Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Sưu tập và xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là Nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt để phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành một số mô đunmôn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật tại trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt.

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH LÂM ĐỒNG TRƯỜNG CAO ĐẲNG NGHỀ ĐÀ LẠT _oOo _

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NĂM 2015-2016

SƯU TẬP VÀ XÂY DỰNG QUỸ GEN INVITRO

MỘT SỐ GIỐNG HOA CÚC PHỔ BIẾN

TẠI ĐÀ LẠT

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Th S Nguyễn Đình Tiến

Đà Lạt, tháng 02 năm 2017

TÓM TẮT

Hiện nay ở Việt Nam, nguồn gen invitro cây hoa cúc không thể tìm mua bên ngoài thị trường Các nhà khoa học hoặc các doanh nghiệp nuôi cấy mô phải tự thu thập, đánh giá, xây dựng và lưu giữ nguồn gen invitro cây hoa cúc bản địa cũng như nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích bảo tồn, sử dụng và khai thác trong đó bao gồm cả công tác nghiên cứu và giảng dạy Nhằm góp phần phục vụ tốt cho công tác giảng dạy của giáo viên cũng như quá trình học tập của học sinh/sinh viên thuộc nghề Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật tại trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt, tôi đã tiến hành Sưu tập và xây dựng thành công 10 giống cúc invitro phổ biến tại Đà Lạt

ABSTRACT

Currently in Vietnam, asteraceae in vitro breed is unavailable to purchase Scientists or plant tissue culture laboratories themselves have to accumulate and evaluate, develop and reserve local and imported asteraceae genetic resources in order

to conserve and put to use in research projects and academic training In the interest of improving the quality of teaching and learning of Biotechnology and Plant Protection concentrations at Dalat Vocational College, I have successfully collected and produced

10 prevalent asteraceae in vitro breeds in Dalat

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Khả năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu 1

4 Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu 2

5 Tính mới của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 3

1.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng 3

1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô 3

1.1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng 4

1.1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô 5

1.1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) 8

1.2 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc 13

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cúc 13

1.2.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.2 Hóa chất nghiên cứu 19

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp vô trùng mô nuôi cây 20

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 21

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Thu thập và lựa chọn mẫu giống cúc 23

3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho các giống hoa cúc 25

3.2.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu 25

3.2.2 Kết quả tạo callus 27

3.2.3 Kết quả nghiên cứu tái sinh cây từ callus 29

3.2.4 Kết quả nhân nhanh đối với chồi hoa cúc 31

3.2.5 Kết quả nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 33

3.2.6 Kết quả nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹ gen invitro 35

3.3 Thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ, bảo quản và sử dụng quỹ gen invitro giống hoa cúc 36

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.1.1 Về khối lượng công việc và mục tiêu của đề tài 38

4.1.2 Về các nội dung khoa học của đề tài 38

4.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4 - diclophenoxyl axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng

BAP/BA : 6-benzyl aminopurin - Chất điều hòa sinh trưởng

NAA : Naphtyl axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng

MS : Murahige & Skoog, 1962 với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và pH = 5.8 KIN/KI : Kinetin - Chất điều hòa sinh trưởng

KH&CN : Khoa học và Công nghệ

IAA : Indol axetic axit - Chất điều hòa sinh trưởng

IBA : Indol butyric acid - Chất điều hòa sinh trưởng

THT : Than hoạt tính

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS 19

Bảng 3.1 Một số đặc điểm của các giống cúc được thu thập 23

Bảng 3.2 Kết quả khử trùng mẫu đối với giống cúc C01 sau 1 tuần nuôi cấy 26

Bảng 3.3 Kết quả khử trùng mẫu của giống cúc C03 sau 1 tuần nuôi cấy 26

Bảng 3.4 Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúc C01 27

Bảng 3.5 Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống cúc C03 27

Bảng 3.6 Kết quả tái sinh chồi của callus cây hoa cúc sau 6 tuần nuôi cấy 29

Bảng 3.7 Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúc giống C01 31

Bảng 3.8 Kết quả tạo rễ của chồi hoa cúc giống C01 33

Bảng 3.9 Kết quả lưu trữ của chồi hoa cúc giống C01 35

Bảng 4.1 Kết quả đạt được các nội dung, công việc đã được thực hiện 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng hoa cúc 17

Hình 3.1 Các callus hình thành từ nụ hoa 29

Hình 3.2 Cây hoa cúc tái sinh từ callus 31

Hình 3.3 Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúc C01 33

Hình 3.4 Cây hoa cúc C01 trên môi trường tạo rễ 34

Hình 3.5 Quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ và sử dụng quỹ gen invitro 37

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống invitro để sản xuất hoa cúc đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu thành công Nhưng hiện nay ở Việt Nam, nguồn gen invitro cây hoa cúc không thể tìm mua bên ngoài thị trường Các nhà khoa học hoặc các doanh nghiệp nuôi cấy mô phải tự thu thập, đánh giá, xây dựng và lưu giữ nguồn gen invitro cây hoa cúc bản địa cũng như nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích

bảo tồn, sử dụng và khai thác trong đó bao gồm cả công tác nghiên cứu và giảng dạy

Trong công tác giảng dạy một số mô đun/môn học nghề Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật thuộc trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt có liên quan đến quy trình nhân giống cây hoa cúc như Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhân giống cây hoa, Nhân giống hoa cúc đa phần giáo viên giảng dạy đang sử dụng mẫu cây giả định để học sinh/sinh viên thực hành trong các giai đoạn nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô Vì vậy học sinh/sinh viên không được tiếp cận mẫu cây thực tế khi thực hành trong các giai đoạn nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô

Do đó, việc nghiên cứu xây dựng một quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt là hết sức cần thiết để phục vụ tốt cho công tác giảng dạy của giáo viên

cũng như quá trình học tập của học sinh/sinh viên

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt

để phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành một số mô đun/môn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật tại trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt

3 Khả năng ứng dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu

Khả năng về thị trường

Hướng nghiên cứu với mục đích tạo ra quy trình, sản phẩm phù hợp có khả năng

đáp ứng đối với thị trường sản xuất cây giống hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô.

Khả năng về ứng dụng các kết quả nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh

Hướng nghiên cứu với mục đích tạo ra quy trình, sản phẩm phù hợp có khả năng ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô

Khả năng liên doanh liên kết với các doanh nghiệp trong quá trình nghiên cứu

Nếu đề tài thành công sẽ có khả năng triển khai áp dụng kết quả nghiên cứu tại

các cơ sở sản xuất giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô

4 Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu

Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan

Hướng nghiên cứu với mục đích tạo ra quy trình, sản phẩm phù hợp góp phần đề xuất một giải pháp trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô

Đối với tổ chức chủ trì và các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu

Hướng nghiên cứu với mục đích tạo ra quy trình, sản phẩm phù hợp ứng dụng trong điều kiện giảng dạy một số mô đun/môn học có liên quan thuộc nghề Công nghệ sinh học và Bảo vệ thực vật tại trường Cao đẳng Nghề Đà Lạt, góp phần phục vụ tốt cho công tác giảng dạy của giáo viên cũng như quá trình học tập của học sinh/sinh viên

5 Tính mới của đề tài

Có khả năng tự thu thập, đánh giá, xây dựng và lưu giữ nguồn gen invitro cây hoa cúc bản địa cũng như nguồn gen nhập nội nhằm phục vụ cho mục đích giảng dạy

và nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng

1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình

nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào,

mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật Cuối thế kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi

White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với

một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau

Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và cs (1958) trên mô rễ cây cà rốt Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ

Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin (1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch

đã tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được khẳng định

Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào

đã được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi Phôi soma

đã được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,

Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza,

Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây lương thực, cây ăn quả, Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới

1.1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng

Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng Trước những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa chọn, nhân giống cây trồng

Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen

Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo

ra được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả Nhờ thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn

Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và

nuôi cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn Có thể nói một cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là:

- Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng

- Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển gen ở thực vật

- Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo

ra các dòng lai khác loài

- Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn

- Giúp tạo được cây sạch bệnh

- Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm, đặc biệt là các dược chất

