong không khí có thể

do độ ẩm quá thấp hoặc do nhiệt độ cao, gió mạnh Từ đó gây tác động xấu

ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, cuối cùng là ảnh hưởng đến năng suất, phẩm chất của chúng

Thiếu nước trong cây làm cho lỗ khí đóng, làm giảm lượng CO2 thâm nhập vào lá, khiến cho sự quang hợp giảm sút, suy giảm sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp từ lá đến cơ quan, bộ phận khác của cây, giảm việc gắn C vào các hợp chất protit Quá trình tổng hợp protit cũng bị giảm do sự tăng cường phân giải axit nucleic khi hạn hán

2 Huỳnh quang diệp lục và những nghiên cứu về huỳnh quang diệp lục ở thực vât

2.1 Huỳnh quang diệp lục

Hiện tượng huỳnh quang là sự bức xạ ngắn hạn với bước sóng dài hơn bước sóng ánh sáng hấp thụ và tắt đi đồng thời với sự tắt đi của nguồn sáng kích thích

Khi phân tử diệp lục nhận thêm năng lượng, nó chuyển tới một trạng thái năng lượng mới: trạng thái kích thích, trạng thái này không bền vững và

sự quay lại trạng thái cơ bản diễn ra rất nhanh chóng bằng cách giải phóng năng lượng hấp thụ theo những con đường sau:

Một là có thể chuyển năng lượng tới một phân tử khác và cuối cùng khởi động các phản ứng quang hoá, gây ra sự truyền điện tử quang hợp

Hai là nó có thể bị hao phí dưới dạng nhiệt

Ba là nó có thể phát lại dưới dạng phôtôn có năng lượng nhỏ hơn (tức là

có bước sóng lớn hơn) Hiện tượng này gọi là huỳnh quang diệp lục

Huỳnh quang diệp lục ở thực vật cũng có một chỉ số phản ánh quang hợp, nó liên quan mật thiết với phản ứng quang hoá Trong ba quá trình truyền năng lượng cạnh tranh nhau: những thay đổi của hiệu suất quang hợp hoặc sự hao phí dưới dạng nhiệt sẽ gây ra thay đổi của bức xạ huỳnh quang (trong cùng điều kiện thì sự hao phí dạng nhiệt hầu như là không đổi, chủ yếu là sự cạnh tranh giữa phản ứng quang hoá và huỳnh quang diệp lục)

Ta có thể mô tả mối tương quan của ba quá trình trên thông qua sơ đồ:

Kf + Kd + KPh

P* P

P và P* là trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích của phân tử diệp lục

Kf, Kd, KPh là các hằng số tốc độ làm mất đi trạng thái kích thích bằng bức xạ (huỳnh quang), không bức xạ (mất đi dưới dạng nhiệt) và quang hoá (sự phân chia đầu tiên các điện tích trong tâm phản ứng)

Hiệu suất lượng tử của phân chia đầu tiên điện tích và huỳnh quang sẽ tương ứng bằng:

KF + Kd + KPh KF + Kd + KPhTrong các điều kiện tối ưu, khi các tâm phản ứng hoạt động (tâm phản ứng mở) hằng số KPh lớn so với các hằng số còn lại Do đó năng lượng kích thích được sử dụng trong phản ứng quang hợp với hiệu suất lượng tử Qz gần bằng một đơn vị (=1) và chỉ có một phần nhỏ năng lượng kích thích (gần 0,3%) bị mất đi dưới dạng huỳnh quang Khi tâm phản ứng mở, xảy ra quá trình oxi hoá hoàn toàn chấp nhận điện tử đầu tiên quinon (QA) còn khi các tâm phản ứng đóng xảy ra khử chất nhận điện tử đầu tiên quinon (QA) và khi

đó hiệu suất huỳnh quang đạt giá trị cực đại Như vậy khi tâm phản ứng đóng thì hằng số tốc độ mất trạng thái kích thích bằng quang hoá sẽ bằng không, còn hiệu suất huỳnh quang tăng lên và đạt giá trị cực đại (Fm)

KF

QZ = 0 QFm =

KF + Kd + KPh Hiệu số giữa cường độ huỳnh quang khi tâm phản ứng “đóng” và “mở” (Fv = Fm - Fo) được gọi là huỳnh quang biến đổi diệp lục Nó tương ứng với phần năng lượng ánh sáng được các tâm phản ứng sử dụng trong các phản ứng quang hoá Một cách dễ dàng có thể chỉ ra rằng tỷ lệ huỳnh quang biến đổi trên huỳnh quang cực đại bằng hiệu suất lượng tử của phản ứng quang hoá đầu tiên phân chia các điện tích ở các tâm phản ứng quang hợp

KPh(QFm – QFo) / QFm =

KF + Kd + KPh

Như vậy, đo cường độ huỳnh quang ổn định Fo và cực đại Fm trong một

đơn vị thời gian tương đối cho phép nhận được giá trị tuyệt đối về hiệu quả sử dụng năng lượng ánh sáng trong các phản ứng quang hóa

Fv Fm - Fo

Qz = =

Fm FmHiệu quả phân chia điện tích trong các tâm phản ứng bị giảm đi khi

điều kiện sinh trưởng gặp bất lợi (ánh sáng dư thừa, nhiệt độ thấp, hạn hán, không đủ dinh dưỡng) Hiệu suất huỳnh quang biến đổi đặc trưng cho hiệu quả khử quinon A trong hệ quang hoá II, và có thể được sử dụng để đánh giá trạng thái sinh lý của thực vật

2.2 Những nghiên cứu huỳnh quang diệp lục ở thực vật

Huỳnh quang diệp lục là những thông số phản ánh trạng thái sinh lý bộ

máy quang hợp của cây trồng Nhờ có các phương tiện hiện đại người ta đã thu được kết quả quan trọng để giải thích về nguồn gốc và hiểu được cách sâu sắc về cơ chế của hiện tượng huỳnh quang

Trong những năm gần đây đã có nhiều thông báo như: huỳnh quang diệp lục [19] ; mối liên quan của nó với các hiện tượng vật lý nói chung và quang hợp nói riêng Trong các công trình của Murata và Satoh (1986) và Krause và Weis (1991) đã đưa ra các dẫn liệu mới nhất về mối quan hệ của bức xạ huỳnh quang và quang hợp sau khi đã phân tích các thông tin nhận

được theo quan điểm lý sinh và hoá sinh một cách đầy đủ nhất [7]

ở nước ta những năm gần đây các kỹ thuật hiện đại đo huỳnh quang đã

đưa phương pháp này trở thành một công cụ hết sức hữu hiệu để đánh giá tính chống chịu của một số cây trồng như: nhãn, cà chua, lúa, lạc…trong điều kiện bất lợi Những tác động từ môi trường đã ảnh hưởng không tốt đến trạng thái sinh lý của cây và được thể hiện thông qua huỳnh quang diệp lục (Fo, Fm, Fv/m)

Ưu điểm của phương pháp này là cho phép xác định nhanh tính chống chịu của thực vật dưới tác động của điều kiện môi trường ở trạng thái in vivo mà không gây ra tổn thương cây trồng trong quá trình nghiên cứu

3 Prolin và vai trò của Prolin đối với đời sống thực vật

Prolin

Công thức cấu tạo của prolin Cấu trúc không gian của prolin

Prolin là một imino axit ưa nước, được tổng hợp từ glutamat bởi enzim chìa khoá 1 - pyroline - 5 - carboxylat - synthetaza (P5CS) enzim được điều hành bởi prolin thông qua cơ chế ức chế ngược Prolin thuộc lớp của các phân

tử nhỏ bao gồm nhóm các axit amin, nhóm hợp chất amon bậc bốn (Glycinebetain, prolinbetain, - alanine betain và clolin - oxy - sulfat, và hợp chất sul folium bậc : - dimethylsulfonyo propionat (DMSP) Các hợp chất này đóng vai trò then chốt trong sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở tế bào thực vật để trả lời các stress thẩm thấu (22)

Còn đường tổng hợp prolin trong thực vật bậc cao (20)

( Theo Delanney A J, Verma DPS 1993)

Phân tử prolin có cấu trúc vòng tạo nên cho prolin hình dáng vững chắc hơn so với axit amin khác Vai trò của prolin trong chống chịu stress nước ở thực vật là tổng hợp prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào, tham gia các cấu trúc bảo vệ màng và protein

3.2 Những nghiên cứu về prolin đối với tính chống chịu ở thực vật

Sự tích luỹ prolin là một phản ứng chuyển hoá phổ biến của thực vật bậc cao trong điều kiện thiếu nước và stress muối Đây là vấn đề được các nhà khoa học nghiên cứu hơn 20 năm qua [ 22]

Chất ly gián sinh tổng hợp và phân huỷ của prolin trong cây lúa có thể tăng cường một số gen điều chỉnh thẩm thấu trong đó có DHN4 được sử dụng

để hình thành khả năng chống stress

Đã có những công trình trong và ngoài nước trên các đối tượng thực vật

và cây trồng khác tìm hiểu về chuyển hoá prolin… Kishor B.B.K và cộng sự (1995) [21] nghiên cứu gia tăng sản xuất prolin ở thực vật chuyển gen (cây thuốc lá) trong điều kiện hạn do nước, hạn do muối nhận được kết quả tốt Hàm lượng prolin gấp khoảng 10 - 18 lần so với đối chứng Các nghiên cứu về mô lá, mô phân sinh chồi của thực vật chịu áp lực nước (Barnet và Maylor

1996, Bogess 1976) và trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng nước thấp (Voet Berg và Sharp 1991) [18] Nghiên cứu về sự thay đổi hàm lượng prolin và axit abcsisic của những đối tượng mẫn cảm và chống chịu điều kiện áp suất thẩm thấu của Zheng Yi - Zhi và Litian cũng kết luận rằng: phản ứng với áp lực nước và nồng độ muối, cây đậu tương tích luỹ hàm lượng prolin cao, đó được xem như phản ứng thích nghi với điều kiện khô hạn

Bên cạnh đó còn nhiều công trình nghiên cứu khác: mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở cây lúa của Nguyễn Hữu Cường và cộng sự [2]; sự biến đổi hàm lượng axit amin prolin trong mầm và trong lá đậu

xanh [5]; ảnh hưởng của mannitol đến tích luỹ polin và glucozơ liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy mô sẹo cà chua [13]…

CHƯƠNG 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

1 Đối tượng nghiên cứu

Là giống đậu tương ĐT - 22 do Trung tâm nghiên cứu đậu đỗ, viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam chọn tạo từ dòng đột biến hạt lai của

tổ hợp DT - 95 và ĐT - 12 cung cấp Đây là giống mới có năng suất cao 15 -

27 ta/ha, thời gian sinh trưởng ngắn (85 - 90 ngày) ĐT - 22 có đặc điểm: hoa, màu lông phủ trắng, hạt vàng, rốn nâu, quả chín có màu xám Cây cao 45 – 70

cm, phân cành trung bình Số quả chắc trung bình: 25 - 40 quả, tỷ lệ quả 3 hạt cao (16% - 25%) Khối lượng 1000 hạt (140 - 150g) có thể trồng 3 vụ trong năm Đây là giống chịu được đất ướt và chịu bệnh khá

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu huỳnh quang diệp lục và hàm lượng prolin ở các thời kì sinh trưởng khác nhau của cây đậu tương: cây non (3 lá),

ra hoa, quả non, quả chắc Thời điểm đo huỳnh quang diệp lục vào buổi sáng (8h - 9h30’)

Các thời kì sinh trưởng được xác định dựa theo cách xác định của Phạm Văn Thiều [14]

- Thời kì (3 lá): Khi lá thứ 3 trên thân chính hình thành nhưng chưa buông lá hoà toàn

- Thời kì ra hoa: Thời điểm hoa nở rộ lần đầu

- Thời kì quả non: Bắt đầu hình thành quả (thường sau khi hoa nở rộ 7 ngày)

- Thời kì quả chắc: Khi đã có hạt đầy đủ (thuờng sau khi quả hình thành

21 - 25 ngày)

2.2 Phương pháp xác định huỳnh quang diệp lục

Được đo trên máy Chlorphill fluorometer OS do hãng ADC - Anh cung cấp Thời gian ủ tối là 7 phút để các tâm phản ứng trở về trạng thái ‘mở’ hoàn toàn hay toàn bộ chất nhận điện tử đầu tiên trong mạch vận chuyển điện tử quang hợp quinon A (QA) ở trạng thái oxi hoá

Cường độ huỳnh quang ổn định (F0) phản ánh sự mất đi năng lượng kích thích bằng bức xạ trong khoảng thời gian vận chuyển chúng về tâm phản ứng PSII ở trạng thái ‘mở’

Huỳnh quang cực đại (Fm) được đo khi các tâm phản ứng ở trạng thái

“đóng”

Hiệu suất huỳnh quang biến đổi (Fv/m) phản ánh hiệu quả sử dụng năng lượng ánh sáng trong phản ứng quang hoá được xác định như sau:

Fv/m = Fm - F0/Fm

Huỳnh quang diệp lục của lá được đo 8 lần trên lô thí nghiệm và 8 lần

đối với lô đối chứng Lá được chọn để đo là lá thứ 3 tính từ trên ngọn xuống,

là lá được đánh giá độ hấp thụ ánh sáng hiệu quả nhất

2.3 Phương pháp xác định hàm lượng prolin

* Cơ sở khoa học của phương pháp

Những hợp chất có màu là do trong phân tử chứa các nhóm mang mầu,

đó là các liên kết đôi, liên kết 3 như: C = C, C = O, C = N, N = N, C C, C

N…và nhóm trợ màu là các hệ liên hợp

Theo thuyết MO – Huckel (thuyết obitan phân tử – Theory of Molecular Orbitale): liên kết trong nhóm mang màu là kết quả của sự phân các Electron và các MO Phân tử sẽ hấp thụ photon có năng lượng Ep chuyển lên trạng thái kích thích

Năng lượng kích thích phụ thuộc vào cấu trúc electron của phân tử tức

là phân tử chỉ hấp thụ tia sáng có bước sóng xác định đặc trưng của phân tử Khi đưa một dải photon trong vùng phổ tử ngoại khả biến UV (Ultraviolet - visible Spectrophotometer, UV - VIS) qua dung dịch chiết, sẽ cho ta một phổ UV - VIS đặc trưng cho cấu trúc của phân tử Do đó có thể sử dụng UV - VIS để nghiên cứu cấu trúc phân tử hữu cơ nói chung và các hợp chất màu nói riêng Dựa vào UV của phân tử ta có thể biết bước sóng hấp thụ

đặc trưng của phân tử đó tương ứng với các pick trên phổ UV Theo những

nghiên cứu cho thấy phân tử prolin trong đề tài chúng tôi nghiên cứu hấp thụ cực đại tia sáng có bước sóng 520 nm

+ Nguyên tắc hoạt động của máy đo quang phổ (Spectrophotometer)

Nguồn sáng Bộ tách sóng Cuvet mẫu Bộ phân tích Bộ phận in + Lý thuyết của mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch:

Dựa vào định luật Lambert - Beer:

Io I

D = log = log = Cd (*)

Trong đó: D - Mật độ quang đo ở bước sóng ;

T - độ truyền qua, có giá trị 0 - 100%;

C - nồng độ dung dịch, mol/l;

I,I0 - cường độ bức xạ trước và sau khi ra khỏi dung dịch; – hệ số hấp thụ;

d - chiều dày lớp dung dịch hay chiều dày cuvet

Từ (*) ta thấy với d, không đổi thì giá trị của D phụ thuộc vào nồng

độ C của dung dịch, bước sóng khi đó (*) viết dưới dạng: D = f( ), D = f(C)

* Phương pháp xác định hàm lượng axit amin prolin: theo phương pháp của Bates và cộng sự [18]: cân 0,5g/mẫu nghiền kỹ, thêm 100ml dung dịch axit axetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 100oC trong 1 giờ, sau đó ủ nước đá 5 phút Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều Lấy phần dịch mầu hồng ở trên đem đo mật độ quang học (OD – Optical density)

ở bước sóng = 520 nm trên máy UV- Visible - Spectrophotometer UV -

2450 do hãng Shimadzu sản xuất

Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức sau: ( công thức suy ra từ việc lập đường chuẩn Prolin):

Y = 1,4083 x X + 0,014

2.4 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm:

Số liệu được sử lý đánh giá theo phương pháp toán thống kê trên máy tính nhờ phần mềm Exel - 2003 với các thông số: trung bình số học, độ lệch chuẩn, sai số trung bình số học, hệ số biến động, độ chính xác của thí nghiệm, tiêu chuẩn độ tin của hiệu

n

X X

n i i

d = ư

d

m d

td =