Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng Carbapenem của các chủng Acinetobacter baumannii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung Ương

Kháng sinh là một trong những phát hiện vĩ đại trong lịch sử loài người. Với khả năng kìm hãm và tiêu diệt tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là vi khuẩn, kháng sinh đã trở thành loại thuốc không thể thiếu trong công tác điều trị ở mọi nơi trên thế giới. Việc sử dụng kháng sinh không chỉ cứu sống bệnh nhân mà còn giúp ngăn ngừa các dịch bệnh bùng phát trên toàn cầu. Tuy nhiên, trong nhiều năm trở lại đây, tình hình kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng với tốc độ nhanh chóng và biến đổi phức tạp. Các vi khuẩn không ngừng biến đổi để thích nghi và đề kháng lại các loại kháng sinh. Hiện nay trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều chủng đa kháng thuốc thậm chí có những chủng đã trở thành siêu kháng và toàn kháng. Điều này đã và đang trở thành một thách thức lớn trong công tác điều trị bệnh ở các bệnh viện trên mọi châu lục. Năm 2017, tổ chức Y tế thế giới WHO đưa ra danh sách 12 loài vi khuẩn nguy hiểm nhất với khả năng kháng thuốc kháng sinh mạnh và cần phải nghiên cứu phát triển một loại kháng sinh mới để đối phó với các tác nhân này.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LƯU THỊ NGỌC HÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG

KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter

baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LƯU THỊ NGỌC HÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG

KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter

baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phạm Bảo Yên, người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn cao học Xin chân thành cám ơn cô vì đã luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trường đại học khoa học tự nhiên, các cán bộ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung Ương cùng các thành viên nhóm nghiên cứu của đề tài Q6.17.60 đã tạo điều kiện và môi trường cho tôi thực hiện nghiên cứu Xin cảm ơn các bạn sinh viên trong Phòng Thí nghiệm Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt những kiến thức quý báu và hỗ trợ cho tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sĩ

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, cổ vũ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Mặc dù đã cố gắng nỗ lực, nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Rất mong nhận được những đóng góp từ thầy cô, các nhà khoa học để tôi tiếp tục hoàn thiện công trình nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2019 Học viên

Lưu Thị Ngọc Hân

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A baumannii Acinetobacter baumannii

AMEs Aminoglycoside-modifying enzymes

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CTX-M Cefotaxime hydrolyzing capabilities

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

ECDC European Centre for Disease Prevention and Control

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

LAMP Loop-mediated isothermal amplification

MATE Multidrug and toxic compound extrusion

MFS Major facilitator superfamily

MIC Minimum Inhibitory Concentration

SIM Seoul Imipenemase

SMR Small multidrug resistance

VAP Ventilator Associated Pneumonia

VEB Vietnam extended-spectrum β-lactamase

XDR Extensively drug-resistant

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Các vị trí tác dụng của kháng sinh ………4

Hình 2: Cấu trúc hóa học của carbapenem……….9

Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A baumannii ……… 12

Hình 4: Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường thạch………13

Hình 5: Các cơ chế kháng kháng sinh của A baumannii……… 19

Hình 6: Nguyên tắc của kỹ thuật multiplex PCR……… 25

Hình 7: Chu trình nhiệt đã được tối ưu của phản ứng multiplex PCR……… 31

Hình 8: Kết quả của phản ứng multiplex PCR……… 33

Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ % của các gen nghiên cứu……… 34

Hình 10: Tỷ lệ % kháng carbapenem của các mẫu A baumannii nghiên cứu…….40

Hình 11: Mức độ kháng của A baumannii với các kháng sinh nhóm beta-lactam 42 Hình 12: Mức độ kháng của A baumannii với một số kháng sinh khác………… 43

Hình 13: Kết quả giải trình tự gen OXA-51 với mồi xuôi và so sánh kết quả giải trình tự với ngân hàng gen……… …….47

Hình 14: Mức độ tương đồng về nucleotide……….49

Hình 15: Mức độ tương đồng về acid amin……… 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học……… 3

Bảng 2: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A baumannii…………19

Bảng 3: Bảng danh mục các kháng sinh được sử dụng làm kháng sinh đồ để đánh giá

mức độ nhạy cảm của Acinetobacter spp……… 29 Bảng 4: Trình tự các cặp mồi cho các gen OXA-23, OXA-51, VIM và IMP……… 30

Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng multiplex PCR……… 31

Bảng 6: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-51 trên thế giới và Việt Nam.…… 34 Bảng 7: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-23 trên thế giới và Việt Nam ……….36

Bảng 8: Tổng hợp các tổ hợp gen đích……… 39

Bảng 9: Kết quả PCR và kháng sinh đồ của các mẫu A baumannii…….…………44

Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng được giải trình tự………….48 Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu………….48

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… ……….1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh ……… ……… 3

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học……… 3

1.1.2 Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh……… 4

1.1.2.1 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein…….……….…….………5

1.1.2.2 Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic……… ……… 5

1.1.2.3 Kìm hãm các quá trình trao đổi chất……… … 6

1.1.2.4 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn……… ……6

1.1.2.5 Tác động lên màng tế bào vi khuẩn……….…7

1.1.3 Kháng sinh nhóm beta-lactam……… 7

1.1.3.1 Penicilin ……….……… 8

1.1.3.2 Cephalosporin ……… …8

1.1.3.3 Monobactam……… ……… 9

1.1.3.4 Carbapenem ……… ……9

1.1.3.5 Nhóm ức chế beta-lactamase……… 10

1.1.4 Phối hợp kháng sinh trong điều trị ………10

1.2 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii……… ……….11

1.2.1 Giới thiệu chung và vị trí phân loại………11

1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa………12

1.2.3 Dịch tễ học……… ……13

1.2.4 Thực trạng kháng kháng sinh của A baumannii……… … 15

1.2.4.1 Trên thế giới……… 15

1.2.4.2 Tại Việt Nam……… 16

1.2.4.3 Các cơ chế kháng kháng sinh của A baumannii………17

1.2.4.4 Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase………19

1.2.4.5 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A baumannii…………21

1.3 Các phương pháp nghiên cứu A baumannii ……….…… 22

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy………22

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử………24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu ……… 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu ……….27

2.2.1 Nuôi cấy và định danh A baumannii từ mẫu bệnh phẩm ………… ………27

2.2.1.1 Nguyên tắc……… … 27

2.2.1.2 Hóa chất sinh phẩm……… 27

2.2.1.3 Các bước tiến hành……….………… 27

2.2.2 Tách DNA ……… ………28

2.2.3 Kháng sinh đồ ………28

2.2.4 Multiplex PCR ……… 30

2.2.4.1 Hóa chất, thiết bị ……… 30

2.2.4.2 Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR……….30

2.2.4.3 Các cặp mồi sử dụng ……….29

2.2.4.4 Thành phần phản ứng………31

2.2.4.5 Chu trình nhiệt ……… 31

2.2.4.6 Điện di ……… 31

2.2.5 Phân tích kết quả… ……….…….32

2.2.5.1 Phân tích trình tự DNA ……… ……… 32

2.2.5.2 Xử lý số liệu…….……… ……… …32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương ……….……….33

3.1.1 Tần suất xuất hiện các gen đơn……….33

3.1.2 Sự có mặt của các tổ hợp gen ………38

3.2 Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A baumannii thu được…39

3.2.1 Khả năng kháng beta-lactam carbapenem ……… 39

3.2.2 Các nhóm beta-lactam khác ……… 41

3.2.3 Các kháng sinh khác……… 42

3.2.4 Đánh giá chung……… 43

3.3 So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan ……… ….44

3.4 Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới……….47

3.4.1 Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp……….47

3.4.2 Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới……… 48

KẾT LUẬN……… ……… 51

KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO……… ……….52

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… …53

có khả năng kháng carbapenem đứng đầu danh sách bao gồm: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeroginosa, Enterobacteriaceae A baumannii đang được

xếp ở vị trí số một với mức báo động cao tại nhiều nơi trên thế giới với khả năng

kháng với hầu hết kháng sinh kể cả những kháng sinh phổ rộng mạnh nhất A baumannii có nhiều cơ chế kháng kháng sinh như tổng hợp beta-lactamase, bơm đẩy

ngược thuốc ra bên ngoài tế bào, chỉnh sửa cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm thành tế bào vi khuẩn, thay đổi vị trí đích của thuốc Trong đó cơ chế kháng beta-lactam dựa trên khả năng thủy phân và ức chế các kháng sinh của các beta-

lactamase đóng vai trò quan trọng nhất đối với tính đa kháng sinh ở A baumannii,

đặc biệt đối với carbapenem-liệu pháp cuối cùng trước khi phải chỉ định colistin

Ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào mức độ kháng của

A baumannii đối với các kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị dựa trên

kháng sinh đồ và thống kê tần suất của các chủng gây bệnh hoặc đưa ra tần suất xuất hiện các gen mà chưa xem xét đối mối liên quan giữa các yếu tố này Tuy nhiên, với tình hình kháng kháng sinh mạnh của vi khuẩn do sự lan rộng của các gen mã hóa carbapenemase, việc kết hợp phân tích giữa mối liên quan của kháng sinh đồ với sự

có mặt của các gen liên quan đến tính nhạy cảm với kháng sinh là rất cần thiết trong

hỗ trợ, chẩn đoán và điều trị bệnh Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng Acinetobacter baumannnii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương” với các mục tiêu:

1 Thống kê tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A baumannii tại

Bệnh viện Phổi Trung ương

2 Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A baumannii thu được

3 Nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng kháng carbapenem với sự có mặt bốn gen đích mã hóa carbapenemase So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ

4 Phân tích tính trình tự của một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được với các chủng khác trên thế giới

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học

Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances)

được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức

chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [58]

Theo quan điểm hiện đại, kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamid và quinolon

Hiện nay, có nhiều cách để phân loại kháng sinh nhưng cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và phổ hoạt động của từng kháng sinh Một vài cách phân loại khác trong đó có thể bao gồm đường đưa thuốc (đường tiêm, đường uống hay đường đặt trực tràng…) Kháng sinh trong cùng một nhóm cấu trúc sẽ thể hiện các đặc tính tương tự như nhau về hiệu quả tác dụng, độc tính và cả tác dụng không mong muốn

Bảng 1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [58,20]

beta-sulbactam, tazobactam, acid clavulanic …

6 Tetracyclin tetracyclin, doxycyclin,

mynocyclin

1.1.2 Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh

Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các nhóm kháng sinh đều liên quan trực tiếp đến các đặc tính điển hình của cấu trúc vi khuẩn hoặc các quá trình trao đổi chất của chúng Để tìm hiểu vị trí tác dụng của một loại kháng sinh cụ thể trước hết phải nắm được cấu trúc của kháng sinh và nơi nó có thể gắn kết (Hình 1) Hầu hết các đích của kháng sinh thường liên quan trực tiếp đến tế bào vi khuẩn thông qua việc ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào hoặc ức chế hình thành vật liệu di truyền [16]

Hình 1 Các vị trí tác dụng của kháng sinh [16]

1.1.2.1 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Kháng sinh ngăn cản sự khởi đầu quá trình tổng hợp protein bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosom 30S và 50Svới các cơ chế bao gồm:

Liên kết không đảo ngược với ribosom 30Svà ngăn cản phức hệ khởi đầu 30S mRNA-tRNA): Các aminoglycosid (diệt khuẩn)

(30S-Liên kết có thể đảo ngược với ribosom 30S và ức chế quá trình liên kết RNA với vị trí tiếp nhận trên ribosom 70S: Các tetracycline (kháng khuẩn)

aminoacyl-t-Cản trở có thể đảo ngược quá trình tương tác giữa mRNA và ribosom 30S mà không gây sai sót trong dịch mã mRNA như các aminoglycoside: spectinomycin (kháng khuẩn)

Liên kết với ribosom 50S ức chế hoạt tính của peptidyl transferase: lincomycin, clindamycin, cloramphenicol (kháng khuẩn)

Ức chế quá trình chuyển vị trí của peptidyl tRNA từ vị trí A đến P trên ribosom bằng cách liên kết với ribosom 50S-23S RNA: các marcrolid (kháng khuẩn)

Ngoài cơ chế trên, các kháng sinh còn có khả năng tác động lên quá trình kéo dài chuỗi peptid nhờ vào liên kết với yếu tố kéo dài G (EF-G) và ức chế giải phóng EF-G từ phức hệ EF-G/GDP: acid fusidic (kháng khuẩn)

1.1.2.2 Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic

Kháng sinh có thể tác động quá trình sinh tổng hợp acid nucleic bao gồm cả sinh tổng hợp RNA và DNA

Quá trình ức chế sinh tổng hợp RNA nhờ vào liên kết với các RNA polymerase độc lập với DNA và ức chế sự khởi đầu tổng hợp RNA: rifampin, rifamycin, rifampicin (diệt khuẩn)

