TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM MỘT SỐ DẪN CHẤT 2PYRAZOLIN

Tổng hợp được 5 chalcon, và 15 dẫn chất 2pyrazolin, khảo sát được các điều kiện thuận lợi cho phản ứng tổng hợp. Sàng lọc được 5 dẫn chất từ HP6HP10 có hoạt tính tốt trên Staphylococcus aureus (MIC 48 µgml) và hoạt tính trung bình trên Enterococcus faecalis (MIC 1664 µgml). Từ kết quả thử kháng khuẩn in vitro và mô hình docking trên FabH, rút ra một số nhận xét quan trọng về mối liên quan cấu trúchoạt tính kháng khuẩn: (1) nhóm thế 1phenyl trên nhân 2pyrazolin ảnh hưởng lớn đến hoạt tính, (2) nhóm thế trên nhân thơm ở vị trí số 3 của vòng 2pyrazolin ít ảnh hưởng đến hoạt tính (3) nhóm thế hydroxy trên nhân thơm ở vị trí số 5 của vòng 2pyrazolin cần thiết cho việc gắn kết lên đích tác động. Kết luận: Đề tài đã thực hiện tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của 5 chalcon và 15 dẫn chất 2pyrazolin. Có được một vài nhận xét quan trọng về mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng khuẩn. Các kết quả trên có thể sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo góp phần vào việc phát triển các thuốc kháng khuẩn, kháng nấm mới.

NGUYỄN ĐỨC TÀI

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-PYRAZOLIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

LÂM CHẤN KHANG

9

NGUYỄN ĐỨC TÀI

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-PYRAZOLIN

Ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

Mã số: 8720202

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Phương

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018

LÂM CHẤN KHANG

9

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Đức Tài Lâm Chấn Khang

Nguyễn Đức Tài Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Thị Ngọc Phương

Mở đầu:

Trong bối cảnh tỷ lệ và mức độ của các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm ngày gia tăng, việc phát triển các thuốc kháng khuẩn, kháng nấm mới là một vấn đề cấp thiết Những nghiên cứu trước đó chỉ ra rằng các dẫn 2-pyrazolin thể hiện hoạt tính hoạt tính sinh học đa dạng: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng lao, kháng viêm, kháng ung thư, chống oxi hóa… Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cho thấy tiềm năng của nhóm cấu trúc này trong việc tìm ra các kháng sinh mới Nhằm góp phần trong việc tìm kiếm thuốc kháng sinh mới, chúng tôi thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm một số dẫn chất 2-pyrazolin”

Mục tiêu nghiên cứu:

Tổng hợp các chalcon từ phản ứng ngưng tụ của 5-bromosalicylaldehyd với các dẫn chất acetophenon, tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin tương ứng bằng cách ngưng tụ các chalcon với các dẫn chất của hydrazin Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của tất cả các chất tổng hợp được Từ kết quả in vitro kết hợp với mô hình docking trên đích tác động giả định là enzym FabH, phân tích mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của các chất thử nghiệm

Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu:

Các chalcon được tổng hợp từ 5-bromosalicylaldehyd và các dẫn chất acetophenon Các chalcon này sau đó được ngưng tụ với các dẫn chất của hydrazin để tạo thành các dẫn chất 2-pyrazolin Các phản ứng thực hiện trong điều kiện dung môi, nhiệt độ, xúc tác và tỷ lệ mol được khảo sát Phân tích, kiểm tra sản phẩm bằng cảm quan và các phương pháp đo điểm chảy, phổ UV-Vis, phổ IR, phổ NMR, phổ MS Các chất tổng hợp được thử hoạt tính kháng khuẩn trên Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Stapycoccus aureus ATCC 25921, Enterococcus faecalis ATCC 29212; và hoạt tính kháng nấm trên Trychophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes, Microsporum canis Nghiên cứu mô hình docking được thực hiện bằng phần mềm FlexX 2.0

Kết quả:

Tổng hợp được 5 chalcon, và 15 dẫn chất 2-pyrazolin, khảo sát được các điều kiện thuận lợi cho phản ứng tổng hợp Sàng lọc được 5 dẫn chất từ HP6-HP10 có hoạt tính tốt trên

Staphylococcus aureus (MIC 4- 8 µg/ml) và hoạt tính trung bình trên Enterococcus faecalis

(MIC 16-64 µg/ml) Từ kết quả thử kháng khuẩn in vitro và mô hình docking trên FabH, rút

ra một số nhận xét quan trọng về mối liên quan cấu trúc-hoạt tính kháng khuẩn: (1) nhóm thế 1-phenyl trên nhân 2-pyrazolin ảnh hưởng lớn đến hoạt tính, (2) nhóm thế trên nhân thơm ở vị trí số 3 của vòng 2-pyrazolin ít ảnh hưởng đến hoạt tính (3) nhóm thế hydroxy trên nhân thơm ở vị trí số 5 của vòng 2-pyrazolin cần thiết cho việc gắn kết lên đích tác động

Kết luận:

Đề tài đã thực hiện tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của 5 chalcon

và 15 dẫn chất 2-pyrazolin Có được một vài nhận xét quan trọng về mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng khuẩn Các kết quả trên có thể sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theogóp phần vào việc phát triển các thuốc kháng khuẩn, kháng nấm mới

Lâm Chấn Khang

Nguyen Duc Tai Supervisor: Assoc Prof PhD Huynh Thi Ngoc Phuong Introduction:

In the context of increased rates and levels of bacterial, fungal infections, the development

of new antibacterial, antifungal agents is a matter of urgency The previous studies demonstrated that 2-pyrazoline derivatives exhibit some types of bioactivity such as antibacterial, antifungal, antiviral, anti-tuberculosis, anti-inflammatory, anti-cancer, antioxidant… Studies about antibacterial and antifungal activity illustrated the potential of these derivatives in the discovery of novel new anti-infective drugs Therefore, to contributing to subsequent drug development studies we decide to do the assay " Synthesis and evaluation of antibacterial activity of a number of 2-pyrazoline derivatives”

Objectives:

Synthesis of some chalcones by the condensation reaction of 5-bromosalicylaldehyde and some acetophenone derivatives Then, some 2-pyrazoline derivatives were synthesized by condensation between the chalcones and hydrazine derivatives Study antibacterial,

antifungal activity in vitro of the chalcones and 2-pyrazoline derivatives Study molecular docking model on virtual target as FabH enzyme Based on the in vitro results and binding

model on virtual FabH enzyme, analyze the relationship between the structure and activity

of the test substance

Materials and methods:

