NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ

DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY

ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC

LUẬ N VĂ N THẠ C SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2019

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔ NG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thu Thủy

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ

DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY

ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8420114

LUẬ N VĂ N THẠ C SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hướng dẫn 1: PGS.TS Khuất Hữu Trung Hướng dẫn 2: PGS.TS Đồng Văn Quyền

Hà Nội - 2019

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân

tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Khuất Hữu Trung và PGS.TS Đồng

Văn Quyền Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung

thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Hà Nội, tháng năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Thủy

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung – Phó viện trưởng – Viện Di truyền Nông nghiệp và PGS.TS Đồng Văn Quyền – Phó viện trưởng – Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình giúp đỡ,

hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện

Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc đề tài: “Khai

thác và Phát triển nguồn gen cây Óc chó (Juglans regia Linn) tại Lai Châu và

một số tỉnh miền núi phía Bắc”, mã số NVQG-2016/15 do TS Nguyễn Toàn

Thắng làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cám ơn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn

bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Thủy

AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

ISSR Inter simple sequence repeat

ITS Internal Transcribed Spacer

PCR Phản ứng nhân theo chuỗi

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid

SSR Simple sequence repeats

SCAR Sequence Characterised Amplification Regions

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của các mồi ITS 20Hình 3.1:DNA tổng số của 26 mẫu Óc chó 29Hình 3.2: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 26 mẫu Óc

chó (M1KB: Marker ladder 1Kb; H2O: Đ/c âm) 30

Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương ứng với 4 loại nucleotid của mẫu Óc chó HG02, HG05 và HG18 32Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 26 trình tự ITS1-5,8SrRNA-ITS2 của 26 mẫu Óc chó và mẫu tham chiếu AF399876.1 42Hình 3.5: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 26 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu AF399876.1 46

Bảng 1.1: Các hợp chất của cây Óc chó Anh (Juglans regia) 9

Bảng 2 1: Danh sách 26 mẫu Óc chó 23

Bảng 2 2: Danh sách các mồi ITS (White và cộng sự, 1990) 25

Bảng 2 3: Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 2 4: Chu trình phản ứng PCR 27

Bảng 3 1: Độ dài các trình tự thuộc 26 mẫu Óc chó nghiên cứu và mẫu tham chiếu AF399876.1 33

Bảng 3 2: Thành phần bốn loại nucleotide của 26 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu AF399876.1 34

Bảng 3 3: Hệ số tương đồng di truyền giữa 26 mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu AF399876.1 vào trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 44

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ÓC CHÓ 6

1.1.1 Nguồn gốc và phạm vi phân bố của cây Óc chó 6

1.1.2 Đặc điểm thực vật học và thành phần hóa học trong hạt của cây óc chó 8

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phạm vi phân bố 11

1.1.4 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế 13

1.2 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN LOẠI THỰC VẬT 14

1.2.1 Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái 14

1.2.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử 15

1.2.2.1 Các Marker phân tử dựa trên DNA 15

1.2.2.2 Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật 17

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN ÓC CHÓ 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU 23

2.2 HÓA CHẤT 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 25

2.3.2 Thành phần của 1 phản ứng PCR 26

2.3.3 Chương trình chạy PCR 26

2.3.4 Phương pháp điện di trên agarose 27

2.3.5 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 27

2.3.6 Giải trình tự 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA 29

3.2 KẾT QỦA PCR VÀ TINH SẠCH CÁC SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI 30

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VÙNG TRÌNH TỰ ITS1-5,8SrRNA-ITS2 Ở CÁC MẪU NGHIÊN CỨU 30

3.4 KẾT QỦA SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÙNG ITS1 5,8SrRNA - ITS2 CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU 36

3.5 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY QUAN HỆ PHÁT SINH GIỮA 26 MẪU NGHIÊN CỨU 43

3.6 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ PHÂN BIỆT 26 MẪU ÓC CHÓ NGHIÊN CỨU 49

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

4.1 KẾT LUẬN 55

4.2 KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 26 MẪU ÓC CHÓ NGHIÊN CỨU 62

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây Óc chó có tên khoa học là Juglans regia Linn, phân bố rộng rãi

trên khắp thế giới, được trồng thương mại khắp miền Nam châu Âu, Bắc Phi, Mỹ, Tây Nam Mỹ và Đông Á như một cây cho nhiên liệu điezen sinh học Trên thế giới, ngành sản xuất hạt Óc chó có doanh thu ước tính gần 10

tỷ USD trong năm 2011 (tính theo số lượng của FAO với giá là 4 USD/kg) Hoa Kỳ là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới trong khi Trung Quốc nổi lên là một nước quan trọng về cả sản xuất và tiêu dùng Tính từ năm 2000, tổng sản lượng hạt óc chó toàn cầu đã tăng đều đặn về khối lượng Tới năm 2010, sản lượng đạt 2,55 (triệu tấn), gần gấp đôi 1,29 (triệu tấn) sản lượng năm

2000 Tại Việt Nam, năm 2011 có 22.000 tấn hạt óc chó được tiêu thụ và chủ yếu từ nhập khẩu.[1]

Cây Óc chó được ưa chuộng bởi nó đem giá trị thương mại, thẩm mỹ

và quan trọng hơn hết là nó đem lại giá trị dinh dưỡng cho con người Quả

óc chó và các sản phẩm từ óc chó có tính phổ biến cao như một siêu thực phẩm có lợi cho sức khỏe vì chúng chứa chất chống oxy hóa, hàm lượng chất béo, protein, vitamin và khoáng chất cao Quả óc chó có tác dụng giảm nguy cơ tim mạch, bệnh tim mạch vành, điều trị đái tháo đường tuýp II, phòng ngừa và điều trị một số bệnh ung thư, và giảm các triệu chứng do rối loạn thần kinh và tuổi tác Ngoài ra, cây Óc cho tăng cường sự phát triển trí thông minh của não bộ, phòng và hỗ trợ bệnh ung thư, phòng chống loãng xương, giảm stress, giảm mất ngủ, tăng cường chất lượng tinh trùng, ổn định đường huyết, giảm cholesterol trong máu Các bộ phận của cây đều được sử dụng như một vị thuốc trong y học cổ truyền, điển hình như lá được sử dụng

để điều trị đau thấp khớp, sốt, tiểu đường, bệnh ngoài da và hoa được sử dụng để điều trị đau thấp khớp và sốt rét Gỗ của một số loài óc chó được đánh giá cao về màu sắc, độ cứng và độ bền cao nên được sử dụng làm đồ nội thất, sàn nhà và nhiều vật dụng đặc biệt khác như súng săn

Việc nghiên cứu, phát triển và trồng cây Óc chó không chỉ cải tạo môi

trường mà còn đem lại giá trị kinh tế cho vùng cao, cây Óc chó có thể được khuyến khích trồng xen trong các hệ thống nông lâm kết hợp để giải quyết những thách thức của du canh và độc canh cây lương thực ngắn ngày tại miền núi phía Bắc Vì vậy, để góp phần nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây

óc chó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng chỉ thị ITS để đánh giá quan hệ di truyền và nhận dạng một số m ẫu giống cây Óc chó thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc”

2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là 26 mẫu giống cây Óc chó được thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc: huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang; huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai; huyện Sỉn Hồ và huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu do Viện Nghiên cứu Lâm sinh cung cấp

- Thời gian thu mẫu: tháng 8/2018

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2018 đến tháng 2/2019

- Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn

Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

3 Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các mẫu cây Óc chó thu được, là cơ sở để phân loại, tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới Các marker phân tử nhận biết chính xác một

số nguồn gen Óc chó quý được sử dụng để xác định tính đúng giống phục vụ

công tác nhân giống và kiểm soát cây con giống ở giai đoạn sớm

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Óc chó thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc

Kết quả đề tài góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen Óc chó của Việt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới, chuẩn hóa nguồn

cây giống góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm Óc chó của Việt Nam ở khu vực và trên thế giới

Kết quả của luận văn là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ÓC CHÓ

1.1.1 Nguồn gốc và phạm vi phân bố của cây Óc chó

Cây óc chó có tên khoa học là Juglans regia, tên tiếng anh là Walnut, tên

Latinh là Gallica Đây là một loài cây có giá trị cao về chất lượng gỗ và hạt

lưỡng bội, với dạng karyotype 2n = 2x = 32 (Woodworth,1930[4]; Komanich,

I G., 1982 [5]) Óc chó là một trong những loài sản xuất hạt được trồng lâu đời nhất trong lịch sử loài người và được trồng ở hầu hết các phần ôn đới của bán cầu bắc Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về nguồn gốc của cây

Óc chó, nhưng các nhà nghiên cứu cho rằng óc chó có nguồn gốc từ Hy Lạp

và bán đảo Balkan (Polunin, 1977 [6])

Vào thế kỷ thứ IV trước công nguyên, Óc chó có nguồn gốc từ Iran và vùng Trung Á đã được gây trồng tại Nam Tư và Hy Lạp Những giống đầu tiên này đã được lai tạo thành các giống tốt hơn và kể từ đó nó được gây trồng rộng rãi trên khắp châu Âu và Bắc Phi Sau đó vào thời kỳ Trung cổ những giống này lại được mang về trồng tại Thổ Nhĩ Kỳ Một số nguồn gen

óc chó được cho là du nhập và gây trồng tại Trung Quốc cách đây 2000 năm

và hiện nay tại một số vùng nó được xem như là phân bố tự nhiên tại đây Bên cạnh đó Óc chó được cho là du nhập và gây trồng tại châu Mỹ vào thế

kỷ 17 Những nước gây trồng phổ biến Óc chó hiện nay bao gồm Pháp,

Serbia, Hy lạp, Rumani, Hungari, Trung Quốc, Mỹ, Chi Lê, New Zealand và miền Đông Nam châu Úc Như vậy, hiện nay Óc chó đã được gây trồng từ 30° - 50° vùng Bắc bán cầu và 30° - 40° vùng Nam bán cầu bao gồm rất nhiều giống khác nhau cho hạt to và vỏ hạt mỏng, chịu được các điều kiện khắc nghiệt, thích nghi với điều kiện tự nhiên, đất đai thổ nhưỡng tại các khu vực gây trồng

Cây Óc chó có hai loài phổ biến nhất chi đó là óc chó Ba Tư (Juglans regia) và óc chó Đen (Juglans nigra) Óc chó Ba Tư hay còn gọi là óc chó

Anh Quốc là loài nổi tiếng và được biết đến nhiều Loài này có nguồn gốc từ vùng Balkan ở Đông Nam Châu Âu, Tây Nam và Trung Á đến dãy Himalaya và Tây Nam Trung Quốc và được mở rộng sang Hoa Kỳ bởi những người định cư Anh Ngoài ra, Óc chó Anh Quốc cũng được tìm thấy rải rác ở khắp Châu Âu và Châu Á, chúng được trồng rộng rãi để sản xuất các loại hạt có chất lượng tốt Óc chó Đen là một loài phổ biến ở miền đông Bắc Mỹ và cũng được trồng rộng rãi ở một số nơi khác Cả hai đều là cây rụng lá (lá rụng khi ngủ đông) và sống hơn một thế kỷ và được trồng trên toàn thế giới để lấy hạt và gỗ chất lượng cao, được sử dụng rộng rãi trong nội thất, nội thất xe hơi, cửa ra vào và ngành công nghiệp súng Tuy nhiên, chúng ta có thể nói rằng quả óc chó Anh được trồng nhiều hơn cho các loại hạt và cho gỗ ít hơn Mặc dù hạt óc chó Đen có thể ăn được, nhưng hạt nhân nhỏ và vỏ cứng vì thế chúng không được trồng để sản xuất hạt Vì vậy, trồng cây Óc chó đen để lấy gỗ rất phổ biến ở Mỹ và các nước khác và được coi là một lựa chọn đầu tư sẽ mang lại lợi nhuận lớn trong dài hạn (hai hoặc ba thập kỷ sau khi trồng cây) Óc chó Đen cho gỗ tốt màu tối và cứng nên loài này được đánh giá cao về khả năng đem lại giá trị kinh tế Óc chó Anh và óc chó Đen đều đem lại giá trị thương mại; óc chó Anh cho gỗ và các loại hạt,

óc chó Đen cho gỗ Óc chó đen có thể đạt chiều cao 100-120 feet (30-37 mét), trong khi Óc chó Anh trung bình đạt chiều cao 80 feet (25 mét) khi trưởng thành Cây Óc chó đen và Óc chó Anh đều sản sinh các hóa chất độc hại cho nhiều loại cây (cà chua, khoai tây, cỏ linh lăng, quả việt quất, táo và nhiều loại khác)

Mặc dù cây Óc chó (Carya tongkinensis) không có nguồn gốc từ Việt

Nam nhưng theo ông Vũ Văn Dũng, một chuyên gia trong thụ mọc học, chúng có thể được tái sinh tự nhiên tại các khu vực miền núi phía Bắc của Việt Nam như Cao Bằng, Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang Điều này được cho thấy quả óc chó tại Việt Nam là thuộc giống tương tự như óc chó Anh phát triển trong khu vực Himalaya và Tây Nam của Trung Quốc

1.1.2 Đặc điểm thực vật học và thành phần hóa học trong hạt của cây óc chó

Cây Óc chó thuộc dạng cây lớn, cây trưởng thành có thể đạt độ cao 25–35m, bán kính thân cây có thể lên đến 2m, thân cây mập, ngắn nhưng tán cây thì rất rộng để giành được lợi thế cạnh tranh về ánh sáng trong các khu rừng Cây trưởng thành đặc trưng có thân dài, thường không có nhánh thấp

Vỏ cây óc chó có màu nâu xanh và mịn khi cây còn non, trở nên xám và xuất hiện vết nứt khi cây già đi Cây óc chó có rễ to và sâu tạo ra chất gọi là juglones ngăn chặn sự phát triển của các cây khác ở gần

Tùy thuộc vào vĩ độ, hoa óc chó thường bắt đầu xuất hiện vào khoảng giữa tháng 4 cho đến đầu tháng 6 Sự ra hoa và ra lá xảy ra gần như cùng lúc

và luôn đủ sớm để tránh thiệt hại bởi sương giá cuối mùa xuân Lá óc chó to hình lông chim dài tới 40cm, kép lông sẻ, thường có từ 7 đến 9 lá chét, không cuống, hình trứng thuôn hoặc tròn dẹt một phía, khi vò ra có mùi hăng đặc biệt Hoa đơn tính, màu lục nhạt, hoa đực xếp thành đuôi sóc thõng xuống, hoa cái xếp 2 đến 5 cái ở cuối các nhánh Hoa đực phát triển từ các chồi không lá từ năm trước, chúng có chiều dài khoảng 10 cm (3,9 inch) và

có nhiều hoa nhỏ Hoa cái xuất hiện trong một cụm ở đỉnh của các chồi lá vào năm sau

Quả chín ăn được vào tháng 9 hoặc tháng 10 cùng năm và giảm ngay sau khi lá rụng Quả của cây óc chó có hình tròn, khi chín sẽ tự động khô lại

và nứt ra để lộ hạt bên trong, mỗi quả óc chó chỉ cho 1 hạt duy nhất Quả hạch to có vỏ ngoài màu lục và nạc, dễ hoá đen khi chà xát, vỏ quả bên trong hay vỏ của hạch rất cứng, có 2 van bao lấy hạt với 2 lá mầm to, chia thuỳ và nhăn nheo như nếp của óc động vật

Tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như vị trí địa lý, nhiệt độ, thời gian và các yếu tố khác, mỗi cây Óc chó có thành phần hóa học khác nhau ở các quốc gia khác nhau Ngày nay, các bộ phận khác nhau của cây Óc chó như lá, vỏ cây và trái cây đều được sử dụng trên thế giới Các nhà nghiên cứu cho rằng các hợp chất hóa học được tìm thấy trong quả óc chó là khác nhau ở các vùng khí hậu khác nhau Các hợp chất hóa học của các phần khác nhau của quả óc chó được thể hiện trong Bảng 1.1

Bảng 1.1: Các hợp chất của cây Óc chó Anh (Juglans regia)

Lá Phenolic acids, tannins, esential faty acids, ascorbic

acid, flavonoids, caffeic acid, paracomaric acid, juglone

Vỏ xanh của quả Emulsion, glucose, organic materials such as citric

acid, malic acid, phosphate và calcium oxalate

Quả Óc chó Fatty acids, tocopherols, phytosterols, total phenolic

(tannin)

Zahoo báo cáo rằng 17 hợp chất đã được xác định trong lá óc chó; 9 trong số đó là epicatechin, syringetin-o-hexoside, myricetin-3-o-glucoside, myricetin-3-o-pantocid, aesculetin, taxifolin-pantocid, quercetin glucuronide, kaempferol loại cây này có chứa axit phenolic, tannin, axit béo thiết yếu (axit linoleic là axit béo chính), axit ascobic, flavonoid, axit caffeic

và axit paracomaric Các flavonoid quan trọng nhất trong lá óc chó bao gồm các dẫn xuất quercetin galactoside và quercetin pantocid, quercetin arabinoside, quercetin xyloside và quercetin rhamnoside Ngoài ra, Shah và các cộng sự cũng sàng lọc phytochemical của chiết xuất lá thô có sự hiện diện của carbohydrate, glycoside tim, phenolics, flavonoid, alkaloids, protein, steroid và tannin Amaral và cộng sự đã nghiên cứu có các hợp chất phenolic bao gồm axit 3- và 5-caffeoylquinic, axit 3- và 5-p-

coumaroylquinic, quercetin 3-galactoside, dẫn xuất quercetin 3-pantocide, quercetin 3-arabinoside, quercetin-quercetin và quercetin 3-rhamonocide trong lá óc chó Quercetin 3-galactoside là thành phần chính trong số các hợp chất được đề cập Ngoài ra, đã có nghiên cứu cho rằng lá của cây Óc chó có chứa dẫn xuất naphthalene, đặc biệt là 5- hydroxy-1-4-naphthoquinone Juglone (5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone) là một hợp chất naphthoquinone được tìm thấy trong lá tươi và vỏ xanh của quả óc chó Juglone là thành phần rõ ràng nhất trong các cơ quan khác nhau của cây

Óc chó, với trọng lượng phân tử là 174,16 và công thức C10H5O2-(OH), tiền chất là một glycoside được tìm thấy như một hợp chất trong các bộ phận trên không của cây, đặc biệt là lá, sau đó được chuyển thành juglone thông qua quá trình thủy phân Juglone là một chất kiềm được hòa tan nhẹ trong nước nóng và vừa phải trong rượu; do đó, nó có thể là một trong những hợp chất hiệu quả trong lá óc chó vì các chất khác trong lá của quả óc chó thường tan trong nước hoặc tan trong chất béo Vỏ xanh của quả óc chó có nhũ tương, glucose và các vật liệu hữu cơ như axit citric, axit malic, phốt phát và canxi oxalate Hợp chất Juglone và phenolic là những hợp chất quan trọng nhất được tìm thấy trong lá và vỏ xanh của quả óc chó Juglone, là một hợp chất độc hại, chỉ được tìm thấy trong quả óc chó tươi và xanh Vỏ xanh quả óc chó có sản phẩm phụ với ít công dụng

Quả óc chó có chứa các thành phần hóa học đa dạng, bao gồm

diarylheptanoids, quinones, polyphenol, flavon và terpenes Các diarylheptanoids và quinones có hoạt tính chống ung thư đáng chú ý, cung cấp các hợp chất chì mới để điều chế các thuốc chống ung thư Các hoạt động giảm đau, chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư mạnh của các loại cây này là đáng kể Hơn thế nữa là quả óc chó chứa hàm lượng dinh dưỡng cao như Omega-3, protein quả óc chó chứa 24% protein, 12% –16% carbohydrate, 1,5% –2,0% cellulose, và 1,7% –2,0% khoáng chất, chất xơ, Photpho, Kali, Magie, Canxi, Sắt và Các Vitamin, đặc biệt là hàm lượng Omega-3 cao gấp 5 lần cá hồi

1.1.3 Đặc điểm sinh thái và phạm vi phân bố

Cây óc cho phù hợp trồng ở độ cao từ 1,000 đến 2,000m so với mực nước biển Cây óc chó là một loại cây rất kén đất và yêu cầu điều kiện khí hậu phải phù hợp Cây óc chó phát triển tốt nhất ở những vùng có khí hậu ôn hòa, không quá nóng và điều kiện thổ nhưỡng phải tốt, gần nguồn nước để đảm bảo cho ra chất lượng hạt đồng đều cả về kích thước lẫn dinh dưỡng

- Khí hậu, nhiệt độ: Cây Óc chó thích hướng về ánh nắng mặt trời,

khí hậu ấm áp, có thể chịu nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 20 – 30 oC Trong mùa sinh trưởng cần phải cung cấp nhiệt độ ấm áp cho cây với ít nhất 6 tháng có nhiệt độ trung bình hơn 10oC Cây Óc chó rất nhạy cảm với thời tiết quá nóng và quá lạnh vào mùa hè và mùa đông Óc chó rất nhạy cảm với mùa đông và sương giá của mùa xuân Cành non và hoa dễ dàng bị hư hại do sương giá mùa xuân ở nhiệt độ 1oC; sương giá trong mùa thu có thể ảnh hưởng đến các chồi chưa phát triển Tuy nhiên, trong thời kì ngủ đông, cây Óc chó có thể chịu được thời tiết lạnh -11oC

- Đất đai, thổ nhưỡng: Óc chó đòi hỏi đất sâu và phong phú

(Jacamon, 1987[7]), và để phát triển tốt, loài này phải được trồng trong đất sâu hơn 80-100 cm (Becquey,1997 [8]) Các loại đất tốt nhất cho Óc chó canh tác là loams (đất sét> 25%, phù sa 30- 50% và cát 30-50 %) Hàm lượng đất sét lý tưởng nhất phải nhỏ hơn 35% và lưu lượng mưa càng nhiều, lượng đất sét càng ít dung nạp (Giannini và Mercurrio, 1997 [9]) Ở miền trung nước Ý

sự gia tăng diện tích cơ bản tốt nhất cho các loài đã được tìm thấy trong đất

có hàm lượng sét nằm trong khoảng từ 15 đến 25% (Fratteggiani và cộng sự,

1996 [10]) Óc chó không thích đất ngập nước, đất nông và đất có canxi tự do (Boudru,1989[11]) Giá trị pH đất lý tưởng nằm trong khoảng từ 6,5 đến 7,5 (Becquey, 1997[8]) hoặc theo các tác giả khác trong khoảng từ 6 đến 7.5 (Giannini và Mercurrio, 1997[9]) Để tránh nhiễm clo , Becquey (1997) khuyên trồng cây Óc chó trên đất bề mặt có độ pH cao (8.0-8.5) Vị trí nên tránh là đất cát nhẹ và đất nặng (Klemp , 1979 [12]), đất than bùn

- Nước: Yêu cầu lượng mưa trung bình trong năm khoảng

700-800mm/năm và được phân phối đều trong cả năm (Becquey, 1997 [8]; Bergougnoux and Grospierre, 1981[13] ) Tuy nhiên, cây vẫn có thể chịu được một khoảng thời gian hạn hán với lượng mưa tối thiểu là 100-150mm trong thời gian phát triển của cây (Giannini and Mercurio, 1997 [9])

- Ánh sáng: Óc chó là một loài cây ưa sáng Ánh sáng là yếu tố cần

thiết cho sự phát triển của cây Chỉ có ở dạng cây con và trong đất giàu nitơ, cây chịu được bóng râm Cây non có thể sinh trưởng trong một thời gian ngắn ở điều kiện thiếu ánh sáng, nhưng nếu kéo dài khi cây trưởng thành sẽ xuất hiện các biến dạng không mong muốn Khi cây trưởng thành cần điều kiện ánh sáng đầy đủ để tránh phát triển thân cây quanh co, dẫn đầu đến sự phát triển của gỗ căng hoặc giảm thân cây (Winter, 1982[14] )

Với những điều kiện trên, tại Việt Nam, cây óc chó chỉ có thể trồng và phát triển tốt nhất ở một số vùng núi sát biên giới phía Bắc như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng, Đồng Văn (Hà Giang), Cao Bằng Hiện nhiều dự án nghiên cứu trồng thử nghiệm cây Óc chó cũng chủ yếu được tiến hành ở vùng này Trong cuốn “Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, chương Lâm sản ngoài gỗ” của

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thì cây Óc chó mọc ở độ cao từ 500

- 800 m, có phân bố rải rác từ Thanh Hoá đến Lai Châu, Hà Giang, Lào Cai

Lê Sỹ Doanh và Trần Quang Bảo (2012)[15] khi nghiên cứu kỹ thuật trồng cây Óc chó thấy loài này có thể trồng được ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng, Đồng Văn) và Cao Bằng Nghiên cứu đặc điểm sinh thái cây Óc chó Viện Điều tra Quy hoạch rừng và Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cho thấy loài cây này ít khi mọc thuần loài, mà thường mọc hỗn giao, rải rác trong rừng lá rộng thường xanh hay nửa rụng lá trên đất ẩm, tầng dầy, màu

mỡ và thoát nước tốt với một số loài như Sấu (Dracontomelum duperreanum), Sâng (Pometia pinnata),

Theo Lê Mộng Chân (2000)[16], họ óc chó ở Việt Nam có 5 chi và 8 -

9 loài Trong đó loài óc chó có tên khoa học là Juglans regia có đặc điểm

nhận biết: Lõi cành xếp ngang Lá kép lông chim lẻ, mép lá nguyên Quả hạch, không cánh

Khi nghiên cứu về các loài cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị trong tài liệu “Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, chương Lâm sản ngoài gỗ” năm 2006

thì cây óc chó lại có tên gọi khác là Carya annamocarya

Theo Hoàng Thị Lụa và cộng sự (2014) [1] khi nghiên cứu về thị trường phát triển cây Óc chó tại vùng Tây Bắc Việt Nam Tác giả đưa ra tên

gọi khác cho loài óc chó là Carya tonkinensis

Như vậy, có thể thấy tên khoa học cho loài Óc chó ở Việt Nam chưa được thống nhất giữa các tài liệu Một số tài liệu vẫn còn nhầm lẫn tên khoa học của cây Óc chó với các loài khác cùng họ Hồ đào (Juglandaceae) Do

đó, cần có nghiên cứu làm sáng tỏ tên khoa học của loài Óc chó tại Việt Nam để tránh nhầm lẫn

1.1.4 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Cây Óc chó là một loại cây quan trọng vì mọi bộ phận của cây đều có lợi ích vì vậy óc chó có vị trí đặc biệt trong nền kinh tế xã hội Quả Óc chó rất giàu chất béo, protein, khoáng chất, vitamin và một lượng đáng kể các chất xơ Dầu của hạt óc chó chứa các axit béo chính, như axit oleic, axit linoleic và axit linolenic, được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm công nghiệp

vì nó chứa các đặc tính giữ ẩm và chống oxy hóa Nồng độ omega-3-fatty acids trong quả óc chó có nhiều lợi ích sức khỏe tiềm năng từ bảo vệ tim mạch đến việc thúc đẩy chức năng nhận thức tốt hơn, lợi ích chống viêm, hữu ích trong hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và bệnh viêm ngoài da như eczema và bệnh vẩy nến Quả óc chó còn được sử dụng để điều trị ho, bệnh

dạ dày và ung thư ở châu Á và các nước châu Âu Cây Óc chó là một cái cây thân gỗ thuộc bộ dẻ và gỗ của cây Óc chó được dùng đa dạng để chế tác những sản phẩm nội thất Hiện thị trường hiện giờ rất chuộng những sản phẩm được tạo ra trong khoảng gỗ óc chó như giường, tủ, ghế và các nội thất

gỗ óc chó khác nữa Hiện các sản phẩm nội thất được tạo ra từ cây Óc chó với giá khá cao so với các sản phẩm gỗ khác Điều đó mang lại nguồn thu mang giá trị kinh tế cao cho người trồng cây Óc chó cuối mỗi quá trình thu hoạch Chưa kể là nhiều năm cho thu hoạch trái đem đến nguồn thu đều đặn

thường xuyên cho người trồng cây Óc chó Không những phần thân gỗ của cây Óc chó có giá trị kinh tế mà phần lá của cây Óc chó hứa hẹn cũng mang lại nguồn thu cho người nông dân trồng Hiện lá cây Óc chó sử dụng phổ biến trong lĩnh vực công nghiệp hóa mỹ phẩm, toàn bộ các chế phẩm được chế tạo trong khoảng lá cây Óc chó Trong đông y người ta cũng biết đến lá cây óc chó như một vị thuốc chữa bệnh suy tim và hở van tim

Sản lượng hạt Óc chó đã phát triển nhanh chóng trong mười năm qua

do ngày càng nhiều người nhận thấy giá trị dinh dưỡng của nó Ngành sản xuất hạt Óc chó có doanh thu ước tính gần 10 tỷ USD trong năm 2011 (tính theo số lượng của FAO với giá là 4 USD/kg) Hoa Kỳ là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới trong khi Trung Quốc nổi lên là một nước quan trọng về cả sản xuất tiêu dùng Tính từ năm 2000, tổng sản lượng hạt Óc chó toàn cầu đã tăng đều đặn về khối lượng Tới năm 2010, sản lượng đạt 2,55 (triệu tấn), gần gấp đôi 1,29 (triệu tấn) của năm 2000 Tốc độ tăng trưởng trung bình từ

2000 - 2005 là 6,2%, và từ 2006 - 2010 là 10,8% Sáu nước sản xuất hàng đầu trong năm 2010,xếp theo khối lượng giảm dần là Trung Quốc,Hoa Kỳ, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Ukraine và Mexico Các quốc gia này vẫn giữ vị trí đứng đầu với sản lượng và chiếm hơn 80% sản lượng toàn cầu Hoa Kỳ và Trung Quốc có sản lượng hạt Óc chó liên tục tăng.Tổng sản lượng của hai nước tăng từ 47% tổng nguồn cung toàn cầu năm 2005 lên khoảng 60% trong năm

2010 Sản lượng của Trung Quốc đã tăng gấp đôi từ 2005 - 2010 Trung Quốc đã đạt được tốc độ tăng trung bình giai đoạn 2005 - 2010 là 16,3% cao hơn so với nước sản xuất thứ 2 và thứ 3 là Hoa Kỳ 7,3%, và Iran 9,7%.[1]1.2 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN LOẠI THỰC VẬT

1.2.1 Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái

Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái có nguyên tắc cơ bản là hai đơn vị phân loại (taxon) có nhiều đặc điểm chung, càng giống chúng càng có quan hệ gần gũi với nhau Nhưng không phải đặc điểm nào cũng có thể là đặc điểm để phân loại Các taxon bậc cao thường có đặc điểm

phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến của

cơ thể Còn taxon bậc thấp thì biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách ly sinh sản Do vậy, để tăng độ tin cậy cho phân loại hình thái thì người

ta kết hợp nhiều đặc điểm lại với nhau

Ưu điểm của phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái là rất kinh tế, nhanh chóng và tiện lợi nhưng lại đòi hỏi các nhà phân loại học phải

có kiến thức chuyên sâu, có kinh nghiệm và sự khéo léo Không những thế phương pháp này còn thiếu độ chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loại đồng hình, mặt khác bởi hình thái chính là kết quả nhau thì của biểu hiện gen trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thường biến cao Các marker hình thái có nhiều điểm hạn chế như: các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái nói chung thường giới hạn trong một hay một vài locus; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể

1.2.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

1.2.2.1 Các Marker phân tử dựa trên DNA

Các marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ

sở phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR) Về mặt định dạng, đặc tính DNA có thể nhận ra thông qua việc lai các đoạn DNA được cắt giới hạn bằng enzymes phân giải với các DNA thăm dò (probe) được đánh dấu vốn là các đoạn DNA có nguồn gốc hoặc trình tự đã biết Marker trên cơ sở PCR bao

gồm việc khuếch đại in vitro những trình tự DNA hay locus đặc trưng bằng

cách sử dụng những trình tự olygonucleotide trong vai trò là các mồi đặc hiệu hay ngẫu nhiên và một enzyme DNA polymerase bền nhiệt Các đoạn được khuếch đại được tách ra trên điện di và tạo các đặc trưng hình thành

băng, các đặc trưng này vốn được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như nhuộm hay ghi phóng xạ tự động Những marker phân tử thường được sử dụng bao gồm:

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)]

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằng cách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA của chúng RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trên dải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ họ hàng gần RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồ gen bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gen, khả năng ứng dụng rộng của các enzym cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộ gen của các RFLP (Neale & Williams 1991)[17] RFLP cũng được sử dụng trong nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sử dụng như một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNA fingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gen quan tâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bố gen giữa các cây trồng Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trong việc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triển một bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry và cộng sự, 1987) [18]

DNA Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên [Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)]

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Phương pháp được dựa trên cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác động của enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và McClelland phát triển năm 1991 Trong phản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắn vào DNA bộ gen ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ sung của DNA khuôn mẫu Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại một vài locus riêng rẽ trên bộ gen, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD

cho việc sàng lọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các

cá thể Tuy nhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch đại DNA với các mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa và duy trì điều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA

RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ

cá thể (như xác định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài họ hàng gần nhau RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc nghiên cứu lập bản đồ gen để lấp đầy những lỗ hổng mà các markers khác chưa thực hiện được (Hadrys và cộng sự, 1992) [19]

Vi vệ tinh hay Trình tự lặp đơn giản [Microsatellites or Simple sequence Repeat (SSR)]

Microsatellite đặc biệt thích hợp để phân biệt các kiểu gen có quan hệ

họ hàng gần; bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thích khi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng các chủng giống nông nghiệp có quan hệ gần Microsatellite thể hiện một tính đa hình cao nên chúng là những marker có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về di truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh

từ mức độ cá thể (như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ những loài có quan hệ họ hàng gần Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm cho chúng không thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan hệ phát sinh xa nhau Microsatellite được xem là các marker lý tưởng trong nghiên cứu lập bản đồ gen (Jarne & Lagoda 1996) [19] Marker SSR đã được chứng minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động di truyền trong chọn lọc các sinh vật

1.2.2.2 Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ

phát sinh ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa Sự xuất hiện

và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR (Mullis và Faloona, 1987)[20] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gen: bộ gen trong nhân, bộ gen ty thể và bộ gen lạp thể

Bộ gen lục lạp

Bộ gen lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc trưng bởi phân tử dạng vòng Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của bộ gen lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn cao trong các nghiên cứu về tiến hóa Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào

về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan

hệ phát sinh Các phần khác nhau của bộ gen tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide Những vùng không

mã hóa của bộ gen lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không mang mã Phần lớn các gen lục lạp là loại gen đơn bản trong khi các gen trong nhân là thành viên của những

họ đa gen Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng

nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ

từ loài đến chi và đến họ thực vật Có thể thấy những gen mã hóa và không

mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:

Các trình tự bảo thủ ở bộ gen trong nhân

Bộ gen trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gen ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gen Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình

tự DNA ribosome trong nhân Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene Bộ gen trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã, tiếp theo là gen 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gen 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gen nhỏ hơn là 5,8S Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gen vừa đề cập Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gen 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gen 5,8S

là khoảng 160bp Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gen biến động từ 1 đến 8kb Họ gen rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể

Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gen Trái lại, kích thước của 18S rDNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh

sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử

dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín Cho dù rất

có tiềm năng trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín Gen 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gen 18S rDNA Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gen 26S rDNA tiến hóa nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gen 18S và 26S rDNA Gen 5,8S rDNA hiếm khi được

sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo thủ cao và kích thước bé (164-165bp) Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gen 18S rDNA

Vùng ITS: ITS1 phân cách gen 18S rDNA với gen 5,8S rDNA còn ITS 2 phân cách gen 5,8S rDNA với gen 26S rDNA Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa (Baldwin và cộng sự, 1995)[21].Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn Khó khăn trong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho

thêm Dimethyl sulfoxide (DMSO) vào PCR hay phản ứng giải trình tự là

việc bổ sung mang lại hiệu quả cao Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gen rDNA Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự ITS (Bellarosa và cộng sự, 2005)[22] Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí

của các mồi ITS

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN ÓC CHÓ

Zhang Z Gao Y Zhao Y (2009) sử dụng AFLP xác định mối quan

mối quan hệ di truyền và tính đa dạng trong 8 loài Juglans và 1 loài Peterocarya stenoptera ở Trung Quốc Tám mồi kết hợp tạo ra tổng

cộng 833 băng, trong đó có 819 (98,32%) đa hình trong số 31 mẫu Phân tích phân cụm cho thấy rằng tất cả 31 mẫu đã được phân loại thành 4 nhóm

tương ứng với 8 loài Juglans Kết quả cho thấy mối quan hệ di truyền của

8 loài Juglans này dựa trên phân tích AFLP không phù hợp với phân loại

của chúng theo các phương pháp truyền thống

Malvolti và cộng sự (1993) đã nghiên cứu sự khác biệt di truyền trong quả óc chó Ý dựa trên phân tích isozyme và tìm thấy sự khác biệt không đáng

kể đối với các thông số di truyền được nghiên cứu [19] Năm 1998, Nicese và cộng sự đã sử dụng chỉ thị RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 19 mẫu óc chó được sử dụng làm bố mẹ trong chương trình chọn tạo giống của trường đại học California Kết quả cho thấy 19 mẫu nghiên cứu phân làm 2 nhóm, sự phân nhóm này liên quan đến nguồn gốc phả hệ của các mẫu Các kiểu gen có chung cha hoặc mẹ thường có xu hướng tạo thành nhóm với nhau [23] Wang và cộng sự (2008) đã sử dụng chỉ thị microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc của quần thể cây Óc chó Cùng Trung và Tây Nam Trung Quốc Kết quả cho thấy quần thể này khá đa dạng, tỷ lệ dị hợp dao động từ 0,389 đến 0,687 Dựa vào cây phân loại, có thể thấy khoảng cách di tryền của quần thể có liên quan đến đến sự phân bố địa lý của chúng [24] Miltiadis và cộng sự (2010) sử dụng chỉ thị ISSR để nghiên cứu

sự đa dạng di truyền giữa các giống óc chó đang được canh tác với các giống bản địa tại Hy Lạp Kết quả cho thấy các mẫu óc chó khảo sát có độ đa dạng

di truyền rất cao với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,13 đến 0,93 Kiểu gen của các giống óc chó bản địa đa dạng hơn nhiều so với các giống ngoại óc chó đang được canh tác [25]

Uzma Noor Shah và cộng sự (2017) đã sử dụng 19 mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền các mẫu óc chó thu thập tại Jammu và Kashmir, Ấn

Độ Kết quả phân tích cho thấy 96 mẫu óc chó được khảo sát có tỷ lệ đa hình lên tới 89,6%, hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0 đến 0,43, tỷ lệ

có 244 đa hình đơn nucleotide (SNPs) Dự đoán cấu trúc thứ cấp ITS1 và ITS2 RNA từ mỗi giống đã được cải thiện bằng cách phát hiện các yếu tố chức năng chính được chia sẻ bởi tất cả các trình tự trong các sắp xếp Phân tích phát sinh loài của vùng ITS1-5.8S-ITS2 phân tách rõ ràng trình tự cô lập thành hai cụm Kết quả cho thấy vùng ITS1 và ITS2 có thể được sử dụng

để phân biệt các giống cây Óc chó này [27]

Các nghiên cứu trên cho thấy rằng, marker phân tử ITS của DNA ribosome là phù hợp nhất để điều tra các mối quan hệ phát sinh và sinh học trong chi Juglans do RAPD và ISSR không phù hợp để xác định giống cây trồng do thiếu khả năng tái lặp còn SSR là sự khác biệt về kích thước giữa sản phẩm khuếch đại từ mỗi alen thường nhỏ, làm biến dạng đáng tin cậy bằng gel agarose tiêu chuẩn điện di

Đánh giá đa dạng di truyền là một trong vấn đề còn khá mới đối với các loài cây lâm nghiệp ở Việt Nam Hiện nay, trong công tác bảo tồn nguồn gen và khai thác phát triển nguồn gen đang được quan tâm vấn đề đánh giá

di truyền nguồn gen các loài cây, các giống cây trồng làm cơ sở cho việc lưu giữ, bảo tồn những nguồn gen có giá trị Đến nay, chưa có công trình nào nghiên cứu xác định đa dạng di truyền nguồn gen cây Óc chó ở Việt Nam Điều này là một trong những vấn đề còn tồn tại trong công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Óc chó

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là 26 mẫu lá non cây Óc chó được thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc gồm 9 mẫu thuộc huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang; 5 mẫu thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai và 12 mẫu thuộc các huyện Sỉn Hồ và huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu do Viện Nghiên cứu Lâm sinh cung cấp

Bảng 2 1: Danh sách 26 mẫu Óc chó

STT Ký hiệu

1 HG1 Lũng Hoà B, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

2 HG2 Sà Phìn A, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

3 HG5 Sà Phìn A, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

4 HG7 Há Hơ, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

5 HG9 Lũng Thầu, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

6 HG11 Lũng Thầu, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

7 HG16 Lý Chá Tủng, Sà Phìn, Đồng Văn,Hà Giang

8 HG18 Thành Ma Tủng, Sà Phìn, Đồng Văn, Hà Giang

9 HG22 Séo Lủng B, Sảng Tủng, Đồng Văn, Hà Giang

10 LCa01 Tổ 3, xã Sa Pa, huyện Sa Pa, Lào Cai

11 LCa03 Tổ 3, xã Sa Pa, huyện Sa Pa, Lào Cai

12 LCa04 Tổ 3, xã Sa Pa, huyện Sa Pa, Lào Cai

13 LCa10 Tổ 13, TT Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

14 LCa12 Tổ 13, TT Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

15 LC3 Bành Phán, Tả Phìn, Sìn Hồ, Lai Châu

16 LC14 Xăng Tăng Ngai, Phan Xô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu

17 LC18 Tủa Sín Chải, Sìn Hồ, Lai Châu

18 LC23 Sìn Hồ,Lai Châu

19 LC25 Làng Mô, Sìn Hồ, Lai Châu

20 LC37 Hợp 2, Dào San, Phong Thổ, Lai Châu

21 LC42 Cao Sín Chải, Dào San, Phong Thổ, Lai Châu

22 LC48 Lièng Chư, Dào San, Phong Thổ, Lai Châu

23 LC52 Hà Nhì,Tùng Qua Lìn, Phong Thổ, Lai Châu

24 LC55 Khấu Rào, Tùng Qua Lìn, Phong Thổ, Lai Châu

25 LC65 Pờ Xa, Pa Vây Sử, Phong Thổ, Lai Châu

26 LC68 Ngài Thầu, Pa Vây Sử, Phong Thổ, Lai Châu

2.2 HÓA CHẤT

Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Agarose, kit Qiagen, các

ITS8 5’ GCACTACGATGAAGAACGCT 3’

Kích thước đoạn DNA được khuếch đại bởi cặp mồi ITS 1-8 nằm trong khoảng 750-800bp

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB của P Doyle and Doyle (1987) [29] có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết DNA từ các mẫu nghiên cứu

Quy trình:

- Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C

- Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu óc chó, chày, cối được giữ trước ở - 80C)

- Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10% Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2% và PVP 1%

- Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 30 phút

- Làm nguội ở nhiệt độ phòng và bổ sung 200l potassium acetate 5M, trộn đều và ủ trên đá 45 phút

- Bổ sung thể tích tương đương chloroform—isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm 11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới

- Tiếp tục chiết lần 2 bằng chloroform—isoamylalcohol (24:1), thu được dịch chiết chứa DNA

- Tủa DNA bằng isopropanol đã làm lạnh Để ở -20C trong 1 giờ

- Ly tâm thu tủa 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 4C

- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa

- Làm khô và hòa tan DNA, loại ARN, hoà tan DNA trong đệm TE

Bảng 2 4: Chu trình phản ứng PCR Các bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kì

Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ

sung 4µl loading dye rồi tiến hành điện di

2.3.4 Phương pháp điện di trên agarose

- Cân 0,6g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45-50C bổ sung 2,5l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm

- Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 l loading dye và tra vào các giếng trên gel

- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn Đặt 130 V

- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ liên kết với Ethidium Bromide

2.3.5 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

- Cắt lấy đoạn DNA mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào

ống eppendorf 2ml

- Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 thể tích gel (100mg

~100μl)

- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn

- Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung

10μl sodium acetate 3M, pH 5

- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc

độ 13 000 rpm trong 1 phút

- Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000

rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa

- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút

sau đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút

- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch

- Để hoà tan DNA, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng của cột

QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng DNA tinh sạch

2.3.6 Giải trình tự

Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công

ty Macrogen (HànQuốc) bằng máy Applied Biosystems 3500 Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI bằng công

cụ căn trình tự ClustalW của phần mềm Mega 6.0 và CLC 8.0 Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v6.0 để tạo cây phát sinh loài

29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA

Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong công nghệ DNA Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số của thực vật Tuy nhiên đối với từng đối tượng nhất định cần

có phương pháp riêng Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB của P.Doyle and Doyle (1987)[29] có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết DNA tổng số của 26 mẫu Óc chó nghiên cứu Kết quả tách chiết DNA tổng số của 26 mẫu Óc chó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

Hình 3 1: Ảnh điện di DNA tổng số của 26 mẫu Óc chó

Kết quả điện di trên gel agarose 1% ở Hình 3.1 thể hiện sản phẩm DNA tổng số rõ nét, rõ băng cho thấy chất lượng DNA của các mẫu tốt Kết quả điện di cũng cho thấy DNA có nồng độ tương đối cao, đảm bảo mức độ nguyên vẹn và tinh sạch, đáp ứng được các yêu cầu dành cho việc phân tích

đa hình di truyền trong các thí nghiệm tiếp theo

3.2 KẾT QỦA PCR VÀ TINH SẠCH CÁC SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI Sau khi thực hiện PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS8

và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 750-800bp Kết quả của đối chứng âm là nước không xuất hiện băng vạch chứng tỏ DNA đã được khuyếch đại và không bị nhiễm tạp chất Kết quả được trình bày ở Hình 3.2

Hình 3 2: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 26

mẫu Óc chó (M1KB: Marker ladder 1Kb; H2O: Đ/c âm)

Kết quả khuếch đại sản phẩm PCR của từng mẫu được tiến hành thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT VÙNG TRÌNH TỰ ITS1-5,8SrRNA-ITS2 Ở CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

Bên cạnh việc phân loại theo phương pháp truyền thống dựa vào việc

so sánh hình thái giải phẫu của cơ quan sinh sản và dinh dưỡng, trong việc định loại các taxon sinh vật hiện đại, đặc biệt là các taxon có sự biến động

hình thái lớn như các loại thực vật, trong đó có các loài thuộc chi Juglans,

các dữ liệu về đặc tính phân loại và quan hệ phát sinh dựa trên các vùng bảo thủ cao (phylogenetical characteristics) đóng một vai trò quan trọng Các dữ liệu này dựa trên đặc điểm trình tự các nucleotide của các vùng trình tự bảo

thủ cao trong bộ gen nói chung và các DNA barcode nói riêng nhiều khi

chính là cơ sở để nhận dạng và định loại một số taxon của Óc chó

Việc xác định trình tự và sử dụng trình tự nucleotide đoạn 5,8SrRNA-ITS2 để so sánh nhằm tìm ra mối quan hệ phát sinh giữa các loài hoặc sự đa dạng di truyền trong một chi, thậm chí các bậc phân loại dưới loài trong một loài đã được sử dụng phổ biến từ lâu trên thế giới

ITS1-Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 (Bảng 2.2), sau khi tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3100 DNA Analyzer (Applied Biotech) và phần mềm MEGA v6.0, kết quả cho ra giản

đồ có các đỉnh (peak) với 4 màu sắc khác nhau tương ứng với 4 loại nucleotide và biểu thị dãy trình tự các nucleotide (Hình 3.3) Kết quả thu được 26 đoạn trình tự ITS của 26 mẫu Óc chó với số nucleotide khác nhau trên từng mẫu

Hình 3 3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Óc chó HG02, HG05 và HG18

Thông qua quá trình khuếch đại và giải trình tự đối với các mẫu khảo sát theo phương pháp được nêu trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu, xác định vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 trên sản phẩm khuếch đại thông

qua việc căn trình tự và đối chiếu với các trình tự ITS1-5,8S rRNA và ITS2 của các taxon cùng chi trên Genbank, thu được các trình tự có độ dài được thể hiện trong Bảng 3.1

Bảng 3 1: Độ dài các trình tự thuộc 26 mẫu Óc chó nghiên cứu và mẫu

tham chiếu AF399876.1

STT Kí hiệu Tổng số nucleotide STT Kí hiệu Tổng số nucleotide