SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ VÀ PHÂN LẬP GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill

SỰ PHÁT TRIỂN CỦA BỘ RỄ VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU .... Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tương, đó là sự điều chỉnh áp suất thẩm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÙI NGỌC BÍCH

SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ VÀ PHÂN LẬP

GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO

DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

 Glycine max (L.) Merrill 

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường THPT Lộc Bình Lạng Sơn

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành khoá học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Tác giả luận văn

Bùi Ngọc Bích

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tương 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương 5

1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 6

1.2.1 Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương 6

1.2.2 Mối liên quan giữa tính chịu hạn và sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương 10

1.3 GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 11

1.3.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương 11

1.3.2 Gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương 14

1.3.3 Biện pháp công nghệ sinh học trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương 15

1.3.4 Expansin và gen expansin ở cây đậu tương 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25

2.1.1 Vật liệu 26

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 26

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của cây đậu tương non trong điều kiện hạn

nhân tạo 27

2.2.2 Phương pháp đánh giá sự phát triển của bộ rễ trong điều kiện hạn nhân tạo thông qua chiều dài rễ 28

2.2.3 Phương pháp đánh giá sự phát triển của bộ rễ trong điều kiện hạn nhân tạo thông qua số lương rễ con 28

2.2.4 Xác định chỉ số chịu hạn tương đối thông qua sự phát triển bộ rễ 28

2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 29

2.2.6 Xử lý kết quả và tính toán số liệu 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA BỘ RỄ VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU 36

3.1.1 Sự phát triển của bộ rễ của cây đậu tương non trong điều kiện không xử lý và xử lý bởi hạn 36

3.1.2 Khả năng chịu hạn của ba giống đậu tương nghiên cứu 39

3.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA CẤU TRÚC GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG LƠ BẮC GIANG VÀ XUÂN LẠNG SƠN 41

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá non đậu tương 41

3.2.2 Kết quả nhân bản gen GmEXP1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu tương XLS và LBG 43

3.2.3 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 45

3.2.4 Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu 45

3.2.5 Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

ASTT Áp suất thẩm thấu

Bp Cặp bazơ

cDNA Sợi ADN bổ sung được tổng hợp từ mARN nhờ Enzym

phiên mã ngược dNTP Deoxynucleotide

đtg Đồng tác giả

DHA Docosa Hexaenoic acid

HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt

HSG Heat Shock Granules - Hạt sốc nhiệt

HSPL Hệ số pha loãng

Kb Kilo Bazo = 1000 bp

LEA Late embryogenesis abundant

(Protein được hình thành với số lượng lớn trong quá trình hình thành phôi)

LBG Đậu tương lơ Bắc Giang

MGPT Môi giới phân tử - Molecular chaperone

MW Molecular weight - Khối lượng phân tử

PCR Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase XLS Đậu tương Xuân Lạng Sơn

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Nguôn gốc các giống đậu tương nghiên cứu 25

2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng

pBT

33

3.1 Số lượng rễ con và kích thước rễ của ba giống đậu

tương trong điều kiện không xử lý và xử lý bởi hạn

37

3.2 Chỉ số chịu hạn tương đối của ba giốngđậu tương

nghiên cứu

40

3.3 Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bước

sóng 260nm và 280nm của giống đậu tương XLS và

LBG

42

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tương 22 1.2 Sơ đồ về gen và protein EXP1 ở cây đậu tương 22 1.3 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1 23 1.4 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1 23 1.5 Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1 24 1.6 Mô hình cấu trúc không gian vùng Pollen allerg của

giống đậu tương nghiên cứu

43

3.4 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ lá non đậu tương 43 3.5 Hình ảnh điện di kết quả nhân gen Gm EXP1 44 3.6 Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5α

chứa vector tái tổ hợp mang gen GmEXP1

45

3.8 Trình tự gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tương XLS 48 3.9 So sánh trình tự nucleotide vùng mã hóa của gen GmEXP1

phân lập từ giống đậu tương Xuân Lạng Sơn với trình tự

nucleotide mã số AF516879 công bố trên NCBI

49

3.10 So sánh trình tự amino acid của protein EXP1 do gen

GmEXP1 mã hoá phân lập từ giống đậu tương Xuân Lạng

Sơn với trình tự amino acid của protein EXP1 do gen có

mã số AF516879 công bố trên NCBI

50

MỞ ĐẦU

1.1 Lý do chọn đề tài

Cây đậu tương hay đỗ tương (Glycine max (L.) Merrill) là một loại cây

trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao Hạt đậu tương giàu hàm lượng protein (từ 32% - 52% ) và chứa nhiều amino acid không thay thế ( lysin, triptophan,metionin, cystein, leucin ), 12% -25% lipit

và các vitamin ( B1, B2, C, D, E, K ) cần thiết cho cơ thể người và động vật một đặc tính quan trọng nữa của đậu tương là có nốt sần ở rễ tạo khả năng cố định nitơ trong không khí vì vậy trồng đậu tương còn góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi trường [5]

Cây đậu tương là loại cây trồng có tầm quan trọng thứ ba trong nhóm cây lấy hạt ở Việt Nam sau lúa và ngô Sản lượng đậu tương trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn /năm Trong khi đó ở Việt Nam chỉ đạt vài trăm nghìn tấn /năm, điều này cho thấy tình hình sản xuất đậu tương ở nước ta so với khu vực vẫn còn ở mức thấp Một trong những nguyên nhân là do hạn hán đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém Biến đổi khí hậu, hạn hán xảy ra liên tục và kéo dài, cho nên công tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày càng được quan tâm nghiên cứu [6], [13], [14]

Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tương, đó

là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển bộ rễ Khả năng thu nhận nước của cây phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ Để tránh mất nước những cây chịu hạn thường có bộ rễ khoẻ, dài, mập có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu trong đất hoặc rễ lan rộng với số lượng lớn Thực vật nói chung

và cây đậu tương nói riêng khi ở giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ và còn yếu [5], [6], [13], [14]

Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu

đề tài: “So sánh sự phát triển bộ rễ và phân lập gen GmEXP1 liên quan

đến khả năng kéo dài rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được sự khác biệt về sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương nghiên cứu

Phân tích đặc điểm của trình tự gen liên quan đến khả năng kéo dài của

rễ phân lập từ cây đậu tương

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương thông qua sự phát triển của bộ rễ;

- Khuếch đại gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài của rễ ở cây

đậu tương bằng kỹ thuật PCR từ DNA hệ gen;

- Tách dòng và xác định trình tự gen GmEXP1 liên quan đến khả năng

kéo dài của rễ ở cây đậu tương;

- So sánh trình tự gen GmEXP1 của giống đậu tương nghiên cứu với

trình tự gen đã công bố

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tương

Cây đậu tương hay đậu nành (Glycine max L Merill) là loại cây

quan trọng bậc nhất trong các cây họ Ðậu (Fabaceae) Để có vị trí như vậy là nhờ đậu tương có những đặc tính ưu việt hơn những giống đậu khác, đó là: Hàm lượng protein và lipit cao: protein từ 32% đến 52%, lipit từ 12% đến 25%, glucid (10-15%), chứa nhiều loại vitamin , là nguồn năng lượng quan trọng cho con người và vật nuôi Các sản phẩm rất quen thuộc của đậu tương như đậu phụ, tương, dầu ăn có vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đậu tương có vai trò chữa và điều trị bệnh nan y như ung thư, tim mạch Đậu tương còn có thể giải quyết một phần vấn đề hết sức cấp thiết hiện nay trên thế giới là năng lượng từ các sản phẩm của nó Ngoài ra đậu tương là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất thông qua việc cố định đạm của vi khuẩn trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảm lượng phân hóa học bón xuống đất, khắc phục sự thoái hóa đất và ô nhiễm môi trường [3], [10]

Về phân loại thực vật học, cây đậu tương hay còn gọi là đậu nành, tên

khoa học Glycine max (L.) Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Lengunoceace),họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) (Hymowitz và Newell, 1981) Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max (L.) Merill (2n= 40) trong

giống phụ G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu (Lengunoceace) họ phụ cánh

bướm (Papilinoideae) Thân đậu tương là cây thân thảo, ít phân cành dạng

bụi, lá đậu tương là lá kép với ba lá chét nhưng cá biệt cũng có lúc có 4 đến

5 lá chét Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ không có mùi, có màu tím, tím nhạt, hoặc màu trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín màu vàng hoặc xám Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp mỏng bao quanh một phôi lớn Hạt có hình tròn, ôvan, dẹt, bầu dục vỏ hạt nhẵn

có thể có màu vàng đậm, vàng nhạt, xanh hoặc nâu, đen nhưng đa số là hạt màu vàng

Đối với đậu tương có thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng, theo thời vụ Hiện nay đậu tương được trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội Mặc dù nguồn gốc và lịch sử ban đầu của cây đậu tương chưa sáng tỏ nhưng

đã có những bằng chứng chứng tỏ giống đậu này đã được thuần hoá đầu tiên ở Trung Quốc Từ Trung Quốc đậu tương được đưa sang Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Đông Nam Á và Nam Á qua con đường tơ lụa Ở Việt Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc

và miền Đông Nam Bộ [3], [10], [14]

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất trong các cây lấy dầu Theo thống kê của FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương trên thế giới tăng gấp 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích Trong vòng 100 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình quân tăng khá cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế giới là: Mỹ, Bzaxin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90- 95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới

Ở Việt Nam, hiện nay đậu tương được trồng trên cả bảy vùng nông nghiệp, trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn nhất 46,6%,

Đồng bằng sông Hồng 19,3%, vùng Tây nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng sông Cửu Long 8,9%, Khu Bốn 2,3% và Vùng duyên hải miền Trung là 1,6% Cây đậu tương chiếm một vị trí khá quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt ở vùng nông thôn khó khăn, kinh tế chưa phát triển [3], [8], [10]

Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương ở Việt Nam vẫn chưa dược đầu tư cao, do còn sử dụng các giống có năng suất thấp, kỹ thuật chăm sóc lạc hậu

Do vậy việc nghiên cứu cải tiến các đặc điểm nông học cả giống địa phương

và tạo ra các giống mới có năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau bằng các phương pháp chọn và tạo giống hiện đại sẽ đáp ứng được các yêu cầu thực tiễn đặt ra và đó cũng là kế hoạch nằm trong chiến lược phát triển cây đậu đỗ ở nước ta

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Thân, rễ và lá

Đậu tương là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành lá, hoa, quả, hạt Rễ đậu tương là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ

phụ trên rễ có nhiều vi khuẩn nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có

khả năng cố định Nitơ của không khí thành đạm dễ tiêu Đậu tương là cây hai

lá mầm thân thảo Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển sang màu nâu nhạt Màu sắc của thân sẽ cho ta biết màu sắc của hoa sau này, nếu thân có màu xanh thì hoa sẽ có màu trắng còn nếu thân có màu tím thì sau hoa có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3-1m tuỳ theo giống Thân đậu tương hình tròn nhiều đốt thường đứng có khi bò hoặc nửa bò Mỗi thân có từ 8 đến 14 đốt, các cành mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn mọc đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép Mỗi lá kép

có ba lá chét Phiến lá có nhiều hình dạng khác nhau: trứng, tròn ,dài, lưỡi mác Hình dạng của lá thay đổi theo từng giống, những lá nhỏ và dài chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn thường kém

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần,

đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ

Nốt sần có thể dài 1cm, đường kính từ 5- 6mm khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nó có màu hồng, nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0- 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm từ 30-60kg/ha

Đặc điểm về sinh thái học của cây đậu tương

Nhiệt độ: Ở giai đoạn nẩy mầm nhiệt độ thích hợp 24 – 300C, ở giai đoạn cây con nhiệt độ từ 24 – 300

C, ở giai đoạn ra hoa kết trái 24 – 340C và giai đoạn chín: 20 – 250C Cây đậu tương cần lượng mưa tối thiểu phải đạt từ

400 mm, tốt nhất là 700 mm Ở mỗi giai đoạn cây đậu tương có nhu cầu khác nhau về độ ẩm Giai đoạn nẩy mầm thích hợp với độ ẩm khoảng 75 – 80%, đến giai đoạn cây con nhu cầu về độ ẩm giảm 50 – 60% song lại tăng mạnh

ở giai đoạn ra hoa kết quả 70 – 80% và thấp nhất ở giai đoạn chín: 35 – 50 %

Đa số các giống đậu tương trồng hiện nay đều có phản ứng quang chu kỳ ngày ngắn Đậu tương có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau: đất đỏ, đất xám, đất phù sa, đất giồng cát Nhưng để trồng đậu tương có hiệu quả phải trồng trên đất có thành phần cơ giới nhẹ, pH từ 5 – 8 [3], [8], [10]

1.2 ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.2.1 Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương

Hạn và tác động hạn đến sinh trưởng của thực vật

Hạn là tình trạng mất nước ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: như sự thiếu nước trong môi trường hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, độ mặn cao Hạn cũng như các yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể gây ra các phản ứng của cơ thể, tuỳ theo từng loài từng giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại do khô hạn gây ra là khác nhau: một số bị chết, một số bị thương, một số khác bị ảnh hưởng còn lại một số không bị ảnh hưởng

Khô hạn có thể phân ra làm hai trường hợp sau:

- Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định trong chu kỳ sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử) Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây Đây là quá trình biến đỏi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khả năng chịu hạn tăng lên Khả năng này đạt cực đại ở thời kỳ hạt chín và có chiều hưóng giảm dần khi hạt nảy mầm Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như như nhiệt độ, gió

- Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây huỷ hoại cây cối và gây mất mùa Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết, khí hậu Có hai loại hạn do môi trường tác động là: hạn đất

và hạn không khí

- Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây Sự tác động này được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu với điều kiện cực đoan

- Hạn nhiệt độ không khí: thường xảy ra ở những vùng có gió nóng, nhiệt độ cao Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặt đất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau

Tác hại của khô hạn

Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính: làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Nước là yếu tố giới hạn với cây trồng, vừa là nguyên liệu khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh học Nước còn là môi trường cho các phản ứng sinh hoá trong tế bào xảy ra, do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo giống thường xuyên được quan tâm Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, hạn

có ảnh hưởng tới hai quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đó là giai đoạn cây non và giai đoạn cây ra hoa

Như vậy ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng tác động xấu đến các yếu tố cấu thành năng suất, làm giảm năng suất cây trồng [1], [2], [9], [13], [16], [18]

Cơ chế chịu hạn của cây đậu tương liên quan đến hai cơ chế chính là

điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT) và sự phát triển bộ rễ

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT)

Khả năng điều chỉnh ASTT là một đặc tính quan trọng của tế bào khi mất nước do nóng hạn Những thực vật tồn tại trên môi trường mất cân bằng

về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại điều kiện khắc nghiệt

đó Trong điều kiện khô hạn ASTT được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước từ đất Bằng cơ chế như vậy, thực vật có thể vượt qua t́nh trạng hạn cục bộ [17]

Thông thường, thiếu nước gây rối loạn toàn bộ phương thức chuyển hoá ở thực vật, tăng lên hoặc giảm hàm lượng các chất chuyển hoá như: tăng

về hàm lượng prolin, nồng độ ion K+, các loại đường axít hữu cơ

Sự tổng hợp các chất diễn ra rất nhanh khi tế bào mất nước, các chất hoà tan sẽ được tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nước, tăng khả năng giữ nước của chất nguyên sinh và chúng có thể tương tác với lipit hoặc protein màng ngăn chặn sự phá huỷ màng và các phức protein Quá trình này liên quan đến sự biểu hiện của các gen, hàng loạt gen nghỉ được hoạt hoá tổng hợp tạo ra các chất cần thiết để chống lại sự khô hạn

Ngoài ra khi nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chống chịu người ta đã nhận thấy khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan thuộc

về vai trò của nhóm chất protein sốc nhiệt (heat shock protein- HSP), trong đó

có các chất môi giới phân tử (MGPT)- Molecular chaperonin, ubiquitin, protease, amilase, LEA (late embryogeis abudant protein)- protein được hình thành với số lượng lớn trong quá trình hình thành phôi Những nhóm chất này

có liên quan đến sự bảo vệ các enzyme, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời đào thải các chất biến tính có khả năng gây độc cho tế bào khi gặp phải các yếu tố cực đoan [7], [9]

- Vai trò của bộ rễ

Khả năng thu nhận nước phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ Để tránh mất nước những cây chịu hạn thường có bộ rễ khoẻ, dài, mập có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu trong đất hoặc rễ lan rộng với số lượng lớn Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng khi ở giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ còn yếu Trong các cây trồng lấy hạt thì cây đậu tương có nhu cầu về nước cao hơn các loại cây khác, đó là do trong hạt và cây đậu tương có hàm lưọng protein và

lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530kg nước Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước của đậu tương cũng khá cao 50% trong khi ngô

là 30%, lúa là 26% [10]

Nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện

di truyền cho thấy rằng tính trạng chịu hạn của cây đậu tương là tính trạng đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: Sự phát triển của bộ rễ (số lượng rễ, chiều dài rễ, trọng lượng rễ, kích thước rễ, số lượng nốt sần), tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Căn cứ vào đặc điểm này đậu tương được chia làm hai nhóm : Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn của cây và Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn đậu tương dễ dàng vượt qua hơn, còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp hạn sẽ làm giảm đáng kể năng suất

1.2.2 Mối liên quan giữa tính chịu hạn và sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm

vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua sự phát triển của rễ cọc để có thể tiếp tục tìm kiếm nguồn nước từ các lớp đất sâu Bên cạnh đó sự phát triển hệ thống rễ con cũng giúp cho cây có thể lan toả theo chiều ngang giúp tìm kiếm nước ở các lớp đất có độ ẩm cao đồng thời tìm kiếm chất dinh dưỡng khoáng khác như phospho Kasper và đtg khi đánh giá 105 giống đậu tương trong điều kiện khô hạn đã nhận thấy, cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn cây đậu tương được tưới nước, ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan

chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ con ở các giống chịu hạn Và các tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn Trong một nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi được xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa sẽ cho năng suất cao hơn những cây đậu tương được xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa, điều này được giải thích là do chúng đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều kiện hạn trước khi nở hoa Các kết quả này cho thấy nếu cây đậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai đoạn sớm của quá trình sinh trưởng sinh dưỡng sẽ giúp cho cây thích ứng được với các điều kiện hạn [12], [35]

Trong điều kiện khô hạn thì khả năng cố định N2 ở đậu tương cũng là một trong các yếu tố thích nghi với tình trạng thiếu nước

1.3 GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương

Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hưởng làm giảm mạnh năng suất cây trồng trên toàn thế giới (Boyer, 1982) trong đó có đậu tương Để thích ứng với điều kiện như vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi

sự khởi động của nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện vô sinh bất lợi Một số lượng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu mặn đã được xác định Nhưng vẫn còn một số lượng đáng kể các gen liên quan đến tính chống chịu của thực vật chưa được xác định (Bray 1997, Zhu 2002) Vì vậy điều quan trọng là nghiên cứu chức năng của gen liên quan đến các stress nhằm cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán Có hai nhóm gen có liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương [19]

Nhóm gen mà sản phẩm của nó liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn

Trong các công trình nghiên cứu về các gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương đã phát hiện một số gen và nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương như: gen cystatin, gen chaperonin, protein LEA, gen P5CS Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu tương nói riêng và tính chống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh

lý, hoá sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC ) [6], [9]

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bị mất nước do hạn, nóng, lạnh Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất Các chất

và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+; các amino acid như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol

và các chất khác như glycine betain, - alanin betain Các chất này có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ [18]

Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậc cao ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tế bào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trưởng phát triển

và đáp ứng với stress của môi trường Đối với stress hạn, ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích nghi với

điều kiện khô hạn Về cơ chế tác động người ta cho rằng ABA làm biến đổi điện thế hoá màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+

[29]

Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xảy ra, các protein bị biến tính và bị tổn thương Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biến tính Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi là

cystatin [45]

Các gen chức năng có liên quan trực tiếp đến khả năng chịu hạn được biết đến là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein - HSP), môi giới phân tử (Molecular chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C (PLC), protein vận chuyển lipit (LTP)

Ở Việt Nam đã có một số công trình phân lập các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonmironi - Nhật bản với kích thước phân tử 1,6kb của Nông Văn Hải và đtg (1997) Nghiên cứu của Trần Thị Phương Liên (1999) đã phân lập và đọc trình tự gen chaperonin ở tế bào chất của giống đậu tương đột biến M103 với kích thước 1602bp mã hoá cho 533 axit amin Nguyễn Thị Thu Hiền (2005) phân lập được gen dehydrin với kích thước 751bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống Vàng Mường Khương và Cao Bằng Chu Hoàng Mậu và đtg đã tách dòng gen chapẻonin từ một số giống đậu tương vùng Tây Nguyên [7], [14], [44]

Nhóm gen kích hoạt quá trình phiên mã

Các gen điều khiển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng promotor và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đã được quan tâm nghiên

cứu như: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY Mỗi nhóm nhân

tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịu hạn có trình tự cis riêng biệt và promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố

khởi đầu phiên mã [9]

1.3.2 Gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương

Khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng hút nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài, ăn sâu xuống các tầng đất sẽ có khả năng lấy được nhiều nước Các giống đậu tương địa phương thường có bộ rễ dài do vậy khả năng chống hạn cũng cao hơn Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi nghiên cứu vai trò của bộ rễ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của đậu tương Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu phân lập gen Expansin (EXP1) từ mARN của cây đậu tương với kích thước 1089bp và năm 2011 ông và các cộng sự đã nghiên cứu biểu hiện của gen expansin (EXP) liên quan đến việc kéo dài rễ của cây đậu tương Expansin là một họ protein tác động trong việc mở rộng của thành tế bào thực vật và được coi là một protein chủ yếu ảnh hưởng đến sự mở rộng của tế bào thực vật

Mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian hạt

nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài rễ diễn ra rất

nhanh Biểu hiện của gen GmEXP1 làm tăng sự phát triển rễ của hạt cây

thuốc lá chuyển gen và ít chịu tác động từ môi trường bên ngoài Các kết

quả nghiên cứu cho thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong

việc phát triển rễ của cây đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của

rễ chính và rễ thứ cấp [38]

Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko

Watanabe và đtg (2011) nhận thấy: Cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế liên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán Ví dụ: Các cơ thể thực vật

có thể thích ứng với hạn hán bằng cách phát triển rễ cọc theo chiều dài vươn tới các lớp đất sâu hơn để hút nước dễ dàng hơn Ngoài ra hệ thống rễ con phát triển mở rộng theo bề ngang có thể thích ứng tốt với việc tìm kiếm dinh dưõng khoáng và nước trong lòng đất Mặt khác việc hạn chế tăng trưởng bề mặt lá cũng là một yếu tố tích cực trong điều kiện môi trường bất lợi để giảm thiểu diện tích bề mặt lá hạn chế sự bay hơi nước [30]

1.3.3 Biện pháp công nghệ sinh học trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương

Chuyển gen

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu thành công trên nhiều đối tượng cây trồng như chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng hoá chất, xung điện,

súng bắn gen, chuyển gen bằng vi tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng ủ dung dịch hạt khô và dung dịch DNA Hai phương pháp chuyển gen thành công nhất là chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen

gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen ở thực vật trong việc nâng cao tính chịu hạn đã đạt được kết quả ở nhiều loài cây khác nhau

như lúa, Arabidopsis thalian, bạch dương Tuy nhiên những kết quả nghiên

cứu tương tự ở đậu tương là còn khá mới mẻ không chỉ ở điều kiện Việt Nam

mà còn ở cả trên thế giới Các ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực

vật chủ yếu tập trung ở một số tính trạng chống chịu bệnh và năng suất (Subramanian và đtg 2005; Trần Thị Cúc Hoà 2008) Ngoài ra cũng phải kể đến ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở đậu tương nhằm tạo ra thư viện các dòng đậu tương mang T-DNA phục vụ cho nghiên cứu các chức năng gen Có thể nhận định rằng tính khả thi và tiềm năng ứng dụng phương pháp chuyển gen thực vật trong vấn đề nâng cao tính chịu hạn của cây đậu tương tại Việt Nam

là rất cao do các yếu tố sau: 1) Các gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn ở cây đậu tương trồng tại Việt Nam đã được tách dòng và nghiên cứu chi tiết ở cây mô hình thuốc lá ( Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg 2010); 2) đối với các giống đậu tương trồng ở Việt Nam đã được tối ưu và thiết lập (Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg 2009); Đây là những cơ sở thuận lợi đối với các nghiên cứu tạo cây đậu tương chịu hạn trồng tại Việt Nam trong thời gian ngắn nhất [4], [7]

Chọn dòng tế bào bằng công nghệ tế bào thực vật

Cơ sở của chọn dòng tế bào ở thực vật là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành cơ thể mới hoàn chỉnh Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào có thể được xem là quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra sự thay đổi về kiểu gen và kiểu hình và tuổi Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào còn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn lọc được những tính trạng mong muốn.(Lê Trần Bình và đtg, 1997; Lê Trần Bình và đtg, 1998; Nguyễn Đức Thành, 2000) Trong quá trình sử dụng hệ thống nuôi cấy trong chọn dòng tế bào tuỳ theo đối tượng cây trồng và mục đích chọn dòng mà có thế chọn lựa một trong các hệ thống nuôi cấy sau đây: Nuôi cấy mô sẹo( Callus), Nuôi cấy tế bào huyền phù và nuôi cấy tế bào trần Trong quá trình nuôi cấy

có thể dùng một trong các phương thức sau đây chọn dòng tế bào là: Chọn trực tiếp, chọn gián tiếp và chọn tổng thể [1], [2]

Có nhiều nghiên cứu đã thành công khi tạo ra các dòng cây chịu nóng chịu hạn, chịu lạnh đã được công bố và ứng dụng trong sản xuất Ở Viện Công nghệ sinh học đã tạo được hai giống lúa là DR1 và DR2 vừa có khả năng chịu lạnh, chịu hạn bằng nuôi cấy invitro Cả tính chịu hạn chịu lạnh và chịu nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt protein mới (Đinh Thị Phòng, 2001) chọn dòng chống chịu với các stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tác giống cây trồng Ngày nay nhờ sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử với việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống,

kỹ thuật này ngày càng được áp dụng rộng rãi và có hiệu quả Các nghiên cứu chọn dòng đậu tương chịu hạn ở Việt Nam cũng đã được tiến hành nhưng đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu Những kết quả thu được mới chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương thu thập được từ các tỉnh thành khác nhau thông qua các chỉ tiêu như chất lượng hạt, khả năng sống sót và phục hồi sau các thí nghiệm gây hạn nhân tạo và hàm lượng proline tích luỹ trong điều kiện gây hạn ở các giống đậu tương nghiên cứu này (Nguyễn Thị Thuý Hường, 2006 và 2008) Mặc dù vậy những nghiên cứu theo hướng này cũng rất có triển vọng đối với việc cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu cho những nghiên cứu sâu hơn theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn của đậu tương bằng phương pháp chọn dòng tế bào thực vật.[7], [16], [15]

1.3.4 Expansin và gen expansin ở cây đậu tương

1.3.4.1 Expansin

Expansin là một họ protein có chức năng mở rộng thành tế bào và đã được coi là loại protein chủ yếu có ảnh hưởng đến việc kéo dài tế bào rễ ở

thực vật Lee và đtg (2003) lần đầu tiên đã xác định được gen expansin ở cây

đậu tương (Glycine max)- GmEXP1 có thể đóng vai trò trong sự kéo dài

rễ Mức độ biểu hiện của GmEXP1 rất cao trong rễ của mầm 5 ngày tuổi Hơn nữa, mRNA của gen GmEXP1 được tìm thấy nhiều nhất ở vùng gốc rễ và

vùng tế bào kéo dài, nhưng khan hiếm trong miền sinh trưởng của rễ Kết quả

lai tại chỗ cho thấy GmEXP1 có nhiều ở các tế bào biểu bì là các lớp tế bào cơ bản trong rễ sơ cấp và thứ cấp Gen GmEXP1 biểu hiện đã đẩy nhanh tốc độ kéo dài rễ của cây thuốc lá biến đổi gen (Nicotiana tabacum) ở điều kiện thiếu nước cực đoan Những kết quả thí nghiệm đã cho thấy gen GmEXP1 giữ vai

trò quan trọng trong sự phát triển rễ đậu tương, đặc biệt là trong sự kéo dài, hoặc bắt đầu ở thời điểm hình thành các rễ sơ cấp và thứ cấp [38]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng expansin chủ yếu được xem xét như là một tác nhân chính trong sự kéo dài thành tế bào, trong khi các chất khác cũng có thể sửa đổi cấu trúc vách tế bào và hỗ trợ sự kéo dài của vách tế bào Tuy nhiên, vai trò chức năng của expansin trong sự kéo dài tế bào mới chỉ được nghiên cứu trong ống nghiệm mà ít thấy công trình nghiên cứu ở cơ

thể tự nhiên (Link và Cosgrove, năm 1996, Fleming et al, 1997) Mặc dù cơ

sở phân tử của sự hoạt động thay đổi vách tế bào của expansin vẫn còn chưa được sáng tỏ, nhưng hầu hết các bằng chứng đều cho thấy expansin là nguyên nhân gây ra sự dãn dài tế bào bằng cách nới lỏng các liên kết hydro giữa các microfibrils cellulose và mạng lưới polymer (McQueen-Mason và Cosgrove,

1994 ; Cosgrove, 1997 ).Kể từ lần đầu tiên nhân bản gen expansin được công

bố bởi Shcherban et al (1995)và cho đến nay các gen expansin đã được nhiều tác giả phân lập từ một loạt các loài thực vật.Các gen expansin phân bố

ở ba phân họ, được gọi là α, β, và γ (Li et al, 2002) α-expansins chiếm phần

lớn của expansin, bao gồm cả những gen phân lập từ cà chua ( Lycopersicon

esculentum ;Keller và Cosgrove, năm 1995), lúa gạo (Oryza sativa ; Cho và

Kende, 1997), yến mạch (Avena sativa ; Li et al, 1993), và cây Arabidopsis ( Cosgrove, năm 1998 , Li et al, 2002 ). Theo đề nghị của Cosgrove (1998) thì phân họ α-expansin có thể được chia thành các nhóm A, B, C, và D Mô hình biểu hiện của gen α-expansin đã được nghiên cứu rộng rãi ở cây lúa nước (Cho và Kende, 1997 ) và cà chua (Reinhardt et al, 1998 ; Brummell et al,

1999 ) Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen OsEXP4 ở cây lúa nước cho

thấy sản phẩm biểu hiện của gen expansin đã tăng hàm lượng trước khi bắt đầu mở rộng thành tế bào và hỗ trợ việc kéo dài tế bào (Cho và Kende, 1998) Ở cà chua, biểu hiện củagen LeEXP18 đã được khu vực hoá ở một nhóm các tế bào trong mô phân sinh chồi ngọn (Reinhardt et al., 1998) Như

vậy, sự biểu hiện các LeEXP18 được coi như là một dấu hiệu phân tử trong

sự hoạt động của lá cây, dự đoán có thể được phát hiện trong mô phân sinh đỉnh chồi (Reinhardt et al, 1998) Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng biểu

hiện LeEXP18 không tương quan với mức tăng trưởng kéo dài và một số gen

expansin ở cà chua lại biểu hiện trong quá trình phát triển của quả, như vậy không phải tất cả các expansin đều tham gia trong quá trình giãn dài của tế bào (Brummell et al, 1999; Caderas et al, 2000; Rose et al, 2000) Sự phức tạp của họ expansin thể hiện ở chỗ các expansin khác nhau có thể đóng vai trò khác nhau ở các loại tế bào trong quá trình phát triển các cơ quan bộ phận của cây (Rose et al, 1997; Reinhardt et al, 1998) [20], [24], [25], [31], [32], [37], [38], [39], [40], [42], [47], [48], [49], [50]

1.3.4.2 Gen GmEXP1 ở cây đậu tương

Sự kéo dài tế bào gây ra bởi môi trường có tính axit và expansin với vai trò mở rộng thành tế bào đã tìm thấy ở tảo, rêu, dương xỉ, cây hạt trần và cây hạt kín, cho nên có thể coi expansin giữ vai trò trong việc làm giãn dài tế bào

(Cosgrove, 1996) GmEXP1, GmEXP2 và expansins khác trong họ expansin

có độ tương đồng cao, chỉ khác ở hàm lượng acid amin (http://www.plantphysiol.org ) Nhiều gen đã được phân lập từ một loạt các loài thực vật và kết quả thu được đã chỉ ra rằng chúng tạo thành một họ expansin multigene (Cosgrove, 1998 ) Li et al.(2002) và gần đây đã phân loại expansin thành ba phân họ α-, β-và γ-expansin, dựa trên mối quan hệ phát sinh loài của chúng Link và Cosgrove (1998) cũng đã phân loại trước đó các phân họ α-expansin thành bốn nhóm Phân tích sự phát sinh loài Lee và đtg

chỉ ra rằng GmEXP1 thuộc nhóm D, trong đó bao gồm NtEXP3 ( Link và

Cosgrove, năm 1998 ), OsEXP1 (Cho và Kende, 1997 ), và CsEXP2

( Shcherban et al., 1995 ), trong khi GmEXP2 thuộc nhóm A, trong đó bao

gồm AtEXP6 (Shcherban et al, 1995), PsEXP1 ( Michael, năm 1996 ), và LeEXP18 ( Reinhardt et al, 1998 ; http://www.plantphysiol.org ) Các trình tự bảo tồn cao giữa các expansins khác nhau từ các cây một lá mầm và hai lá mầm, chẳng hạn như lúa, dưa chuột, Arabidopsis, hạt đậu, và đậu tương, có thể hỗ trợ một số điểm quan trọng: (a) Các họ gen expansin đã phát sinh bởi gen nhân bản trước khi phân kỳ tiến hóa của cây một lá mầm và cây hai lá mầm khoảng 150 triệu năm trước, (b) protein expansin có vai trò sửa đổi cấu trúc trong khi có thể duy trì chức năng; và (c) các chức năng của chúng là rất quan trọng để phát triển bình thường và sinh lý của cây hạt kín (Shcherban et