Chalcones were synthesized from 5-bromosalicylaldehyde and acetophenone These chalcones react with hydrazine derivatives to produce corresponding 2-pyrazoline derivatives These reactions were carry out at the investigated conditions of solvent, temperature, catalyst and the molar ratio Analyzing, testing by sense and melting point, UV-Vis, IR spectrum, NMR spectrum, MS spectrum The bactericide activities against

Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Stapycoccus aureus ATCC 25921, Enterococcus faecalis ATCC 29212; and fungistatic activities against Trychophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes, Microsporum canis were evaluated

for all the synthesized compounds Study molecular docking model with FlexX 2.0 software

Results and discussion:

In this study, 5 chalcones and 15 derivatives of 2-pyrazoline were synthesized The result showed that the derivatives of HP6-HP10 (1-phenyl-2-pyrazoline derivatives) have a low value of MIC (4-8 μg/ml) on S aureus and a medium value of MIC (16-64 µg/ml) on E

faecalis From the results of antibaterial activity test in vitro and molecular docking model on

vitual FabH enzyme, some important conclusions about the structure-antibacterial activity relationships were obtained: (1) 1-phenyl substituent of 2-pyrazoline moiety is especially impotant for activity (2) substituent of aromatic ring at 3-position of 2-pyrazoline moiety seems to influence sightly on activity, (3) hydroxy substituent of aromatic ring at 5-position

of 2-pyrazoline moiety is essential for binding of these compound on target protein

Conclusion

The assay has synthesized and evaluated the antibacterial and antifungal activities of 5 chalcones and 15 derivatives of 2-pyrazoline There are some critical conclusions about the relationship between the structure and antibacterial activity These results can be used in further studies to contribute to the development of new antibacterial, antifungal agents

Lam Chan Khang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về các dẫn chất 2-pyrazolin 2

2.2 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm của các dẫn chất 2-pyrazolin 7

2.3 Các phương pháp tổng hợp 2-pyrazolin 12

2.3.1 Tổng hợp 2-pyrazolin từ chalcon 12

2.3.2 Tổng hợp qua một giai đoạn từ ceton, arylacetylen và hydrazin 13

2.3.3 Các phương pháp tổng hợp khác 14

2.4 Liên quan cấu trúc pyrazolin và hoạt tính ức chế enzym FabH 15

2.5 Tổng quan về docking 17

2.5.1 Khái niệm về docking 17

2.5.2 Phân loại docking 18

2.5.3 Giới thiệu chung về các phần mềm docking 19

2.5.4 Docking bằng phần mềm FlexX (BioSolveIT GmbH) 19

2.6 Tổng quan về enzym FabH 20

2.6.1 Vai trò của FabH trong tổng hợp acid béo ở vi khuẩn 20

2.6.2 Cấu trúc và cơ chế xúc tác của FabH 21

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.1 Các chất được tổng hợp trong nghiên cứu 23

3.1.2 Nguyên liệu cho tổng hợp và tinh chế 26

3.1.3 Nguyên liệu thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 27

3.1.4 Dụng cụ, thiết bị 28

3.1.5 Công cụ nghiên cứu docking 28

3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Tổng hợp các chalcon 29

3.2.2 Tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin 31

3.2.3 Xác định cấu trúc và độ tính khiết các sản phẩm thu được 36

3.2.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm các dẫn chất 2-pyrazolin 36

3.2.5 Xây dựng mô hình gắn kết trên FabH bằng phần mềm FlexX 39

3.2.6 Khảo sát mối liên quan cấu trúc – tác động của các dẫn chất 2-pyrazolin 43

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

4.1 Kết quả tổng hợp 44

4.1.1 Tổng hợp chalcon 44

4.1.2 Phản ứng giữa chalcon và hydrazin 48

4.1.3 Tổng hợp dẫn chất 2-pyrazolin từ chalcon và phenylhydrazin 52

4.1.4 Tổng hợp các dẫn chất 1-acetyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol 56

4.1.5 Tổng hợp dẫn chất 1-benzoyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol 60

4.2 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 61

4.2.1 Kết quả thử định tính 61

4.2.2 Kết quả thử MIC 62

4.3 Kết quả docking 62

4.4 Bàn luận 67

4.4.1 Phản ứng tổng hợp chalcon 67

4.4.2 Phản ứng giữa chalcon và hydrazin 67

4.4.3 Phản ứng giữa chalcon và phenylhydrazin hydroclorid 69

4.4.4 Mô hình docking trên enzym FabH 69

4.4.5 Mối liên quan cấu trúc – hoạt tính 70

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73

5.1 Kết luận 73

5.2 Đề nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

FabH Fatty acid biosynthesis (H)

ecFabH FabH của Escherichia coli

saFabH FabH của Staphylococcus aureus

KAS III β-ketoacyl-ACP synthase

MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ tối thiểu ức chế)

IR Infrared spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại)

MS Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại – khả kiến)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Công thức cấu tạo, danh pháp và kí hiệu các chất được tổng hợp 23

Bảng 3.2 Danh mục các nguyên liệu ban đầu 26

Bảng 3.3 Dung môi sử dụng tổng hợp (S), tinh chế (P), sắc kí (C) 27

Bảng 3.4 Thiết bị sử dụng trong tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 28

Bảng 3.5 Thiết bị phân tích, kiểm tra sản phẩm 28

Bảng 3.6 Các protein được sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 4.7 Kết quả đo đường kính vùng ức chế (mm) 61

Bảng 4.8 Kết quả thử MIC 62

Bảng 4.9 Các mô hình docking 63

Bảng 4.10 Điểm số của 20 dẫn chất nghiên cứu trên 4 mô hình docking 64

Bảng 4.11 Giá trị logMIC và điểm số docking của các dẫn chất có hoạt tính trên S aureus 66

Bảng 4.12 Các dẫn chất dự đoán có hoạt tính tốt trên S aureus 72

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc pyrazol và 2-pyrazolin 2

Hình 2.2 Một số thuốc có cấu trúc pyrazolin 2

Hình 2.3 Các nhóm thế khác nhau trên nhân 2-pyrazolin 3

Hình 2.4 Các dẫn chất kháng ung thư nhóm 1 4

Hình 2.5 Các dẫn chất ức chế FabH nhóm 1 5

Hình 2.6 Các dẫn chất có hoạt tính giảm đau nhóm 2 5

Hình 2.7 Các dẫn chất kháng ung thư nhóm 3 5

Hình 2.8 Các chất trong nghiên cứu của Khaled A Abdellatif 6

Hình 2.9 Các chất trong nghiên cứu của Hai-Liang Zhu và cộng sự 6

Hình 2.10 Các chất trong nghiên cứu của Hai-Liang Zhu năm 2015 7

Hình 2.11 Cấu trúc các chất trong nghiên cứu của Sivakumar 7

Hình 2.12 Các chất có hoạt tính tốt trong nghiên cứu của Hui Deng 8

Hình 2.13 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Mohammad M Ibrahim và cộng sự 8

Hình 2.14 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Javarappa Rangaswamy (2012) 8

Hình 2.15 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Javarappa Rangaswamy (2013) 9

Hình 2.16 Các chất trong nghiên cứu của Y Rajendra Prasad 10

Hình 2.17 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Jia Jia Liu 10

Hình 2.18 Cấu trúc các chất 7e, 7f trong nghiên cứu của Juan Ramirez 11

Hình 2.19 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Hamada và Abdo 11

Hình 2.20 Hai dẫn chất kháng khuẩn mạnh trong nghiên cứu của Arpita Chakrabarty 11

Hình 2.21 Tổng hợp 2-pyrazolin từ chalcon 12

Hình 2.22 Tổng hợp 2-pyrazolin với hỗ trợ của vi sóng 12

Hình 2.23 Phản ứng một giai đoạn tổng hợp 2-pyrazolin 13

Hình 2.24 Cơ chế đề nghị phản ứng một giai đoạn tổng hợp 2-pyrazolin 13

Hình 2.25 Cơ chế phản ứng tổng hợp 2-pyrazolin từ hydrazin và 1,3-dihalogen 14

Hình 2.26 Phản ứng tổng hợp 2-pyrazolin từ hydrazonoyl bromid 14

Hình 2.27 Hợp chất A và mô hình gắn kết của A trên FabH E Coli (1HNJ) 15

Hình 2.28 Cấu tạo các hợp chất B và C trong nghiên cứu của Hai Liang Zhu 16

Hình 2.29 Mô hình gắn kết 2D và 3D của hợp chất B trên FabH (1HNJ) 16

Hình 2.30 Mô hình gắn kết 2D và 3D của hợp chất C trên FabH (1HNJ) 16

Hình 2.31 Quá trình docking 17

Hình 2.32 Thuật toán docking xây dựng lớn dần 20

Hình 2.33 Cơ chế xúc tác của FabH 21

Hình 2.34 Sự chồng phủ cấu trúc của ecFabH (màu vàng) và saFabH (màu xanh) 22

Hình 3.35 Cấu trúc các hợp chất được tổng hợp 23

Hình 3.36 Phản ứng tạo chalcon 29

Hình 3.37 Cơ chế phản ứng tạo chalcon 30

Hình 3.38 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin 31

Hình 3.39 Quá trình tìm cấu dạng bền của phân tử 41

Hình 4.40 Cấu trúc các khoang gắn kết của ecFabH Vùng xúc tác nằm giữa đường hầm nối liền 2 khoang gắn kết 63

Hình 4.41 Các tương tác giữa C1 và saFabH (mô hình 4) 65

Hình 4.42 Các tương tác giữa HP1 và HP6 trên saFabH (mô hình 4) 66

Hình 4.43 Đường biểu diễn mối liên quan giữa log MIC và điểm số docking 67

Hình 4.44 Cấu trúc của các dẫn chất 2-pyrazolin 70

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm gây ra một mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe con người Tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của các bệnh này ngày càng tăng, nhất là ở các quốc gia đang phát triển Việc xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn,

vi nấm đề kháng hoặc đa đề kháng với các thuốc kháng sinh cổ điển làm cho các bệnh nhiễm trùng ngày càng khó điều trị và trở thành một vấn đề đáng lo ngại đối với nền

y tế toàn cầu [26] Do đó, việc tìm kiếm các nhóm thuốc kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao và an toàn đang là một vấn đề cấp thiết

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn chất 2-pyrazolin thể hiện nhiều tác động sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng lao, kháng sốt rét, kháng

kí sinh trùng, kháng amib, kháng viêm, kháng ung thư, chống trầm cảm, kháng androgen, chống oxi hóa, ức chế tổng hợp nitric oxid, ức chế COX II… [11] Sự xuất hiện dị vòng pyrazolin trong một số thuốc như noramidopyrin, methampyron, phenylbutazon, sulfinpyrazon tạo tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển thuốc dựa trên cấu trúc 2-pyrazolin Các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cũng cho thấy tiềm năng của nhóm cấu trúc này trong việc tìm ra các kháng sinh mới [11] Đặc biệt về cơ chế kháng khuẩn, nhóm cấu trúc 2-pyrazolin được cho là ức chế enzym FabH, một đích tác động mới so với protein đích của các kháng sinh cổ điển [6] [21] Nhằm góp phần nghiên cứu, tìm kiếm thuốc kháng sinh mới, đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm một số dẫn xuất 2-pyrazolin” được thực hiện với mục tiêu tổng hợp, thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và tìm mối liên quan cấu trúc – hoạt tính của một số dẫn chất 2-pyrazolin

Mục tiêu nghiên cứu

1 Tổng hợp các chalcon từ 5-bromosalicylaldehyd và các dẫn chất acetophenon

2 Tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin từ chalcon và các dẫn chất của hydrazin

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các dẫn chất 2-pyrazolin

4 Khảo sát mối liên quan cấu trúc – hoạt tính của các dẫn chất 2-pyrazolin dựa trên các giá trị MIC và mô hình gắn kết với protein FabH

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC DẪN CHẤT 2-PYRAZOLIN

Pyrazol thuộc nhóm dị vòng thơm chứa nitơ, cấu trúc này xuất hiện trong nhiều phân

tử thuốc với nhiều tác động khác nhau Hoạt tính đa dạng của pyrazol tạo tiền đề cho

việc biến đổi cấu trúc pyrazol thành 2-pyrazolin (hay 4,5-dihydro-1H-pyrazol) [4]

So với pyrazol, các pyrazolin có tính base mạnh hơn, ít ổn định hơn và có các tính chất của hợp chất chưa no Nitơ giàu điện tử trong các dị vòng là đối tượng cho quá trình khử và oxi hóa Vòng 2-pyrazolin hấp thu ánh sáng trong vùng 300-400 nm và phát huỳnh quang do hệ thống liên hợp của hai nguyên tử nitơ dị vòng với liên kết đôi Hệ liên kết N1-N2=C3 theo kiểu π-σ-ρ ảnh hưởng tới cấu trúc của vòng, trừ nguyên tử C5, các nguyên tử khác trong vòng 2-pyrazolin cùng nằm trên một mặt phẳng Sự chệch hướng này cũng gây ra nhiều khác biệt trong hoạt tính của các dẫn chất này [25]

Một số alkaloid, vitamin, phẩm nhuộm… chứa nhân pyrazolin Antipyrin dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on) là dẫn chất pyrazolin đầu tiên đã từng được sử dụng để làm thuốc kháng viêm và giảm đau Cấu trúc này cũng hiện diện trong nhiều phân tử có tác dụng điều trị: noramidopyrin, methampyron, phenylbutazon, sulfinpyrazon…, điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới: thay đổi các nhóm thế

(2,3-để thu được các dẫn xuất 2-pyrazolin với nhiều tác động sinh học khác nhau

Sự biến đổi nhóm thế trên 2-pyrazolin bao gồm sự thay thế các nhân thơm, dị vòng thơm vào vị trí 3,5 Các nhóm thế trên nhân thơm có thể tăng độ hòa tan trong nước của phân tử, các nhân thơm gắn vào có thể kết hợp với hoạt tính của vòng pyrazolin Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng nhóm thế trên N1 đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính sinh học Hoạt tính thay đổi đáng kể với sự biến thiên của nhóm thế trên N1: acetyl, amid, phenyl… Các nhóm thế R1, R2, R có thể là alkyl, nhân thơm hoặc dị vòng thơm….[4]

Có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các dẫn chất 2-pyrazolin Suresh Kumar và cộng sự (2009) tổng hợp thông tin về các dẫn chất 2-pyrazolin trong các nghiên cứu từ năm 2005 đến 2009 [17] Năm 2011, M Yusuf và cộng sự tổng hợp các nghiên cứu về các dẫn xuất 2-pyrazolin từ năm 2007 đến 2011 [44] Năm 2012, Dipankar Bardalai và cộng sự đã điểm lại các dẫn chất 2-pyrazolin có tác dụng kháng viêm giảm đau được tổng hợp từ 1993-2011 [5] Các tác giả chỉ ra rằng những hợp chất có cấu trúc 2-pyrazolin thể hiện hoạt tính sinh học rất đa dạng: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng lao, kháng sốt rét, kháng kí sinh trùng, kháng amip, kháng viêm, kháng ung thư, chống trầm cảm, kháng androgen, chống oxi hóa ức chế tổng hợp nitric oxid, ức chế COX II, monoamin oxidase, xanthin oxidase, đối vận thụ thể CB1 cannabinoid,

Năm 2013, Jimi Marin và Rai Kumar nghiên cứu mối liên quan cấu trúc – tác động của nhóm thế trên N1 và các hướng tổng hợp các dẫn xuất 2-pyrazolin mới Các nhóm thế trên N1 ảnh hưởng quan trọng tới đến kiểu tác dụng của các dẫn chất [4] Các dẫn chất trong những nghiên cứu từ năm 2009 – 2013 được chia làm 3 nhóm với các kiểu tác động đặc trưng

R, R1, R2 có thể là alkyl, nhân thơm, dị vòng thơm

Hình 2.5 Các dẫn chất ức chế FabH nhóm 1 Các chất trong nhóm 2 cho tác động kháng khuẩn, kháng lao, kháng amip, kháng HIV, kháng sốt rét, giảm đau Năm 2010, Joshi R.S và cộng sự tổng hợp các dẫn chất thế có hoạt tính giảm đau [14]

Các chất trong nhóm 3 cho tác động kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống nhiễm trùng, kháng ung thư Năm 2010, Shaharyar M và cộng sự tổng hợp các dẫn chất có hoạt tính kháng ung thư [34]

Năm 2016, Khaled A Abdellatif và Wael A A Fadaly tổng hợp và thử hoạt tính ức chế cyclooxygenase, kháng viêm, khả năng gây loét và hoạt tính giảm đau của các

dẫn chất 1,3,5-triaryl-4,5-dihydro-1H-pyrazol, kết quả thu được 4 dẫn chất với hoạt

tính kháng viêm tốt hơn, ít gây loét hơn so với celecoxib và ibuprofen Thêm vào đó, kết quả docking cho thấy sự tương quan giữa hoạt tính và điểm số docking [2]

Hình 2.8 Các chất trong nghiên cứu của Khaled A Abdellatif

Từ năm 2012 đến 2014, nhóm nghiên cứu của Hai-Liang Zhu đã tổng hợp 3 nhóm dẫn chất của 2-pyrazolin, thử hoạt tính ức chế B-Raf kinase, sau đó xây dựng mô hình docking và 3D-QSAR trên B-Raf kinase Kết quả của các nghiên cứu chỉ ra rằng nhóm –OH phenol trên nhân thơm gắn với C5 làm tăng hoạt tính ức chế B-Raf kinase của các dẫn chất 2-pyrazolin, mặt khác, một nhóm thế có kích thước nhỏ mang điện tích âm gắn trên C5 cũng đem lại hiệu quả Nhóm thế trên N1 cũng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của các dẫn chất này, sự tăng kích thước nhóm thế trên N1 cũng làm tăng hoạt tính [18] [19] [42]

Năm 2015, dựa vào mô hình docking và 3D-QSAR trên B-Raf V600E, Hai-Liang Zhu tiếp tục tổng hợp các dẫn chất 3-aryl-5-(thiophen-2-yl)-1-(4-arylthiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol Kết quả thu dẫn chất với R1 = -Cl, R2 = -CF3 có IC50 trên B-Raf V600E và trên hai dòng tế bào WM266.4, MCF-7 lần lượt là 0,05 μM; 0.12 μM

và 0.16 μM Các giá trị này tương đương với thuốc sorafenid (với IC50 tương ứng là 0,03 μM; 0,06 μM và 0,19 μM) [45]

Hình 2.10 Các chất trong nghiên cứu của Hai-Liang Zhu năm 2015

2.2 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN KHÁNG NẤM CỦA CÁC DẪN CHẤT 2-PYRAZOLIN

Năm 2010, P M Sivakumar và cộng sự đã tổng hợp 16 dẫn chất

3,5-triphenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol (Hình 2.11) và thu được các dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn

đáng kể với nhóm thế X là các halogen, kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng, nhóm

thế p-halogeno làm cho hoạt tính của hợp chất tổng hợp mạnh hơn so với nhóm

methoxy, nitro và hydroxy Hoạt tính của các chất có tương quan chặt chẽ tới nội

năng (R = 0,99) và giá trị Alog P (R từ -0,87 đến -0,99) [36]

Năm 2012, Hui Deng và cộng sự tổng hợp các dẫn chất 3-(furan-2-yl)-2-pyrazolin, các chất này được thử hoạt tính kháng nấm Kết quả thu được hai dẫn chất A, B và C

có giá trị EC50 trên Rhizoctonia solani tương đương so với chất đối chiếu carbendazim

(EC50 lần lượt là 3,46; 3,20; 4,86 và 4,36 μg/mL) Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng các chất có hai nhóm thế furanyl ở C3 và C5 có hoạt tính tăng đáng kể so với các dẫn chất chỉ có một nhóm thế ở C3 Nhóm acetyl ở N1 cho hoạt tính mạnh hơn nhóm phenyl [8]

Mohammad M Ibrahim và cộng sự tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng

nấm của 8 dẫn chất của 3-(2,5-dicloro-3-thienyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol Các dẫn

chất này đều cho hoạt tính tương đương với ampicillin trên S aureus, B subtilis, gentamicin trên E coli và fluconazol trên M mehei, A niger

Javarappa Rangaswamy tổng hợp các dẫn chất hydroxy-3-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-carboxamid Các chất có nhóm thế ở vị trí para trên nhóm N-aryl trên đều cho hoạt tính từ vừa đến mạnh, trong

N-aryl-3-(benzofuran-2-yl)-5-(4-đó có ba dẫn chất D, E, F cho hoạt tính trên các chủng Escherichia coli,

Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa tương đương streptomycin Hoạt

tính kháng nấm trên các chủng Aspergillus flavus, Chrysosporium keratinophilum,

Candida albicans tương đương fluconazol Các dẫn chất này có nhóm thế p-halogeno

trên nhóm N-aryl thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với các nhóm thế methyl, methoxy, p-nitro Hoạt tính của D mạnh hơn E và E mạnh hơn F có liên quan đến nhóm thế p-floro, p-cloro, p-bromo tương ứng trong cấu trúc của A, B, C [32]

Năm 2013, Javarappa Rangaswamy và cộng sự tổng hợp 18 dẫn chất với các nhóm thế khác nhau trên nhân benzoyl gắn trên N1 của 3-(benzofuran-2-yl)-5-(4-

methoxyphenyl)-1-benzoyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol Kết quả thu được 4 dẫn chất có hoạt tính trên Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa tương dương streptomycin, hoạt tính trên Aspergillus flavus, Chrysosporium

keratinophilum, Candida albicans tương đương fluconazol Trong đó, dẫn chất có

nhóm thế flo và cloro cho hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn so với dẫn chất thế brom [31]

Y Rajendra Prasad và cộng sự thực hiện phản ứng đóng vòng trên mạch nhánh của 5-(2,6-difluorophenyl)-3-phenyl-4,5-dihydropyrazol-1-carbothioamid tạo ra các dẫn chất với nhóm thế dị vòng trên N1 của nhân 2-pyrazolin Trong đó có bốn dẫn chất cho tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt trên các chủng thử nghiệm (MIC từ 4 – 16 μg/mL) [29]

Năm 2014, Jia Jia Liu và cộng sự tổng hợp các dẫn xuất thế của

1-acetyl-3-phenyl-5-(2-(4’-trifloromethyl-2',6'-trinitro-phenoxy)phenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol, các

chất này được thử hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng B subtilis, S aureus, P

aeruginosa, E coli Kết quả hầu hết các chất này có hoạt tính tốt trên các chủng thử

nghiệm với giá trị MIC từ 0,39 – 12,5 μg/mL Các dẫn chất có nhóm thế cloro ở vị trí

5 trên vòng B cho tác dụng tốt hơn các dẫn chất khác, nếu nhóm thế ở vòng A là bromo sẽ thu được hợp chất có MIC trên các chủng thử nghiệm tương đương với hai thuốc đối chiếu là penicillin và kanamycin B Trong nghiên cứu này, Jia Jia Liu đã

làm rõ cơ chế tác động bằng sự tương quan giữa giá trị MIC trên hai chủng S aureus,

B subtilis và giá trị IC50 ức chế enzym DNA gyrase của các dẫn chất tổng hợp được Kết quả docking cũng cho thấy các dẫn chất này gắn kết tốt trên vùng tác động của enzym DNA gyrase [20]

Juan Ramirez và cộng sự tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng nấm của 18 dẫn chất của 2-pyrazolin, các chất có hoạt tính tốt được thử hiệp đồng với fluconazol, itraconazol, amphotericin B Kết quả thu được hai dẫn chất G, H có tác dụng hiệp đồng mạnh với các thuốc kháng nấm trên, H cho tác dụng hiệp đồng mạnh hơn G, hợp chất H giảm giá trị MIC50 của fluconazol từ 2,730 μg/mL xuống 0,018 μg/mL; itraconazol từ 1,780 μg/mL xuống 0,15 μg/mL và amphotericin B từ 0,071 μg/mL xuống 0,022 μg/mL [30]

Hình 2.18 Cấu trúc các chất G, H trong nghiên cứu của Juan Ramirez

Năm 2015, Hamada và Abdo tổng hợp các chalcon từ vanilin và các dẫn xuất thế

para cloro, bromo, nitro, methoxy của acetophenon, các chalcon này tác dụng với

hydrazin, isoniazid, p-sulfamylphenyl hydrazin tạo ra các dẫn chất hydrazon và

2-pyrazolin tương ứng Các chalcon, hydrazon và 2-2-pyrazolin được thử hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm Kết quả, các dẫn chất 2-pyrazolin tương ứng đi từ p-cloro

acetophenon có tác động kháng khuẩn, kháng nấm đáng kể [13]

Arpita Chakrabarty và cộng sự tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm các

Nhiều nghiên cứu sử dụng vi sóng để giảm thời gian phản ứng, nâng cao hiệu suất,

kể cả khi không sử dụng dung môi hoặc xúc tác acid [33] [37]

Sushama Katade (2009) và Deepashree R Deshmukh (2011) tổng hợp các dẫn chất

4,5-dihydro-1H-pyrazol đi từ chalcon với sự hỗ trợ của vi sóng Phản ứng được thực

hiện trong lò vi sóng trong thời gian 1 – 2 phút [9] [16]

Năm 2011, Zeba N Siddiqui thực hiện phản ứng đóng vòng tạo 2-pyrazolin từ chalcon bằng cách đun hồi lưu thông thường và trong điều kiện không dung môi ở 80

ºC Điều kiện không dung môi thu được hiệu suất cao hơn, thời gian phản ứng chỉ còn 10 – 20 phút, không cần sử dụng thêm xúc tác acid hay base so với phương pháp đun thông thường Đặc biệt là hạn chế lượng dung môi thải ra môi trường [35]

2.3.2 Tổng hợp qua một giai đoạn từ ceton, arylacetylen và hydrazin

Năm 2014, Ying-Chun Wang và cộng sự thực hiện phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin đi từ các ceton, arylacetylen và hydrazin tương ứng Phản ứng được thực

hiện trong dung môi DMSO với xúc tác tert-BuOK [40]

Đầu tiên là giai đoạn tạo enolat của ceton dưới tác dụng của tert-BuOK, sau đó là sự

tấn công của enolat vào arylacetylen để tạo ra dẫn chất 3-en-1-on, sau cùng, các chất này sẽ phản ứng với các dẫn chất hydrazin để tạo ra dẫn chất 2-pyrazol tương ứng [40]

2.3.3 Các phương pháp tổng hợp khác

Năm 2006, Yuhong Ju và Rajender S Varma tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin đi từ hydrazin và các hợp chất 1,3-dihalogen Phản ứng thực hiện trong môi trường kiềm dưới sự hỗ trợ của vi sóng Giai đoạn đầu là sự hình thành hợp chất pyrazolidin bằng phản ứng thế halogen của hai nitơ trong hydrazin Sau đó là quá trình dehydro hóa với sự có mặt của oxi trong không khí để thành các dẫn chất 2-pyrazolin [15]

Năm 2008, Nada M Abunada và cộng sự thực hiện phản ứng loại HBr từ hydrazonoyl

bromid với xúc tác kiềm Sản phẩm là các nitrilimin tiếp tục phản ứng in situ với

acrylonitril, acrylamid hoặc ethyl acrylat để thu dược các dẫn xuất thế của pyrazolin [3]

2.4 LIÊN QUAN CẤU TRÚC PYRAZOLIN VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM FabH

Sinh tổng hợp acid béo là cần thiết cho sự sống của vi sinh vật FabH, acyl carrier protein (ACP) synthase III là một enzym quan trọng, xúc tác quy trình đầu tiên của chu trình tổng hợp acid béo trên hầu hết các vi khuẩn gram âm và gram dương Nghiên cứu tối ưu hóa công thức các chất có khả năng ức chế FabH là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để cho ra đời những thuốc mới có hoạt tính kháng khuẩn tốt [43]

β-ketoacyl-Năm 2010, Hai Liang Zhu và cộng sự tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn 55 dẫn

chất 1-acetyl-3,5-diaryl-4,5-dihydro-1H-pyrazol 7 Dẫn chất có hoạt tính tốt được thử hoạt tính ức chế enzym FabH E coli Hợp chất A có khả năng ức chế FabH mạnh

nhất (IC50 = 4,2 μM) Mô hình gắn kết chỉ ra rằng hợp chất A hình thành được hai liên kết hydro giữa N2 của vòng pyrazolin với Asn 247 và giữa oxy của nhóm N1-acetyl với Arg 249 [21]

Năm 2012, Hai Liang Zhu và cộng sự tổng hợp 27 dẫn chất 2-pyrazolin với các nhóm thế dị vòng chứa lưu huỳnh trên N1 và C5 12 Dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn tốt

nhất và 3 dẫn chất có hoạt tính kém nhất được đem thử khả năng ức chế FabH E coli

Nghiên cứu này sử dụng mô hình docking để chứng minh cơ chế tác động của các dẫn chất Hợp chất B và C cho hoạt tính tốt nhất với IC50 tương ứng là 4,6 μM và 8,2

μM, hai chất này cũng cho khả năng gắn kết tốt với FabH (1HNJ) với điểm số docking

A

lần lượt là -20,47 kcal/mol và -17,10 kcal/mol Hai dẫn chất B và C cho 2 mô hình gắn kết khác nhau trên FabH

Hợp chất B gắn kết tốt với protein đích bằng 1 liên kết hydro, 4 tương tác π-cation, 1 tương tác π-σ trong đó nhân phenyl ở C3 tạo được hai tương tác π-cation với Arg 249,

hai tương tác π-cation với Arg 36, nhân thiazol ở N1 tạo một tương tác π-σ với Gly

209, nguyên tử oxy trong nhân furan ở C5 tạo một liên kết hydro với Asn 247 Hợp chất C có 2 liên kết hydro và 1 tương tác π-cation, trong đó nhóm thế furan ở C5 tạo được 1 tương tác π-cation với Arg 36, một liên kết hydro với Asn 201, nhóm thế trên N1 tạo được một liên kết hydro với Arg 249 [43]

2.5 TỔNG QUAN VỀ DOCKING

2.5.1 Khái niệm về docking

Docking là phương pháp thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc mục tiêu tác động Docking xác định tương tác giữa phối tử và phân tử đích, dự đoán ái lực liên kết của phối tử

để hình thành một phức hợp ổn định với protein, enzym, DNA… bằng cách tìm ra kiểu gắn kết với mức năng lượng tự do thấp nhất, giá trị năng lượng này được thể hiện bằng điểm số docking Các tương tác giữa phối tử và đích tác động bao gồm liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kị nước và liên kết Van der Waals Nghiên cứu docking

có thể thực hiện giữa protein – protein, protein – ligand và protein – nucleotid Quá trình docking được thực hiện qua các bước như hình 2.31 [12]

của đích tác động; (C) Phối tử được gắn vào đích tác động với các cấu dạng

dự đoán phù hợp; (D) Cấu trúc với khả năng gắn kết tốt nhất được xác định Bao gồm vị trí gắn kết và các tương tác xảy ra

Nghiên cứu docking giữ vai trò quan trọng trong thiết kế thuốc với sự trợ giúp của máy tính (Computer-aided Drug Design) Dựa vào điểm số docking, một lượng lớn hợp chất trong các ngân hàng dữ liệu được sàng lọc và tìm ra các chất có khả năng gắn kết tốt với protein đích Mô hình gắn kết của phối tử và protein sẽ được sử dụng

để thiết kế các chất tương tự với tác dụng mạnh hơn và chọn lọc hơn [22]

2.5.2 Phân loại docking

2.5.2.1 Phối tử và đích tác động đều là phân tử cứng

Khi phối tử và thụ thể được coi là cứng, tập hợp các gắn kết rất hạn chế, các trạng thái gắn kết này chỉ xem xét trên sự dịch chuyển và ba bậc quay của phối tử trong không gian Trong trường hợp này, tính linh hoạt của phối tử có thể được cải thiện bằng cách sử dụng một tập hợp cấu dạng của các phối tử được tính toán trước, hoặc cho phép một mức độ chồng chéo giữa protein và phối tử Các phiên bản đầu tiên của phần mềm DOCK, FLOG, FTDOCK đã áp dụng phương pháp giữ phối tử và đích tác động cứng nhắc trong suốt quá trình docking [22]

2.5.2.2 Phối tử và protein đều linh động

Tương tác giữa phối tử và protein đích được chứng minh có tác động đến sự thay đổi hình dạng của protein đích, thêm vào đó, phối tử có khả năng chuyển đổi protein thành cấu trúc khác so với trạng thái không gắn kết Do đó việc docking cần thực hiện trên một thụ thể linh động để cho kết quả tin cậy nhất [38] Lý tưởng nhất là mô hình hóa tất cả các cấu dạng trong phức hợp thụ thể với phối tử Tuy nhiên trở ngại của phương pháp này là việc tính toán rất phức tạp và tốn nhiều thời gian, vì vậy phương pháp này không phù hợp khi sàng lọc với một số lượng lớn các hợp chất [22]

2.5.2.3 Phối tử linh động và đích tác động cứng

Việc docking với phối tử linh động và thụ thể được giữ cứng nhắc giúp cân bằng giữa

độ chính xác và thời gian tính toán Hầu hết các chương trình docking đã áp dụng phương pháp này như Autodock, FlexX [22]

2.5.3 Giới thiệu chung về các phần mềm docking

Ngày nay, có trên 60 chương trình docking, tuy nhiên chỉ có một vài chương trình được sử dụng rộng rãi như Autodock, DOCK, FlexX, FRED, Glide, GOLD, ICM, QXP/Flo+, Surflex Mỗi chương trình docking đều dựa trên hai thành phần cơ bản: (1) phương pháp tìm ra không gian gắn kết (conformational space) giữa phối tử và protein đích; (2) chức năng chấm điểm (scoring function) để đánh giá các kiểu gắn kết được tìm ra Việc tính toán phải đảm bảo chất có khả năng gắn kết cao hơn phải cho điểm số tốt hơn, việc này rất quan trọng trong việc tối ưu hóa các chất khởi nguồn

và trong sàng lọc ảo từ các thư viện chất lớn Từ những năm 90, các chức năng chấm điểm liên tục được phát triển và sử dụng trong các chương trình docking Các thuật toán này đều cố gắng dự đoán đúng năng lượng tự do của liên kết giữa phối tử và protein đích phù hợp với hoạt tính sinh học của chúng Trên thực tế, một chương trình

có thể sử dụng nhiều chức năng chấm điểm khác nhau để nâng cao tốc độ cũng như

độ chính xác của việc sàng lọc [23]

2.5.4 Docking bằng phần mềm FlexX (BioSolveIT GmbH)

Phần mềm FlexX tìm ra các kiểu gắn kết giữa phối tử và đích tác động dựa vào thuật toán xây dựng lớn dần (Incremental Construction Algorithm), cấu trúc mục tiêu tác động (protein) được giữ cứng, còn phối tử được thiết kế linh động bằng cách tạo ra nhiều cấu dạng khác nhau Phối tử được chia thành một tập hợp các mảnh, một trong

số đó được chọn và gắn cố định vào vùng gắn kết Các mảnh tiếp theo được ghép vào mảnh trước đó để tạo ra các cấu dạng có mức năng lượng gắn kết thấp Quá trình tiếp tục đến khi ghép xong toàn bộ các mảnh Thuật toán xây dựng lớn dần được mô tả như trong hình 2.32 [23]

Hình 2.32 Thuật toán docking xây dựng lớn dần

2.6 TỔNG QUAN VỀ ENZYM FabH

2.6.1 Vai trò của FabH trong tổng hợp acid béo ở vi khuẩn

Tổng hợp acid béo (fatty acid synthesis FAS) là một con đường chuyển hóa thiết yếu

và có ý nghĩa sống còn đối với tế bào vi khuẩn Tổng hợp acid béo ở vi khuẩn có sự tham gia của nhiều enzym khác nhau, mỗi enzym xúc tác cho một giai đoạn trong chu trình, trong khi đó, ở người, chu trình này chỉ do một enzym đa chức năng thực hiện Chính vì vậy, tác động lên quá trình tổng hợp acid béo là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng trong việc tìm ra các tác nhân kháng khuẩn mới

Enzym β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (KAS III hay FabH) xúc tác cho phản ứng ngưng tự giữa malonyl-ACP và acetyl-CoA tạo ra acetoacteyl-ACP, chất này tham gia vào chu trình nối dài mạch tạo ra các acid béo FabH còn đóng vai trò điều hòa chu trình nối dài mạch thông qua cơ chế ức chế ngược bởi chuỗi dài acyl-ACP Enzym FabH được chứng minh là enzym quan trọng và đóng vai trò thiết yếu với sự sống của tế bào vi khuẩn Nhiều hợp chất ức chế FabH có tác dụng tốt trên nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, trong đó có các chủng đa đề kháng Do đó, FabH được xem là đích tác động tiềm năng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng khuẩn mới [6]

2.6.2 Cấu trúc và cơ chế xúc tác của FabH

Enzym FabH ở E coli có vùng hoạt động là dạng đường hầm kị nước với bộ ba xúc tác Cys112, His244, Asn274 nằm ở phần cuối của đường hầm Ở S aureus, bộ ba

này là Cys112, His238, Asn268 [28] Enzym FabH xúc tác phản ứng ngưng tụ giữa malonyl-ACP và acyl-CoA thông qua hai bước

Bước 1: Sự chuyển nhóm acyl từ aceyl-CoA đến nhóm -SH của cystein tại vùng xúc tác và loại bỏ CoA

Bước 2: Ngưng tụ giữa malonyl-ACP với histamin và asparagin ở vùng hoạt động tạo ra dạng trung gian và giải phóng CO2 Dạng trung gian này sau đó ngưng tụ với nhóm acyl trước đó để tạo ra acetoacetyl-ACP [6]

Về tổng thể, cấu trúc của enzym FabH ở E coli (ecFabH) và ở S aureus (saFabH) không khác biệt đáng kể (RMS Cα là 1,0 Å) Chuỗi acid amin ở saFabH ngắn hơn 7 đơn vị so với ecFabH tại nút 193-195 [28]

Hình 2.34 Sự chồng phủ cấu trúc của ecFabH (màu vàng) và saFabH (màu xanh)

Sự khác biệt quan trọng trong cấu trúc của enzym ecFabH và saFabH là kích thước của túi gắn kết dẫn đến sự khác biệt về cơ chất của hai enzym này Ở saFabH, các

chuỗi bên di chuyển ra xa Cys112 để mở rộng khoang gắn kết, trong đó Phe87 dịch

chuyển 1,7 Å, Leu142 dịch chuyển 3,0 Å Điều này dẫn đến việc ecFabH chỉ có thể

sử dụng cơ chất là acetyl- hoặc propyl-CoA Trong khi đó, với khoang gắn kết lớn

hơn, saFabH có thể sử dụng các chất nền có kích thước lớn hơn như isobutyl-CoA,

hexanoyl-CoA, isovaleryl-CoA, đây là các chất nền ban đầu trong việc tổng hợp các

acid béo mạch nhánh cần thiết cho hoạt động sống của S aureus [28]

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Các chất được tổng hợp trong nghiên cứu

- Tổng hợp 5 chalcon từ phản ứng của 5-bromosalicylaldehyd và 5 dẫn chất acetophenon

- Tổng hợp các dẫn chất 2-pyrazolin từ các chalcon và dẫn chất hydrazin

- Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất được tổng hợp

hiệu

1

(E)-3-(5-bromo-2-en-1-on

hydroxyphenyl)-1-phenylprop-2-C1

2

(E)-3-(5-bromo-2-bromophenyl)prop-2-en-1-on

hydroxyphenyl)-1-(4-C3

3

hydroxyphenyl)-1-(p-tolyl)prop-

hydroxyphenyl)-1-(4-C4

5

(E)-3-(5-bromo-2-clorophenyl)prop-2-en-1-on

3-(4-bromophenyl)-5-(5-bromo-1H-pyrazol

HP2

8

(4-methylphenyl)-4,5-dihydro-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-1H-pyrazol

HP3

9

(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-

3-(4-bromophenyl)-5-(5-bromo-dihydro-1H-pyrazol

HP7

13

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)- 3-(4-methylphenyl)-1-phenyl-

4,5-dihydro-1H-pyrazol

HP8

14

(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-4,5-dihydro-1H-pyrazol

HP9

15

(4-clorophenyl)-1-phenyl-4,5-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-dihydro-1H-pyrazol

HP12

18

(4-methylphenyl)-1-acetyl-4,5-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-dihydro-1H-pyrazol

HP13

19

(4-methoxyphenyl)-1-acetyl-4,5-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-dihydro-1H-pyrazol

HP14

20

(4-clorophenyl)-1-acetyl-4,5-

5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)-3-dihydro-1H-pyrazol

HP15

3.1.2 Nguyên liệu cho tổng hợp và tinh chế

Bảng 3.3 Dung môi sử dụng tổng hợp (S), tinh chế (P), sắc kí (C)

ST

T

lượng

1 Cồn tuyệt đối   Chemsol, Việt Nam ≥ 99,7 %

4 Dicloromethan   Quangdong, Trung Quốc ≥ 99,5 %

7 Acid acetic băng   Guangdong, Trung Quốc ≥ 99,5 %

3.1.3 Nguyên liệu thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Hoạt tính kháng khuẩn được thử trên các chủng:

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Escherichia coli ATCC 25922

- Enterococcus faecalis ATCC 29212

- Staphylococcus aureus ATCC 25921

Hoạt tính kháng nấm được thử trên các chủng nấm da:

3.1.4 Dụng cụ, thiết bị

1 Cân phân tích Kern ABS 220-4

2 Máy khuấy từ gia nhiệt CB 162

3 Bếp điện Gali

4 Bơm chân không TPR-6 Woosung, KOREA

5 Tủ sấy Memmert 500, Allemand

6 Nồi hấp tiệt trùng Himaraya

7 Tủ ấm Shellab

8 Máy vortex Labnet

9 Tủ cấy vô khuẩn

3 Phổ hồng ngoại IRAffinity-1S (SHIMADZU)

4 Phổ UV-Vis UV-2010 Hitachi, JAPON

5 Phổ 1H, 13C NMR Bruker BioSpin GmbH, USA

3.1.5 Công cụ nghiên cứu docking

Docking sử dụng các phần mềm được cung cấp bởi Bộ môn Hóa Dược – Khoa Dược – Đại học Y Dược TpHCM Các phần mềm được sử dụng bao gồm:

- MOE 2008.10 (Chemical Computing Group Inc.)

- Sybyl – X 2.0 (Tripos L.P.)

- LeadIT với công cụ FlexX (BioSolveIT GmbH)

- Các enzym FabH của các chủng vi khuẩn khác nhau được tải về từ ngân hàng dữ liệu protein https://www.rcsb.org/

Bảng 3.6 Các protein được sử dụng trong nghiên cứu

STT Chủng vi khuẩn Mã số Ligand đồng kết tinh IC50 Độ phân