Đối với sinh tổng hợp DNA, kháng sinh liên kết với tiểu đơn vị A của DNA gyrase (topoisomerase) và ngăn cản quá trình siêu cuộn xoắn của DNA bởi vậy ức chế quá trình tổng hợp DNA: quinolon, fluoroquinolone, acid oxolinic (diệt khuẩn)

Bên cạnh cơ chế ức chế quá trình sinh tổng, một số kháng sinh còn là các tác nhân làm suy yếu chức năng của khuôn DNA Về mặt lý thuyết không có loại nào trong số các tác nhân trên được sử dụng trong trị liệu Cơ chế của chloroquine và miracil D (lucanthone) là ức chế plasmodia và schistosome tương ứng bằng cách xen

kẽ vào DNA và từ đó dẫn đến ức chế tổng hợp acid nucleic Thuốc nhuộm acridine như proflavine cũng hoạt động theo cơ chế xen kẽ, nhưng vì chúng có độc tính và gây ung thư ở động vật có vú nên chúng cũng không được sử dụng làm chất kháng khuẩn

1.1.2.3 Kìm hãm các quá trình trao đổi chất

Cơ chế này thông qua quá trình ức chế sinh tổng hợp acid folic Đây là chất rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cả acid nucleic và acid amin Một số loại kháng sinh như sulphonamid và trimethoprim thể hiện tính chất như một cơ chất giả cần thiết cho quá trình trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn Cơ chế này làm cho enzyme của vi khuẩn gắn với kháng sinh thay vì gắn với cơ chế thông thường Cụ thế đối với sulfonamid, đóng vai trò như tetrahydrofolate là một thành phần quan trọng trong việc tổng hợp acid folic ở tế bào vi khuẩn

Các chất tương tự acid para-aminobenzoic ức chế cạnh tranh đối với sự hình thành acid folic: sulfonamid, sulfone, para-aminosalicylic, depsone (kháng khuẩn) Liên kết với dihydrofolate reductase và ức chế sự hình thành acid tetrahydrofolic: trimethoprim, methotrexate, pyrimethamine (kháng khuẩn)

1.1.2.4 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn

Kháng sinh đại diện cho cơ chế ức chế sinh tổng hợp acid mycolic, một thành phần của thành tế bào vi khuẩn, là isoniazid Tuy nhiên cơ chế chính tác động lên thành tế bào vi khuẩn của kháng sinh đó là quá trình ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Quá trình tổng hợp peptidoglycan diễn ra theo ba bước, và mỗi bước đều có thể trở thành đích tác động của kháng sinh Trong đó giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp thành tế bào bao gồm quá trình polymer hóa và gắn peptidoglycan mới sinh vào thành tế bào là giai đoạn tác động chủ yếu của kháng sinh Giai đoạn này có sự tham gia của các PBP đó là các enzyme thuộc họ transglycosylase và transpeptidase Hai loại enzyme này đóng vai trò then chốt trong việc hình thành peptidoglycan bằng cách thêm các pentapeptide disaccarid để mở rộng chuỗi glycan của phân tử peptidoglycan đã có và cả chuỗi liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan chưa trưởng thành Các loại thuốc thuộc nhóm beta-lactam như penicillin, carbapenem và cephalosporin có thể ngăn chặn liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan bằng cách ức chế sự hình thành liên kết peptide được xúc tác bởi các PBP

1.1.2.5 Tác động lên màng tế bào vi khuẩn

Kháng sinh có thể thay đổi tính thấm của màng với các ion natri và kali Valinomycin thay đổi tính thấm của màng đối với ion K+ của cả tế bào nhân sơ và nhân chuẩn bởi vậy nó không phải là chất kháng khuẩn được dùng trong hóa trị liệu Tuy nhiên monensin (ở gia súc) và salinomycin (ở heo) được sử dụng rộng rãi trong thú y và có thể tức chế cả vi khuẩn, protozoa và metazoan ký sinh Ngoài ra một số nhóm kháng sinh có thể liên kết với màng tế bào chất và khử cực, ví dụ như daptomycin khử cực màng phụ thuộc canxi, và điều đó dẫn đến sự ngừng tổng hợp đại phân tử và phá vỡ màng tế bào ở vi khuẩn

Một đích tác dụng quan trọng khác của kháng sinh trên màng tế bào đó là LPS Kháng sinh sẽ liên kết với LPS để phá hủy lớp màng ngoài LPS có vài điểm tích điện

âm có khả năng tương tác với các kháng sinh cyclopeptid như polymyxin và colistin tích điện dương, ngoài ra một vài phản ứng kỵ nước giữa hai phân tử cũng dẫn tới làm phân ra lớp màng ngoài

Các kháng sinh nhóm polyen tạo kênh ion giả gắn với màng sterol của màng

tế bào nấm tạo ra phức hệ màng-polyen có thể thay đổi tính thấm của màng, dẫn tới làm thất thoát các thành phần của tế bào như ester phosphate, acid hữu cơ, nucleotide

và thậm chí cả các protein tế bào

Cơ chế cuối cùng tác động lên màng tế bào là cản trở quá trình tổng hợp màng lipid Những kháng sinh này ức chế quá trình liên kết của các tiểu đơn vị tạo thành ergosterol và có thể trực tiếp phả hủy màng tế bào nấm: các kháng sinh này thuộc nhóm imidazoles: miconazole, ketoconazole, clotrimazole, và fluconazole

1.1.3 Kháng sinh nhóm beta-lactam

Đây là nhóm kháng sinh lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác điều trị tại nhiều nơi Việc đặt tên là kháng sinh beta-lactam dựa trên cấu trúc phân tử có vòng beta-lactam, một amid nội phân tử mà nhóm amin ở vị trí beta so với nhóm chức acid Các kháng sinh nhóm này gắn vào PBP và ngăn cản quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan ở thành tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị ly giải và chết Nhóm kháng sinh này bao gồm 5 phân nhóm là: penicillin, cephalosporin, monobactam, carbapenem và nhóm chất ức chế beta-lactamase

1.1.3.1 Penicillin [20,72]

Đây là nhóm được Alexander Fleming phân lập đầu tiên từ môi trường nuôi

cấy nấm Penicillium notatum Dựa trên phổ tác dụng chúng được chia thành 4 loại: Penicillin tự nhiên: Tác dụng mạnh trên các cầu khuẩn Gram (+) không sinh

penicillinase

Penicillin kháng penicillinase: Có phổ hẹp, được nghiên cứu chỉ nhằm tiêu diệt các

tụ cầu sinh penicillinase mà loại penicillin tự nhiên không tác dụng

Aminopenicillin: Có phổ mở rộng Tác dụng tương tự như penicillin tự nhiên trên vi

khuẩn Gram (+) nhưng yếu hơn, tuy nhiên lại mở rộng tác dụng trên một số vi khuẩn

Gram (-) như Haemophilus influenza, Salmonella, Escherichia coli, …

Penicillin phổ rộng: loại này có tác dụng mạnh hơn các loại khác trên các vi khuẩn Gram (-) (đặc biệt Pseudomonas và Proteus) do tăng tính thấm qua màng tế bào vi khuẩn Ưu điểm chủ yếu của nhóm này là có tác dụng lên Pseudomonas aeruginosa 1.1.3.2 Cephalosporin

Năm 1948, Abraham và cộng sự đã phân lập được từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporium acremonium hợp chất đặt tên là cephalosporin C Hợp chất này có

tác dụng kháng khuẩn nhưng rất yếu, tuy nhiên nó lại chính là tiền đề cho việc tổng hợp ra các loại cephalosporin sau này Hiện nay có bốn thế hệ cephalosporin được phân loại dựa trên phổ tác dụng đối với vi khuẩn Gram (-) và độ bền của chúng đối với các beta-lactamase [72]

Thế hệ I: Tác dụng mạnh nhất trên các vi khuẩn Gram (+) và yếu nhất trên vi khuẩn

Gram (-) Không bền và dễ bị beta-lactamase phá hủy

Thế hệ II: Gồm các chất tác dụng mạnh hơn trên vi khuẩn Gram (-) và yếu hơn trên

vi khuẩn Gram (+) so với thế hệ I, trong đó đáng chú ý và tác dụng mạnh hơn trên H influenza Giống như thế hệ I, các chất thuộc thế hệ II không tác dụng lên P aeruginosa Tuy nhiên chúng tương đối bền với beta-lactamase

Thế hệ III: Tác dụng trên vi khuẩn Gram (+), đặc biệt tụ cầu, tuy nhiên kém hơn

cephalosporin thế hệ I, nhưng có phổ rộng tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-) Khả năng kháng beta-lactamase của vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn so với thế hệ II

Thế hệ IV: Đây là các cephalosporin phổ rộng Trên vi khuẩn Gram (+) chúng có hoạt

tính tương tự cephalosporin thế hệ I Trên vi khuẩn Gram (-), do các cephalosporin thế hệ IV là các ion lưