Luận văn thạc sĩ: Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản của phụ nữ

Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa là thuật ngữ dùng để chỉ các bệnh ở nữ giới gây ra tình trạng viêm nhiễm tại cơ quan sinh dục như: âm đạo, cổ tử cung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, và các vùng xung quanh. Tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm phụ khoa ở nữ giới chưa quan hệ tình dục lần nào sẽ thấp hơn vì có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tử cung. Đối với nữ giới đã quan hệ tình dục, đặc biệt đang trong thời kì mang thai, sinh nở thì nguy cơ mắc các bệnh viêm phụ khoa sẽ rất cao. Viêm nhiễm phụ khoa được coi là bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Nhiều thống kê từ 2004 đến nay cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ vẫn ở mức cao, chiếm đến 90%.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thanh Hiền

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CÓ HOẠT TÍNH

PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO

SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thanh Hiền

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CÓ HOẠT TÍNH

PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO

SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa học thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của mình,trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Visinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) đãtin tưởng, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoànthành luận văn này

Trong thời gian học tập tại trường em cũng xin chân thành cảm ơn tới cácthầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học, Phòng Sinh học Nano và ứng dụng –KLEPT, Khoa Sinh học và Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên(ĐHQGHN) đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập vàthực hiện luận văn

Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các anh chị,các em sinh viên và bạn bè trong phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi trườngtrong suốt thời gian em thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạođiều kiện, quan tâm, động viên và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập, nghiêncứu và hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên

Nguyễn Thanh Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Probiotic 3

1.1.1 Khái niệm probiotic 3

1.1.2 Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp 3

1.2 Vai trò của vi khuẩn probiotic 4

1.2.1 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa 5

1.2.2 Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến 6

1.2.3 Tác động trên biểu mô ruột 7

1.2.4 Kích thích hệ thống miễn dịch 8

1.2.5 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose 8

1.2.6 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch 8

1.2.7 Khả năng chống dị ứng 8

1.2.8 Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ 9

1.3 Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics 11

1.3.1 Sinh ra H2O2 11

1.3.2 Sinh ra axit lactic 11

1.3.3 Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn 12

1.4 Tổng quan chung về sức khỏe sinh sản của phụ nữ 13

1.5 Một số loại thực phẩm chức năng probiotics thương mại dùng cho con người 14

1.5.1 Một số loại thực phẩm chức năng probiotics dành riêng cho phụ nữ được thương mại trên Thế giới 14

1.5.2 Một số thực phẩm chức năng probiotics thương mại trong nước hỗ trợ

sức khỏe cho con người 15

1.6 Vi khuẩn probiotic trong sữa mẹ 16

1.7 Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp bằng phương pháp đông khô 17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ 18

2.1.3 Thiết bị 18

2.1.4 Dụng cụ 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp trong mẫu sữa mẹ 20

2.2.2 Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro 23

2.2.3 Nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn được tuyển chọn 25

2.2.4 Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá trình đông khô của các chủng được tuyển chọn 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và kết quả tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ 29

3.1.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29

3.1.2 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp từ sữa mẹ 30 3.1.3 Kết quả định danh chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ 32

3.2 Kết quả đánh giá một số tính chất, hoạt tính và điều kiện nhân giống của

chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro 34

3.2.1 Kết quả đánh giá một số tính chất và hoạt tính probiotic của chủng vi

khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro 34 3.2.2 Kết quả nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi

khuẩn được tuyển chọn 433.3 Nghiên cứu các công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống của các chủngtuyển chọn sau khi đông khô 453.3.1 Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trước khi đông khô 453.3.2 Mật độ sống của chủng vi khuẩn tuyển chọn sau khi đông khô 46KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic 27

với các chất bảo vệ 27

Bảng 2 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri trong sữa mẹ ở khu vực thành thị và

khu vực nông thôn tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29

Bảng 3 Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L reuteri và Lactobacillus spp 30

Bảng 4 Đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn 33 Bảng 5 Số đo vòng kháng khuẩn của chủng tuyển chọn với các loại kháng sinh 40 Bảng 6 Khả năng ức chế đối với các vi khuẩn và nấm có hại 42

Bảng 7 Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L rhamnosus SMH1 46 Bảng 8 Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L reuteri SMH2 47

Hình 4 Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến

khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102] 7

Hình 5 Thiết kế thí nghiệm 19 Hình 6 Máy đông khô vi khuẩn 28 Hình 7 Đường cong sinh trưởng và lượng axit lactic sinh ra theo thời gian của

chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 và chủng đối chứng 34

Hình 8 Khả năng chịu muối mật của chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2

Hình 11 Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của chủng ĐC L reuteri VTCC

910087 (Hình 6A), chủng L reuteri SMH2 (Hình 6B) và L rhamnosus SMH1

rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 và chủng đối chứng L reuteri VTCC 91008744

MỞ ĐẦU

Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa là thuật ngữ dùng để chỉ các bệnh

ở nữ giới gây ra tình trạng viêm nhiễm tại cơ quan sinh dục như: âm đạo, cổ tửcung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, và các vùng xung quanh Tỉ lệ mắcbệnh viêm nhiễm phụ khoa ở nữ giới chưa quan hệ tình dục lần nào sẽ thấp hơn vì

có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tử cung.Đối với nữ giới đã quan hệ tình dục, đặc biệt đang trong thời kì mang thai, sinh nởthì nguy cơ mắc các bệnh viêm phụ khoa sẽ rất cao Viêm nhiễm phụ khoa được coi

là bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam.Nhiều thống kê từ 2004 đến nay cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ trong

độ tuổi sinh đẻ vẫn ở mức cao, chiếm đến 90% [1] Nếu không điều trị hoặc điều trịkhông đúng cách, không đầy đủ có thể gây nên các biến chứng như vô sinh, chửangoài tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung và các biến chứng cho thai nhi như thaichết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ đây được coi là một vấn đề rất lớn đã vàđang rất được quan tâm vì những thiệt hại do bệnh gây ra là rất lớn Mặc dù nhiễmtrùng đường sinh dục có thể có các triệu chứng khác nhau, nhưng không phải lúcnào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra Trên thực tế việc chẩn đoán thậm chí còn khókhăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm Các trường hợp nhiễm trùng nặng đượcbác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với liều khá cao nên gây ra các tácdụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sinh hoạt tình dục… và nếu đượcđiều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, một vấn đề nổi cộm vàthách thức hiện nay

Để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm trùng đường sinh sản, nhiềunghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng các chế phẩm probiotics chứa các chủng lợi

khuẩn Lactobacillus spp là hiệu quả Các sản phẩm probiotics dành cho phụ nữ

hiện nay bắt đầu được sử dụng khá phổ biến dưới dạng sản phẩm chức năng hỗ trợđiều trị cho các bệnh nhân nhiễm trùng đường âm đạo và tiết niệu Các sản phẩmthương mại này được bán nhiều nhất trên thị trường Việt Nam phần lớn là hàngnhập khẩu từ Mỹ, Anh, Nhật Bản với giá thành rất cao và hiện tại Việt Nam chưa cómột dòng sản phẩm nào nghiên cứu và phát triển dành riêng cho phụ nữ Sản phẩmnhập ngoại chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp của người dân ViệtNam, đặc biệt là phụ nữ ở vùng nông thôn và miền núi Trong khi đó, hơn 80% phụ

nữ Việt Nam bị mắc bệnh phụ khoa Chính vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất một số

chế phẩm probiotics từ Lactobacillus spp phân lập ở sữa mẹ của các bà mẹ đang

cho con bú tại Việt Nam có các đặc tính ưu việt về việc ức chế các vi sinh vật gây

viêm nhiễm phụ khoa là việc làm hết sức cần thiết, có ý nghĩa cộng đồng và ý nghĩathực tiễn cao Dựa trên nhu cầu và tính cấp thiết của vấn đề nêu trên nên chúng tôi

đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp có hoạt

tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ”.

Hiện nay, vẫn còn rất ít tài liệu công bố liên quan đến sự xuất hiện của

Lactobacilli và Lactobacillus reuteri trong sữa mẹ ở Việt Nam Chính vì thế, nghiên

cứu này được thực hiện để điều tra sự xuất hiện của nhóm vi khuẩn thuộc chi

Lactobacillus spp và loài L reuteri trong sữa mẹ, xác định mối liên hệ có thể có giữa sự có mặt của L reuteri trong sữa mẹ của các bà mẹ ở vùng nông thôn và

thành thị tại miền Bắc Việt Nam và nghiên cứu các đặc tính probiotic của chủng

Lactobacillus spp được tuyển chọn để hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics

dành cho phụ nữ

Mục tiêu của đề tài:

- Xác định được tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri có trong sữa mẹ của các bà mẹ

sống tại khu vực nông thôn và thành thị ở một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và

tuyển chọn được 2 chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic tốt nhất.

- Xác định được công thức phối trộn để nâng cao mật độ sống sót sau quá trìnhđông khô của các chủng được tuyển chọn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Probiotic

1.1.1 Khái niệm probiotic

Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và cómột số nghĩa khác nhau theo thời gian Khái niệm này được sử dụng lần đầu tiênbởi Lilley và Stillwell vào năm 1965 để mô tả các chất được tiết ra bởi một loại visinh vật kích thích sự phát triển của loại vi sinh vật khác Do vậy, khái niệm này cónghĩa ngược lại hoàn toàn với “antibiotic – kháng sinh” Tuy nhiên, việc sử dụngkhái niệm probiotic này đã không tồn tại và sau đó được Sperti sử dụng để mô tảcác chất chiết xuất từ mô kích thích sự phát triển của vi sinh vật năm 1971 Mãi đếnnăm 1974, Parker mới sử dụng probiotic để chỉ những vi sinh vật như vi khuẩn haynấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vậtđường ruột của sinh vật chủ Định nghĩa này liên quan đến việc sử dụng probioticvào hệ vi sinh đường ruột nhưng bao gồm “các chất phụ khác” đã cho probioticnghĩa rộng bao gồm cả các kháng sinh Trong việc nỗ lực cải thiện định nghĩa, năm

1989 Fuller đã định nghĩa lại probiotic là một chất (có bổ sung vi sinh vật sống) ảnhhưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruộtcủa sinh vật chủ Định nghĩa sửa đổi này nhấn mạnh sự cần thiết của một probiotic[38]

Hiện nay, chế phẩm probiotics được hiểu là những chế phẩm có chứa các visinh vật sống, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe, đặc biệt

là hệ tiêu hóa [80], [48], [82] Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm cả vi khuẩn

có lợi và có hại Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể giúp kìm hãm các

vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cũng như tăng cườngkhả năng miễn dịch Probiotics được coi là an toàn để tiêu thụ nhưng cũng có thểgây ra tương tác giữa vi khuẩn & sinh vật chủ và tác dụng phụ không mong muốntrong những trường hợp hiếm gặp [31], [90], [32] Khi vi khuẩn có hại trong cơ thểlấn át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học probiotics

để lấy lại sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể

1.1.2 Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp.

Lactobacillus spp thường được xem là một trong các loại probiotics phổ

biến Lactobacilli là một chi của vi khuẩn Gram dương, kị khí hoặc vi hiếu khí, hìnhque, không hình thành bào tử [57] Chúng là một phần chính của nhóm vi khuẩnlactic (tức là, chúng chuyển đổi đường thành axit lactic) Môi trường sống chủ yếu

có chứa carbohydrate (lớp chất nhầy của người và động vật, chất thải và thực phẩmlên men hay hư hỏng) Ở người, chúng tạo thành một phần quan trọng của hệ visinh vật tại một số vị trí cơ thể, chẳng hạn như hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống

sinh dục Ở phụ nữ châu Âu, các loài thuộc chủng Lactobacillus spp thường là một

phần chính của hệ vi sinh vật âm đạo [53], [36]

Hình 1 Hình thái các sinh vật Lactobacillus và tế bào biểu mô âm đạo

(ảnh nhuộm Gram) [64]

L reuteri là một loài vi khuẩn Gram dương, chúng được tìm thấy ở ruột của

động vật có vú, chim, sữa mẹ và dịch âm đạo ở người Chúng là một loài probiotic

đã được ứng dụng từ rất lâu và có khả năng sinh ra reuterin - một chất có khả năng

ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram âm và Gram dương có hại cùng với

nấm men, nấm và động vật nguyên sinh [126] L reuteri có thể giúp cơ thể chống

lại nhiều bệnh nhiễm trùng thông thường, thúc đẩy sức khoẻ tổng thể ở cả trẻ em và

người lớn Với những đặc tính hữu ích vốn có của loài này, việc tuyển chọn L reuteri trong nghiên cứu này để sản xuất thực phẩm chức năng probiotics nhất định

sẽ có tiềm năng trong việc bảo vệ sức khỏe con người nói chung và cho sức khỏesinh sản của phụ nữ nói riêng

1.2 Vai trò của vi khuẩn probiotic

Việc duy trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trong bảo

vệ sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật Vai trò chính của vi khuẩn probiotic là giúpcho hệ VSV đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản sự thâm nhập và phát triển VSV gâybệnh, tăng cường đề kháng tự nhiên với các bệnh truyền nhiễm của đường tiêu hóa.Vai trò này được thể hiện ở một số biểu hiện cụ thể như sau

1.2.1 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa

Sự sống sót của vi khuẩn probiotic ở những phần khác nhau của đường tiêuhóa thường khác nhau giữa các loài Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sựcân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy mộtvài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ chế phẩm probiotics, phụ thuộc vào công dụng vàliều lượng của chủng vi khuẩn Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên thì

vi khuẩn probiotic định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêuthụ này thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống Điều này đúng cho tất cảcác loại vi khuẩn probiotic [115]

Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng gồm có các axit hữu cơ gồm cácaxit béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate và butyrate, nhất làaxit lactic, hydrogen peroxide (H2O2) và các chất diệt khuẩn có thể ức chế cả khuẩnGram (+) và Gram (-) Cụ thể những hợp chất này làm giảm pH trong khoang ruộtgây ảnh hưởng đến quá trình điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đườngruột thông qua việc cản trở hoạt động tiết ra enzyme và tạo ra các độc tố của vikhuẩn gây hại đường ruột [107], [93], [70], [119]

Hình 2 Tương tác của các vi sinh vật trong đường ruột [35]

Chú thích: Các mầm bệnh và độc tố của vi sinh vật gây hại kết dính vào màng nhầy, cụ thể

là thụ thể của đường ruột và phá hủy nó Khi cơ thể được bổ sung vi khuẩn probiotic, các

tăng lên Vi khuẩn probiotic cạnh tranh các chất dinh dưỡng quan trọng với mầm bệnh

Loại trừ bằng cách cạnh tranh/ ngụy trang: vi khuẩn probiotic khóa các thụ thể bêntrong đường ruột làm cho mầm bệnh không bám vào được, do đó loại trừ mầm bệnh Sự tập hợp các vi khuẩn probiotic gây cản trở sự gắn kết và tăng sinh của mầm bệnh

Các vi khuẩn probiotic ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranhdinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của các VSV gây bệnh phổ biến như

Salmonella và Shigella Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường vi khuẩn có

lợi và giảm số lượng những vi khuẩn gây hại mang mầm bệnh Cuối cùng điềuchỉnh thành phần phân bố của vi khuẩn đường ruột [115].

1.2.2 Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến

Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơung thư ruột kết và ung thư bàng quang Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gâyung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu Cơ chế này

đã được nghiên cứu và kết luận như sau [29]

+ Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư

+ Sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những axit yếu có lợi cho đườngruột như axit butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột

và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương màu lành và phục hồi chứcnăng

+ Điều hòa những enzyme như nitroreductase, ß-glucuronidase (các enzyme này cókhả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng).+ Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch

Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in-vitro và in-vivo, việc

mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi

Hình 3 Các chủng vi khuẩn probiotic và các cơ chế chống lại các bệnh ung thư

[29]

1.2.3 Tác động trên biểu mô ruột

Vi khuẩn probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tửkháng viêm cho đường ruột Cụ thể là đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làmgiảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ visinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón Vi khuẩn probiotic giúp đẩymạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô; giảm việc kích thích bài tiết &những hậu quả khi bị viêm gây ra do lây nhiễm vi khuẩn và đẩy mạnh việc tạo racác phân tử phòng vệ như chất nhầy [102]

Hình 4 Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến

khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102]

Vi khuẩn probiotic hỗ trợ điều hòa cân bằng nội môi của tế bào chủ Vikhuẩn probiotic gây ra một số phản ứng có lợi cho tế bào chủ, bao gồm: ngăn chặntác động của vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản xuất các chất kháng khuẩn (Anti-bacterial substance) và cạnh tranh với mầm bệnh để liên kết với các tế bào biểu mô;xác định sự cân bằng giữa khả năng miễn dịch cần thiết và khả năng miễn dịchphòng vệ quá mức bằng cách tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh (innate immunity),điều chỉnh tăng sản xuất cytokine chống viêm và ức chế sản xuất cytokine tiền

viêm; thúc đẩy cân bằng nội môi của tế bào biểu mô ruột bằng cách tăng tỉ lệ sống,chức năng rào cản và phản ứng bảo vệ bên trong tế bào chất (survival, barrierfunction and cytoprotective responses) DC, dendritic cell; IL, interleukin; M, M-cell; Hsp, heat shock protein [102].

1.2.4 Kích thích hệ thống miễn dịch

Thực phẩm chức năng probiotics có thể góp phần cải thiện hệ thống miễndịch của cơ thể, giúp tăng cường hàm lượng globulin Sự hấp thụ thực phẩm chứcnăng probiotics đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể,giúp tăng cường hiệu quả của một số vắc xin như vắc xin thương hàn [113] Nhữngcải thiện hệ miễn dịch bởi vi khuẩn probiotic có thể được trình bày theo 3 cách sau:tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vậthay hạt carbon; tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là IgM, IgA và interferon(nhân tố kháng vi rút không đặc hiệu); tăng cường khả năng định vị kháng thể trên

bề mặt ruột thường là IgA [113]

1.2.5 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được

lactose

Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ởnhiều người, gây đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose.Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic trong sảnphẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactose của cơ thểbằng cách cung cấp lactase cho dạ dày và đường ruột Sử dụng các thực phẩm cóchứa các chủng vi khuẩn probiotic này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đườnglactose [88]

1.2.6 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan

1.2.7 Khả năng chống dị ứng

Thực phẩm chức năng probiotics góp phần chống lại một số dị ứng của cơthể và cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể (ví dụ như axit folic, niacin,riboflavin, vitamin B6 và B12) [76], [75], [114]

1.2.8 Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ

Việc sử dụng thực phẩm chức năng probiotics chứa các lợi khuẩn đã đượcphổ biến rộng rãi trên toàn thế giới Ngoài các vai trò kể trên, thực phẩm chức năngprobiotics giành riêng cho phụ nữ còn góp phần phòng ngừa và điều trị viêm nhiễmphụ khoa

Các nghiên cứu in-vitro chỉ ra rằng một số chủng Lactobacillus spp có thể

ức chế sự gắn kết của Gardnerella vaginalis với biểu mô âm đạo và tạo ra H2O2,axit lactic và các chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây nhiễm

trùng âm đạo Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy đặt viên nén chứa L acidophilus trong âm đạo trong 6 - 12 ngày hay uống L acidophilus hoặc L rhamnosus GR-1

và L fermentum RC-14 trong 2 tháng có thể giúp chữa trị và làm giảm sự tái phát

nhiễm khuẩn âm đạo đồng thời giúp gia tăng lượng Lactobacilli trong âm đạo vàphục hồi một hệ vi sinh âm đạo khỏe mạnh một cách thường xuyên hơn là dùngthuốc tạm thời (axit axetic) hoặc không điều trị [34]

Mastromarino và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hiệu quả của viên

nén đặt âm đạo chứa Lactobacillus trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo và trong việc

khôi phục hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh 39 phụ nữ đã được ghi tên vào một thử

nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả tác động của viên nén Lactobacillus lên vi sinh

vật âm đạo và so sánh với nhóm sử dụng giả dược Sản phẩm được chỉ định dùngliên tục trong 7 ngày Các chỉ số lâm sàng, điểm số Gram âm đạo và các triệu chứng

đã được so sánh với những người ở lần khám đầu tiên, những người đã hoàn thànhđiều trị và 2 tuần sau đó Sau khi hoàn thành điều trị, tất cả bệnh nhân trong nhóm

sử dụng Lactobacillus (n = 18) không còn nhiễm khuẩn âm đạo, cho thấy hệ vi sinh

vật âm đạo khỏe mạnh (83%) hoặc ở ngưỡng trung gian (17%) Ngược lại, chỉ có 2bệnh nhân không còn nhiễm khuẩn âm đạo, hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (12%)trong số 16 phụ nữ được điều trị bằng giả dược (p < 0,001) Hai tuần sau khi hoànthành điều trị, việc điều trị đã thành công với 61% số bệnh nhân được điều trị bằng

Lactobacillus so với 19% số bệnh nhân điều trị thành công được điều trị bằng giả

dược (p < 0,05) Trong nhóm điều trị, tổng số bệnh nhân có triệu chứng và cường

độ của các triệu chứng nhiễm khuẩn âm đạo đặc biệt là viêm âm đạo đã giảm đáng

kể ở cả hai lần theo dõi tiếp theo Các dữ liệu cho thấy bổ sung các chủng

Lactobacillus ngoại sinh được lựa chọn là có thể khôi phục lại hệ vi sinh vật âm đạo

khỏe mạnh và được sử dụng trong điều trị viêm nhiễm âm đạo phụ khoa [60]

Chế phẩm probiotics chứa các loài L rhamnosus và L reuteri còn được bác

sĩ chỉ định hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn âm đạo khi kê đơn dưới dạng thực phẩmchức năng sử dụng qua đường uống cùng với kháng sinh metronidazole

(thuốc thuộc về nhóm kháng sinh nitroimidazole, hoạt động bằng cách ngăn chặn sựtăng trưởng của vi khuẩn và động vật nguyên sinh Kháng sinh này rất có hiệu quảkhi xử lý với nhiễm khuẩn và protozoa ở đường âm đạo) Kết quả cho thấy số lượng

Lactobacillus được phát hiện nhiều hơn đáng kể ở các bệnh nhân được điều trị bằng

metronidazole kết hợp với probiotic so với các bệnh nhân chỉ được điều trị vớimetronidazole trong 5 ngày [105]

Theo các nghiên cứu về vi khuẩn âm đạo ở phụ nữ thì các loài Lactobacillus chiếm đa số trong các vi sinh vật có lợi ở âm đạo những phụ nữ khỏe mạnh Các loài G vaginalis, Prevotella, Atopobium, Sneathia và Megasphaera thường được

gặp ở những phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo và được điều trị bằng tinidazole(Tinidazole là một thuốc kháng sinh nhóm nitroimidazole Thuốc hoạt động bằngcách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn và sinh vật đơn bào) Khi kết hợp điều

trị kháng sinh này kèm với chế phẩm probiotics có chứa 2 chủng L reuteri RC-14

và L rhamnosus GR-1 sử dụng qua đường uống, số lượng L iners hoặc L crispatus

gia tăng mạnh ở âm đạo phụ nữ cùng với khả năng phục hồi cân bằng nội mô dẫnđến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics và kháng sinh trong điều trị nhiễmkhuẩn âm đạo đem lại hiệu quả cao Điều đó chứng tỏ khả năng khôi phục cân bằngnội môi có liên quan đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics với điều trịkháng sinh trong việc nhiễm khuẩn âm đạo [55]

Trong một nghiên cứu khác về “Tác động của chế phẩm Probiotic SYNBIOđặt âm đạo trong việc thúc đẩy sức khỏe âm đạo của phụ nữ” đã cho thấy việc sử

dụng chế phẩm probiotics Lactobacillus dạng viên nang đặt âm đạo làm gia tăng

các vi khuẩn có lợi, giúp chúng chiếm và tồn tại trong âm đạo Việc sử dụng chếphẩm sinh học probiotics dạng thuốc đặt âm đạo đã được thực hiện trên 35 phụ nữkhỏe mạnh trong nghiên cứu của Maria cùng cộng sự Mỗi phụ nữ được kiểm tra balần trong quá trình nghiên cứu Người tình nguyện được hướng dẫn nhận và sử dụng

thuốc đặt SYNBIO (L rhamnosus IMC 501 và L paracasei IMC 502) mỗi ngày và

duy trì trong 7 ngày Các miếng gạc âm đạo được thu thập 3 lần, mỗi lần cách nhau

7 ngày sau khi sử dụng SYNBIO để xác định số lượng lactobacilli có mặt, giá trị pH

và chẩn đoán viêm nhiễm phụ khoa dựa vào thang điểm Nugent phụ thuộc hình thái

vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram (quan sát trên 10 hiển vi trường) và chẩn đoánxác định viêm nhiễm phụ khoa khi đạt từ 7 đến 10 điểm [69] Khi đánh giá khảnăng dung nạp trong điều trị được dựa trên phân tích các loại và sự xuất hiện củacác tác dụng bất lợi, kết quả cho thấy thuốc đặt âm đạo probiotic được dung nạp tốt

và không có tác dụng phụ nào đã được báo cáo Điểm số Nugent ở ngưỡng trunggian đã được ghi chép lại ở 40% phụ nữ tại lần khám thứ nhất và các điểm ở

ngưỡng trung gian này trở lại bình thường vào ngày thứ 7 (kết thúc điều trị) ở 20%phụ nữ tham gia SYNBIO đã góp phần làm tăng đáng kể lượng Lactobacilli tại lầnkhám thứ 2 Các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho thấy sự hiện diện của hai chủng

có nguồn gốc từ SYNBIO ở 100% phụ nữ khám lần 2 và 34% khi đến thăm khámlần 3 Không có thay đổi đáng kể nào được ghi nhận về độ pH giữa các lần thămkhám Sản phẩm SYNBIO an toàn cho việc sử dụng hàng ngày ở phụ nữ khỏe mạnh

và có thể sẽ rất hữu ích để khôi phục và duy trì một hệ vi khuẩn âm đạo khỏe mạnh[103]

1.3 Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ

nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics

1.3.1 Sinh ra H 2 O 2

H2O2 là một chất oxy hóa mạnh Các nghiên cứu đã cho thấy chất này cũnggiống như O2- hay OH- có khả năng gây tổn thương cao khi tham gia vào phản ứngFenton Chúng gây tổn thương cấu trúc và chức năng các đại phân tử trong tế bàonhư protein, ADN, lipid…dẫn đến gây chết mạnh các vi khuẩn [86] Một số chủng

Lactobacillus được tìm thấy có tác dụng ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh ở

âm đạo trong ống nghiệm bằng cách sản xuất tạo ra H2O2 Mastromarino và nhóm

cộng sự đã nghiên cứu L salivarius FV2 và L gasseri 335 được phân lập từ âm đạo

của người và phát hiện thấy chúng có thể sản xuất ra một lượng lớn H2O2 cũng như

ức chế sự tăng trưởng của G vaginalis [60] McLean và Rosenstein đã chứng minh

L acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã sản xuất

lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp., Prevotella bivia và

G vaginalis được lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo [62] Mặc dù

đã có khá nhiều nghiên cứu chứng minh Lactobacilli sản xuất H2O2 bảo vệ chođường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng và quan điểm cho rằng H2O2 là yếu tố kháng

khuẩn chính được sản xuất bởi Lactobacillus vẫn là phổ biến nhất nhưng một nghiên cứu in-vitro khác lại chứng minh rằng H2O2 được tạo ra do Lactobacillus

không phải là nguyên nhân chính gây ức chế các tác nhân gây bệnh Các

Lactobacillus này sản xuất H2O2 có thể làm tăng khả năng hoạt động của các chuỗipeptide kháng khuẩn của vật chủ (muramidase và lactoferrin) cũng như hoạt tínhkháng khuẩn của các tế bào biểu mô [11]

1.3.2 Sinh ra axit lactic

Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạocủa axit lactic được chứng minh rõ ràng Axit lactic ở nồng độ sinh lý (ví dụ: 110mM) thậm chí ở pH 4,5 làm giảm 106 lần khả năng tồn tại của 17 loại vi khuẩn

khác nhau gây viêm nhiễm âm trong khi đó lại không ảnh hưởng đến khả năng tồn

tại của bốn loài Lactobacillus spp âm đạo trong nghiên cứu in-vitro Đáng chú ý là

hoạt tính kháng khuẩn của axit lactic có cường độ lớn hơn các chất được axit hóa

đến pH 4,5 như axit chlohydric hoặc axit axetic [70] Ngoài ra, ở gần điều kiện vivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ không kết hợp với bacteriocin vẫn có hiệu quả kháng

ex-vi khuẩn gây ex-viêm nhiễm ở đường sinh dục nữ [30] Một số nghiên cứu đã chứngminh rằng axit lactic có tác dụng chính trong chống lại các bệnh do vi khuẩn gây rabệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections- STIs) chứkhông phải là H2O2 Axit lactic sinh ra bởi L crispatus và L gasseri đã làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [67] và Neisseria gonorrhoeae [45] Axit lactic sản xuất bởi

L crispatus đã được chứng minh có tác dụng ức chế N gonorrhoeae và G vaginalis trong mô hình niêm mạc âm đạo ở lợn [20] Tóm lại, những nghiên cứu in-vitro và ex-vivo đều cho thấy rằng axit lactic được sản sinh ở các chủng probiotic thuộc chi Lactobaciilus có khả năng duy trì hệ vi sinh vật âm đạo và bảo vệ vi

khuẩn chống lại bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục

1.3.3 Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn

Bacteriocin có bản chất là protein hoặc các chuỗi peptide được sản xuất bởi

vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn tương đồng hoặc các chủng

vi khuẩn có liên quan chặt chẽ với chủng đó Chúng tương tự như các yếu tố diệtnấm men và paramecium, chúng đa dạng về cấu trúc, chức năng và về sinh thái học.Các ứng dụng của bacteriocin đang được thử nghiệm để đánh giá ứng dụng củachúng như các kháng sinh phổ hẹp [28]

Bacteriocin lần đầu tiên được André Gratia phát hiện năm 1925, cho đến nay

có hàng ngàn loại bacteriocin đã được nghiên cứu Ông đã tham gia vào quá trìnhtìm kiếm các cách để tiêu diệt vi khuẩn, điều này cũng dẫn đến sự phát triển củakháng sinh và phát hiện ra bacteriophage, tất cả chỉ trong một vài năm Ông ấy đãgọi chất kháng khuẩn phát hiện đầu tiên của mình là colicine vì chất này có khả

năng giết chết E coli [44].

Việc sản xuất các chất kháng khuẩn bởi một số Lactobacillus cũng đã được tìm thấy với vai trò ức chế tăng trưởng của G vaginalis, ít nhất là trong ống nghiệm Aroutcheva cùng các cộng sự đã kiểm tra 22 chủng Lactobacillus và nhận thấy rằng 80% số chủng sản xuất một loại độc tố ức chế sự phát triển của G vaginalis [15] Trong một nghiên cứu khác, Simoes và cộng sự đã phát hiện thấy sự tăng trưởng của 28 trường hợp (78%) trong số 36 trường hợp lâm sàng nhiễm G vaginalis bị ức chế bởi vi khuẩn L acidophilus do các chủng này nhạy cảm với

bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn này [89]

1.4 Tổng quan chung về sức khỏe sinh sản của phụ nữ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sức khỏe sinh sản (SKSS) là trạng tháikhỏe mạnh về thể chất, về tinh thần và hòa hợp xã hội về tất cả các phương diệnliên quan đến quá trình sinh sản trong suốt cuộc đời Chăm sóc SKSS là tập hợp cácphương pháp, kỹ thuật và dịch vụ nhằm giúp cho con người có tình trạng SKSSkhỏe mạnh thông qua việc phòng chống và giải quyết những vấn đề liên quan đếnSKSS Điều này cũng bao gồm cả sức khỏe tình dục với mục đích nâng cao chấtlượng cuộc sống và mối quan hệ giữa con người với con người mà không chỉ dừnglại ở chăm sóc y tế và tư vấn một cách đơn thuần cho việc sinh sản cùng các nhiễmtrùng đường sinh dục Các nghiên cứu về SKSS được tiến hành rất sớm trên thếgiới, chủ yếu là các nước phát triển như Mỹ và các nước châu Âu

Hiện nay, tỉ lệ phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ mắc viêm nhiễm phụ khoa là rấtcao (trên 80%) [1], đây được coi là một vấn đề lớn đã và đang rất được quan tâm vìnhững thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra là rất lớn bao gồm những gánh nặng về y

tế cũng như các vấn đề về gia đình và xã hội Nếu bệnh không được điều trị kịp thờihoặc điều trị không đúng, không đầy đủ có thể gây ra những biến chứng như: vôsinh, mang thai ngoài tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung, các biến chứng cho thainhi như thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ Viêm nhiễm phụ khoa là bệnh

lý nhiễm trùng đường sinh sản ở phụ nữ gây ra chủ yếu bởi G vaginalis, Mycoplasma hominis và một số vi khuẩn kị khí Bệnh gây ra do nhóm vi khuẩn có lợi ở âm đạo Lactobacillus spp bị thay thế dẫn đến tình trạng phát triển quá mức

của vi khuẩn kị khí có hại Trên thế giới và ở Việt Nam, viêm nhiễm phụ khoa làbệnh lý nhiễm trùng phổ biến ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản Viêm nhiễm phụkhoa gặp ở tất cả các chủng tộc người, tỉ lệ mắc bệnh cao chiếm 40% đến 80% tùytheo vùng miền [10], [4], [2]

Ở Hoa Kỳ, theo khảo sát của Bộ Y tế Quốc gia thì tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụkhoa chiếm 29% ở phụ nữ từ 14 đến 49 tuổi và 50% ở người Mỹ gốc Phi [13].Nghiên cứu của Gavin và cộng sự về sức khỏe sinh sản và tình dục từ 2002 đến

2007 cho thấy riêng năm 2006, có khoảng 1 triệu người ở tuổi vị thành niên và

thanh niên tuổi từ 10 đến 24 tuổi ở 33 bang đã bị lậu do nhiễm Chlamydia hoặc

xoắn khuẩn giang mai [40] Ở các quốc gia đang phát triển, có nhiều nghiên cứu đãđược báo cáo với tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụ khoa cũng rất cao Theo Aggarwal vàcộng sự nghiên cứu trên 2325 phụ nữ có chồng trong độ tuổi sinh đẻ tại vùng nôngthôn Harryana, Ấn Độ có tới 61% có ít nhất một triệu chứng của viêm nhiễm phụkhoa trong đó viêm âm đạo là 32%, viêm cổ tử cung là 21%, bệnh lý viêm khung

chậu là 19%, xét nghiệm dịch âm đạo có 48% viêm âm đạo do vi khuẩn, 9% do

trùng roi âm đạo và 0,8% do nấm Candida albicans [12].

Nghiên cứu của Bùi Thị Thu Hà ở 380 phụ nữ từ 18 đến 49 tuổi ở nội thành

Hà Nội (2005) cũng cho kết quả tỉ lệ mắc viêm nhiễm phụ khoa rất cao lên tới

62,1%, trong đó viêm âm đạo do vi khuẩn chiếm chủ yếu với tỉ lệ 50,0%, do C trachomatis là 45,8%, do nấm C albicans là 31,8% và thấp nhất do T vaginalis là

3,8% [3]

Tác giả Lê Hoài Chương (2011) khảo sát 960 phụ nữ 18 - 49 tuổi đến khámtại Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2011 và phát hiện thấy có 83,1% phụ nữ có

ít nhất một hình thái tổn thương đường sinh dục dưới, trong đó viêm âm đạo chiếm

tỉ lệ cao nhất (66,6%), viêm âm đạo kết hợp viêm CTC chiếm 33,8%, tỉ lệ nhiễm

nấm chiếm 35,3%, nhiễm Gardnerella chiếm 15,9% [7].

Nghiên cứu của Nông Thị Thu Trang (2015) tại Thái Nguyên cho thấy, tỉ lệviêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ nông thôn là 35,4%; căn nguyên hàng đầu là do vi

khuẩn (43,3%), tiếp theo là do nấm Candida (28,0%) [9].

Mặc dù viêm nhiễm phụ khoa có thể có các triệu chứng khác nhau, nhưngkhông phải lúc nào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra Trên thực tế, việc chẩn đoán thậmchí còn khó khăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm Các trường hợp nhiễm trùngnặng được bác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với liều khá cao nêngây ra các tác dụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sức khoẻ và sinh hoạttình dục và nếu được điều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh,một vấn đề nổi cộm và thách thức hiện nay Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinhcũng dẫn tới mất cân bằng hệ vi sinh có lợi ở âm đạo, dẫn tới khả năng tái nhiễmcao hơn người bình thường Do đó, việc sử dụng chế phẩm probiotics như một liệupháp thay thế kháng sinh trong việc phòng và điều trị các bệnh phụ khoa là một lựachọn lý tưởng

1.5 Một số loại thực phẩm chức năng probiotics thương mại dùng cho con

người

1.5.1 Một số loại thực phẩm chức năng probiotics dành riêng cho phụ nữ được

thương mại trên Thế giới

Sản phẩm Optibac probiotics for women của Anh, giúp điều trị viêm nhiễm

phụ khoa, đặc biệt là viêm âm đạo và đường tiết niệu ở phụ nữ có chứa tới 2,3 tỷ vi

khuẩn, gồm 2 chủng L rhamnosus GR-1® và L reuteri RC-14 Hai chủng vi khuẩn

đặc hiệu này đã được thử nghiệm lâm sàng với hơn 2500 phụ nữ trên khắp thế giới

và cho kết quả tích cực Điều đặc biệt, hai chủng vi khuẩn đặc hiệu L rhamnosus

GR-1® và L reuteri RC-14 sống sót đến tận vùng kín phụ nữ, hạn chế khả năng gây

ra vi khuẩn gây bệnh nấm men giúp ngăn ngừa và điều trị những vấn đề viêm âmđạo và viêm tiết niệu Sản phẩm này được nhập nhiều nhất về Việt Nam so với cácsản phẩm probiotics khác dành cho phụ nữ với giá thành khoảng 400.000đồng/hộp/30 viên

Sản phẩm ReNew Life Ultimate Flora Vaginal Support Probiotic của Mỹ,

với giá thành $57,79/hộp/60 viên Sản phẩm có tác dụng hỗ trợ sức khoẻ âm đạo,đường tiêu hoá, chứa hàng tỷ vi khuẩn trong 1 viên, gồm 10 loại vi khuẩn hữu ích

Sản phẩm Fem-Dophilus® của Mỹ chứa hơn 1 tỷ vi khuẩn gồm 2 chủng L.

rhamnosus GR-1® và L reuteri RC-14®, 60 viên với giá thành $83,91, hỗ trợ sức

khoẻ âm đạo, đường tiết niệu cho phụ nữ

Sản phẩm Jarro-Dophilus probiotics for women của Mỹ có giá thành

$30,9/hộp/60 viên dạng uống Sản phẩm chứa 5 tỷ vi khuẩn gồm 4 loài Lactobacilli

thường có mặt trong âm đạo phụ nữ: L crispatus LbV88, L gasseri LbV150, L jensenii LbV116, L rhamnosus LbV96.

Nhìn chung các sản phẩm kể trên đều có tác dụng duy trì khu hệ vi sinh vật

âm đạo khỏe mạnh ở phụ nữ, giúp giảm bớt sự kết dính của vi khuẩn vào đường tiếtniệu, giúp giảm tần suất viêm bàng quang tái phát và hỗ trợ hệ thống miễn dịchkhỏe mạnh Đây hoàn toàn là các sản phẩm nhập ngoại về Việt Nam với giá thànhtương đối cao, chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp của người dânViệt Nam, đặc biệt là phụ nữ ở vùng nông thôn và miền núi

1.5.2 Một số thực phẩm chức năng probiotics thương mại trong nước hỗ trợ

sức khỏe cho con người

Trên thị trường hiê ên đang có hàng nghìn sản phẩm probiotics dùng cho conngười để tăng cường tiêu hoá và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan tới tiêu hoá, tăngcường miễn dịch Có thể kể đến một số sản phẩm probiotics trong nước dùng chocon người được thị trường quan tâm hiện nay như sau:

- Sản phẩm trong nước phải kể đến đầu tiên là BioLactoMen, Biolactovin do

PGS.TS Đinh Duy Kháng và cô êng sự tại Viện Công nghệ Sinh học nghiên cứu và

chế tạo ở dạng dạng đông khô từ chủng vi khuẩn lactic dược dụng L acidophilus

108 CFU/g, với giá 55.000 vnđ/hộp/10 lọ, ngày uống 2 lọ để điều trị các bệnh rốiloạn tiêu hóa, loạn khuẩn do sử dụng kháng sinh, ngộ độc thực phẩm, viêm đạitràng, táo bón…

- Bio-acimin Gold do công ty dược phẩm Việt Đức sản xuất giúp bổ sung gồm

nhiều chủng lợi khuẩn có lợi như L acidophilus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis Ngoài ra, sản phẩm còn cung cấp chất xơ và 21 loại axit amin thiết yếu

được chiết xuất từ men bia có tác dụng cải thiện tình trạng biếng ăn ở trẻ saukhoảng 2 tuần sử dụng, làm giảm các triệu chứng của bệnh rối loạn tiêu hóa do sửdụng thuốc kháng sinh kéo dài hoặc do ăn phải thức ăn kém vệ sinh, được bán vớigiá là 180.000 vnđ/hộp/30 gói.

- Spobio CL, Spobio Guard, Bespo SpoCure SOS BABY, Spobio Chemo… do

công ty ANABIO R&D sản xuất giúp bổ sung gồm nhiều chủng lợi khuẩn có lợi

như B subtilis, B clausii, B coagulans…ở cả dạng bô êt, dạng viên nang và dạng

hỗn dịch Ngoài ra, sản phẩm còn cung cấp các chất xơ hòa tan oligosaccharide(Bespo SpoCure SOS BABY) để phòng ngừa rối loạn tiêu hoá, hỗ trợ điều trị viêmđại tràng, tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng, tăng cân Sản phẩm gồm cácbào tử bền nhiệt nên khả năng sống sót được duy trì ổn định, chất lượng không thayđổi theo thời gian bảo quản Công ty cũng đang hướng đến phát triển sản phẩm

probiotic phục vụ sức khoẻ sinh sản cho phụ nữ dựa trên chủng B coagulans, tuy

nhiên sản phẩm mới ở giai đoạn nghiên cứu phát triển và không phải là các chủngđặc thù được phân lập và tuyển chọn ở phụ nữ khoẻ mạnh tại Việt Nam nên chưađược thương mại hoá rộng rãi

Như vậy có thể thấy rằng, mặc dù hiện nay đã có khá nhiều chế phẩmprobiotics ở Việt Nam nhưng chưa có chế phẩm nào phát triển để phục vụ riêng choviệc chăm sóc sức khoẻ sinh sản của phụ nữ Ý tưởng sản xuất sản phẩm probiotic

để hỗ trợ điều trị bệnh phụ khoa cho phụ nữ Việt Nam là hoàn toàn mới, sáng tạo và

có ý nghĩa ứng dụng cao

1.6 Vi khuẩn probiotic trong sữa mẹ

Sữa mẹ được coi là có tầm quan trọng hàng đầu đối với sức khỏe, sự sinhtrưởng và phát triển tối ưu của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [79] Bên cạnh những giá trịdinh dưỡng của nó, sữa mẹ cũng chứa một số yếu tố hoạt tính sinh học giúp tăngcường khả năng phòng tránh của trẻ sơ sinh [79], [25] và bảo vệ nó chống lại cácmầm bệnh xâm nhập [41], [47] Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng cácthành phần của những vi khuẩn có hoạt tính sinh học tiềm năng xuất hiện trong sữa

mẹ cũng có thể liên quan đến sự phát triển của các mô niêm mạc đường tiêu hóa ởtrẻ sơ sinh và việc thu nhận một hệ vi khuẩn đường ruột khỏe mạnh [25], [54] Cácloài vi khuẩn thường được tìm thấy ở sữa của các bà mẹ người khỏe mạnh thuộc các

chi Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Micrococcus, Enterococcus và Bifidobacterium [47], [54], [59] Một số chi này bắt nguồn từ bề mặt của núm vú &

vùng da xung quanh và có thể thích nghi với sự sống sót trong các ống dẫn sữa ở vú[79], [54]

Lactobacilli chiếm một phần quan trọng của hệ vi sinh vật đường ruột khỏemạnh ở con người và được cho là có liên quan đến việc kiểm soát và duy trì hệ vi

sinh vật này [81] L reuteri là một vi sinh vật bản địa của đường tiêu hóa ở người

và động vật [81], [22] L reuteri đã được chứng minh là có đặc tính probiotic [81],

[22], [99], [85], [87], [111] và trước đây đã được tìm thấy trong sữa của phụ nữPhần Lan [22] Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy việc xâm chiếmLactobacilli sớm có thể bảo vệ trẻ khỏi bị dị ứng [50], từ đó cho thấy vai trò trongviệc cung cấp Lactobacilli tự nhiên trong sữa mẹ là yếu tố có lợi cho trẻ nhỏ trongthời gian bú mẹ

Bên cạnh đó, cách tiếp cận nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn các chủng

vi khuẩn có lợi ở sữa mẹ của các bà mẹ cho con bú ở miền Bắc Việt Nam, do đóchủng sử dụng làm thực phẩm chức năng probiotics sẽ thân thiện và dễ cư trú hơn

so với với các chủng có nguồn gốc khác Đây chính là tính mới, tính độc đáo củanghiên cứu

1.7 Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp bằng phương pháp

đông khô

Lactobacillus là một chi vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy tiện hoặc vi hiếu

khí, hình que và không hình thành bào tử [56] Chính vì đặc điểm không hình thành

bào tử nên chúng ta không thể bảo quản Lactobacillus bằng phương pháp sấy khô vì

chúng rất dễ chết dưới nhiệt độ cao Do vậy, tại Việt Nam các sản phẩm probiotics

nghiên cứu cho phụ nữ hầu hết đều chuyển sang chi Bacillus vì đặc điểm của chi

này là có hình thành bào tử và chúng không bị chết sau quá trình sấy khô [98] Đâycũng là một trong các lý do khiến chúng tôi thực hiện nghiên cứu này

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ởtrạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp vàđược làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuốicùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Đây là phương pháp phổ biến có hiệuquả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vikhuẩn và một số vi rút và được chúng tôi sử dụng để bảo quản chế phẩm probiotics

có chứa Lactobacillus spp [6].

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

60 mẫu sữa mẹ được thu thập từ các bà mẹ sống ở cả nông thôn (30 mẫu) vàthành thị (30 mẫu) tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: S aureus ATCC 25923, E coli ATCC

25922, C albicans JCM 2070 (Được lưu giữ ở 4oC tại Green Lab - Trung tâmnghiên cứu Khoa học sự sống)

Chủng vi sinh vật đối chứng: L reuteri VTCC 910087 (Được lưu giữ ở 4oCtại Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống)

Các hóa chất khác như thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kit tinhsạch DNA và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này được sản xuất từ các hãng

có uy tín về sinh học phân tử như Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Mỹ), ThermoScientific (Mỹ), Anabio R&D (Việt Nam),

2.1.2 Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ

Các mẫu sữa cho nghiên cứu được thu thập từ những bà mẹ cho con bú khỏemạnh không sử dụng kháng sinh trong vòng 2 tuần trước đó Các bà mẹ tình nguyện

đồng ý tham gia nghiên cứu này được kí vào bản thỏa thuận (Consent form – Phụ lục 1) và được yêu cầu tránh ăn uống bất kỳ thực phẩm nào bổ sung thêm vi khuẩn

axit lactic trong 2 tuần trước khi thu thập mẫu sữa Thu thập mẫu sữa từ những bà

mẹ trong độ tuổi từ 16 đến 30 và các mẫu sữa được thu thập sau khoảng 0 - 6 ngàytính cả thời vận chuyển Các bà mẹ được yêu cầu không cho con bú trong vòng 1đến 2 giờ trước khi lấy mẫu sữa và lấy mẫu vào buổi sáng Mẫu sữa được thu thập

và được làm sạch bề mặt vú & núm vú mà không cần sát trùng trước khi lấy mẫu.Trong mỗi trường hợp, sữa mẹ được thu thập vô trùng bằng máy hút sữa, 10 - 15

mL sữa đầu tiên được thu thập và chuyển vào ống falcon vô trùng Các mẫu sữa mẹsau đó được đông lạnh ngay lập tức và được lưu trữ ở -20oC trong tối đa 1 tháng.Các mẫu được đóng gói với đá khô trong hộp cách nhiệt và được gửi đến phòng thínghiệm của chúng tôi nếu ở xa Mẫu sữa đông lạnh được rã đông qua đêm trong tủlạnh và sau đó duy trì ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi được pha loãng vàcấy trải [91]

2.1.3 Thiết bị

- Máy lắc ổn nhiệt (Model: WSB – 30; Serial No: 0398272117PO10; Hàn Quốc);

- Bình khí N2 và dây dẫn khí (Model: Tornado LS/B – He; Việt Nam);

- Cân điện tử (Model: precisa 310M, Thụy Sĩ);

- Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh);

- Máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức);

- Hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp);

- Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật);

- Máy đo OD (Model: Biomate 3; Serial No: 2KBK 138001; Mỹ);

- Máy đông khô (Modulyod Freeze Dryer, Thermo electron corporation);

2.2.1 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp trong

mẫu sữa mẹ

2.2.1.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp trong mẫu sữa mẹ

Xác định tổng số Lactobacilli (CFU/mL) xuất hiện trong mỗi mẫu sữa theophương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): mỗi mẫu sữa được pha loãng 10lần trong dung dịch NaCl 0,15 M Sau đó cấy trải 100 µL mẫu từ mỗi nồng độ phaloãng lên trên đĩa thạch MRS và đĩa thạch LBS Các đĩa thạch này sau đó được ủtrong 48 - 72 giờ ở 37oC dưới điều kiện kị khí [91] Thành phần môi trường MRS vàLBS được liệt kê dưới đây:

- Môi trường MRS lỏng không có CaCO 3 và agar.

Chuẩn pH 6,2 – 6,5 Khử trùng ướt môi trường 110oC trong 20 phút

- Môi trường LBS

Chuẩn pH 5.5 ± 0.2 (ở 25 oC) Khử trùng ướt môi trường 121oC trong 15 phút.

Làm giàu môi trường để tăng sinh L reuteri trong các mẫu sữa mẹ theo

phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): Cứ 1 mL sữa mẹ đã voltex đềuđược thêm vào 10 mL môi trường (bao gồm 20 mM arabinose; 20 mM ribose; 1

mM MgSO4; 0,1 mM MnSO4; 5 mM FeSO4) Hỗn hợp làm giàu được ủ ở 37oCtrong 6 đến 8 giờ Các mẫu sữa mẹ sau khi làm giàu được cấy trải trên môi trường

thạch MRS cải tiến chứa 0,05 mg/mL vancomycin để xác định sự có mặt của L reuteri Các đĩa thạch được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí [91]

Các khuẩn lạc L reuteri được xác định và đếm bằng cách sử dụng phương pháp của Chung và đồng tác giả (1989) dựa trên việc sản xuất reuterin đặc trưng của L reuteri từ glycerol trong điều kiện kị khí tại 37oC và pH 6-8 [24]

Các chủng Lactobacillus spp sau phân lập được thử hoạt tính sơ bộ về khả

năng sinh axit lactic và sau đó tuyển chọn ra các chủng có khả năng sinh axit lacticcao nhất để nghiên cứu sâu hơn, định danh bằng phân tích PCR và đặt tên chủngtuyển chọn

2.2.1.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

Khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng được tuyển chọn được sử dụng để táchchiết ADN bằng Kit Anapure Bacterial DNA mini kit theo các bước sau:

- Thêm 150 L dịch chứa mẫu vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 mL vô trùng sau đóthêm vào 20 µL Proteinase K

- Thêm 250 L Binding Buffer Trộn đều bằng cách pipet lên xuống 10 lần hoặcvortex 10-15 giây Ủ mẫu ở 70oC trong 15 phút

- Thêm 150 L Ethanol 96o Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần

- Chuyển mẫu ở bước 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trênống thu dịch CT01 (ANAPURE collection tube)

- Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12 000 vòng/phút trong 1phút Đổ bỏ dịch chảy qua cột

- Thêm 500 L Washing Buffer 1 vào cột lọc SC01 Lặp lại bước 5

- Thêm 500 L Washing Buffer 2 vào cột lọc SC01 Ly tâm cột lọc-ống thu dịchSC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 2 phút Chú ý cần loại bỏ hoàntoàn WB2 vì WB2 ảnh hưởng tới việc chiết đẩy ADN

- Nhấc cột lọc SC01 chuyển sang ống thu mẫu eppendorf 1,5 mL vô trùng mới

- Thêm 50-200 L Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc SC01 Ly tâm cột lọcống eppendorf ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 1 phút

- Thu dịch chảy qua cột chứa ADN trong ống eppendorf Bảo quản sản phẩm ADNtinh sạch ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho ứng dụng mong muốn

ADN tinh sạch được phân tích kích thước và độ tinh sạch bằng phương phápđiện di trên gel agarose 1% (100V - 30 phút), nhuộm bởi EtBr và được quan sátdưới ánh sáng UV ADN sau tinh sạch được dùng làm khuôn của PCR khuếch đạiđoạn gen mã hoá cho 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 27F: 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ và 1527R: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ và chu trình nhiệt 95°C/10 phút - 30 chu kỳ 94°C/30 giây + 60°C/30 giây +72°C/1 phút 30 giây - 72°C/5 phút - 4°C/∞ Thành phần của mỗi phản ứng PCRkhuếch đại đoạn gen 16S rRNA được liệt kê dưới đây:

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr

và được quan sát dưới ánh sáng UV để kiểm tra kết quả Sản phẩm PCR dương tínhđược tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất sử dụng Anapure PCR purificationmini kit (ANABIO R&D) Sản phẩm PCR sau tinh sạch được điện di kiểm tra bằnggel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát dưới ánh sáng UV Băng có kích thước

khoảng 1500 base pair được gửi đi 1 st BASE DNA Sequencing Services để giải trình

tự ADN Các trình tự ADN sau đó được phân tích bằng phần mềm Geneious Prime

và so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụngchương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương đồng.Tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST Các dữ liệuliên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủngloại.

2.2.2 Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn

được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro

2.2.2.1 Khả năng sinh trưởng

Chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi lắc trong môi trườngMRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ởbình cấp giống trong 12 giờ Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trườngMRS lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng làbằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫubằng máy đo quang phổ ở OD620 và vẽ đường cong sinh trưởng tại các mốc thờigian [8]

2.2.2.2 Khả năng sinh axit lactic

Thí nghiệm này được thực hiện song song với thí nghiệm xác định khả năngsinh trưởng Sau khi tiếp giống, chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng tiếp tụcđược nuôi lắc ở 37oC ở 200 vòng/ phút trong môi trường MRS chuẩn pH 6,5 Tạimỗi mốc thời gian, hút ra 10 mL dịch nuôi lắc, ly tâm và cho vào cốc thủy tinh, bổsung thêm 20 mL nước cất và 1-2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o).Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì

dừng lại Ghi lại thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ [68] Độ axit tính

theo độ Therner: oT = VNaOH tiêu tốn x 10, % axit lactic = oT x 0,009; trong đó: oT là độTherner, 1oT tương ứng với 9 mg axit lactic

2.2.2.3 Khả năng chịu muối mật

Dựa theo phương pháp của Todorov và đồng tác giả (2011); Colombo vàđồng tác giả (2018), phương pháp thử khả năng chịu muối mật của chủng tuyểnchọn được thực hiện như sau: Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứngtrong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dướiđiều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ Sau đó tiếp giống (10%) sang bìnhchứa môi trường muối mật 0,3% và 3,0% lỏng khác sao cho OD620 đầu vào củachủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,3) và tiếp tụcnuôi lắc với điều kiện như trên Chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS không

chứa muối mật được dùng làm đối chứng Đo OD620 lúc 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc

ở 37oC để xác định khả năng chịu muối mật của chủng vi khuẩn được tuyển chọn[97], [26].

2.2.2.4 Khả năng chịu axit

Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRSlỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấpgiống trong 12 giờ Sau đó tiếp giống (10%) sang các bình chứa môi trường MRS

đã chuẩn pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và 6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M) sao cho

OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên Đo OD620 tại 0 giờ và sau

3 giờ để xác định khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97],[26]

2.2.2.5 Khả năng sinh H 2 O 2

Chủng tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi cấy trong môi trường thạchMRS có bổ sung thêm 250 µg/mL 3-3’-5-5’ tetramethylbenzidine và 0,01 mg/mLhorse radish peroxidase Quan sát cường độ màu được phân loại giúp xác định khảnăng sinh H2O2 [19]

2.2.2.6 Khả năng nhạy cảm với kháng sinh

Các kháng sinh được sử dụng là (C) Chloramphenicol 30 µg, (E)Erythromycin 15 µg, (TE) Tetracycline 30 µg, (CTX) Cefotaxine 30 µg, (AMP)Ampicillin 10 µg, (CN) Gentamicin 10 µg, (CIP) Ciprofloxacin 5 µg Sử dụngkhoanh giấy kháng sinh đặt trên môi trường đã cấy trải các chủng vi khuẩn nghiêncứu, đường kính vòng ức chế được đo sau khi ủ đĩa ở 37oC trong 48 giờ dưới điềukiện kị khí [107], [106]

2.2.2.7 Khả năng tạo màng biofilm

Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một sốchủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể

Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằngphương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% được thực hiện như sau:khuẩn lạc các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nuôi cấy kích hoạt trong bình tamgiác chứa 10 mL môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí

và chỉnh mật độ tế bào OD620 khoảng ~ 0,6 Hút 100 L dịch nuôi cấy vi khuẩn đã

nuôi lắc bổ sung vào 700 L môi trường MRS lỏng trong các ống eppendorf (2 mLhoặc 1,5 mL) đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC trong 24 giờ Sau đó,dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf Đánh giá mật độ tế bào sống

trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở OD620 trongdịch nuôi cấy vi khuẩn [72].

Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật theo phương pháp sau: mỗi ốngeppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng Sau đó mỗi ống eppendorfđược bổ sung thêm 1 mL dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độphòng Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nướccất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh Saukhi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf đượchòa tan trong 1 mL ethanol 70o Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác địnhbằng cách đo OD620 [65]

2.2.2.8 Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại

Sau khi nuôi lắc qua đêm chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở 37oC trong môitrường MRS lỏng, chỉnh dịch nuôi lắc về pH 7 rồi nhỏ 150 µL dịch nuôi lắc vào mỗi

lỗ thạch trên đĩa môi trường đã được cấy trải các chủng vi sinh vật gây hại: S aureus ATCC 25923, E coli ATCC 25922 và nấm C albicans JCM 2070.

Quan sát đĩa thạch sau 24 - 48 giờ và đo đường kính vòng ức chế xung quanh

lỗ thạch tại thời điểm 48 giờ nếu có (D – d, mm; trong đó: D là đường kính vòng ứcchế, mm; d là đường kính lỗ thạch, mm) [8]

2.2.3 Nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn

được tuyển chọn

Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRSlỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấpgiống trong 12 giờ

2.2.3.1 So sánh sinh khối tế bào ở chế độ nuôi lắc và chế độ nuôi tĩnh

Chuẩn bị môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5) đã khử trùng, sau đó tiếpgiống (10%) các chủng vi khuẩn (với cùng số đo OD620) vào các bình môi trường đó

và nuôi cấy ở 2 điều kiện tĩnh và lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 37oC Đo OD620sau 24 giờ ở các điều kiện và nhận xét sự chênh lệch [8]

2.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng vi khuẩn

lactic

Chuẩn bị môi trường MRS lỏng (pH 6,5) đã khử trùng, sau đó tiếp giống(10%) các chủng vi khuẩn (với cùng số đo OD) vào các bình môi trường đó và nuôinuôi lắc 200 vòng/phút mỗi bình ở một mức nhiệt độ khác nhau là 25oC, 30oC,

37oC, 45oC và 50oC dưới điều kiện kị khí Đo OD620 sau 24 giờ và so sánh kết quả,tìm nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [8]

2.2.4 Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá

trình đông khô của các chủng được tuyển chọn

2.2.4.1 Thu sinh khối chủng vi khuẩn tuyển chọn

Từ kết quả thí nghiệm ở mục 2.2.3 và 2.2.4, các điều kiện nhân giống tối ưucủa chủng tuyển chọn và chủng đối chứng đã được chúng tôi đưa ra Tiến hành nuôichủng tuyển chọn và chủng đối chứng trong 5 lít môi trường MRS lỏng với các điềukiện tối ưu kể trên, ly tâm thu sinh khối chủng vi khuẩn ở gần cuối pha log (10 – 12giờ) để đảm bảo các chủng đó có tỉ lệ sống cao nhất trước khi phối trộn cùng cácchất bảo vệ và đông khô

2.2.4.2 Xác định mật độ sống CFU/g (mL) của chủng vi khuẩn được tuyển chọn

trước khi phối trộn chất bảo vệ

Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn sau đó xác định mật độ sống trước khi đôngkhô của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp xác định số khuẩn lạc CFU/g (mL).Tiến hành pha loãng thập phân mỗi mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý NaCl0,9% và bằng dung dịch muối đệm phốt phát PBS [110]; cấy trải 100 µL trên đĩathạch MRS (đường kính 10 cm) ở 3 nồng độ pha loãng 10-6, 10-7 và 10-8; nuôi cấy kị

kí trong 24 - 48 giờ và đếm số lượng khuẩn lạc sau đó tính ra CFU/g (mL) theocông thức sau:

CFU/g (mL) = a x 1/k x 1/V [23]

Trong đó:

+ a – số khuẩn lạc trên các đĩa có cùng nồng độ pha loãng (lấy số khuẩn lạc trung bình);+ k – độ pha loãng của dịch lắc nuôi cấy;

+ V – thể tích dung dịch pha loãng được cấy trên đĩa (đổi ra đơn vị mL)

Lưu ý chọn đĩa nuôi cấy có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25 đến 300 Nếu 2đĩa có cùng nồng độ pha loãng thì số khuẩn lạc đếm được chỉ được chênh nhaukhoảng 10% Khi pha loãng xuống 10 lần thì số khuẩn lạc cũng giảm xuống 10 lần

2.2.4.3 Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá

trình đông khô của các chủng được tuyển chọn

Bảng 1 Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic

với các chất bảo vệ

Lô

1 Sữa gầy 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ

(gồm sữa gầy và sucrose) (1)

Thêm Glycerol [43]

3 70% sinh khối và 30% chất bảo vệ

(gồm sữa gầy và vitamin C) (2)

Thêm Glycerol

[117]

5 92,8% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ

(gồm sữa gầy và sucrose) (3)

Không thêm Glycerol [43],

[117]

6 91,5% sinh khối và 7,2% chất bảo vệ

(gồm sữa gầy và vitamin C) (4)7

Mannitol

70% sinh khối, 30% mannitol (5) Thêm Glycerol

[84],[43],[117]

9 81,5% sinh khối và 18,5% chất bảo

vệ (gồm mannitol và vitamin C) (6)

Thêm Glycerol

11 84% sinh khối, 16% mannitol (7)

Không thêm Glycerol

12 82,8% sinh khối và 18,5% chất bảo

vệ (gồm mannitol và sucrose) (8)

13 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (gồm sữa gầy và mannitol) (9)

14 80% sinh khối và 20% chất bảo vệ (maltodextrin

và microcrystalline cellulose) (10)

Chế phẩm Optibac probiotics forwomen - Anh

15 ĐC (-) Không phối trộn

2.2.4.4 Đông khô và xác định mật độ sống sót sau đông khô

10 gam hỗn hợp sau phối trộn được dàn lên đĩa petri nhựa (mỗi một côngthức phối trộn làm 2 đĩa), các đĩa được để đông lạnh sau đó đem đi đông khô Càiđặt chương trình cho quá trình đông khô: nhiệt độ -50oC trong 20 - 30 giờ

Hình 6 Máy đông khô vi khuẩn

Các lô thí nghiệm cùng đối chứng được xác định mật độ sống sót CFU/gngay sau khi đông khô để tìm ra công thức hiệu quả nhất Sau khi đông khô, hỗnhợp được trộn thêm cùng một số chất độn và tiếp tục được nghiên cứu

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, các kết quả được xử lý thống kê.

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành

thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và kết quả tuyển chọn

chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất

chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ

3.1.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực

thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam

Trong tổng số 60 mẫu sữa mẹ thu thập được từ các bà mẹ ở vùng nông thôn

và thành thị, các chủng thuộc về Lactobacillus spp được tìm thấy trên 25 mẫu, chiếm tỉ lệ 41,67% và các chủng L reuteri được tìm thấy trên 7 mẫu, chiếm tỉ lệ 11,67% Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực

thành thị được biểu diễn ở Bảng 2.

Bảng 2 Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri trong sữa mẹ ở khu vực thành thị

và khu vực nông thôn tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam

Lactobacillus spp. 40% (12/30) 43,33% (13/30)

Kết quả từ Bảng 2 cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa tỉ lệ

Lactobacillus spp và L reuteri trong sữa mẹ ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị Tỉ lệ Lactobacillus spp và L reuteri xuất hiện trong sữa mẹ ở khu vực thành thị

lần lượt chiếm 40% và 13,33% trong khi đó tỉ lệ này ở khu vực nông thôn lần lượt

là 43,33% và 10% Tuy nhiên, tổng số Lactobacilli trung bình trong sữa của các bà

mẹ khu vực nông thôn cao hơn khu vực thành thị (1,1x103 so với 3,0x102 CFU/mL)

Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở 60 mẫusữa mẹ được thu thập từ các bà mẹ sống ở cả nông thôn (30 mẫu) và thành thị (30mẫu) tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam (việc thu thập và phân lập trên mẫu

sữa mẹ vẫn tiếp tục được tiến hành) Có thể nói đây là một trong các nghiên cứu đầu

tiên về việc phân lập Lactobacillus spp và đặc biệt chứng minh sự có mặt của L reuteri trong sữa mẹ ở phụ nữ cho con bú tại Việt Nam Mặc dù số mẫu vẫn còn hạn chế (n = 60), kết quả cho thấy sự có mặt của loài L reuteri chiếm tỉ lệ là ~ 12%

(7/60) Tỷ lệ này thấp hơn khoảng 3% so với một nghiên cứu tương tự của Gabriela

và Ljunggren năm 2008 trên đối tượng sữa mẹ được thu thập từ 7 nước khác nhau:Thụy Điển, Israel, Nam Phi, Nhật Bản, Peru, Hàn Quốc và Đan Mạch với tỉ lệ

~ 15% (32/220) [91] Tỉ lệ của Lactobacillus spp và L reuteri ở 2 nghiên cứu này

tương đối như nhau và không có sự khác biệt ở 2 khu vực nông thôn và thành thị.Bên cạnh đó, tổng số Lactobacilli trung bình trong sữa của bà mẹ khu vực nôngthôn vẫn cao hơn khu vực thành thị

3.1.2 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp từ sữa mẹ

Từ 7 mẫu sữa mẹ có sự xuất hiện của L reuteri đã phân lập được 8 chủng thuộc loài L reuteri, 8 chủng này được đặt tên SMH2, SMH3, SMH4, SMH5,

SMH6, SMH7, SMH8, SMH9

Từ 25 mẫu có sự xuất hiện của các chủng Lactobacillus spp đã phân lập được 27 chủng Lactobacillus spp Các chủng này được đặt tên SMH1 và lần lượt từ

SMH10 đến SM35

Lactobacilli đã được chứng minh là ức chế sự tăng trưởng in-vitro của các vi

sinh vật gây bệnh ở âm đạo như Bacteroides fragilis, E coli, G vaginalis, Mobiluncus spp., Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, P bivia, Staphylococcus aureus và Candida Điều này đạt được chủ yếu thông qua hoạt động

của axit lactic [45], [61], [92], [94] Hơn nữa, đây là các chủng vi khuẩn gây bệnhnên chúng tôi không thể nuôi cấy trực tiếp để nghiên cứu về khả năng ức chế cácchủng này trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện có Do đó chúng tôi lựa chọn thử

hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic để tuyển chọn ra chủng Lactobacillus

spp với mục đích đưa chủng tuyển chọn định hướng vào sản xuất thực phẩm chức

năng dành cho phụ nữ Kết quả sinh axit lactic của 8 chủng L reuteri và 27 chủng

Lactobacillus spp được biểu diễn tại Bảng 3.

Bảng 3 Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L reuteri và Lactobacillus spp.

(Các giá trị trong Bảng 3 là giá trị trung bình sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, giá trị độ lệch

chuẩn được thống kê tại Phụ lục 2)

STT

Ký hiệu các

chủng thuộc

loài L reuteri

Lượng axit lactic (g/100 mL)

0 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24

giờ

28 giờ

32 giờ 36 giờ