NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG LOÉT DẠ DÀY VÀ GIẢM ĐAU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA BỘT CAO KHÔ NGẢI CỨU (Artemisia vulgaris L.)

ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisia là một trong những chi lớn nhất trong họ Cúc (Asteraceae) bao gồm 500 loài và ngày càng được các nhà khoa học quan tâm do sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học và đặc biệt là việc chiết xuất, phân lập ra artemisinin, một thuốc chống sốt rét đầy hứa hẹn. Trong các loài thuộc chi Artemisia, Ngải cứu là một trong những loài cây thuốc quan trọng nó được sử dụng từ lâu đời để điều trị bệnh ở nhiều nơi trên thế giới. Y học Cổ truyền Trung Quốc dùng Ngải cứu để điều trị đau dạ dày, loét dạ dày, viêm gan, vàng da sơ sinh. Y học hiện đại cũng chứng minh Ngải cứu có tác dụng hạ đường huyết, điều kinh, chống nhiễm trùng, tiêu độc, lợi tiểu, giảm đau và chống giun sán và được coi là một loại thuốc hữu ích trong điều trị thấp khớp, hen suyễn, ung thư và động kinh. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ về thành phần hóa học trong cây như nhóm terpenoid, flavonoid, coumarin, acid caffeoylquinic, sterol, acetylene và polysaccharide 1. Trong đó, nhóm hoạt chất flavonoid là một nhóm quan trọng mà đáng quan tâm nhất là hợp chất eupatilin. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, hoạt chất này có một số tác dụng sinh học đáng quan tâm như: chống ung thư, chống viêm, bảo vệ tế bào thần kinh, chống oxy hóa…Ngoài ra eupatilin còn được biết đến là một tác nhân có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày và làm giảm nhu động đường tiêu hóa. Hiện nay, Ngải cứu thường được dùng tươi hay phơi khô tán thành bột, hãm hoặc sắc uống. Với cách sử dụng như vậy sẽ gây bất tiện cho người dùng (tốn thời gian sắc, liều lượng không đồng đều…), đặc biệt với những người sử dụng trong thời gian dài. Trong khí đó nhóm hoạt chất chính của Ngải cứu là flavonoid không hòa tan tốt trong nước. Để khắc phục những nhược điểm đó, người ta bào chế ra một số dạng dùng như: siro, cao thuốc, viên nén, viên nang… giúp người sử dụng thuận tiện hơn khi dùng và nâng cao được hiệu quả điều trị. Theo xu hướng này, để điều chế được bột cao khô Ngải cứu làm nguyên liệu sản xuất thuốc có tác dụng giảm đau, chống loét dạ dày, đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống loét dạ dày và giảm2 đau trên thực nghiệm của bột cao khô ngải cứu (Artemisia vulgaris L.)”. Với các mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp điều chế bột cao khô Ngải cứu bằng phương pháp phun sấy quy mô phòng thí nghiệm. 2. Đánh giá được tác dụng chống loét dạ dày, giảm đau của cao khô ngải cứu trên động vật thực nghiệm. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI NGẢI CỨU 1.1.1. Tên gọi và phân loại thực vật 1.1.1.1. Tên gọi Tên khoa học: Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae. Tên thường gọi: Ngải cứu Tên khác: Cây thuốc cứu, Ngải, Nhã ngải, Ngải cao, Ngải diệp. Hình 1.1. Cây Ngải cứu (Hình chụp tại Thanh Hóa tháng 9 năm 2018). 1.1.1.2. Phân loại thực vật Theo phân loại thực vật, cây Ngải cứu được xếp theo trình tự: Ngành: Thực vật bậc cao (Tracheophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ (order): Cúc (Asterales) Họ (family): Cúc (Asteraceae) Chi (genus) : Ngải (Artemisia) Loài (species): vulgaris4 1.1.2. Đặc điểm thực vật Chi Artemisia là một trong những chi lớn nhất và phân bố rộng rãi nhất của họ Cúc (Asteraceae) gồm khoảng hơn 500 loài khác nhau 1 2 3.Ở Việt Nam có khoảng 15 loài đã được mô tả trong từ điển thực vật Việt Nam. Ngải cứu có tên khoa học là Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc–Asteracea 1 2 3 4. Cây sống lâu năm, cao từ 70cm 150cm, cây bụi phân nhiều nhánh và thân rễ có khớp nối phía ngoài hoặc thân bò. Mặc dù vậy, loại thảo mộc này có thể có phân nhánh cao hoặc ngắn nhưng một số loài Artemisia không phân nhánh và cao (2 m) cũng đã được báo cáo ở một số nơi trên thế giới. Thân rễ có màu nâu nhạt, đường kính lên đến 1 cm và có thể mọc sâu đến 718 cm trong đất. Lá mọc so le, phiến rộng, xẻ theo nhiều kiểu khác nhau, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới màu tro trắng do có nhiều lông mịn như nhung. Hoa mọc tập trung đầu cành, hình đầu, màu vàng lục nhạt. Đầu hoa có hình trứng, dài 34 mm, rộng 2 mm, đế hoa có nhiều lông; hoa lưỡng tính, với tràng hoa hình ống. Quả bế nhỏ, dài và nhẵn, quả có mép không rõ ràng. Toàn cây có mùi thơm hắc 4. 1.1.3. Phân bố và thu hái Chi Artemisia có nguồn gốc châu Âu (chủ yếu là khô hạn và bán khô hạn), châu Á và Bắc Mỹ (Hoa Kỳ và Canada, chủ yếu). Nó cũng được tìm thấy ở Đông Nam Á, Úc và Nam Mỹ (chủ yếu là Brazil), Nam Phi và quần đảo Thái Bình Dương và được du nhập ở các vùng ấm ôn đới của miền nam Bắc Mỹ đến dãy núi Himalaya (3700 m). Nam Cực là lục địa duy nhất nơi mà A. vulgaris chưa được báo cáo, cho đến nay. Sự phân bố rộng rãi cho thấy sự thay đổi lớn về hành vi và hình thái học 4. Được biết, cây phát triển tốt trong một khí hậu mát mẻ với cát, sỏi và đất thoát nước tốt. Cây này chịu được một phổ nhiệt độ rộng, nhưng thích đất ẩm hơn 2. Ở nước ta từ lâu, cây ngải cứu được trồng làm rau và gia vị khá phổ biến. Cây này trồng nhiều ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, đặc biệt5 thấy mọc nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc: Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình…. Thu hái quanh năm khi chưa ra hoa và lá đang tươi tốt. Cắt lấy đoạn thân cành dài 40cm, phơi trong râm hay sấy nhẹ cho khô. 1.1.4. Bộ phận dùng Bộ phận dùng làm thuốc của ngải cứu là thân cành mang ngọn và lá. Thu hái quanh năm khi chưa ra hoa và lá đang tươi tốt. Cắt lấy đoạn thân cành dài 40cm, phơi trong râm hay sấy nhẹ cho khô. 1.1.5. Thành phần hóa học của cây Ngải cứu Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng thành phần hóa học của các loài này chủ yếu là terpenoid, flavonoid, coumarin, acid caffeoylquinic, sterol, acetylene và polysaccharid 1. Flavonoid: có khoảng hơn 20 flavonoid đã được phân lập từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) 3. Tricin, R1 = R2 = R5 = H, R3 = R4 = OCH3 Jaceosidine, R1 = R4 = R5 = H, R2 = R3 = OCH3 Eupafolin, R1 = R4 = R5 = H, R2 = OCH3, R3 = OH Diosmetin, R1 = R2 = R4 = H, R3 = OH, R5 = CH3 Chrysoeriol, R1 = R2 = R4= R5= H, R3 = OCH3 Isorhamnetin, R1 = OH, R2 = R4= R5= H, R3 = OCH3 Apigenin, R1 = R2 = R3 = R4= R5= H Kaempferol, R1 = OH, R2 = R3 = R4= R5= H Luteolin, R1 = R2 = R4= R5= H, R3 = OH Rutin, R1 = Orhamnoglucosyl, R2 = R4= R5= H, R3 = OH6 Eupatilin, R1 = H, R2 = R3 = R4= CH3 Eriodictyol, R1 = R2= H, R3 = R4 = H Homoeriodictyol, R1 = R2= H, R3 = CH3, R4= H Vitexin, R = glucosyl Sesquiterpen 3,5: Coumarin 6 6methoxy7,8 methylenedioxycoumarin, R1 = CH3, R2R3 = CH27 Fraxetin, R1 = CH3, R2 = R3 = H 8methoxy6,7methylenedioxycoumarin, R1R2 = CH3, R3 = CH3 Aesculetin, R1 = R2 = H Aesculetin6 methyl ether, R1 = H, R2 = CH3 Scopoletin, R1 = OCH3, R2 = H 1.1.6. Tác dụng dược lý 1.1.6.1. Tác dụng chống loét dạ dày Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết cồn từ loài Artemisia asiatica (DA9601, StillenTM) với thành phần chủ yếu là eupatilin, Jaceosidin và các flavonoid khác có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm ở đường tiêu hóa, gan và tụy trên thực nghiệm 69. DA9601 uống với liều 40 mgkg trọng lượng cơ thể có tác dụng làm giảm tổn thương chảy máu niêm mạc dạ dày và quá trình peroxy hóa lipid do ethanol tuyệt đối gây ra ở chuột. Tác dụng trên thông qua việc DA9601 có tác dụng ức chế enzyme xanthine oxidase và các stress oxy hóa gây ra bởi ethanol 10. DA9601với liều 100 mgkg có tác dụng bảo vệ các tổn thương của niêm mạc dạ dày gây ra bởi NSAIDs trên chuột thông qua làm bình thường hóa quá trình sản sinh prostaglandin và tăng cường chức năng của niêm mạc dạ dày do làm tăng lượng GSH (glutathione) đồng thời giảm quá trình viêm bằng cách giảm hàm lượng MDA (malondialdehyde) và MPO (myeloperoxidase) 11. Dịch chiết cồn từ loài A. argyi chứa các flavonoid như jaceosidin và eupatilin, có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày trên mô hình gây tổn thương niêm mạc dạ dày bởi ethanol trên chuột nhờ việc kiểm soát các yếu tố gây viêm và giảm oxy hóa. Do đó, dịch chiết A. argyi thích hợp cho người có tổn thương niêm mạc dạ dày hoặc có thói quen ăn uống không lành mạnh.8 1.1.6.2. Tác dụng chống ung thư của ngải cứu DA9601 ức chế sự phát triển của tế bào MCF10Aras (rastransfected human mammary epithelial cell) 11, ức chế hoạt động của enzyme 5 lipoxygenase, gây ra quá trình apoptosis của tế bào HL60 (tế bào ung thư bạch cầu ở người) và tế bào ung thư dạ dày người (AGS). Eupatilin phân lập từ loài A. asiatica còn có tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dạy người (MKN1) thông qua hoạt hóa caspase3 và khả năng di căn của các tế bào này nhờ vào việc giảm điều hòa hoạt động của NFκB, sau đó giảm các cytokine gây viêm 13.Ngoài ra Eupatilin còn có tác dụng ức chế sự hình thành mạch (angiogenesis) ở tế bào ung thư dạ dày thông qua khóa STAT 3 (activator of transcription 3) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF: Vascular endothelial growth factor) 14. Eupatilin còn có tác dụng kháng khối u 15. Tinh dầu chiết xuất từ phần trên mặt đất của cây ngải cứu (A. vulgaris) với thành phần chính là caryophyllene, alphazingiberene, borneol và arcurcumenecó tác dụng thúc đẩy quá trình apoptosis trên dòng bạch cầu tủy cấp tính ở người (HL60) và trên một số dòng tế bào ung thư khác như Jurkat, K562, MCF7, HepG2, PC3, HeLa 16. 1.1.6.3. Tác dụng chống oxy hóa Dịch chiết nước từ ngải cứu có tác dụng dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 là 11,4 µgmL tương đương với tác dụng của rutin (10µgmL). Ngoài ra dịch chiết nước của ngải cứu còn có tác dụng dọn gốc tự do NO với IC50 là 125 mgmL. Trên chuột, dịch chiết nước từ ngải cứu có tác dụng làm tăng đáng kể lượng glutathione, SOD trong máu so với nhóm chứng tương ứng 17. Các hợp chất phenolic phân lập từ lá ngải cứu có tác dụng chống oxy hóa thông qua cơ chế dọn gốc tự do DPPH với giá trị EC50 là 16,0 và khả năng hấp thu gốc oxy hóa (ORAC: oxygen radicalabsorbance capacity) 5700 (µmol đương lượng Troloxg dịch chiết) khả năng chống oxy hóa từ dịch chiết methanol của A. vulgaris mạnh hơn tác dụng chống oxy hóa từ dịch chiết nước của loài A. anomala, A. argyi và A. annua 18. 1.1.6.4. Tác dụng kháng khuẩn9 Tinh dầu từ ngải cứu có tác dụng kháng các loại vi khuẩn Erwinia herbicola, Bacillus subtilis, Salmonella typhe, Pseudomonas putida, Escherichia colivà các loại nấm như Penicillium expansum, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus và Aspergillus terreus 18. Dịch chiết cồn và ethanol từ ngải cứu có tác dụng kháng khuẩn trên Bacillus subtilis, Staphylococcus aureusvà MethicillinResistant Staphylococcus aureus(Tụ cầu vàng kháng Methicillin) 20. Dịch chiết nước từ A. vulgaris có tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans 21. 1.1.6.5. Tác dụng giảm đau, chống viêm Dịch chiết methanol từ A. vulgaris với liều 400 mgkg trọng lượng cơ thể có tác dụng ức chế 55,3% trọng lượng của viên cotton ẩm và 64,06% trọng lượng của viên cotton khô trên mô hình gây viêm hạt bằng viên cotton trên chuột (Cotton Pellet Granuloma Method) 23. Dịch chiết methanol 70% từ ngải cứu còn có tác dụng làm giảm nồng độ của TNFα và interleukin1α 23. Tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin, dịch chiết methanol từ A. vulgaris với liều 200, 400 và 800 mgml có tác dụng ức chế lần lượt 71,3, 72,2 và 74% phù bàn chân chuột so với nhóm chứng. Trên mô hình mâm nóng ở nhiệt độ 55o C (hot plate) và mô hình tail – flick (vẫy đuôi), dịch chiết methanol với các mức liều ở trên có tác dụng làm tăng ngưỡng đau. Điều này chứng tỏ dịch chiết từ A. vulgaris có tác dụng giảm đau, chống viêm tốt 24. 1.1.6.6. Tác dụng bảo vệ gan Thuốc tiêm truyền thành phần gồm có 40% carbohydrat, 2,9% protein và 9,8% phenolic và Inulin từ A. vulgariscó tác dụng làm giảm ALT, AST và ALP huyết tương và ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan. Inulin một polysaccharide được chiết xuất từ A. vulgarisvới liều thấp (10 mgkg) có tác dụng làm giảm ALT, AST và ALP về gần giá với nhóm khỏe mạnh. Cơ chế của tác dụng trên là do khả năng chống oxy hóa và ức chế quá trình peroxy hóa10 lipid 25. Trên mô hình gây viêm gan bằng DGalactosamine và lipopolysaccharide ở chuột, dịch chiết methanol 70% từ A. vulgaris với liều 150600 mgkg làm giảm ALT và AST huyết tương. Trên mô bệnh học của gan, cải thiện cấu trúc, không có sung huyết nhu mô gan…26. 1.1.6.7. Các tác dụng khác Theo Đông y, ngải cứu là vị thuốc có tính ôn, vị cay dùng để điều hòa khí huyết, trục hàn thấp, an thai, cầm máu thường được dùng để chữa các bệnh ở phụ nữ, bệnh thổ huyết, chảy máu cam, nôn mửa, đau bụng, đau dây thần kinh, thấp khớp, ghẻ lở… 1.1.7 Liều dùng và cách dùng Liều dùng và cách dùng Ngải cứu được dùng tươi hay phơi khô tán thành bột, hãm hoặc sắc uống. Ngày dùng 610g. Thường phối hợp với Ích mẫu, Cỏ gấu để điều hòa kinh nguyệt. Phối hợp với Gừng tươi trị hàn lỵ ra huyết. Phối hợp với Hà thủ ô, mạch nha làm thuốc bổ máu…thường được dụng trực tiếp như: dạng hãm trà, hoặc ngâm rượu với liều khoảng 1g ngày. 1.2. TỔNG QUAN VỀ EUPATILIN 1.2.1. Công thức cấu tạo Hình 1.2 Công thức cấu tạo Eupatilin IUPAC: 2(3,4dimethoxyphenyl)5,7dihydroxy6

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ BÁ BÁCH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG LOÉT DẠ DÀY, GIẢM ĐAU TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA BỘT CAO KHÔ NGẢI CỨU

(Artemisia vulgaris L.)

