Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ thạch tùng

Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium clavatum“Nguồn: Erdogan Orhan Ilkay, 2007” [20] Terpenoid: một số triterpenoid đã được phân lập và định danh từ các l

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI

TRONG HỌ THẠCH TÙNG

LUẬN ÁN TIÊN SĨ DƯỢC HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, năm 2020

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ LOÀI

TRONG HỌ THẠCH TÙNG

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã số: 62720410 LUẬN ÁN TIÊN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN

TS TRẦN MẠNH HÙNG

TP HỒ CHÍ MINH, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứuđược trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ởbất kỳ nơi nào

Tác giả luận án

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 7

1.3 CÁC PHƯƠNG CHIÊT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH HUPERZIN A 18

1.4 THIÊT LẬP CHẤT ĐỐI CHIÊU 20

1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHÊ ACETYLCHOLINESTERASE 22

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHƠ 23

1.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỌ THẠCH TÙNG 25

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 THIÊT KÊ NGHIÊN CỨU 27

2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 27

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29

2.4 CỠ MẪU 29

2.5 XÁC ĐỊNH CÁC BIÊN SỐ 30

2.6 DUNG MÔI - HÓA CHẤT - TRANG THIÊT BỊ 30

2.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

Chương 3 KÊT QUẢ NGHIÊN CỨU 51

3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 51

3.2 TÁC DỤNG ỨC CHÊ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG 58

3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 61

3.4 THIÊT LẬP CHẤT ĐỐI CHIÊU 82

3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC

LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CZE VÀ HPLC 88

3.6 NGHIÊN CỨU IN VIVO TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHƠ CỦA THẠCH TÙNG NGHIÊN 104

Chương 4 BÀN LUẬN 106

4.1 VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC 106

4.2 VỀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHÊ ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC LOÀI THẠCH TÙNG 110

4.3 VỀ MẶT HÓA HỌC 112

4.4 VỀ MẶT THIÊT LẬP CHẤT ĐỐI CHIÊU 119

4.5 VỀ MẶT XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HUPERZIN A TRONG DƯỢC LIỆU 121

4.6 VỀ MẶT THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC 125

KÊT LUẬN 129

KIÊN NGHỊ 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Polarization TransferDTNB 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoic

EtOAc Ethyl acetat

FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm

dược phẩm Hoa KỳHMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC High Pressure Liquid Chromatography Sắc ký lỏng cao áp

HRMS High Resolution Mass Spectrometry Khối phổ phân giải cao

Correlation

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PCRS Primary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học sơ

cấpSCRS Secondary Chemical Reference Standard Chất đối chiếu hóa học thứ

cấp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 29

Bảng 2.2 Thành phần một mẫu thử nghiệm theo phương pháp Ellman 32

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khác nhau của các chi trong họ Thạch tùng 55

Bảng 3.2 Kết quả xác định độ ẩm cao chiết MeOH và hiệu suất chiết các dược liệu 58 Bảng 3.3 Kết quả tác động ức chế AChE của mẫu thử nghiệm 59

Bảng 3.4 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật 61

Bảng 3.5 Kết quả so sánh 2 quy trình phân lập alcaloid 62

Bảng 3.6 Các phân đoạn của cột Diaion HP-20 64

Bảng 3.7 Các phân đoạn của cột sắc ký MeOH 100 % 65

Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1 H, 113 C và DEPT của hợp chất 1 66

Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 1 H, 113 C và DEPT của hợp chất 2 68

Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1 H, 113 C và DEPT của hợp chất 3 70

Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 4 72

Bảng 3.12 So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3 73

Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 77

Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 6 78

Bảng 3.15 Kết quả tác động ức chế AChE của các hợp chất phân lập được 80

Bảng 3.16 Các phân đoạn của cột R-1 81

Bảng 3.17 Các phân đoạn của cột R-2 81

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát hàm ẩm và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết 82

Bảng 3.19 Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của huperzin A 83

Bảng 3.20 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu thiết lập CĐC 84 Bảng 3.21 Kết quả phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA 87

Bảng 3.22 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống và kết quả xác định hàm lượng huperzin A tại 2 phòng thí nghiệm (n = 6) 87

Bảng 3.23 Xác định giá trị công bố 87

Bảng 3.24 Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn 92

Bảng 3.25 Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử 92

Bảng 3.26 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Thạch

tùng răng 93

Bảng 3.27 Tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A 94

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng huperzin A 95

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn huperzin A 97

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng huperzin A trong Râu rồng 98

Bảng 3.31 Kết quả tính toán hàm lượng huperzin A trong cây Râu rồng 99

Bảng 3.32 Tương quan nồng độ và diện tích đỉnh của huperzin A 99

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng 100

Bảng 3.34 Kết quả xác định hàm lượng huperzin A của 10 loài trong họ Thạch tùng 103 Bảng 4.1 Các hệ thống phân loại họ Thạch tùng 107

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid 8

Hình 1.2 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin 8

Hình 1.3 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin 9

Hình 1.4 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin 9

Hình 1.5 Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng 10

Hình 1.6 Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium clavatum 11

Hình 1.7 Cấu trúc một số terpenoid được phân lập từ loài Lycopodium japonicum 11 Hình 1.8 Cấu trúc của một số flavonoid trong chi Lycopodium 12

Hình 1.9 Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên 14

Hình 1.10 Cấu trúc của huperzin A 15

Hình 3.1 Các loài Thạch tùng nghiên cứu 54

Hình 3.2 So sánh đặc điểm vi phẫu rễ của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 56 Hình 3.3 So sánh đặc điểm vi phẫu thân của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 57 Hình 3.4 So sánh đặc điểm vi phẫu lá của 3 loài thuộc 3 chi trong họ Thạch tùng 58 Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch chiết alcaloid từ quy trình 1 và quy trình 2 62

Hình 3.6 Sắc ký đồ các phân đoạn MeOH 100 % 64

Hình 3.7 Công thức cấu tạo của huperzin A 67

Hình 3.8 Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B 68 Hình 3.9 Công thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A) 69

Hình 3.10 Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A) 69

Hình 3.11 Công thức cấu tạo của acetylaposerratinin 71

Hình 3.12 Công thức cấu tạo của huperzinin 72

Hình 3.13 Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid 75

Hình 3.14 Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion 75

Hình 3.15 Công thức cấu tạo của lycocernuin 76

Hình 3.16 Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid 79

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A 80

Hình 3.18 Sắc ký đồ các phân đoạn cột R-1 81

Hình 3.19 Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn huperzin A 83

Hình 3.20 Điện di đồ của mẫu thử khảo sát dung dịch đệm 88

Hình 3.21 Điện di đồ của mẫu thử khảo sát nồng độ dung dịch đệm 88

Hình 3.22 Khảo sát nồng độ đệm đến (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển, (c) thời gian xuất hiện pic chuẩn nội 89

Hình 3.23 Điện di đồ của mẫu thử khảo sát sự ảnh hưởng của pH 89

Hình 3.24 Khảo sát pH theo độ phân giải (a) và theo cường độ dòng (b) 90

Hình 3.25 Điện di đồ của mẫu thử khảo sát điện thế 90

Hình 3.26 Khảo sát điện thế theo (a) độ phân giải, (b) thời gian dịch chuyển 90

Hình 3.27 Diện di đồ của mẫu thử khảo sát phương pháp chiết 91

Hình 3.28 Điện di đồ mẫu thử chiết huperzin A trong Thạch tùng răng bằng MeOH lần thứ 4 91

Hình 3.29 Phổ UV huperzin A trong mẫu thử và mẫu chuẩn 92

Hình 3.30 Điện di đồ các mẫu trắng (a), chuẩn (b), thử (c), thử thêm chuẩn (d) 93

Hình 3.31 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích đỉnh chuẩn hóa của huperzin A 94

Hình 3.32 Sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát pha động MeOH - acid phosphoric 0,1 % (18:82) 96

Hình 3.33 Sắc ký đồcủa mẫu thử khảo sát dung môi chiết 96

Hình 3.34 Sắc ký đồ dịch chiết MeOH lần thứ 4 của mẫu thử 97

Hình 3.35 Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn khảo sát tính chọn lọc 98

Hình 3.36 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của huperzin A 99

Hình 3.37 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia phlegmaria 101

Hình 3.38 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia carinata 101

Hình 3.39 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia fordii 101

Hình 3.40 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia tetrasticha 102

Hình 3.41 Sắc ký đồ của mẫu thử Huperzia serrata 102

Hình 3.42 Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium complanatum 102

Hình 3.43 Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium clavatum 102

Hình 3.44 Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodium casuarinoides 103

Hình 3.45 Sắc ký đồ của mẫu thử Lycopodiella cernua 103

Hình 4.1 Công thức cấu tạo của huperzin A và huperzinin 115

Hình 4.2 Công thức cấu tạo của lycosquarosin A và acetylaposerratinin 117

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Lycopodiaceae……….3

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu 28

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ thử nghiệm mô hình mê cung bơi 50

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Râu rồng 63

Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên 74 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Kết quả thử nghiệm tránh né thụ động (n = 5) 104

Biểu đồ 3.2 So sánh thời gian chuột tìm đến chân đế (n = 5) 105

Biểu đồ 3.3 So sánh thời gian chuột bơi trong vùng có chân đế (n = 5) 105

MỞ ĐẦU

Bệnh Alzheimer là một chứng suy giảm trí nhớ phổ biến nhất, ảnh hưởngnghiêm trọng đến cuộc sống của người lớn tuổi Vì bệnh không thể chữa khỏi,người bệnh cần được chăm sóc bởi người thân Đây quả thực là áp lực rất lớn vềmặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người trong giađình Do đó, bệnh Alzheimer trở thành một thách thức lớn cho xã hội trong thế kỷnày [21] [95] [111]

Alzheimer được xem như một triệu chứng của quá trình lão hoá mà đặc trưngcủa bệnh là sự suy thoái trí nhớ và sự mất trí nhớ toàn bộ xảy ra khi bệnh tiến triển.Những nghiên cứu về căn bệnh đã xác định mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diệncủa chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholin, vốn cần cho việc hình thành vàlưu giữ trí nhớ, với sự tiến triển của bệnh Alzheimer Acetylcholin tồn tại càng lâu trongnão thì các tế bào não có thể gợi nhắc trí nhớ càng lâu Ngày nay, phương pháp hiệu quảnhất là sử dụng các chất có tác dụng ức chế acetylcholinesterase như tacrin, donepezil,galantamin và rivastigmin [33] [94] [112] Huperzin A được chiết xuất từ cây Thạchtùng răng đã gây được rất nhiều chú ý bởi các công dụng của nó trong điều trị chứngbệnh mất trí nhớ Các nghiên cứu khoa học hiện đại đã chỉ ra rằng huperzin A có khảnăng ức chế enzym acetylcholinesterase, loại enzym quan trọng trong quá trình gây rabệnh mất trí nhớ Huperzin A đã được công nhận là một loại thuốc điều trị mất trí nhớhiệu quả ở Trung Quốc và hiện nay đã được cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA)công nhận là 1 loại thực phẩm chức năng cho các bệnh nhân bị Alzheimer [9] [17].Huperzin A đã được chứng minh bởi nhiều công trình nghiên cứu rằng nó có thể làmtăng khả năng ghi nhớ và lưu trữ thông tin của não cũng như cải thiện sự sa sút về trí tuệcủa các bệnh nhân ở Trung Quốc [35] [49] [136] Huperzin A cũng có khả năng bảo vệkhác như điều chỉnh tiền chất beta-amyloid protein, qua đó chống lại sự oxi hóa, sự tựchết của tế bào thần kinh theo quá trình apoptosis, rối loạn chức năng của ti thể và cókhả năng chống viêm nhiễm Những khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh của huperzin

A đã giúp ích rất nhiều cho các bệnh nhân Alzheimer [57] [117] [124] [125]

Thạch tùng răng có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb ex Murray)

Trevis thuộc họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) Trong y học cổ truyền Trung Quốc,Thạch tùng được sử dụng để điều trị sưng phù nề tâm thần phân liệt [9] Theo cáctài liệu cổ, Thạch tùng được sử dụng trong dân gian ở Việt Nam dùng để điều trị cáctổn thương, nôn ra máu, trĩ, đinh nhọt, viêm da, và rắn cắn [2]

Ở Trung Quốc, cùng với Huperzia serrata, các thực vật khác thuộc họ Lycopodiaceae có thể chứa hợp chất huperzin A như là Huperzia crispata (Ching) Ching, Huperzia miyoshiana (Makino) Ching và một số loài khác [67] [70] Trong

khi đó ở Việt Nam, một số cây thuộc họ Lycopodiaceae cũng có thể là nguồn thựcvật cung cấp các hợp chất tự nhiên theo hướng tác dụng sinh học cải thiện trí nhớ

như Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis (Râu rồng), Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm (Thạch tùng nghiên ) và nhiều loài khác Thực tế hiện nay chưa có những

đánh giá chi tiết và hoàn chỉnh về tác động ức chế enzym acetylcholinesterase và

hàm lượng các thành phần Lycopodium alcaloid trong thực vật có thể chứa những

2 Thử nghiệm in vitro sàng lọc tác dụng kháng acetylcholinesterase của cao

chiết của một số loài Thạch tùng

3 Phân lập một số hợp chất tự nhiên trong cây Râu rồng (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.), Thạch tùng nghiên (Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm.) và

đánh giá tác dụng kháng acetylcholinesterase của các chất phân lập được

4 Thiết lập chất chuẩn hợp chất kháng enzym acetylcholinesterase phân lập được

5 Xây dựng phương pháp định lượng hợp chất có tác dụng kháng enzymacetylcholinesterase trong các loài Thạch tùng bằng phương pháp điện dimao quản và HPLC

6 Thử nghiệm in vivo tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết alcaloid của loài

Thạch tùng nghiên có trữ lượng lớn và tiềm năng

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC

1.1.1 Tổng quan về họ Lycopodiaceae

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Họ Thạch tùng hay còn được gọi là họ Thông đất (Lycopodiaceae) bao gồm hơn

400 loài cổ thực vật có mạch, tồn tại từ cuối kỷ Silur cách đây khoảng 400 triệu năm,phân bố rộng rãi khắp nơi trên thế giới Đây là họ thực vật thuộc lớp Thông đất, theo hệthống phân loại của Øllgaard năm 1989, họ Thạch tùng được phân loại theo Sơ đồ 1.1

[2] [82]

Lycopodiophyta (Ngành Thông đất)

Lycopodiopsida (Lớp Thông đất)

Lycopodiales (Bộ Thông đất)

Lycopodiaceae (Họ Thông đất)

Chi Lycopodium L Chi Lycopodiella Chi Huperzia Chi Phyloglossum

Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại của Lycopodiaceae

“Nguồn: Øllgaard Benjamin, (1989)” [82]

Thực tế hiện nay, họ Lycopodiaceae còn có nhiều hệ thống phân loại khác được đềxuất bởi các nhà khoa học trên thế giới Phổ biến nhất là hệ thống phân loại của Øllgaard

1989 phân chia bộ Thông đất chỉ có 1 họ Thạch tùng và trong đó có 4 chi như trên Đốivới hệ thống phân loại của Holub 1985 thì phân chia bộ Thông đất thành 2 họ

là Huperziaceae và Lycopodiaceae, trong đó có 11 chi [40] [144] Tác giả Ching cũng

đề xuất phân chia bộ Thông đất thành 2 họ là Huperziaceae có 2 chi (Huperzia va Phlegmariurus) và họ Lycopodiaceae có 5 chi (Lycopodium, Diphasiastrum, Palhinhaea, Lycopodiella va Lycopodiostrum) [40] [69] [81] Chính vì thế mà vẫn còn

tồn tại nhiều tên đồng danh xuất phát từ một loài Cụ thể như cây Râu rồng có tên

khoa học là Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis., tên đồng danh của nó là Lycopodium squarrosum Forst hay Thạch tùng nghiên có tên khoa học là Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm., tên đồng danh là Lycopodium cernuum (L.), Palhinhaea cernua (L.) Franco & Vasc., Lepidotis cernua (L.) P.Beauv [145].

Ngành Thông đất (Lycopodiophyta) có thể bào tử, có rễ thật Thân phát triểnmạnh, phân nhánh rẽ đôi, mang nhiều lá nhỏ dạng vảy hay hình kim, xếp xoắn ốc, cómạch dẫn Lá bào tử hợp thành bông lá bào tử ở đầu cành Ngành Thông đất được chiathành 2 lớp: Lớp Thông đất – Lycopodiopsida và lớp Thủy phỉ – Isoetopsida Trong

đó, lớp Thông đất có đặc điểm: Thân đứng hoặc bò trên mặt đất, không có lóng vàmắt, phân nhánh theo lối rẽ đôi Lá nhiều, nhỏ, nguyên, một gân Lá bào tử tụ thànhbông ở ngọn Túi bào tử đính ở gốc các lá bào tử và chỉ có một ô Cây đẳng bào tử hay

dị bào tử Lớp Thông đất được chia thành 2 bộ, mỗi bộ có 1 họ: Bộ Thông đất(Lycopodiales) đẳng bào tử, họ Thông đất (Lycopodiaceae) và bộ Quyển bá(Selaginellales) dị bào tử, họ Quyển bá (Selaginellaceae)

Các loài trong họ Thông đất thuộc thân thảo đa niên, sinh sản bằng bào tử, phân

bố ở nhiều nước châu Á và vùng Trung Mỹ, được phát hiện ở trong các khu rừng nhiệt

đới ẩm ướt Ở Việt Nam, phát hiện được 3 chi là Lycopodium L., Lycopodiella Holub, Huperzia Bernh và có khoảng 16 loài, phân bố ở những vùng núi cao trên 1000 m thuộc các tỉnh Lâm Đồng, Kon Tum, Quảng Nam, Nghệ An, Lào Cai, Cao Bằng, bao

gồm [1] [2]:

Chi Huperzia:

• Huperzia chinense (Christ) Ching (Thạch tùng Trung Quốc)

• Huperzia serrata (Thunb.) Trevis (Thạch tùng răng)

• Huperzia cancellata (Spring.) Trevis (Thạch tùng bôi)

• Huperzia carinata (Poir.) Trevis (Thạch tùng sóng)

• Huperzia hamiltonii (Spring.) Trevis (Thạch tùng hamilton)

• Huperzia subdisticha Mak (Thạch tùng song đính)

• Huperzia obovalifolia (Bon.) (Thạch tùng xoan ngược)

• Huperzia phlegmaria (L.) Roth (Thạch tùng đuôi ngựa)

• Huperzia salvinoides (Herter) Alston (Thạch tùng bèo)

• Huperzia fordii (Baker) R D Dixit (Thạch tùng Ford)

• Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis (Râu rồng)

Chi Lycopodium:

• Lycopodium complanatum L (Thạch tùng dẹp)

• Lycopodium annotinum L (Thạch tùng nhiều bông)

• Lycopodium carsuarinoides L (Thạch tùng dương)

• Lycopodium clavatum L (Thạch tùng dùi)

Chi Lycopodiella:

• Lycopodiella cernua (L.) Pic Serm (Thạch tùng nghiên )

1.1.1.2 Đặc điểm Phân bố, sinh thái

Họ Lycopodiaceae bao gồm các loài thân thảo đa niên sống trên mặt đất haysống phụ sinh Nhóm sống trên mặt đất có thể phát triển trên các vùng đất bạc màu ẩmhay trong và xung quanh vùng đầm lầy, áp suất thấp Do đó, chúng thường được tìmthấy trên các vùng núi cao và vùng phụ cận núi cao Nhóm phụ sinh thường phát triểntrên các thân cây to hay mọc trên các vách đá Chúng thường được tìm thấy ngày càngnhiều trong các khu rừng ẩm ướt và rừng nhiệt đới ở độ cao, ở trong và giữa rêu vàthực vật biểu sinh khác [2]

Bốn chi thuộc họ Lycopodiaceae phân bố ở các vùng khác nhau Chi

Lycopodium và chi Lycopodiella gồm các loài mọc trên mặt đất hoặc leo bám lên thân cây khác, mỗi chi gồm khoảng 40 loài Chi Lycopodium phân bố rộng ở vùng nhiệt đới

và ôn đới Còn chi Lycopodiella phân bố rộng ở các vùng ẩm ướt, ôn đới và nhiệt đới trên thế giới nhưng đặc biệt đa dạng ở châu Mỹ Chi Phyloglossum bao gồm các loài thực vật nhỏ mọc ở đất Đây là một chi đơn loài (Phyloglossum drummondii) đặc hữu của miền nam Australia và New Zealand Chi Huperzia gồm hơn 200 loài sống phụ

sinh hay mọc trên mặt đất có thể phát triển từ vùng nhiệt đới đến các vùng Bắc cực và

từ mực nước biển tới môi trường núi cao [2] [66]

1.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật

Thân: Có nhánh hoặc không phân nhánh, nhánh đứng hoặc treo thõng xuốngđất nhưng không bao giờ leo Nếu thân cây được phân nhánh, các nhánh luôn luôn làphân đôi Thông thường các phân đôi liên tiếp và phân đôi về góc bên phải với nhau

Lá: Lá nhỏ, đơn giản, không cuống, nhiều và bao phủ gần hết thân cây Thông

thường lá dài 2-10 mm và xếp theo hình xoắn ốc khép kín như ở loai Lycopodium clavatum và Lycopodium annotinum Trong khi đó ở một số trường hợp khác lá xếp

theo hình vòng xoắn như Lycopodium verticillatum và Lycopodiella cernua Ở một số loài khác lá lại xếp theo từng cặp đối diện nhau như Lycopodium alpinium, ở loài khác

lá lại không sắp xếp theo bất kỳ quy tắc nào Lá có dạng mũi mác Các lá đều giốngnhau về kích thước và hình dạng, nhưng trong một vài loài chẳng hạn như

Lycopodium complanatum, Lycopodium volubile và Lycopodium chamaecyparissus có

lá lưỡng hình và được xếp theo 4 hàng dọc trên thân, 2 hàng kích thước lớn hơn và 2

hàng kích thước nhỏ hơn [7]

Rễ: Phát sinh đơn lẻ hoặc theo nhóm hướng ngọn dọc theo phía dưới của thân

cây Ở một số loài, ví dụ Lycopodium selago, Lycopodium phlegmaria và một số loài

khác rễ phát sinh bên ngoài trung trụ không xuyên qua khu vực vỏ của thân Những rễnày chuyển xuống dưới và xuyên qua vùng vỏ giữa và cuối cùng nó chỉ xuất hiện ởthân cây Rễ như vậy được gọi là rễ vỏ hay rễ bên trong Ở một số loài như

Lycopodium obscurum và Lycopodium lucidulum điểm nổi bật của quá trình phân nhánh ở rễ là phân đôi Quá trình phân đôi theo hướng về bên phải của lần phân nhánh

trước đó Ở nhiều loài sự phân nhánh không rõ [24]

Nhánh mang bào tử: Lá thường và lá bào tử giống nhau hoặc khác nhau về hìnhdạng và kích thước Nhánh mang bào tử rất đa dạng ở các loài khác nhau Các nhánhbào tử nằm khắp chiều dài của thân cây Ở một số loài khác, trên nhánh bào tử cómang lá bào tử Lá bào tử có thể giống hay khác lá dinh dưỡng về kích thước, độ đậm

nhạt trong màu sắc và mép răng cưa Trong một số loài như Lycopodium clavatum và Lycopodium complanatum nhánh mang bào tử thường sinh ra trên thân cứng dài, và vẫn còn được phủ với một lượng nhỏ lá Trong một số loài nhánh mang bào tử không cuống ví dụ Lycopodium inundatum, Lycopodium alpinum [116].

Bào tử: Các loài có bào tử nhỏ Bông bào tử mang nhiều lá bào tử xếp xoắn ốctrên một trục Mỗi túi bào tử có dạng hình cầu hay hình thận nằm ở nách lá bào tử.Cây sinh sản bằng bào tử Khi bào tử nảy mầm cho nguyên tản hình tim mang túi tinh

và túi noãn, noãn cầu thụ tinh tạo ra hợp tử và phát triển trên nguyên tản tạo thành câymới [24]

Đặc điểm vi phẫu của rễ: Tiết diện cắt ngang của rễ cho thấy cấu tạo của rễgồm những phần sau: Rễ bao gồm lớp biểu bì, vùng vỏ và trung trụ như thực vật cómạch khác Lớp biểu bì là lớp duy nhất làm phát sinh lông hút Các lông hút được hìnhthành theo cặp Lông hút được hình thành do sự phân chia xiên hoặc nếp lồi của tế bàobiểu bì non Nằm ngay dưới lớp biểu bì là vùng vỏ rộng, bao gồm một số tế bào váchdày Vùng trung trụ gồm tiền mộc chiếm đa số trong tổng thể Thông thường rễ có 1khối libe nằm xen giữa khối gỗ hình chữ C hoặc hình chữ U [7]

Đặc điểm giải phẫu thân: Vi phẫu cắt ngang của thân cây trưởng thành của

Lycopodium clavatum cho thấy: Biểu bì là một lớp tế bào dày, bên ngoài có phủ lớp cutin.

Vùng vỏ là khá rộng và thay đổi rất nhiều trong độ dày tương đối từ loài này sang loàikhác Ở một số loài độ dày gấp nhiều lần so với trung trụ, ở các loài khác hai vùng này làtương đương nhau Vỏ có ba vùng Các vùng bên ngoài và trung tâm bao gồm các tế bàohóa mô cứng dày trong khi vùng giữa bao gồm các tế bào lớn hơn và mỏng có chứa mộtvài lục lạp Vùng trung trụ chiếm khoảng một nửa diện tích của phần này, bao gồm các tếbào có hình dạng không đều, gồm gỗ xen kẽ với libe Gỗ bao gồm: chủ yếu là quản bàohình thang, không có mạch và tế bào mô mềm Mỗi bó gỗ được bao quanh bởi duy nhấtmột lớp mô mềm Libe chỉ gồm các ống rây và mô mềm Sự phát triển của cả libe và gỗhướng tâm Các tiền mộc gồm các quản bào xoắn ốc Các tiền mộc nằm ở cạnh ngoài của

bó gỗ Ở mặt trong của vùng vỏ có thể có một lớp nội bì, ít nhất là ở vùng thân non có

thành xuyên tâm dày đặc Các nội bì của của các loài thuộc Lycopodium được cho là có nguồn gốc từ vùng trung trụ, không phải từ vùng vỏ Bên trong nội bì là lớp trụ bì gồm

nhiều lớp Lớp trụ bì thường có từ 3-6 lớp tế bào dày [7]

Đặc điểm giải phẫu của lá: Tiết diện cắt ngang của lá có cấu tạo như sau: Gângiữa có một bó dẫn duy nhất Gỗ ở trung tâm khá nhỏ, không phân biệt được cấu tạocấp 1 và cấp 2 Gỗ bao gồm thành dày bao quanh Libe bao gồm mô mềm libe và ốngrây Nội bì khó nhìn thấy Các bó mạch vẫn còn bao quanh bởi trụ bì hóa mô cứng Mômềm lá nằm giữa bó mạch và lớp biểu bì Lớp biểu bì của hầu hết các loài có lỗ khí

trên cả hai mặt của lá như trong Lycopodium clavatum, Lycopodium selago Tuy

nhiên, ở các loài có lá lưỡng hình các lỗ khí thường được tìm thấy trên một mặt của lá

như trong Lycopodium complanatum và Lycopodium volubile [7] [24].

1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Các nhóm hoạt chất được phát hiện nhiều nhất từ các loài thuộc họ Thạch tùng

chủ yếu bao gồm nhóm Lycopodium alcaloid, terpenoid, flavonoid và các acid

phenolic [66] [97] [149]

1.2.1. Lycopodium alcaloid

Các Lycopodium alcaloid này thường có khung cấu trúc 16 carbon, 32 carbon,

một số ít công thức hóa học có ít hơn 16 carbon và được chia thành 4 nhóm làlycopodin, lycodin, fawcettimin và nhóm có cấu trúc khác tương tự như phlegmarin[9] [54] [58] [66]

N B

Hình 1.1 Cấu trúc của bốn nhóm Lycopodium alcaloid

“Nguồn: Ma X., 2004” [66]

Theo đề xuất về sinh phát nguyên của Corony, khung cấu trúc của các

Lycopodium alcaloid này có cấu tạo bởi 2 đơn vị 2 - propylpiperidin, liên kết với nhau

tạo thành khung phlegmarin Sự hình thành liên kết giữa C4 và C13 tạo ra khunglycodan Các alcaloid thuộc nhóm này phân lập được trong tự nhiên đa số đều có vòng

A bị oxy hóa thành vòng pyridin và pyridon Sự thay đổi ở vị trí C1 gắn với N α được

tách ra và gắn lại vào N β đã tạo ra khung lycopodin Khung fawcettimin được hìnhthành từ sự dịch chuyển C4 liên kết với C13 chuyển sang C4 liên kết với C12 [66]

Nhóm lycodin: Khung cơ bản của nhóm này cũng bao gồm 4 vòng 6 cạnh liên kết

với nhau nhưng khác với nhóm lycopodin là vòng A mở và sắp xếp lại thành vòng piridin

hoặc vòng piridon Tất cả các Lycopodium alcaloid nhóm này có hoạt động ức chế AChE,

đáng chú ý nhất là huperzin A, huperzin B, N-methyl-huperzin B [64] [91]

Hình 1.2 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycodin

“Nguồn: Zhang, Dong-Bo, 2013” [152]

Nhóm lycopodin: Là nhóm có nhiều hợp chất được phân lập nhất của

Lycopodium alcaloid Nhóm này được đặc trưng bởi 4 vòng 6 cạnh liên kết với nhau,

trong đó vòng A và vòng C là vòng quinolizidin

Hình 1.3 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung lycopodin

“Nguồn: Kogure, Noriyuki va cộng sự, 2016” [55]

Nhóm fawcettimin: Đặc điểm khung cấu trúc của nhóm này là liên kết đôi ở

carbon số 13 và 14 Do đó, nó dễ dàng bị hydrat hóa để gắn hydroxyl vào vị trí C13

Hình 1.4 Cấu trúc của một số hợp chất alcaloid khung fawcettimin

“Nguồn: Tang Yu., 2016” [109]

Nhóm lycopodium alcaloid khác: Các hợp chất trong nhóm này có cấu trúc rất đa

dạng Khung cơ bản của nhóm là phlegmarin Khung phlegmarin được xem là chất trung

gian để sinh tổng hợp các Lycopodium alcaloid khác Khác với 3 nhóm trên, nhóm này có

C4 không nối với C12 và C13 qua cầu nối C-C, khung cấu trúc chỉ có 3 vòng, thay vì banhóm trên khung cấu trúc có 4 vòng Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp ngoại lệ, một

số hợp chất thuộc nhóm này nhưng khung cấu trúc có 6 vòng như huperzin J, lucidin A,

oxolucidin A, lucidin B, oxolucidin B Cermizin A giống phlegmarin nhất chỉ khác ở Nα

và C9 Cernuin, lycocernuin có cấu trúc khác với phlegmarin, các hợp chất này mở vòng

D ở C7-C12 tạo thành khung tetracyclic Ngoài ra, nhóm này còn có 5 alcaloid có 2 vòng:huperzinin B, phlegmariurin N, cermizin C, senepodin G và senepodin H là nhữngalcaloid lycopodin có cấu trúc đơn giản nhất, vòng quinolizidin

của cermizin C, senepodin G và senepodin H có liên quan đến nguồn gốc vòngquinolizidin (vòng A và C) của nhóm lycopodin [54] [114].

Một số Lycopodium alcaloid đã phân lập được trong họ Lycopodiaceae như: Huperzin W, huperserratinin, serratin, lucidiolin, serratanidin (Huperzia serrata) [150]; complanadin A, lycopladin B, lycopladin C, lycopladin D, lyconadin B (Lycopodium complanatum) [45] [53]; lycoparins A-C (Lycopodium casuarinoides) [38]; lycopoclavamin A-B, dihydrolycopoclavamin A (Lycopodium clavatum) [52]; cermizin A-

D, senepodin G-H, cernuin N-oxide, lycocernuin N-oxide, cernuin, lycocernuin; hydroxycernuin (Lycopodiella cernua) [77] Nhiều công trình nghiên cứu in vitro và in vivo về tác dụng dược lý cho thấy các lycopodium alcaloid có những ảnh hưởng nhất định

2-trong việc điều trị các bệnh liên quan đến hệ thống tim mạch, thần kinh cơ và hoạt động

ức chế AChE Những alcaloid này được chứng minh có tác động tích cực đến trí nhớ vàkhả năng học tập Trong đó, hợp chất được quan tâm nhiều nhất đó là huperzin

A vì có tác dụng ức chế chọn lọc AChE, cải thiện trí nhớ và sự tiếp thu kiến thức, chống oxy hóa [44]

Hình 1.5 Cấu trúc của một số Lycopodium alcaloid trong cây Thạch tùng răng

“Nguồn: Ma X., 2004” [66]

1.2.2 Các nhóm hợp chất khác

Acid phenolic: Một số acid phenolic đã được phân lập từ loài Lycopodium

clavatum L., Lycopodiaceae [20] [83].

Hình 1.6 Cấu trúc của một số acid phenolic được phân lập từ loài Lycopodium clavatum

“Nguồn: Erdogan Orhan Ilkay, 2007” [20]

Terpenoid: một số triterpenoid đã được phân lập và định danh từ các loài trong

họ Thạnh tùng

H H

CHO HO

1.2.3 Thành phần hóa học của cây Râu rồng

Những nghiên cứu về thành phần hóa học về Lycopodium alcaloid của loài Râu

rồng nhằm mục đích tìm ra chất mới có tác dụng thay thế huperzin A và thay thế choloài Thạch tùng răng đang ngày càng trở nên cạn kiệt Những thử nghiệm nhân giống

in vitro cho thấy hàm lượng huperzin A trong loài Râu rồng cao hơn rất nhiều so với

Thạch tùng răng [67]

Công trình của các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập được một số alcaloidkhác thuộc nhóm fawcettimin từ cây Râu rồng khi tiến hành nghiên cứu 3 loài đại diệntrong họ Thạch tùng Các alcaloid này đã được xác đinh cấu trúc bao gồm [52]:

Lycopo-squarrosamin-A,

Acetylaposerratinin,

8α-hydroxyfawcettimin, 8β-hydroxyfawcettimin,

8β-acetoxyfawcettimin, acetyllycoposerramin-U, lycoflexin N-oxide.

1.2.4 Thành phần hóa học của cây Thạch tùng nghiên

Cũng giống như các loài thuộc họ Lycopodiaceae, trong cây Thạch tùng nghiêncũng có 4 thành phần hóa học chủ yếu là: Alcaloid, triterpen, flavonoid, acid phenolic.Trong đó các alcaloid đã được xác định cấu trúc bao gồm:

Nhóm chất có khung gần giống phlegmarin chỉ khác ở Nα và C-9: Cermizin A

và cermizin B

Nhóm chất có vòng quinolizidin: cermizin C, senepodin G và senepodin H.Nhóm chất có vòng quinolizidin và piperidin: Cermizin D, đây là một alcaloid

C16N2, và được xem là tiền chất của cernuin, lycocernuin

Nhóm chất có vòng tetracyclic (alcaloid cernuin): Cernuin, lycocernuin,

2-hydroxycernuin, cernuin N-oxid, lycocernuin N-oxid [76] [77].

Đa số những công bố chỉ tập trung chủ yếu vào alcaloid nhằm tìm ra chất có tácdụng sinh học giống huperzin A để có thêm thuốc mới trong việc điều trị bệnhAlzheimer Chưa có nhiều báo cáo về những thành phần hóa học khác trong cây Thạchtùng nghiên Một số hợp chất khác đã được phân lập và định danh như sau:

Triterpenoid: Acid lycocernuic A–E; en-3 β, 21 β -diol và en-3 β, 21 α-diol.

serrat-14-Flavonoid: Apigenin-4-O-(2ʹ,6ʹ-di-O-coumaroyl)-β–D-glucopyranoside,

apigenin-7-O-(2ʹ,6ʹ-di- O-(E)-coumaroyl) - β - D –glucopyranosid

Acid phenolic: Acid caffeic, ester của acid quinic, 1-O-caffeoyl-β-D

-glucopyranosid [147]

Lycocernuin Cernuin N-oxide Lycocernuin N-oxide

Hình 1.9 Cấu trúc của một số alcaloid trong cây Thạch tùng nghiên

“Nguồn: Ma X., 2004” [66]

1.2.5 Tổng quan về huperzin A

Phát hiện Huperzin A

Cây Thạch tùng răng (Huperzia serrata) và các cây khác cùng chi được sử

dụng để trị bệnh xáo trộn trí nhớ và tâm thần phân liệt ở Trung Quốc Những nghiêncứu hóa thực vật đã chỉ ra rằng những cây này chứa thành phần chủ yếu là triterpen

loại serraten và Lycopodium alcaloid Đầu thập niên 1970, nhà khoa học Trung Quốc báo cáo rằng alcaloid toàn phần của Huperzia serrata giúp làm dịu cơ và giảm nhẹ

triệu chứng nhược cơ nặng trên động vật thử nghiệm Thử nghiệm sinh học đối với

những hợp chất khung Lycopodium alcaloid trở thành tâm điểm nghiên cứu và kết quả phân lập chất hóa học là huperzin A [64] [151].

Cấu trúc Huperzin A

Phân tử Huperzin A cấu tạo gồm: Một tetrahydroquinolinon, cầu 3 carbon,exocyclic ethyliden, và nhóm amino Công thức phân tử C15H18N2O, trọng lượng phân

tử 242, đồng phân quang học trong cây (-)-huperzin A là có hoạt tính Huperzin A có

Mp = 230 oC; Độ hấp thu UV cực đại ở bước sóng 231 nm và 313 nm; Phổ IR có cácđỉnh hấp thu 3180, 1650, 1615, 1550 cm-1 Huperzin A là Lycopodium alcaloid loại lycodin với vòng C mở và mất 1 nguyên tố carbon [64] Có hơn 200 loại Lycopodium

alcaloid đã được báo cáo, tuy nhiên chúng hoặc là không có hoạt tính khángacetylcholinesterase hoặc có nhưng kém hơn huperzin A [64] [151]

Hình 1.10 Cấu trúc của huperzin A

“Nguồn: Liu, 1986” [64]

Các loài trong họ Thạch tùng đã được công bố cũng có khả năng cung cấp nguồn

Huperzin A là [62]:

• Huperzia aqualupiana (Spring) Rothm.

• Huperzia carinata (Desv.ex Poir.) Trevis.

• Huperzia elmeri (Herter) Holub.

• Huperzia mirabilis (Willd.) Holub.

• Huperzia ovalifolia Ching.

• Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.

• Huperzia phlegmarioides (Gaudich.) Rothm.

• Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.

• Huperzia tetrasticha (Kunze) Holub.

• Huperzia varia (R.Br.) Trevis.

• Huperzia vrieseana (Spring) Rothm.

Huperzin A tồn tại trong nhiều loài cây khác nhau nhưng người dân vẫn tìm

kiếm khai thác cây Thạch tùng răng (Huperzia serrata) vì lợi ích của nó mang lại là rất

lớn do đó có thể dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên này [67]

Tác dụng dược lý của huperzin A

Ức chế acetylcholinesterase: Trong dẫn truyền thần kinh, acetylcholin giải

phóng từ các dây thần kinh trước synap liên kết với các thụ thể tương ứng Ở màngsau synap, acetylcholine bị thủy phân tạo acetat và cholin bởi acetylcholinesterase đểchấm dứt sự dẫn truyền thần kinh

Phân tích của Lineweaver-Burk cho thấy huperzin A là một chất ức chế cạnh tranhcủa AChE [8] Dạng (-) huperzine A là dạng ức chế chủ yếu AChE và có tác dụng mạnhhơn ít nhất 50 lần so với các đồng phân (+) huperzin A [106] Cấu trúc AChE tạo phức vớihuperzin A, trong đó có một sự tương tác mạnh mẽ tích cực giữa nhóm amin của huperzin

A và vòng thơm của Trp84 và Phe330 trong các vị trí hoạt động Ái lực cao của huperzin A đối với acetylcholinesterase là cơ sở đề xuất cho việc sử dụng nó trong điều trị

(-)-AD và như là một thuốc xử lý ngộ độc thần kinh do lân hữu cơ [117]

Mặc dù nguyên nhân chính xác của AD vẫn chưa được biết nhưng các triệuchứng AD có liên quan đến việc thiếu hụt acetylcholin [25], do vậy huperzin A đãđược tiến hành nghiên cứu trong điều trị AD Từ năm 1996, huperzine A đã được chấpthuận cho điều trị AD mức độ nhẹ đến trung bình ở Trung Quốc Huperzin A phổ biếntrong thị trường thực phẩm chức năng ở Mỹ [68] [107] [135]

Chống lại tác dụng độc thần kinh bởi phospho hữu cơ: Chất độc thần kinh

phospho hữu cơ như soman và sarin được phân loại theo Liên Hợp Quốc là vũ khí pháhủy hàng loạt Cơ chế gây độc của nó thông qua việc phosphoryl hóa AChE không đảongược, các triệu chứng ngộ độc từ nhẹ đến nặng gồm từ suy hô hấp, tăng tiết đến các triệuchứng nghiêm trọng hơn bao gồm co giật và mất sức, ở liều cao hơn gây tử vong Chất cótác dụng ức chế AChE dùng giải độc trong trường hợp này như pyridostigmin.Pyridostigmin phản ứng với AChE tạo thành cabamoyl enzym tạo ổn định tạm thời Trongvài giờ, tương tác này được đảo ngược để giải phóng AChE, việc đảo ngược này

cung cấp một cơ chế để bảo vệ AChE trong khi các tác nhân thần kinh được chuyểnhóa Tuy nhiên, pyridostigmin không thể vượt qua hàng rào máu não do đó nó chỉ tácdụng đối với AChE ngoại biên Trong khi đó một hợp chất tương tự là physostigminthì có thể vượt qua hàng rào máu não Tuy nhiên, physostigmin gây ra tác dụng khôngmong muốn như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và chán ăn Đã có nhiều nghiên cứu đánhgiá tiềm năng dự phòng huperzin A chống lại phospho hữu cơ Trong đó, một nghiêncứu liên quan đến xác định giá trị LD50 của soman cho chuột (tiêm dưới da) và thửnghiệm với huperzin A (500 mg / kg, tiêm trong phúc mạc) và physostigmin (100 mg /

kg, tiêm bắp) Kết quả là huperzin A bảo vệ gấp 2 lần trong vòng 6 giờ, trong khi đótiền xử lý với physostigmin chỉ bảo vệ 1,5 lần trong 2 giờ [19] [32] [34] [59]

Suy giảm độc tính β-amyloid: Mảng già ngoại bào là một dấu hiệu mô học

trong não của bệnh nhân AD Các thành phần chính của mảng già là mảnh β-amyloid (Aβ) chứa các peptide ngắn gồm 36 - 43 acid amin Mảnh β-amyloid (Aβ) được hình

thành bởi sự phân giải protein màng liên kết với tiền chất protein amyloid (APP) APP

bị phân tách theo hai con đường Thứ nhất là α-secretase tạo mảnh α-APP hòa tan,mảnh này có tác dụng dinh dưỡng thần kinh và bảo vệ thần kinh Thứ hai là β / γ-secretase tạo mảnh Aβ không hòa tan Chính Aβ đã được báo cáo gây apoptosis dẫnđến chết tế bào Do đó, nhiều khả năng việc chữa trị AD là tìm cách sửa đổi con đường

chuyển hóa thứ hai β / γ-secretase [27] [125] [133].

Chống lại tác dụng độc thần kinh bởi glutamat: Các thụ thể glutamat quan

trọng trong việc góp phần vào các hoạt động của synap và đóng vai trò quan trọngtrong việc hình thành trí nhớ và học tập Hai thụ thể chính, tên được đặt theo chất chủvận liên kết với nó, là AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionat) vàNMDA (N-methyl-D-aspartat) Gần đây, NMDA được chú ý nhiều do người ta chorằng việc quá kích thích nó có liên quan đến nhiều bệnh thoái hóa thần kinh như độngkinh và AD Một lượng lớn bằng chứng gợi ý rằng ức chế thụ thể NMDA hiệu quảtrong sự suy giảm các bệnh này Sự kích thích quá mức các thụ thể NMDA dẫn đến sựxâm nhập của dòng ion calci, dòng calci tăng lên kèm theo một chuỗi các quá trìnhsuy thoái tế bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào thần kinh và làm tiến triển của một sốbệnh thoái hóa thần kinh Tác dụng đối kháng thụ thể NMDA của huperzin A đã đượcnghiên cứu và chứng minh tính hiệu quả của nó Trong một nghiên cứu khác, huperzin

A được chứng minh là có hiệu quả trước và sau điều trị chống co giật do NMDA gây

ra Do đó, hoạt động đối kháng NMDA của huperzin A là độc lập với hoạt động ức chếAChE [14] [85] [117] [119] [142]

1.3 CÁC PHƯƠNG CHIÊT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÁP PHÂN TÍCH

HUPERZIN A

1.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập huperzin A

Để chiết xuất và phân lập huperzin A, đa số kỹ thuật chiết xuất từ cổ điển đếnhiện đại đã được sử dụng Đầu tiên, các phương pháp chiết xuất thường quy để thualcaloid toàn phần được đều được sử dụng Bột dược liệu được chiết ngâm lạnh, ngấmkiệt hoặc chiết hồi lưu với MeOH, EtOH hoặc với EtOH - acid để thu alcaloid toàn

phần dạng muối, sau đó tiến hành kiềm hóa và chiết phân bố với ether, n-hexan,

cloroform, dicloromethan, và cô dưới áp suất giảm Một số trường hợp làm ẩm dượcliệu với kiềm (NH4OH) và chiết trực tiếp bằng dung môi hữu cơ để thu alcaloid toànphần dạng base Sau khi thu được các alcaloid toàn phần, nhiều phương pháp đã được

áp dụng cho việc phân lập huperzin A và các hợp chất khác trong đó phương pháp sắc

ký được sử dụng phổ biến với các loại pha tĩnh khác nhau như: silica gel pha thuận,sephadex LH-20, sử dụng nhựa resin hấp phụ, trao đổi ion, silica gel pha đảo với cáchệ dung môi rửa giải khác nhau từ phân cực trung bình đến phân cực mạnh Ngoài ra,các thiết bị máy móc được sử dụng hỗ trợ tích cực cho việc tách chất như máy sắc kýlỏng điều chế, máy sắc ký phân bố ly tâm [22] [50] [102] [103] [104] [115] [141]

Quy trình 1: Từ 5 kg bột dược liệu khô Huperzia serrata được chiết với EtOH

95 %, dịch chiết sau đó được cô dưới áp suất giảm để lấy cao chiết và tiếp tục phân tántrong dung dịch HCl 1 %, sau đó lắc phân bố với CHCl3 Lớp dung dịch nước acid nàyđược điều chỉnh đến pH 10 với dung dịch amoniac, và sau đó lắc phân bố lại vớiCHCl3 Cao CHCl3 được phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel và phađộng là ether dầu hỏa - cloroform (1:1), cloroform, cloroform - methanol (10:01, 5:1),

và cuối cùng là methanol 100 % Phân đoạn cloroform được gộp lại, cô loại dung môi,hòa tan cắn thu được với aceton nóng, sau khi làm lạnh, thu được hỗn hợp tinh thể.Hỗn hợp này được phân lập bằng sắc ký cột silica gel với cloroform - methanol (25:1)

thu được 12-deoxyhuperzin O (52 mg), huperzin E (310 mg) và Huperzin F (248 mg) Các dịch thu được tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với ether dầu hỏa-aceton,

thay đổi tỉ lệ theo chiều tăng dần độ phân cực thu được 8-deoxy-13-dehydroserratinin(45mg), 6α-hydroxy-5,15-oxid-lycopodan (38 mg), phlegmariurin B (860 mg) Phầncòn lại được phân lập bằng sắc ký cột silica gel với CHCl3-aceton (10:1) thu được

huperzinin (18 mg) và N-methyl-huperzin B (35 mg) [139].

Quy trình 2: 50 kg bột dược liệu khô Huperzia serrata được chiết với nước acid

tartric 1 % ở nhiệt độ phòng, dịch chiết acid được kiềm hóa đến pH 9 bằng amoniac đậmđặc, sau đó lắc phân bố với CHCl3 Dịch CHCl3 được cô đến cắn thu được cao alcaloidtoàn phần, cao alcaloid này được phân lập bằng sắc ký cột cổ điển, pha tĩnh là

silica gel với dung môi rửa giải là CH2Cl2, CH2Cl2 - MeOH (20:1 và 10:1) và MeOH

100 % thu được huperzin A (506 mg), serratinin (26 mg), lucidiolin (73 mg) [9]

Quy trình 3: Bột dược liệu khô Huperzia serrata được chiết bằng EtOH 95 %,

cao chiết được phân bố với dung dịch NaOH 1 %, dịch kiềm được acid hóa bằng dungdịch HCl 5 % và lắc phân bố với diethyl ether, sau đó kiềm hóa trở lại đến pH >10bằng amoniac Dịch kiềm thu được, lắc phân bố với CHCl3, cô thu hồi dung môi thuđược cao alcaloid Cao alcaloid này được phân lập bằng sắc ký cột silica gel với hệdung môi CHCl3 - MeOH Huperzin A thô được kết tinh trong aceton Lượng huperzin

1.3.2 Phương pháp định lượng huperzin A

Theo tác giả NorShahidah Sahidan, các mẫu thử của nhiều loài Thạch tùng đượcchiết xuất trực tiếp bằng MeOH và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi định lượnghuperzin A bằng phương pháp HPLC/PDA Cột sắc ký được sử dụng là ODS-3 (, ( 250

mm × 4,6 mm, 3 μm), hệ dung môi pha động là MeOH – dung dịch acid TFA 0,1 %, tỉ lệMeOH thay đổi từ 20 % đến 70 % Bước sóng phát hiện được cài đặt ở 308 nm [93]

Theo tác giả Qingqing Wu., mẫu Thạch tùng răng được chiết với ethanol 95 %bằng Soxhlet, dịch chiết được cô cắn, hòa cắn trong 100 ml HCl 0,5 M, khuấy trong 2giờ, lắc loại tạp kém phân cực bằng CHCl3, sau đó kiềm hóa bằng dung dịch amoniacđến pH 9 và chiết lại bằng CHCl3 Dịch CHCl3 được cô cắn và sau đó hòa tan trongMeOH và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi định lượng bằng HPLC, đầu dò PDA/(ESI-MS) Điều kiện sắc ký: Cột Dianosil C18 (200 × 4,6 nm, 5 µm); pha độngMeOH-dung dịch đệm amoni acetat 80 mM, pH 6 (40:60); tốc độ dòng 1 ml/phút;bước sóng phát hiện 230 nm [132]

Theo tác giả Szypuła WJ, dịch chiết bằng MeOH của loài Huperzia selego

được cô dưới áp suất giảm ở 40 oC, cắn thu được hòa tan trong HCl 2,5 %, lắc loại tạpkém phân cực bằng 50 ml cloroform và diethyl ether, sau đó kiềm hóa bằng dung dịchamoniac 25 % đến pH 9 và chiết lại bằng cloroform Dịch cloroform được cô cắn, cắnđược hòa tan trong MeOH và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi triển khai HPLC vớiđầu dò UV-MS Điều kiện sắc ký: cột Gold C18 (250×10 nm, 5 µm); Pha động là hệdung môi nước-acetonitril, NaPF6 30 mM Tốc độ dòng 1 ml/phút; Bước sóng pháthiện 230 nm [100]

Theo tác giả Goodger Jason, định lượng đồng thời huperzin A và B trong các

loài Huperzia ở Úc bằng HPLC Mẫu bột dược liệu họ Thạch tùng được chiết với 20

acid tartric 2 %, siêu âm 30 phút, lọc, gộp dịch lọc, cô còn khoảng 15 ml, lắc loại tạpkém phân cực bằng CHCl3, sau đó kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đến pH 10 vàchiết lại bằng CHCl3, gộp dịch chiết, lọc, cô đến cắn Cắn hòa tan trong MeOH và lọcqua màng lọc 0,45 µm trước khi triển khai HPLC Điều kiện sắc ký: Cột PhenomenexLuna C18 (250 × 10 nm, 5 µm); Pha động MeOH - dung dịch đệm amoni acetat 80

mM, pH 6 (32:68); Tốc độ dòng 1 ml/phút; Bước sóng phát hiện 313 nm [31]

Theo tác giả Zhang J., chiết xuất alcaloid trong cây Thạch tùng răng bằng dungmôi: MeOH - acid formic 2 %, dịch chiết lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi triểnkhai HPLC Điều kiện sắc ký: Cột XCharge C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm); Phađộng: acetonitrile – TFA 0,1 %, rửa giải gradient; Tốc độ dòng 2 mL/phút, bước sóngphát hiện 310 nm [143]

Những nghiên cứu về định lượng huperzin A trong dược liệu, các tác giả đều sửdụng phương pháp HPLC để định lượng các alcaloid Mẫu thử được chiết xuất theo cácnguyên tắc chung về chiết xuất alcaloid là chiết bằng MeOH, chiết bằng nước acid, chiếtbằng cồn acid, kiềm hóa bột dược liệu kết hợp với chiết bằng cloroform Quy trình địnhlượng đảm bảo các yêu cầu về độ nhạy, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng Tuy nhiên,chưa thấy có tài liệu công bố ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong xác địnhhàm lượng huperzin A trong dược liệu thuộc họ Lycopodiaceae Dựa vào cấu trúc hóahọc, huperzin A có nhóm amin tự do (-NH2) và nhóm chức amid (O=C-NH) Do vậy, cóthể áp dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng hợp chất có tính kiềm

1.4 THIÊT LẬP CHẤT ĐỐI CHIÊU

1.4.1 Mục đích sử dụng chất đối chiếu hóa học

Theo ISO 13528 [43], CĐC hoá học được sử dụng vào bốn mục đích chính:Thẩm định phương pháp và độ không chắc chắn của một phép đo, xác minhkhả năng áp dụng đúng đắn của một phương pháp, hiệu chuẩn thiết bị, kiểm tra chấtlượng và đảm bảo chất lượng

Trong lĩnh vực kiểm tra chất lượng thuốc, các phương pháp phân tích trong cácDược điển hiện hành có yêu cầu chất đối chiếu hoá học trong các phép thử sau:

- Định tính: Phản ứng hóa học, phổ hồng ngoại, quang phổ UV-Vis, sắc ký lớp mỏng

- Thử tạp chất liên quan: Các phương pháp sắc ký, quang phổ

- Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ

- Hiệu chuẩn thiết bị phân tích: Hệ thống LC hay GC, hệ thống quang phổ

- Thẩm định quy trình phân tích.

- Trong đo lường: Hiệu chuẩn pH, hiệu chuẩn thiết bị thử độ hoà tan

- Đánh giá thử nghiệm thành thạo

1.4.2 Thiết lập chất đối chiếu

Quy trình thiết lập chất đối chiếu gốc (PCRS) gồm các bước như đánh giá nhucầu và mục đích sử dụng, lựa chọn nguyên liệu, xây dựng phương pháp kiểm nghiệm,xác định hàm lượng, đóng gói - phân phối, thực hiện theo tài liệu hướng dẫn do WHOban hành [123]

Tùy vào mục đích sử dụng mà hàm lượng của chất đối chiếu và số lượng phòng thínghiệm tham gia đánh giá khác nhau Với phép thử định tính và thử tinh khiết chỉ cần 1phòng thí nghiệm đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025 và hàm lượng có thể chỉ khoảng

90 % Với phép thử định lượng và hiệu chỉnh thiết bị thì ít nhất là 3 phòng thí nghiệm vàhàm lượng là 99,5 % hoặc cao hơn Các chất đối chiếu đóng vai trò quan trọng trong hoạtđộng sản xuất và đảm bảo chất lượng của ngành Dược Nhưng trên thực tế, các PCRS củaAnh, Mỹ, Châu Âu lại quá đắt cho nhu cầu phân tích hay nghiên cứu thường quy Do đó,PCSR được các Hội đồng Dược điển của khu vực, quốc gia hoặc các PTN đạt chuẩn thiếtlập trên cơ sở của quy trình thiết lập chất đối chiếu thứ cấp (SCSR) [127]

1.4.3 Lựa chọn phương pháp phân tích để đánh giá PCRS

Các phương pháp lựa chọn để đánh giá các CĐC chia thành 2 nhóm [127]:Nhóm các phương pháp định tính: Thường dùng phổ IR Trường hợp không cóCĐC liên kết hoặc thiếu các dữ liệu về các đặc tính của CĐC, cần phải xác minh nhậndạng chất đó bằng một số kĩ thuật dùng để mô tả đặc tính một chất mới, như nghiêncứu tinh thể học, phổ NMR, MS, phân tích nhóm chức và các phương pháp khác cóthể, để đảm bảo một CĐC được mô tả đặc tính đầy đủ

Nhóm các phương pháp định lượng: Các phương pháp cần chất CĐC ngoài nhưsắc ký, quang phổ Các phương pháp chỉ phụ thuộc vào tính chất động học nội tại củachất như phương pháp phân tích độ hòa tan của các thành phần rắn trong dung môi,quét nhiệt vi sai

1.4.4 Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp (SCRS)

Việc thiết lập SCRS dựa trên PCRS thường được tiến hành do nhu cầu thực tế,khi nguồn PCRS không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên cứu

và đảm bảo chất lượng thuốc Giá trị ấn định (GTAĐ) của SCRS thông thường được

xử lý thống kê từ kết quả đánh giá liên phòng PTN tham gia thiết lập chất đối chiếu[43] Một SCRS của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn gốc để thiếtlập chất chuẩn PTN của các PTN hoặc các nhà sản xuất dược phẩm

Theo quy định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất đối chiếu ASEAN(ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủy bằng các

kĩ thuật phân tích phù hợp (sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh, độ nhạy cao) Đốivới ACRS tần suất đánh giá lại được quy định như sau: 3 năm đối với CĐC dùng chophép thử hóa học, 2 năm đối với CĐC dùng cho phép thử vi sinh, 1 năm đối với cácchất đặc biệt nhạy cảm Chương trình đánh giá lại thường bao gồm thử nghiệm:

- Xác định hàm lượng nước, mất khối lượng khi sấy khô

bố điều chỉnh lại GTAĐ trên chứng chỉ phân tích

1.5 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHÊ

ACETYLCHOLINESTERASE

1.5.1 Vai trò của enzym acetylcholinesterase

Cholinesterase là nhóm enzym có tác dụng thủy phân, được chia làm 2 loạiacetylcholinesterase và butyrylcholinesterase giữ vai trò sinh lý quan trọng đối với cơ thểngười và động vật AChE hiện diện chủ yếu ở hệ thống thần kinh trung ương trong khiBuChE có trong huyết tương, gan, ruột và các mô cơ khác Chức năng sinh học của AChE

là thủy phân acetylcholin thành cholin và acid acetic, một phản ứng cần thiết cho phép tếbào thần kinh cholinergic từ trạng thái kích thích về trạng thái nghỉ [96]

Chế phẩm thương mại sử dụng AChE từ Electric eel và Drosophila melanogaster hoặc AChE biến đổi gen.

1.5.2 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase

Phương pháp quang phổ UV - Vis

Đây là phương pháp cơ bản và phổ biến nhất hiện nay được Ellman công bố năm

1961 Acetylthiocholin iodin (ATCI) phản ứng với AChE tạo ra thiocholin Sản phẩm tạothành phản ứng với thuốc thử Ellman là 5,5ʹ-dithio-bis-nitro benzoat (DTNB) tạo ra sảnphẩm 2-nitrobenzoat-5-mecaptothiocholin và 5-thio-2-nitrobenzoat có màu vàng đượcphát hiện ở bước sóng 405 nm Hoạt độ của enzym được tính bằng lượng enzym có khảnăng xúc tác chuyển hóa 1 µmol/ml cơ chất trong 1 phút (µmol/ml/min) [98]

Phương pháp này có nhiều ưu điểm là đơn giản, nhanh, chính xác, chi phítương đối thấp, thích hợp cho phân tích tự động, thực hiện trên số lượng mẫu thử lớn.

Áp dụng thử hoạt tính cũng như khả năng ức chế enzym AChE

Phương pháp huỳnh quang

Cơ chất sử dụng là resorufin butyrat và indoxyl acetat, cả hai đều là chất khôngphát quang, khi bị thủy phân bởi AChE tạo sản phẩm phát quang Khả năng thủy phâncủa indoxyl acetat nhanh và ổn định hơn Tuy nhiên, resorufin butyrat cho huỳnhquang mạnh hơn, thích hợp khảo sát ở nồng độ cơ chất thấp

Hiện trên thị trường có bộ kit thử Amplex Red Hoạt tính của AChE được đogián tiếp bằng thuốc thử Amplex Red, một mẫu dò huỳnh quang rất nhạy với H2O2.Đầu tiên, AChE thủy phân acetylthiocholin thành cholin, cholin bị oxi hóa bởi cholinoxidase thành betain và H2O2 Sau đó, H2O2 phản ứng với thuốc thử Amplex Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin) tạo resorufin phát huỳnh quang mạnh, phát hiện ởbước sóng 571 - 585 nm [74]

Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học

Đầu tiên, rửa bản mỏng với aceton hoặc isopropanol rồi để khô Chấm mẫu thử

và dung dịch chất đối chứng dương, triển khai với hệ dung môi phù hợp, sau đó đểkhô dung môi Tiếp theo, phun enzym lên bản mỏng, để khô hoàn toàn Phun hỗn hợpnaphthyl acetat và thuốc thử Fast Blue B lên bản mỏng Sau cùng, làm khô bản mỏng

ở nhiệt độ phòng Quan sát các chất có hoạt tính ức chế AChE sẽ có vết màu trắng trênnền tím của sắc ký đồ lớp mỏng [74] [84]

Ưu điểm: Đơn giản, phát hiện nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và được ứng dụngrộng

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỀ TRÍ NHỚ

1.6.1 MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM TRÍ NHỚ

Trimethyltin gây độc tế bào thần kinh do gây stress oxy hóa và hình thành các gốc

tự do, vấn đề này có thể được cải thiện bởi các chất chống oxy hóa Trimethyltin cũng làmtăng hoạt động của AChE dẫn đến làm giảm nồng độ acetylcholin, sự gắn kết giữaacetylcholin với thụ thể làm hoạt hóa biến đổi synap, đóng vai trò quan trọng trong

việc học và nhớ Trimethyltin khác với các mô hình gây tổn thương não khác là hàngrào máu não vẫn còn nguyên vẹn và không có biểu hiện gia tăng cytokin.

Scopolamin và atropin là những chất đối kháng cạnh tranh tại thụ thểmuscarinic, được chứng tỏ là làm suy giảm trí nhớ và học hỏi của loài gặm nhấm trongthử nghiệm tránh né thụ động và mê cung bơi [30]

Paraquat có tên khoa học là N,Nʹ-dimethyl-4,4ʹ-bipyridium dichloride, là mộttrong những chất diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới Gần đây có nhiều đềtài nghiên cứu đã dùng Paraquat làm chất gây thoái hóa tế bào thần kinh để làm môhình nghiên cứu về sự thoái hóa và chống thoái hóa tế bào thần kinh [87]

Nhiều bằng chứng cho rằng sự tăng quá mức Fe2+ trong những vùng nhạy cảmcủa não có thể gây ra độc tính, theo cách đó nó có liên quan đến nguyên nhân gây ra

sự xáo trộn dẫn đến thoái hóa tế bào thần kinh Sự gia tăng lượng Fe2+ trong não cũngđược tìm thấy ở một vài bệnh lý thoái hóa tế bào thần kinh như: Parkinson, AD,Huntington Vì vậy Fe2+ cũng được ứng dụng trong làm mô hình gây suy giảm trí nhớ

để gây sự sụt giảm trí nhớ hình ảnh, trí nhớ dài hạn Carbon monoxid cũng là một chấtđược ứng dụng làm mô hình gây thoái hóa tế bào thần kinh được nhiều nhà khoa họcứng dụng Do CO gây chết các neuron ở vùng hồi hải mã và làm rối loạn chức năngtrong hệ cholinergic tại các neuron, trong vỏ não phía trước, các thể vân và vùng hải

mã của chuột nhắt Tuy nhiên CO lại gây ra sự mất trí nhớ muộn do những tác độnggây chết muộn các neuron [28]

1.6.2 CÁC MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM HÀNH VI

Có rất nhiều mô hình đánh giá khả năng học hỏi, ghi nhớ được tiến hành trênđộng vật Dưới đây là các mô hình được sử dụng nhiều trong nghiên cứu khoa học

Mô hình mê cung chữ Y

Mô hình được làm bằng nhựa dễ chùi rửa Là một thử nghiệm trí nhớ ngắn hạnđược thực hiện trên chuột nhắt, gồm 2 ngày thử nghiệm: Ngày 1 huấn luyện, ngày 2 làngày thử nghiệm Đánh giá sự thay đổi hành vi tự phát của chuột Thông số đánh giá

là % tổ hợp 3 nhánh A, B, C [121]

Mô hình tìm nước

Mô hình làm bằng vật liệu là mica, màu trắng sữa Đây là mô hình thử nghiệmđánh giá trí nhớ ngắn hạn, gồm 2 ngày thử nghiệm: Ngày huấn luyện và ngày thửnghiệm Mô hình này được đánh giá qua các thông số chính là thời gian chuột tìm thấyống nước để uống nước và số ô chuột di chuyển để đến được ống nước, thông số nàyđánh giá khả năng ghi nhớ của chuột, chuột nào nhớ tốt hơn sẽ di chuyển bằng conđường ngắn nhất để đi tới hộp có nước để uống nước [87]

Mô hình mê cung bơi

Đây là một thử nghiệm đánh giá hoạt động của trí nhớ dài hạn Thử nghiệm đượctiến hành huấn luyện 4 ngày đầu, ngày thứ 5 - thử nghiệm thăm dò khả năng học và nhớcủa chuột sau thời gian huấn luyện; ngày 6 - thử nghiệm đánh giá trí nhớ hoạt động củachuột khi thay đổi vị trí của chân đế Thông số đánh giá trong 4 ngày đầu và những ngàycuối là thời gian tìm thấy chân đế Trong ngày thứ 5, chân đế được lấy ra khỏi bể nước,đánh giá bằng thông số số lần chuột bơi qua vị trí của chân đế [10] [16] [87]

Thử nghiệm tránh né thụ động

Trong thử nghiệm này, chuột phải học cách tránh kích thích sợ hãi trong bóngtối bằng việc duy trì vị trí trong phòng có ánh sáng nhân tạo và không bước vào phòngtối, nơi mà nó nhận kích thích sợ hãi Chuột bẩm sinh luôn có xu hướng hướng vềbóng tối, vì vậy để tránh kích thích gây sợ hãi thì nó phải ngăn xu hướng này Chuộtnào không có khả năng ghi nhớ thì sẽ bước qua ranh giới sớm hơn chuột có khả năngghi nhớ

Thử nghiệm này được đánh giá thông số: thời gian chuột băng qua vạch giớihạn và phần trăm số chuột trong mỗi lô thí nghiệm băng qua vạch giới hạn trong thờigian quy định [92]

Mô hình ma trận 8 nhánh

Mô hình gồm 8 - 17 nhánh bằng nhau tỏa ra từ một chân đế trung tâm mà chuộtphải vào để lấy được thức ăn hoặc nước ở 1 số nhánh Trong thử nghiệm này, chuộtđược hướng dẫn bởi những tín hiệu không gian quanh phòng để có thể tìm được lượngthức ăn hoặc nước trong khoảng thời gian ngắn nhất và với nổ lực nhỏ nhất Mô hìnhnày đòi hỏi sử dụng trí nhớ hoạt động để ghi nhớ thông tin quan trọng trong một thờigian ngắn cũng như sử dụng trí nhớ ám thị để ghi nhớ được quy luật chung trong suốtthử nghiệm Thử nghiệm cho phép kiểm tra cả trí nhớ hoạt động và trí nhớ ám thị Tuynhiên, thử nghiệm này có một hạn chế là sự ảnh hưởng bởi các yếu tố mùi của thức ăn

và nước trong quá trình thử nghiệm [138]

1.7.1 Trên thế giới

Sự phát hiện huperzin A và tác dụng kháng AChE của hợp chất này trong câyThạch tùng răng của các nhà khoa học Trung Quốc đã bắt đầu tạo ra sự quan tâm nghiêncứu về các loài trong họ Thạch tùng ở nhiều nước trên thế giới vào thập niên 90 của thế

kỷ trước Các kết quả nghiên cứu có liên quan đến họ Thạch tùng vẫn tiếp tục được công

bố trong thời gian qua [134] [140] [146] Các nghiên cứu tập trung phần lớn vào

chiết xuất phân lập và thử tác dụng sinh học kháng AChE của các thành phần hóa họctrong các loài Thạch tùng.

Nhiều nghiên cứu về hợp chất tự nhiên mới có tác dụng kháng AChE đã lần lượtđược công bố trên các tạp chí chuyên ngành trên thế giới Năm 2016, Thanasan Nilsu và

cộng sự đã nghiên cứu phân lập được squarrosin A từ cây Râu rồng (Huperzia squarrosa)

và đã có thử nghiệm tác dụng khác AChE với IC50 là 7,30 µM [80] Năm 2017, Jing Li và

cộng sự đã phân lập được hợp chất lycocernuasid B, C D từ cây Thạch tùng nghiên

(Lycopodiella cernua) [61] Các tác giả này có trích dẫn các bài báo đã công bố quốc tế về kết quả nghiên cứu luận án (Chemical-Biological Interactions 2015 và Molecules 2014) Tương tự, những nghiên cứu thử nghiệm in vitro và in vivo đối với cây Thạch tùng nghiên

của tác giả Porquis H.C và cộng sự [88] cũng có trích dẫn bài báo quốc tế về kết quả thử

nghiệm cải thiện trí nhớ trên chuột của luận án (Neuroscience Letters 2014) Điều này cho thấy, những kết quả nghiên cứu của luận án mang tính mới về khoa học và minh chứng

cho sự không trùng lắp với những nghiên cứu khác

về tác dụng cải thiện trí nhớ của cây Râu rồng (Huperzia squarrosa) [118] Các kết

quả nghiên cứu của luận án đều không trùng lắp với với những nghiên cứu trong nước

về Thạch tùng Trong 2 nghiên cứu trên đều có trích dẫn các bài báo quốc tế của luận

án Nhóm tác giả của Viện công nghệ sinh học đã nghiên cứu định tính và định lượnghuperzin A trong cây Thạch tùng răng bằng phương pháp LC/MS cũng không trùnglắp với phương pháp HPLC/PDA trong luận án [6] Nhóm tác giả của Trường Đại họcDược Hà Nội đã nghiên cứu thực vật học loài Thạch tùng răng và Thạch tùng sóng [3].Kết quả thực vật học của luận án là nghiên cứu so sánh về thực vật học của 10 loàithuộc 3 chi trong họ Thạch tùng của luận án và không có sự trùng lắp với nhữngnghiên cứu khác

Tình hình nghiên cứu về họ Thạch tùng trong nước và ngoài nước rất phongphú Mỗi nhóm nghiên cứu theo nhiều lĩnh vực khác nhau Các kết quả nghiên cứu đã

bổ sung cho nhau và đóng góp phần đầy đủ hơn về thực vật học, hóa học và sinh họccho các loài Thạch tùng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 THIÊT KÊ NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực vật học: Phân tích đặc điểm phân bố, sinh thái, hình thái cơ quansinh trưởng và sinh sản Giải phẫu các cơ quan rễ, thân, lá để quan sát đặc điểm tế bàodưới kính hiển vi và chụp hình ảnh So sánh các đặc điểm hình thái và vi phẫu thực vật đểxác định các đặc điểm đặc trưng phân biệt một số loài trong họ Thạch tùng

Nghiên cứu sàng lọc tác dụng in vitro kháng enzyme AChE: Chiết xuất bột

dược liệu bằng methanol Thử nghiệm bằng phương pháp Ellman đối với mẫu caochiết thu được của các loài Thạch tùng So sánh tác dụng kháng AChE của các loàitrong họ Thạch tùng Từ kết quả sàng lọc, chọn 2 đối tượng dược liệu để nghiên cứuphân lập hợp chất tự nhiên

Nghiên cứu hóa học: Chiết xuất và phân lập các hợp chất tự nhiên, xác định cấutrúc và đánh giá tác dụng kháng AChE của chất tinh khiết phân lập được

Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu: Chất tinh khiết phân lập dùng làm chất đốichiếu phải có tác dụng sinh học kháng AChE, khối lượng phân lập được tối thiểu 500

mg và là chất của đa số các loài Thạch tùng

Nghiên cứu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng bằng phương phápđiện di mao quản và sắc ký lỏng hiệu năng cao Lựa chọn quy trình thích hợp để xácđịnh hàm lượng hoạt chất trong các loài Thạch tùng

Nghiên cứu in vivo qua 2 mô hình mê cung bơi và né tránh thụ động đánh giá

tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột đối cao chiết của loài Thạch tùng có tiềm năng vàtrữ lượng lớn

2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu được xây dựng thành 7 giai đoạn cụ thể Kết quả nghiêncứu ở mỗi giai đoạn được đánh giá và làm cơ sở định hướng cho những nghiên cứutiếp theo Trình tự các giai đoạn nghiên cứu được tóm tắt trong quy trình nghiên cứu ở

sơ đồ 2.2

Thu thập mẫu các loài Thạch tùng và nghiên cứu thực vật học

Sàng lọc tác dụng kháng AChE in vitro đối với cao chiết của các loài

Thạch tùng Chọn lọc 2 loài tiềm năng nhất để nghiên cứu hóa học

Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá tác dụng kháng AChE các chất

tinh khiết phân lập được để lựa chọn làm chất đối chiếu

Xây dựng quy trình phân lập chất đối chiếu, thiết lập và xây dựng tiêu

chuẩn đánh giá chất lượng chất đối chiếu

Xây dựng qui trình định lượng hoạt chất trong dược liệu bằng

phương pháp CE và HPLC

Ứng dụng quy trình định lượng hoạt chất trong các mẫu dược liệu

nghiên cứu

Thử nghiệm in vivo đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột đối

với loài Thạch tùng nghiên

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các loài trong họ Thạch tùng được thu hái tại rừng vùng cao Tây Nguyên thuộc

2 tỉnh Lâm Đồng, Kon Tum, là những mẫu cây tươi có đủ bộ phận rễ, thân, lá Mẫu

được thu thập vào tháng 12 năm 2012 và tháng 3 năm 2013, được chụp hình và ghi nhận

đặc tính sinh thái, kết hợp so sánh mô tả về hình thái thực vật với tài liệu tham khảothực vật học của cây cùng với sự định danh của chuyên gia TS Võ Văn Chi để xácđịnh chính xác tên khoa học của loài nghiên cứu