al, 1995 ) Kết quả nghiên cứu của Lee và đtg (2008) khi phân tích RNA

bằng Northern blot cho thấy rằng gen GmEXP1 được biểu hiện mạnh ở rễ, đặc

biệt khi quá trình hình thành các rễ chính và rễ phụ Hơn nữa, ở mầm 5 ngày tuổi, sự tăng trưởng của rễ chính giảm và các rễ phụ lai được phát triển

mạnh Những kết quả nghiên cứu cho rằng gen GmEXP1 có liên quan đến sự kéo dài rễ cây đậu tương Phân tử mRNA của gen GmEXP1 thường được các

khu vực hóa với các lớp tế bào biểu bì và nằm dưới ở vùng kéo dài của rễ sơ cấp ở đậu tương

Kết quả các thí nghiệm khác cũng chỉ ra rằng gen GmEXP1 chủ yếu thể

hiện ở các vùng phân chia tế bào và kéo dài của rễ sơ cấp và thứ cấp Kết quả

lai tại chỗ cho thấy GmEXP1 xuất hiện nhiều ở vùng gốc rễ sơ cấp và thứ cấp Gen GmEXP1 biểu hiện ở các tế bào trong lớp biểu bì và các lớp tế bào

cơ bản của khu vực kéo dài của rễ chính Các kết quả nghiên cứu về gen

GmEXP1 đã gợi ý rằng sự biểu hiện của gen GmEXP1 xảy ra trong thời gian

và không gian xác định của quá trình phát triển của rễ cây đậu tương

Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tương vẫn chưa được làm sáng tỏ mặc dù đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu Tuy nhiên, hướng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều hành các hoạt động kéo dài và trưởng thành của cây cũng sẽ được quan tâm (Hasenstein và Evans, 1988) Hầu hết sự gia tăng chiều dài rễ bắt đầu từ sự kéo dài tế bào ở vùng sinh trưởng của rễ Ban đầu thể hiện rõ ở các rễ sơ cấp, sau đó thì sự

biểu hiện này giảm dần và cây càng lớn sự biểu hiện của Gm EXP1 càng thấy

rõ rệt ở khu vực rễ thứ cấp [21], [22], [28], [29], [34], [38], [39], [41], [43], [47], [48], [49]

Phân tích trình tự nucleotid của gen GmEXP1 cho thấy gen GmEXP1 có

số lượng nucleotid 1089 bp, từ vị trí nucleotid thứ 1 đến 1089, vùng mã hóa

có 768 nucleotid từ nucleotide 52 đến nucleotide 819 (Lee và đtg, 2003) (Hình 1.1)

Hình 1.1 Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tương

Sơ đồ ở hình 1.2 trình bày về gen GmEXP1 và protein với hai vùng

chức năng của protein EXP1 ở cây đậu tương là DPBB và Pollen allerg

Hình 1.2 Sơ đồ về gen và protein EXP1 ở cây đậu tương

Gen GmEXP1 có kích thước phân tử là 1089 bp, mã hóa cho 255 acid

amin, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 255

1 mgkimlvlgs liglccftit tyafspsgwt nahatfyggs dasgtmggac gygnlyatgy

61 gtrtaalsta lfndgascgq cykiicdyks dsrwcikgrs vtvtatnfcp pnfalpnnng

121 gwcnpplkhf dmaqpaweki giyrggivpv lfqrvpckkh ggvrfsvngr dyfelvlisn

181 vggagsiqsv fikgsktgwm amsrnwgsnw qsnaylngqs lsfrvtttdg etrvfqdivp

241 vswtfgqtfs spvqf

Hình 1.3 Trình tự amino acid do gen GmEXP1 mã hoá

Khi phân tích về trình tự chuỗi protein EXP1, chúng tôi nhận thấy

protein này chứa một vùng bảo thủ DPBB và vùng Pollen allerg Vùng DPBB

có 91 amino acid, từ vị trí amino acid 64 đến 152 (Hình 1.3) DPBB là một

vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có cấu trúc bởi hai chuỗi dạng

cuộn gấp kiểu beta (DPBB) Chức năng của RlpA đến nay vẫn chưa được làm

rõ, nhưng hoạt động của nó đã được chứng minh như một chất kìm hãm sự

phát sinh đột biến ở E.coli Khúc cuộn DPBB thường là một miền enzyme và

các thành viên của họ DPBB là khá đa dạng và mỗi dạng DPBB có thể có một

số chức năng khác nhau

Hình 1.4 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1

Vùng Pollen allerg có 77 amino acid từ vị trí amino acid số 163 đến vị trí amino acid 240 (Hình 1.4)

Hình 1.5 Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc không gian vùng Pollen allerg của protein EXP1

Như vậy việc nghiên cứu về gen GmEXP1 làm cơ sở nghiên cứu cơ chế

kháng hạn của cây đậu tương, tạo tiền đề nghiên cứu biện pháp công nghệ nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của cây đậu tương và nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm đậu tương Việt Nam