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc

Mã số: 872.02.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN VĂN THƯ

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau đại học, Hệ sau đại học, các Bộ môn chuyên ngành Dược đã tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Văn Thư, người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực

hiện luận văn này

Tôi xin tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Duy Bắc chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu bào chế tính an toàn và tác dụng điều trị loét dạ dày, hành tá

tràng của viên nén nổi từ Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) và Chè dây (Ampelopsis cantoniensis)”, đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng số liệu để

báo cáo trong luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt thành, tình cảm tốt đẹp của

toàn thể cán bộ nhân viên Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y đã hỗ trợ tôi

trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các đồng chí, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên tôi trong suốt thời gian qua

Lần nữa, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc nhất tới tất cả sự giúp đỡ, động viên quí báu trên

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2019

Lê Bá Bách

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là một phần số liệu trong đề tài nghiên cứu có tên là: “Nghiên cứu bào chế tính an toàn và tác dụng điều trị loét dạ dày,

hành tá tràng của viên nén nổi từ ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) và chè dây

(Ampelopsis cantoniensis)” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập

thể mà tôi là một thành viên chính Tôi đã được chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận văn để bảo vệ lấy bằng thạc sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tác giả

Lê Bá Bách

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận văn

Danh mục bảng

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI NGẢI CỨU 3

1.1.1 Tên gọi và phân loại thực vật 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 4

1.1.3 Phân bố và thu hái 4

1.1.4 Bộ phận dùng 5

1.1.5 Thành phần hóa học của cây Ngải cứu 5

1.1.6 Tác dụng dược lý 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ EUPATILIN 10

1.2.1 Công thức cấu tạo 10

1.2.2 Tính chất của Eupatilin 11

1.2.3 Định tính 11

1.2.4 Tác dụng sinh học của Eupatilin 11

1.3 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT SIÊU ÂM VÀ BÀO CHẾ CAO KHÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHUN SẤY 14

1.3.1 Kỹ thuật chiết xuất siêu âm 14

1.3.2 Bào chế cao khô bằng phương pháp phun sấy 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 17

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Xây dựng phương pháp điều chế bột cao khô Ngải cứu 18

2.2.2 Đánh giá tác dụng chống loét dạ dày, giảm đau của cao khô ngải cứu trên động vật thực nghiệm 24

2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 26

2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CAO KHÔ NGẢI CỨU 28

3.1.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng eupatilin toàn phần trong dịch chiết dược liệu 28

3.1.2 Kết quả xây dựng quy trình điều chế bột cao khô ngải cứu 34

3.2 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG LOÉT DẠ DÀY CỦA BỘT CAO KHÔ NGẢI CỨU 48

3.2.1 Tác dụng chống loét bảo vệ niêm mạc dạ dày trên mô hình thực nghiệm gây loét dạ dày bằng cồn 90% ở chuột nhắt trắng 48

3.2.2 Tác dụng giảm đau trên trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 53

KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

8 DM/DL Dung môi/Dược liệu

13 EtOAc Ethyl acetate

14 FI Fractioned by ion exchange chromatography

(Phân đoạn tách bằng sắc ký trao đổi ion)

16 HL E Hàm lượng eupatilin

17 HPS Hiệu suất phun sấy

18 HTH Hiệu suất thu hồi hoạt chất

19 HLLT Hàm lượng hoạt chất theo lý thuyết

20 HIV gp41 Human Immunodeficiency Virus glycoprotein 4

(Virut gây suy giảm miễn dịch ở người)

21 HepG2 Human liver cancer cell G2

(Tế bào ung thư gan G2 ở người)

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

22 HPLC -

DPPH

High performance liquid chromatography – 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sắc ký lỏng hiệu năng cao gắn 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)

23 H2SO4 đđ H2SO4 đậm đặc

24 IC50 Inhibitory concentration 50%

(Nồng độ ức chế 50%)

26 iNOS Inducible nitric oxide synthetase

(Enzym cảm ứng sản xuất nitric oxide)

32 NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs

(Các thuốc giảm đau chống viêm không steroid)

33 NF - κB Nuclear factor – kappa B (Yếu tố nhân kappa B)

37 PGE2 Prostaglandin E2

38 RSD Relative Standard Deviation

(Độ lệch chuẩn tương đối)

39 SD Standard Deviation (Độ lệch chuẩn)

40 TCCL Tiêu chuẩn chất lượng

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

41 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

42 TNF - α Tumor necrosis factor – α (Yếu tố hoại tử khối u α)

43 TLR4 Toll-like receptor 4 (Thụ thể Toll-like 4)

44 Tvào Nhiệt độ đầu vào

46 UV-VIS Ultraviolet- Visible (Tử ngoại-khả kiến)

47 USP United states pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu 17

3.1 Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống 29 3.2 Sự tương quan giữa diện tích píc và nồng độ eupatilin 31 3.3 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu Ngải cứu 32

3.6 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết 34

3.10 Một vài thông số của cao lỏng Ngải cứu 37 3.11 Thiết kế ảnh hưởng của loại tá dược hỗ trợ phun sấy 39 3.12 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của loại tá dược đến quá trình phun sấy 40 3.13 Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược đến quá trình phun sấy 42 3.14 Kết quả đánh giá ảnh hưởngcủa tỷ lệ tá dược đến quá trình phun sấy 42 3.15 Thiết kế khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến quá trình

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Sắc ký đồ khảo sát pha động chương trình 1 28

3.2 Sắc ký đồ khảo sát pha động chương trình 2 28

3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eupatilin 30

3.4 Sắc ký đồ dịch chiết mẫu thử ngải cứu 30

3.5 Đồ thị tương quan tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ

3.9 Sơ đồ quy trình bào chế bột cao khô ngải cứu 47

3.10 Hình ảnh đại thể dạ dày các nhóm nghiên cứu 49

3.11 Hình ảnh mô bệnh học dạ dày nhóm chứng 51

3.12 Hình ảnh mô bệnh học dạ dày nhóm Cồn 52

3.13 Hình ảnh mô bệnh học dạ dày nhóm Omeprazole 52

3.14 Hình ảnh mô bệnh học dạ dày nhóm Ngải cứu liều 1 52

3.15 Hình ảnh mô bệnh học dạ dày nhóm Ngải cứu liều 2 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artemisia là một trong những chi lớn nhất trong họ Cúc (Asteraceae) bao

gồm 500 loài và ngày càng được các nhà khoa học quan tâm do sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học và đặc biệt là việc chiết xuất, phân lập ra artemisinin, một thuốc chống sốt rét đầy hứa hẹn Trong các loài thuộc chi