- Các cây mô là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử

- Các cây mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng

- Các cây mô có thể cung cấp quanh năm

1.1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật

là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây

Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó

Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và

cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật

1.1.3.1 Các auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 - diclophenoxyl axetic axit (2,4-D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ

NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ

Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp (10-9 -10-12g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế

IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng

NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra Chất này có tác dụng làm tăng

hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy

Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào Ngoài ra

các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzim

Benjamín và cs (1987) đã cho rằng nồng độ BAp cao (1-5ppm) kích thích

sự phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona.Lat và cs (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ

1- 5mg/l

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh

trưởng nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến

sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô

Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển mô

sẹo Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago ovata

tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6M phối hợp với NAA 0,05M

Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trìnhmitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào

Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường

1.S.S Các nhóm chất khác

Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro còn

sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid

Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghỉ bắt buộc Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật Ethylen có thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đẩy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô Silver nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình nuôi cấy mô

Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây L Glutamine có thể được xem như là nguồn nitơ Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l Thêm vào đó malate, citrate, pyruvate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986)

Ngoài ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định và các nhân tố sinh trưởng

1.1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)

Trong 5 thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000) Vi nhân giống là sự nhân giống vô tính với số lượng của cây trồng thông qua nuôi cấy mô

in vitro Kỹ thuật nuôi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống các

loài cây cảnh và những loài khác trên toàn thế giới (Chu 1992; Huetteman và Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987)

Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là

khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuôi cấy tế bào và mô Dạng đơn giản nhất của

tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi Kỹ thuật này tận dụng sự phát

triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên Trạng thái ngủ của những chồi này bị phá hủy và sự phát triển của các chồi non được kích thích bằng

tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh ra chồi con Các chồi con này sau đó được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con

Sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của đỉnh sinh trưởng Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ Sự tái sinh chồi bất định thường phụ thuộc vào

sự có mặt của gen cấu trúc Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào thường không

có mặt của gen cấu trúc

Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc

rễ Sự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ Hầu hết các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng rất ít loài có thể được cả hai cách Một số loài có thể tái sinh một cách

dễ dàng từ nuôi cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định

Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống do có sự biến dị ít nhất Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ tái sinh của nó

1.1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống

Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George và cs 1984)

Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu

Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu

Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên nhất trong vi nhân giống (Chu 1992) Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa

Giai đoạn 3: là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con Giai đoạn này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài

Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng

1.1.4.2 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro

Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi

cấy cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989)

1.1.4.3 Môi trường nuôi cấy

Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in

vitro nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige,

1977) Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999; Saxena và cs., 1988)

Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin

và chất điều tiết sinh trưởng Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986)

Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy

mô tế bào Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ Muối amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay đổi từ ức chế đến hiệu quả Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3

mM là thích hợp Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng

vi lượng

Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây Môi trường B5 (Gamborg và cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây Theo Huang và cs., Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi trường MS

1.1.4.4 Các chất điều tiết sinh trưởng

Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật Mor và Zieslin (1987), Rout và cs

(2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất rõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây khác nhau Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi

Theo Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin trên môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA Theo kết quả nghiên cứu của Kang và cs (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân

nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa Loại dâu này sẽ cho số lượng

chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0M BA kết hợp với 0,1M NAA Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya

và Chandra, 1983) Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc

Trong nuôi cấy rễ in vitro,sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường

hạn chế khả năng ra rễ Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs., 2000)

1.1.4.5 Nguồn cacbon và những cơ chất khác

Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro hoặc glucose (nhưng rất ít) Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose, galactose nhưng rất ít sử dụng Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế bào Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3, vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong

nuôi cấy in vitro để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968)

Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của quá

trình nuôi cấy in vitro Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó đóng

vai trò như là chất hút ẩm của môi trường Than hoạt tính có khả năng hấp thụ một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs., 1993; Eymar

và cs., 2000; George và Sherrington, 1984) Bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra

rễ có trong môi trường nuôi cấy (Dumas và cs.,1995; George và Sherrington, 1984)

1.1.4.6 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro Có

3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996) Trong trường thông qua nuôi cấy chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi trường

và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây Trên cây dâu tây Fragaria x ananasa, tốc

độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS các chất điều tiết sinh trưởng BAP (4,0M) và NAA (0,1M) sau 60 ngày nuôi cấy Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0M cùng với 0,1M NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ nhân nhanh cũng giảm

1.1.4.7 Sự hình thành rễ

Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998) Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5% (Webb và Street, 1977) Theo Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành

rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng thấp

(0.1mg/l)

Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin Than hoạt tínhlàm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999) Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs., 1993; George và Sherrington, 1984)

Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện

thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng

1.2 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cúc

1.2.1.1 Trên thế giới

Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa cúc là loài quan trọng thứ hai sau hoa hồng Cúc còn được xem như là một trong những loài hoa trang trí được ưa chuộng nhất trên toàn thế giới

Ở Nhật Bản, hoa cúc là quốc hoa từ năm 910 (L.Naeve, và D Nelson, 2005), nên ngành sản xuất hoa cúc đã mang về lợi nhuận tăng hơn hai lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của người dân tăng nhanh Hoa cúc ở Nhật Bản chiếm đến 35% tổng sản phẩm hoa cắt cành trong nước (Boase và cs, 1997)

Trên thế giới, hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều nhất, với 2 tỉ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500 triệu; Hoa Kì:300 triệu (Boase và cs, 1997) Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành quan trọng đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001)

Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25% được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003)

Cải cúc (C.coronarium L.) được trồng rất phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc và

vùng Đông Nam Á, như một loại rau ăn hàng ngày khá phổ biến (Oka và cs., 1999) Một số loài cúc khác có chứa một hàm lượng tinh dầu đáng kể, nên một số loài được trồng để khai thác tinh dầu (Schwinn và cs., 1994)

1.2.1.2 Tại Việt Nam

Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi Một số loài

được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ công anh (Lactuca laciniata

L.) Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu thế kỉ XVI Lúc đó chủ yếu dùng làm cảnh Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như một loại cây thương mại Ở nước ta, Hà Nội và Lâm Đồng là nơi có diện tích trồng hoa cúc nhiều nhất cà nước (N.Q Trạch và Đ.V.Đông, 2002)

1.2.1.3 Tại Lâm Đồng

Hầu hết diện tích trồng hoa cúc ở Lâm Đồng tập trung ở thành phố Đà Lạt, ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương,… diện tích không đáng kể Mặc dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa cúc trở thành một sản phẩm thương mại mới từ năm 1995

Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây Diện tích trồng hoa cúc chiếm đến 40-50% diện tích trồng hoa nói chung Trong việc trồng hoa cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp kĩ thuật, như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10-

15 triệu cành

Tại Đà Lạt, hiện có khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và không chính thức Do đó, việc xác định tên thương phẩm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khó khăn

1.2.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae)

1.2.2.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978, họ cúc thuộc:

- Giới thực vật

- Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín)

- Lớp Magnoliopsida (Dicotyledonea) - Ngọc Lan (hai lá mầm)

- Bộ Asterales (cúc)

Bộ cúc có một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay Compositae) được xem

là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật nói chung Bao gồm gần 1.000 chi

và hơn 20.000 loài, có những chi có tới 1.000 loài Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên Trái Đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường, đất đai khác nhau Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986)

Trong họ cúc được chia thành hai phân họ: hoa ống (Asteroideae =

Tubiliflorae) và thìa lìa (Cichorioideae = Liguliflorae)

Phân họ hoa ống có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm hoa đầu tiên hình ống (ống phễu, ống sợi, ống hình chuông), hoặc hoa hai môi, hoặc hoa có hoa hình ống

ở giữa và hoa thìa lìa giả xung quanh Trong phân họ hoa ống có gần 740 chi, và rất

nhiều loài với các cây quen thuộc như là: ngãi cứu (Artemisia vulgarisL var.indica Willd.) DC.), thanh hao (Artemisia carvifloria Wall.), nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thược dược (Dahila pinnata Cav.)

Trong đó, chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng chậu hay hoa cắt cành Hoa cúc là một loài hoa cắt cành phổ biến trên toàn thế giới,

nó đa dạng về các thứ và có hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985) Ngoài ra một số loài khác trong chi này còn được dùng làm rau ăn, làm thuốc an

thần, thuốc chữa bệnh như là: cải cúc (C.coronarium L.), bạch cúc (C moriforium Ramatj, kim cúc (C indicum L.)

Phân họ thìa lìa có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm đầu tiên là hoa thìa lìa Phân họ này có ít loài hơn Một số loài rất quen thuộc như là rau diếp, rau xà lách

(Lactuca sativaL.), rau diếp xoăn (Cichorium endivia L.), bồ công anh (Lactuca laciniata L.) (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978)

1.2.2.2 Đặc điểm thực vật học

Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986; N.Q Trạch và Đ.V.Đông, 2002 thì cúc có các đặc điểm sau:

Rễ - Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm rễ

cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn, nên khả năng hút nước và chất dinh dướng rất mạnh Do cúc được nhân giống bằng phương pháp vô tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất

Thân - Thân hoa cúc là thân thảo nhỏ, nhiều đốt, mọng nước, giòn, dễ gãy

Trên thân non một số loài có phủ một lớp lông tơ Một số loài có dạng thân bò Chiều cao thân tuỳ loài Nhưng đa số các giống nhập có thân to, thẳng, giòn Còn các giống nội địa có thân nhỏ, mảnh, cong

Lá - Lá cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc so le Bản lá có xẻ thuỳ

hình lông chim Phiến lá mỏng, mặt dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn Gân lá hình mạng Mỗi cây có khoảng 30 - 50 lá

Hoa, quả - Hoa cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính Hoa cúc có nhiều màu sắc

khác nhau, thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ Hoa nhỏ, sít nhau và luôn luôn tập hợp thành cụm hoa đầu, để một sâu bọ thụ phấn được cho nhiều hoa cùng một lúc

Đế hoa lồi lên Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả

Ở cúc, quả là quả bế Chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi dính với vỏ quả Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng không có nội nhũ Quả phát tán nhờ gió và động vật

Hình 1.1 Các dạng hoa cúc

(Nguồn:RHS A-Z Encyclopedia of Garden Plants (c) DK Images) 1.2.2.3 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Khí hậu - Đa số hoa cúc thích hợp với điều kiện khí hậu ôn hoà, mát mẻ,

lượng mưa đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới Với nhiệt độ trên

250C, cúc sinh trưởng và phát triển kém (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Đất đai - Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai Thích hợp với đất acid nhẹ, pH

khoảng5 - 6.5 Nhìn chung, cúc sẽ phát triển tốt trên đất có độ ẩm tốt, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, đặc biệt là có phân chuồng Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20-

40 cm để đảm bảo độ thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ (M.N Dana và B R Lerner, 1996; M.Top và B Tatura, 2002; L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Phân bón - Cúc là cây đòi hỏi một lượng phân bón khá lớn, vì vậy, cần bón 2

lần NPK, với tỷ lệ 10:10:10 Mỗi lần bón khoảng 25 kg/ 100m2 Tốt hơn là bón lót

trong giai đoạn chuẩn bị đất một lượng phân hữu cơ (M.N Dana và B.R.Lerner, 1996; M.Top và B Tatura, 2002)

Cần chú ý không bón phân để cây bước vào giai đoạn ra hoa (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Nước tưới - Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu khô hạn

kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây Vì vậy, tưới nước rất quan trọng đối với cúc, nhất là trong mùa khô (L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước phải thấm sâu xuống đất ít nhất 12-15cm Cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước mạnh quá Những tổn thương này là nguyên nhân để các virus xâm nhập, các vi khuẩn và nấm phát triển (M.N Dana và B R Lerner, 1996)

Sâu bệnh hại - Một số côn trùng gây hại trên cúc thường xuyên là rệp muội,

sâu vẽ bùa, nhện Các bệnh thường gặp là: đốm lá, thối thân rễ, mốc sương (M.N Dana và B R Lerner, 1996; L.Naeve, và D Nelson, 2005)

Trong trường hợp sâu hại không nhiều lắm thì không cần thiết phải sử dụng thuốc hoá học Nên áp dụng biện pháp phòng ngừa tổng hợp, bằng thiên địch, bằng bẫy côn trùng (M.N Dana và B R Lerner, 1996)