Artemisia, Ngải cứu là một trong những loài cây thuốc quan trọng nó được sử

dụng từ lâu đời để điều trị bệnh ở nhiều nơi trên thế giới Y học Cổ truyền Trung Quốc dùng Ngải cứu để điều trị đau dạ dày, loét dạ dày, viêm gan, vàng da sơ sinh Y học hiện đại cũng chứng minh Ngải cứu có tác dụng hạ đường huyết, điều kinh, chống nhiễm trùng, tiêu độc, lợi tiểu, giảm đau và chống giun sán và được coi là một loại thuốc hữu ích trong điều trị thấp khớp, hen suyễn, ung thư và động kinh Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ về thành phần hóa học trong cây như nhóm terpenoid, flavonoid, coumarin, acid caffeoylquinic, sterol, acetylene và polysaccharide [1] Trong đó, nhóm hoạt chất flavonoid là một nhóm quan trọng mà đáng quan tâm nhất là hợp chất eupatilin Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, hoạt chất này có một số tác dụng sinh học đáng quan tâm như: chống ung thư, chống viêm, bảo vệ tế bào thần kinh, chống oxy hóa…Ngoài ra eupatilin còn được biết đến là một tác nhân có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày và làm giảm nhu động đường tiêu hóa

Hiện nay, Ngải cứu thường được dùng tươi hay phơi khô tán thành bột, hãm hoặc sắc uống Với cách sử dụng như vậy sẽ gây bất tiện cho người dùng (tốn thời gian sắc, liều lượng không đồng đều…), đặc biệt với những người sử dụng trong thời gian dài Trong khí đó nhóm hoạt chất chính của Ngải cứu là flavonoid không hòa tan tốt trong nước Để khắc phục những nhược điểm đó, người ta bào chế ra một số dạng dùng như: siro, cao thuốc, viên nén, viên nang… giúp người sử dụng thuận tiện hơn khi dùng và nâng cao được hiệu quả điều trị Theo xu hướng này, để điều chế được bột cao khô Ngải cứu làm nguyên liệu sản xuất thuốc có tác dụng giảm đau, chống loét dạ dày, đề tài:

“Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống loét dạ dày và giảm

đau trên thực nghiệm của bột cao khô ngải cứu (Artemisia vulgaris L.)”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI NGẢI CỨU

1.1.1 Tên gọi và phân loại thực vật

1.1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Artemisia vulgaris L thuộc họ Cúc - Asteraceae

Tên thường gọi: Ngải cứu

Tên khác: Cây thuốc cứu, Ngải, Nhã ngải, Ngải cao, Ngải diệp

Hình 1.1 Cây Ngải cứu (Hình chụp tại Thanh Hóa tháng 9 năm 2018).

1.1.1.2 Phân loại thực vật

Theo phân loại thực vật, cây Ngải cứu được xếp theo trình tự:

Ngành: Thực vật bậc cao (Tracheophyta)

Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)

Bộ (order): Cúc (Asterales)

Họ (family): Cúc (Asteraceae)

Chi (genus) : Ngải (Artemisia)

Loài (species): vulgaris

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Chi Artemisia là một trong những chi lớn nhất và phân bố rộng rãi nhất

của họ Cúc (Asteraceae) gồm khoảng hơn 500 loài khác nhau [1] [2] [3].Ở Việt Nam có khoảng 15 loài đã được mô tả trong từ điển thực vật Việt Nam Ngải

cứu có tên khoa học là Artemisia vulgaris L thuộc họ Cúc–Asteracea [1] [2]

[3] [4] Cây sống lâu năm, cao từ 70cm- 150cm, cây bụi phân nhiều nhánh và thân rễ có khớp nối phía ngoài hoặc thân bò Mặc dù vậy, loại thảo mộc này có thể có phân nhánh cao hoặc ngắn nhưng một số loài Artemisia không phân nhánh và cao (2 m) cũng đã được báo cáo ở một số nơi trên thế giới Thân rễ

có màu nâu nhạt, đường kính lên đến 1 cm và có thể mọc sâu đến 7-18 cm trong đất Lá mọc so le, phiến rộng, xẻ theo nhiều kiểu khác nhau, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới màu tro trắng do có nhiều lông mịn như nhung Hoa mọc tập trung đầu cành, hình đầu, màu vàng lục nhạt Đầu hoa có hình trứng, dài 3-4

mm, rộng 2 mm, đế hoa có nhiều lông; hoa lưỡng tính, với tràng hoa hình ống Quả bế nhỏ, dài và nhẵn, quả có mép không rõ ràng Toàn cây có mùi thơm hắc [4]

1.1.3 Phân bố và thu hái

Chi Artemisia có nguồn gốc châu Âu (chủ yếu là khô hạn và bán khô

hạn), châu Á và Bắc Mỹ (Hoa Kỳ và Canada, chủ yếu) Nó cũng được tìm thấy ở Đông Nam Á, Úc và Nam Mỹ (chủ yếu là Brazil), Nam Phi và quần đảo Thái Bình Dương và được du nhập ở các vùng ấm ôn đới của miền nam Bắc Mỹ đến dãy núi Himalaya (3700 m) Nam Cực là lục địa duy nhất nơi

mà A vulgaris chưa được báo cáo, cho đến nay Sự phân bố rộng rãi cho

thấy sự thay đổi lớn về hành vi và hình thái học [4]

Được biết, cây phát triển tốt trong một khí hậu mát mẻ với cát, sỏi và đất thoát nước tốt Cây này chịu được một phổ nhiệt độ rộng, nhưng thích đất ẩm hơn [2] Ở nước ta từ lâu, cây ngải cứu được trồng làm rau và gia vị khá phổ biến Cây này trồng nhiều ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, đặc biệt

thấy mọc nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc: Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình… Thu hái quanh năm khi chưa ra hoa và lá đang tươi tốt Cắt lấy đoạn thân cành dài 40cm, phơi trong râm hay sấy nhẹ cho khô

1.1.4 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng làm thuốc của ngải cứu là thân cành mang ngọn và lá Thu hái quanh năm khi chưa ra hoa và lá đang tươi tốt Cắt lấy đoạn thân cành dài 40cm, phơi trong râm hay sấy nhẹ cho khô

1.1.5 Thành phần hóa học của cây Ngải cứu

Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng thành phần hóa học của các loài này chủ yếu là terpenoid, flavonoid, coumarin, acid caffeoylquinic, sterol, acetylene và polysaccharid [1] Flavonoid: có khoảng hơn 20 flavonoid đã được

phân lập từ cây ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) [3]

Fraxetin, R1 = CH3, R2 = R3 = H

8-methoxy-6,7-methylenedioxycoumarin, R1R2 = CH3, R3 = CH3

Aesculetin, R1 = R2 = H Aesculetin-6 methyl ether, R1 = H, R2 = CH3 Scopoletin, R1 = OCH3, R2 = H

1.1.6 Tác dụng dược lý

1.1.6.1 Tác dụng chống loét dạ dày

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết cồn từ loài Artemisia asiatica

(DA-9601, StillenTM) với thành phần chủ yếu là eupatilin, Jaceosidin và các flavonoid khác có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm ở đường tiêu hóa, gan và tụy trên thực nghiệm [6-9] DA-9601 uống với liều 40 mg/kg trọng lượng cơ thể có tác dụng làm giảm tổn thương chảy máu niêm mạc dạ dày và quá trình peroxy hóa lipid do ethanol tuyệt đối gây ra ở chuột Tác dụng trên thông qua việc DA-9601 có tác dụng ức chế enzyme xanthine oxidase và các stress oxy hóa gây ra bởi ethanol [10] DA-9601với liều 100 mg/kg có tác dụng bảo vệ các tổn thương của niêm mạc dạ dày gây ra bởi NSAIDs trên chuột thông qua làm bình thường hóa quá trình sản sinh prostaglandin và tăng cường chức năng của niêm mạc dạ dày do làm tăng lượng GSH (glutathione) đồng thời giảm quá trình viêm bằng cách giảm hàm lượng MDA (malondialdehyde)

và MPO (myeloperoxidase) [11]

Dịch chiết cồn từ loài A argyi chứa các flavonoid như jaceosidin và

eupatilin, có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày trên mô hình gây tổn thương niêm mạc dạ dày bởi ethanol trên chuột nhờ việc kiểm soát các yếu tố gây viêm

và giảm oxy hóa Do đó, dịch chiết A argyi thích hợp cho người có tổn thương

niêm mạc dạ dày hoặc có thói quen ăn uống không lành mạnh

1.1.6.2 Tác dụng chống ung thư của ngải cứu

DA-9601 ức chế sự phát triển của tế bào MCF-10A-ras (ras-transfected

human mammary epithelial cell) [11], ức chế hoạt động của enzyme lipoxygenase, gây ra quá trình apoptosis của tế bào HL-60 (tế bào ung thư bạch cầu ở người) và tế bào ung thư dạ dày người (AGS) Eupatilin phân lập từ loài

5-A asiatica còn có tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dạy người

(MKN-1) thông qua hoạt hóa caspase-3 và khả năng di căn của các tế bào này nhờ vào việc giảm điều hòa hoạt động của NF-κB, sau đó giảm các cytokine gây viêm [13].Ngoài ra Eupatilin còn có tác dụng ức chế sự hình thành mạch (angiogenesis) ở tế bào ung thư dạ dày thông qua khóa STAT 3 (activator of transcription 3) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF: Vascular endothelial growth factor) [14] Eupatilin còn có tác dụng kháng khối u [15]

Tinh dầu chiết xuất từ phần trên mặt đất của cây ngải cứu (A vulgaris) với

thành phần chính là caryophyllene, alpha-zingiberene, borneol và curcumenecó tác dụng thúc đẩy quá trình apoptosis trên dòng bạch cầu tủy cấp tính ở người (HL-60) và trên một số dòng tế bào ung thư khác như Jurkat, K562, MCF-7, HepG2, PC-3, HeLa [16]

ar-1.1.6.3 Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết nước từ ngải cứu có tác dụng dọn gốc tự do DPPH với giá trị IC50 là 11,4 µg/mL tương đương với tác dụng của rutin (10µg/mL) Ngoài ra dịch chiết nước của ngải cứu còn có tác dụng dọn gốc tự do NO với IC50 là 125 mg/mL Trên chuột, dịch chiết nước từ ngải cứu có tác dụng làm tăng đáng kể lượng glutathione, SOD trong máu so với nhóm chứng tương ứng [17] Các hợp chất phenolic phân lập từ lá ngải cứu có tác dụng chống oxy hóa thông qua

cơ chế dọn gốc tự do DPPH với giá trị EC50 là 16,0 và khả năng hấp thu gốc oxy hóa (ORAC: oxygen radical-absorbance capacity) 5700 (µmol đương lượng Trolox/g dịch chiết) khả năng chống oxy hóa từ dịch chiết methanol của

A vulgaris mạnh hơn tác dụng chống oxy hóa từ dịch chiết nước của loài A anomala, A argyi và A annua [18]

1.1.6.4 Tác dụng kháng khuẩn

Tinh dầu từ ngải cứu có tác dụng kháng các loại vi khuẩn Erwinia

herbicola, Bacillus subtilis, Salmonella typhe, Pseudomonas putida, Escherichia colivà các loại nấm như Penicillium expansum, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus và Aspergillus terreus [18] Dịch chiết cồn và

ethanol từ ngải cứu có tác dụng kháng khuẩn trên Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureusvà Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus(Tụ cầu

vàng kháng Methicillin) [20] Dịch chiết nước từ A vulgaris có tác dụng ức chế

vi khuẩn Streptococcus mutans [21]

1.1.6.5 Tác dụng giảm đau, chống viêm

Dịch chiết methanol từ A vulgaris với liều 400 mg/kg trọng lượng cơ

thể có tác dụng ức chế 55,3% trọng lượng của viên cotton ẩm và 64,06% trọng lượng của viên cotton khô trên mô hình gây viêm hạt bằng viên cotton trên chuột (Cotton Pellet Granuloma Method) [23] Dịch chiết methanol 70% từ ngải cứu còn có tác dụng làm giảm nồng độ của TNF-α và interleukin-1α [23] Tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin,

dịch chiết methanol từ A vulgaris với liều 200, 400 và 800 mg/ml có tác dụng

ức chế lần lượt 71,3, 72,2 và 74% phù bàn chân chuột so với nhóm chứng Trên

mô hình mâm nóng ở nhiệt độ 55o C (hot plate) và mô hình tail – flick (vẫy đuôi), dịch chiết methanol với các mức liều ở trên có tác dụng làm tăng ngưỡng

đau Điều này chứng tỏ dịch chiết từ A vulgaris có tác dụng giảm đau, chống

viêm tốt [24]

1.1.6.6 Tác dụng bảo vệ gan

Thuốc tiêm truyền thành phần gồm có 40% carbohydrat, 2,9% protein

và 9,8% phenolic và Inulin từ A vulgariscó tác dụng làm giảm ALT, AST và

ALP huyết tương và ức chế quá trình peroxy hóa lipid ở gan Inulin một

polysaccharide được chiết xuất từ A vulgarisvới liều thấp (10 mg/kg) có tác

dụng làm giảm ALT, AST và ALP về gần giá với nhóm khỏe mạnh Cơ chế của tác dụng trên là do khả năng chống oxy hóa và ức chế quá trình peroxy hóa

lipid [25] Trên mô hình gây viêm gan bằng D-Galactosamine và

lipopolysaccharide ở chuột, dịch chiết methanol 70% từ A vulgaris với liều

150-600 mg/kg làm giảm ALT và AST huyết tương Trên mô bệnh học của gan, cải thiện cấu trúc, không có sung huyết nhu mô gan…[26]

1.2 TỔNG QUAN VỀ EUPATILIN

1.2.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Eupatilin

- IUPAC:

2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5,7-dihydroxy-6-methoxychromen-4-one

- Công thức phân tử: C18H16O7

- Phân tử lượng: 344,315 g/mol

- Nhiệt độ nóng chảy: 241 - 242 °C

1.2.2 Tính chất của Eupatilin

Eupatilin tồn tại dưới dạng tinh thể không màu, có tính quang hoạt

Dễ bị oxi hóa và trùng hợp hóa nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn

1.2.3 Định tính

1.2.3.1 Theo tính chất hóa học của flavonoid:

- Phản ứng với FeCl3: Khi cho eupatilin tác dụng với FeCl3 cho dung dịch có màu xanh nâu

- Phản ứng với kiềm: Hơ tờ giấy có nhỏ dung dịch eupatilin lên miệng lọ amoniac thì màu vàng tăng

- Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Cho màu vàng đậm

- Tác dụng với antimoin pentachlorid (phản ứng Martini Bettolo): eupatilin cho phản ứng với SbCl5/CCl4 cho màu vàng

- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda hay Willstater): Dung dịch được hòa tan trong EtOH, sau đó thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ acid HCl đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam

1.2.3.2 Dựa vào sắc ký lớp mỏng

eupatilin hoặc jaceosidin là một flavonoid thuộc nhóm flavon nên có thể được phân tích trên sắc ký lớp mỏng pha thuận với một số hệ dung môi như sau:

1.2.4.1 Tác dụng chống ung thư

Một số nghiên cứu về eupatilin đã giải thích tính chất chống ung thư của

nó do eupatilin có khả năng ngăn chặn apoptosis trong các dòng tế bào ung thư khác nhau bao gồm tế bào ung thư dạ dày (AGS, MKN-1), tế bào ung thư bạch cầu (HL-60), ung thư biểu mô thận (786-O), tế bào ung thư tế bào gan (Huh-BAT), tế bào ung thư osteosarcoma (U-2), tế bào ung thư glioma (U87MG, LN229), và tế bào ung thư u ác tính (A375) Các nghiên cứu đã kết luận rằng eupatilin thường cho thấy các tác động hiệp đồng đối với việc bắt giữ chu kỳ tế bào, quá trình apoptosis, và nhiều con đường truyền tín hiệu tế bào trong các loại ung thư khác nhau [30]

1.2.4.2 Tác dụng chống viêm

Những phát hiện của các nhà nghiên cứu đã tuyên bố eupatilin như là một chất ức chế phản ứng viêm và nó hoạt động bằng cách ức chế các điều biến torrent inflamma và kích hoạt NF-κB trong các đại thực bào kích thích nội độc

tố và viêm carrageenan gây ra ở chuột Cơ chế phân tử nằm dưới eupatilin liên quan đến sự giảm nhẹ phản ứng viêm trong biểu mô phế quản do TNF-α gây ra viêm nằm trong sự ức chế biểu hiện eotaxin và suy giảm trong các hoạt động của tín hiệu NF-κB và IκBα kinase [30]

Eupatilin, cùng với các hợp chất tự nhiên khác đặc biệt ức chế lipoxygenase: một chất trung gian mạnh của đáp ứng viêm và cũng gây ra sự ức chế leukotriene D4 và C4 trong các tế bào mastocytoma nuôi cấy Eupatilin có khả năng ức chế phản ứng viêm TNF-α gây ra thông qua ức chế đường truyền tín hiệu ROS/MAPK-NF-κB trong các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của người [30]

5-1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hóa

Eupatilin có khả năng kích hoạt phụ thuộc sestrin-2 bằng cách ức chế mạnh tác nhân oxy hóa được kích thích bằng axit arachidonic (AA +) trong tế bào HepG2, H4IIE và Hepa-1c1c7 Nó nâng cấp đáng kể khả năng tồn tại của

tế bào chống lại AA + sắt một cách liên quan đến nồng độ và cũng bị cấm rối loạn chức năng ty thể và sản xuất ROS Trong các tế bào biểu mô MCF-10A của con người, eupatilin đã ngăn chặn sự xâm nhập TNF-α qua trung gian và hình thành ROS nội bào, cùng với hoạt hóa plasminogen loại urokinase bị ức chế (uPA) và biểu hiện catenin [30]

Eupatilin có thể cung cấp như là mục tiêu điều trị tiềm năng chống lại chấn thương thận thiếu máu cục bộ cấp tính thông qua giảm lipocalin tương quan với bạch cầu trung tính và các biểu hiện tổn thương thận, nồng độ creatinin huyết thanh và mức urê nitrogen trong máu Nó cũng tăng cường sự biểu hiện của Hsp70 và Bcl-2 thông qua các mức iNOS, caspase-3 và Bax suy yếu [30]

1.2.4.4 Tác dụng bảo vệ thần kinh

Eupatilin, một flavonoid hoạt tính sinh học từ nhiều loài Artemisia, đã được chứng minh là bảo vệ thần kinh chống lại tổn thương thần kinh não thiếu máu cục bộ kích thích toàn cầu ở chuột bằng cách giảm một số tế bào thần kinh suy giảm thông qua biểu hiện tăng cường của quá trình phospho AKT Eupatilin cũng gây tác dụng thần kinh chống lại thiếu máu cục bộ não ebral ở chuột tMCAO

in vivo qua việc giảm kích hoạt và số lượng các tế bào miễn dịch lBA1 trên não thiếu máu cục bộ và ức chế chức năng xếp tầng tín hiệu NF-κB Stillen và thành phần chính của nó, eupatilin có chống trầm cảm poten tial để vượt qua trầm cảm bằng cách điều chỉnh mRNA lên của estrogen β-receptor và điều chỉnh giảm TNFα, IL-6, và IL-1β ở vùng hippocampus [30]

1.2.4.5 Các tác dụng khác

Trong số các hoạt động sinh học khác, eupatilin chủ động đóng vai trò của một thành phần chống đái tháo đường ở A princeps và cơ chế hoạt động của nó bằng cách làm tăng chuyển hóa glucose và gan, cùng với tăng tiết insulin

ở chuột tiểu đường type 2 Eupatilin đã được chứng minh là có hiệu quả để ức chế lão hóa da (IC50 = 1.18 μM) bằng cách huy động thụ thể hoạt hóa proliferator peroxisome alpha (PPARα) Nó ngăn chặn đáng kể sự biểu hiện của

enzyme TNFα qua trung gian metalloproteinase (MMP-2 / -9) bằng cách giảm sự dịch chuyển hạt nhân NF-κB p65 và đường dẫn tín hiệu MAPK-AP-1 điều hòa xuống trong các tế bào biểu bì HaCaT ở người Eupatilin là một phương thuốc bổ trợ chống lại bệnh viêm da dị ứng (AD) - tổn thương da như nhau và

nó hoạt động thông qua việc giảm interleukin-4 / -19, TNF-α, và biểu thức lymphopoietin stromal

Eupatilin là một tác nhân chống xơ vữa mạnh mẽ và cơ chế hoạt động chính là thông qua ngăn chặn sự tăng trưởng và di chuyển qua trung gian PDGF-

BB trong các tế bào cơ trơn của động mạch chủ người (HASMC), cùng với sự phát triển của động mạch chủ được kích thích thông qua sự suy giảm của MKK3 / 6 -p38 MKK4-JNK, MAPK, và các con đường kích hoạt PI3 K

Các nghiên cứu động học trên microsome gan đã báo cáo eupatilin như một chất ức chế thụ thể cạnh tranh của CYP1A2 [K (i) 2,3 μM] và một chất ức chế hỗn hợp loại CYP2C9 [K (i) 1,6 μM], tương ứng Nó cũng có tiềm năng ngăn ngừa huyết khối thông qua việc ngăn chặn sự kết tập tiểu cầu và tạo ra serotonin và thromboxane A2 (TXA2) cũng như tăng cường thời gian prothrombin một phần (PT) và thời gian thromboplastin (aPTT) [30]

1.3 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT SIÊU ÂM VÀ BÀO CHẾ CAO KHÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHUN SẤY

1.3.1 Kỹ thuật chiết xuất siêu âm

1.3.1.1 Khái niệm:

Chiết xuất với sự trợ giúp của sóng siêu âm (UAE) là phương pháp ngâm cải tiến với việc sử dụng sóng siêu âm tần số cao làm cho chiết xuất dễ dàng hơn Âm thanh được truyền qua một môi trường bằng cách gây chuyển động dao động của các phân tử tạo thành một phần của nó Sóng siêu âm bao gồm các khu vực tần số giữa 18 kHz và 100 MHz [34]

1.3.1.2 Ưu và nhược điểm:

* Ưu điểm:

- Dưới tác động của sóng siêu âm, quá trình khuếch tán nội phân tử tăng nhanh, giúp cho việc hòa tan dược chất vào trong dung môi dẽ dàng hơn Rút ngắn thời gian chiết và giảm được lượng dung môi, tăng hiệu suất chiết so với chiết thông thường

- Chiết siêu âm không đòi hỏi nhiệt độ cao để chiết nhiều dược chất Chính vì vậy, phương pháp chiết này sẽ giúp hạn chế ảnh hưởng của nhiệt độ đến một số dược chất nhạy cảm với nhiệt, nâng cao chất lượng của dịch chiết

- Với một thiết bị chiết siêu âm hiện đại, chất lượng của dịch chiết có thể được kiểm soát dễ dàng thông qua việc điều chỉnh các thông số đã được cài đặt trong máy như nhiệt độ, tần số sóng, tốc độ khuấy…

- Hiệu quả, đơn giản và ít tốn kém hơn so với các phương pháp chiết thông thường Ngoài ra, thiết bị chiết siêu âm thường rẻ tiền hơn so với thiết bị chiết vi sóng hoặc chiết siêu tới hạn Hơn nữa, dung môi sử dụng trong chiết xuất siêu âm cũng giống như chiết Soxhlet, có thể được sử dụng với bất kỳ dung môi nào để chiết xuất một khoảng rộng các hợp chất tự nhiên

* Nhược điểm:

- Ảnh hưởng của siêu âm trên khối lượng chiết xuất và động học có thể liên quan đến bản chất của cấu trúc thực vật

- Sự có mặt của một pha phân tán làm suy giảm sóng siêu âm

- Phần hoạt động của siêu âm bên trong bình chiết được giới hạn trong một khu vực nằm trong vùng lân cận của khu vực phát ra siêu âm [34]

1.3.2 Bào chế cao khô bằng phương pháp phun sấy

1.3.2.1 Khái niệm:

Phun sấy là quá trình phun các giọt chất lỏng vào môi trường nóng, thường là không khí nóng Các giọt chất lỏng này trong môi trường không khí nóng sẽ được sấy khô tạo các hạt tiểu phân Nguyên liệu cấp đầu vào có thể là dung dịch, hỗn dịch, hệ phân tán hoặc nhũ tương Sản phẩm khô thu được có thể là bột, hạt hoặc khối kết tụ, nó phụ thuộc vào tính chất lý hóa của nguyên

liệu đầu vào và một số thông số của thiết bị phun sấy [35][36]

1.3.2.2 Ưu và nhược điểm:

* Ưu điểm:

- Thiết bị đơn giản, tiến hành nhanh chóng Chất lỏng nguyên liệu được dẫn trực tiếp vào buồng phun sấy Dưới tác động của dòng không khí nóng sẽ tạo ra các hạt tiểu phân rắn khô Thời gian chuyển từ chất lỏng sang rắn khoảng

- Thích hợp với các sản phẩm nhạy cảm ở nhiệt độ caovì quá trình phun sấy diễn ra ở áp suất khí quyển, nhiệt độ thấp và thời gian ngắn

- Sản phẩm đầu vào tiếp xúc với bề mặt thiết bị trong điều kiện khô nên giảm thiểu các vấn đề về ăn mòn và lựa chọn vật liệu chế tạo

* Nhược điểm:

- Phun sấy sẽ không thành công nếu sản phẩm có tỷ trọng quá lớn

- Đối với một công suất nhất định, tỉ lệ bốc hơi lớn thường cần thiết hơn với các loại máy sấy khô khác Do vậy nguyên liệu phải được bơm liên tục

- Có vốn đầu tư ban đầu cao so với các loại máy sấy liên tục

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Phần trên mặt đất của ngải cứu tên khoa học là Artemisia vulgaris L., họ

Cúc - Asteraceae

Mẫu nguyên liệu nghiên cứu sau khi thu hái được rửa sạch, loại bỏ tạp

cơ học, băm nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ dưới 60oC, bảo quản trong túi nylon kín nơi khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong thí nghiệm thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu

Eupatilin chuẩn (>98%) Sigma Aldrich, Hoa kỳ BP 2005

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Waters- 2695D (Mỹ) sử dụng cột Eclipse XDB-C18 (150 × 4,6 mm, 5 µm, Agilent, Mỹ) ; bộ phận tiêm mẫu tự động; đầu dò PDA 2998; phần mềm Empower

- Cân phân tích Mettler (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,0001g

- Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g

- Tủ sấy (Trung Quốc)

- Máy lắc siêu âm Elmasonic (Mỹ)

- Máy đo hàm ẩm tự động ADAM 480

- Thiết bị phun sấy LPG5, Trung Quốc

- Bộ cất quay chân không Buchi (Thụy Sĩ)

- Màng lọc kích thước 0,45 µm

- Bếp điện, nồi nhôm để chiết xuất, nồi cô cao cách thuỷ

- Một số dụng cụ, thiết bị nghiên cứu khác dùng trong phòng thí nghiệm (Máy xay dược liệu, nồi cô cao cách thủy, pipet định mức, ống đong, cốc có mỏ, …)

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, khối

lượng 20 ± 2g, của Ban chăn nuôi động vật- Học viện quân y cung cấp

Động vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức

ăn và nước uống tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y từ trước khi nghiên cứu 5 ngày và trong suốt thời gian nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng phương pháp điều chế bột cao khô Ngải cứu

2.2.1.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng eupatilin trong dịch chiết dược liệu Ngải cứu bằng phương pháp HPLC

- Điều kiện phân tích

+ Cột sắc ký: Cột Eclipse XDB-C18 (150 × 4,6 mm, 5 µm, Agilent, Mỹ)

- Tiến hành khảo sát một số yếu tố:

+ Pha động: Thay đổi tỷ lệ pha động và loại dung môi Sử dụng eupatilin chuẩn và dịch chiết ngải cứu trong MeOH để khảo sát chương trình pha động Chương trình pha động được lựa chọn khảo sát gồm:

Bảng 2.2: Khảo sát pha động

ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Dung dịch trong bình được lọc qua màng 0,45 μm và được tiêm vào hệ thống phân tích HPLC

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn eupatilin sau đó hòa tan với MeOH trong bình định mức 10 ml (dung dịch chuẩn gốc), thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng sử dụng dung môi MeOH và bình định mức để được các dung dịch chuẩn cần thiết Dung dịch chuẩn tiến hành phân tích có nồng độ khoảng từ 1-50 µg/ml

- Tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu

+ Tính tương thích của hệ thống

Pha dung dịch chuẩn eupatilin chuẩn làm việc có nồng độ khoảng 1µg/ml

từ dung dịch chuẩn gốc (500 µg/ml) Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC

+ Xác định khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn eupatilin làm việc có nồng độ 0,2; 0,5; 1; 2; 5 µg/ml và phân tích bằng HPLC để xác định sự tương quan tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ dung dịch chất chuẩn

+ Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên việc tiến hành lặp lại 6 thử nghiệm riêng biệt từ bước cân dược liệu, chiết xuất đến phân tích mẫu thử bằng hệ thống HPLC Khối lượng cân mỗi mẫu thử chính xác khoảng 0,5g + Độ đúng

Độ đúng của phương pháp được đánh giá dựa vào phương pháp thêm chuẩn và xác định tỷ lệ % tìm lại Một lượng chính xác chất chuẩn đã biết được thêm vào mẫu dược liệu sau đó xác định lượng eupatilin đã thêm vào dựa vào phân tích HPLC Tiến hành làm lặp lại 6 thử nghiệm riêng biệt

Tỉ lệ phần trăm tìm lại chuẩn được xác định theo công thức:

% tìm lại = =

+ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành pha loãng dần dung dịch chuẩn eupatilin bằng MeOH và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC, LOD và LOQ của phương pháp được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu píc/nhiễu đường nền Thực hiện 03 mẫu

2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện chiết xuất dịch chiết

* Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu Ngải cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất:

+ Phương pháp chiết: Chiết siêu âm, chiết nóng

+ Loại dung môi chiết xuất: ethanol 50, 70, 90%

- Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố đến quá trình chiết xuất Lựa chọn điều kiện chiết xuất tối ưu làm căn cứ để khảo sát ảnh hưởng của yếu

tố tiếp theo

Cụ thể: Cân chính xác 2,0 g bột dược liệu Cho vào thiết bị chiết, tiến hành chiết xuất với các điều kiện về phương pháp chiết, dung môi, nhiệt độ, tỉ

lệ DM/DL, thời gian và số lần chiết theo từng bước khảo sát Gạn, lọc, rửa lấy

dịch chiết vào bình định mức 50 ml, định mức bằng dung môi chiết xuất

- Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất chiết eupatilin trong dịch chiết

Hiệu suất chiết được tính theo công thức:

Hiệu suất = Mhoạtchất

MLT × 100

Khối lượng hoạt chất trong dược liệu (lý thuyết) tính theo:

MLT = mDL × HLhoạt chất × (100 – a)

mDL : khối lượng dược liệu (g)

HLhoạt chất : Hàm lượng hoạt chất trong dược liệu (μg/g)

a : độ ẩm của dược liệu (%)

2.2.1.3 Cô đặc và loại tạp chất

- Sau khi khảo sát được điều kiện chiết xuất tối ưu, tiến hành chiết xuất

ở mẻ lớn hơn Khối lượng dược liệu chiết xuất mỗi lần khoảng 1,0 kg Tiến hành với điều kiện về phương pháp chiết, nhiệt độ, thời gian, dung môi và tỉ lệ DM/DL, số lần chiết theo kết quả phần khảo sát trên Dịch chiết được lọc qua vải gạc, bã dược liệu được rửa bằng dung môi chiết xuất Sau đó, dịch chiết được cô đặc bằng thiết bị cất quay chân không, nhiệt độ khoảng 600C– 700C

Cô dịch chiết đến khi thu được cao lỏng thích hợp Để lắng qua đêm, gạn, thu phần cao lỏng, phần cắn (tạp cơ học) được lọc qua giấy lọc bằng máy hút chân không và rửa bằng dung môi chiết xuất

- Hiệu suất cô cao được tính theo công thức:

2.2.1.4 Xây dựng phương pháp điều chế bột cao khô bằng phương pháp phun sấy

- Quy trình bào chế bộ cao khô từ cao lỏng bằng phương pháp phun sấy theo các giai đoạn sau:

+ Giai đoạn chuẩn bị: Chuẩn bị dịch phun (xác định tỉ lệ chất rắn trong cao lỏng, hàm lượng eupatilin), chuẩn bị tá dược, thiết bị phun sấy, máy khuấy

từ gia nhiệt, túi nilon, cân…

+ Giai đoạn phun sấy: Chú ý các thông số khảo sát Khi đạt được nhiệt độ đầu vào và đầu ra mới bật súng phun và bơm, rửa bằng nước trong khoảng

30 phút Sử dụng máy khuấy từ khuấy đều để dịch phun đồng nhất Sản phẩm được thu vào 02 lần túi nilon, buộc kín bằng dây chun Giữa các lần phun rửa bằng nước 30 phút để tránh tắc vòi phun và tránh nhầm lẫn với bột của lần phun trước

+ Giai đoạn kết thúc: Rửa bằng nước 30 phút Sau đó, tắt bơm, súng phun, gia nhiệt, để nguội máy khoảng 60ºC rồi tắt quạt gió Tháo dỡ các bộ phận của máy và vệ sinh sạch sẽ

- Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phun sấy, bao gồm: + Tá dược hỗ trợ phun sấy: Loại tá dược và tỉ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR): Không sử dụng tá dược, Aerosil (AE), AE/MD (80:20), AE/MD (50:50), AE/MD (20:80), Maltodextrin(MD)

+ Tỉ lệ TD/CR: 40,30,20 (%)

KL euptilin trong cao lỏng loại tạp (mg)

KL euptilin trong dịch chiết (mg)

x 100HCô cao (%) =

+ Nhiệt độ đầu vào buồng phun: 1600C, 1400C, 1300C, 1200C

- Chỉ tiêu đánh giá bao gồm:

+ Hình thái bột: Quan sát bằng cảm quan (hình thức, màu sắc, mùi vị) + Khối lượng riêng biểu kiến của bột (g/ml) và chỉ số nén CI (%): Cân chính xác khoảng 5,0 g bột, cho vào ống đong 25ml sạch đã sấy khô, đọc thể tích ban đầu của bột (V1), gõ đến thể tích không đổi (V2) Khối lượng riêng gõ (d2) là khối lượng riêng biểu kiến của bột, khối lượng riêng không gõ (d1) và chỉ số nén (CI) tính theo công thức:

d1 = m

V1 d2 = m

V2 CI (%) = d2−d1

d2 × 100 + Độ ẩm: Xác định độ ẩm của bột cao khô bằng máy xác định độ ẩm tự động Làm 3 lần, lấy giá trị trung bình

+ Hàm lượng euptilin trong cao: xác định bằng phương pháp HPLC

- Chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác khoảng 500mg bột cao khô vào bình định mức 25ml, thêm khoảng 15-20ml dung môi methanol, lắc siêu âm 15 phút sau đó thêm dung môi vừa đủ đến vạch Dịch trong bình định mức được lọc qua màng 0,45 μm sau đó được phân tích với hệ thống HPLC

- Cách tiến hành: Tiêm dung dịch thử vào máy sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi thời gian lưu và diện tích của pic eupatilin trong mỗi dung dịch

Hàm lượng eupatilin (mg/g) trong bột cao khô ngải cứu được tính theo công thức:

Trong đó:

mc: Khối lượng mẫu thử (mg)

CEu: Nồng độ eupatilin của dung dịch thử (µg/ml)

CEu x 25 x 100

mc x (100-h) x 1000

HL =

h: Độ ẩm bột cao khô (%)

- Hiệu suất thu hồi hoạt chất của quá trình phun sấy:

HTH (%) = Hàm lượng eupatilin trong bột cao khô (mg/g) x 100

Hàm lượng eupatilin trong bột cao khô theo lý thuyết (mg/g) Hàm lượng hoạt chất (mg/g) theo lý thuyết tính theo công thức sau:

HLLT (mg/g) = CDC x mDC

mDC x CRDC + mTD Trong đó:

CDC: Hàm lượng hoạt chất trong dịch phun sấy (mg/g)

mDC: Khối lượng dịch chiết (cao lỏng) cho mẻ phun sấy (g)

CRDC: Tỷ lệ chất rắn có trong dịch phun sấy (%)

mTD: Khối lượng tá dược thêm vào cho một mẻ phun sấy (g)

- Căn cứ vào các chỉ tiêu trên, đối với mỗi yếu tố khảo sát, lựa chọn điều kiện tốt nhất làm cơ sở để khảo sát các điều kiện tiếp theo Mỗi khảo sát tiến hành 03 lần, lấy giá trị trung bình

2.2.2 Đánh giá tác dụng chống loét dạ dày, giảm đau của cao khô ngải cứu trên động vật thực nghiệm

2.2.2.1 Đánh giá tác dụng chống loét dạ dày trên động vật thực nghiệm

Mẫu nghiên cứu: Cao khô điều chế từ lá cây Ngải cứu

Cách tính liều bột cao khô ngải cứu: Liều trên chuột cống trắng 100mg/kg/24h

Ngoại suy cho chuột nhắt trắng: L1= 100

7 × 12= 171,43 mg/kg/24h L2=200

7 × 12= 342,86 mg/kg/24h Cách tiến hành: Tác dụng chống loét dạ dày của mẫu thử được đánh giá trên mô hình gây loét dạ dày bằng cồn 90% trên chuột nhắt trắng Với 4 lô nghiên cứu, mỗi lô 10 con

Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước cất 10mL/kg liên tục trong 5 ngày

Lô 2 (Mô hình): Uống nước cất 10mL/kg + uống cồn 90% liều 7,5mL/1kg/24h (uống 1 lần vào ngày thứ 5)

Lô 3 (Omeprazol): Uống Omeprazol liều 9,6mg/kg/24h ( hệ số 12, tương đương liều dùng trên người là 40mg/50kg/24h) liên tục trong 5 ngày + uống cồn 90 % liều 7,5mL/1kg/24h vào ngày thứ 5 sau khi uống liều cuối cùng 60 phút

Lô 4 (Ngải cứu liều 1): Uống bột cao khô ngải cứu liều 1 là

171,43mg/kg/24h liên tục trong 14 ngày + uống cồn 90 % liều 7,5mL/1kg/24h sau khi uống liều cuối cùng 60 phút

Lô 5 (Ngải cứu liều 2): ): Uống ngải cứu liều 2 là 342,86mg/kg/24h liên

tục trong 14 ngày + uống cồn 90 % liều 7,5mL/1kg/24h sau khi uống liều cuối cùng 60 phút

Tại ngày cuối cùng của nghiên cứu, sau 60 phút uống thuốc, chuột ở các

lô 2, 3, 4 và 5 được uống cồn 90% liều 7,5mL/1kg/24h

Tất cả chuột được đánh số mã hóa, nghiên cứu viên được làm mù để không biết được chuột nào ở lô nào nhằm mục đích hạn chế sai số

Chuột được mổ bụng, bộc lộ dạ dày Rửa sạch bằng nước muối sinh lý, thấm bề mặt vết loét bằng formaldehyd 5% Quan sát kính hiển vi đánh giá mức độ loét theo thang điểm của Reddy và cộng sự (2012):

Dạ dày bình thường (Normal colored stomach): 0 điểm

Sung huyết (Red coloration): 0,5 điểm

Chấm loét (Spot ulcer): 1 điểm

Vệt xuất huyết (Hemorrhagic streak): 1,5 điểm

Loét sâu (Deep ulcers): 2 điểm

Thủng (Perforation): 3 điểm

Các chỉ số đánh giá: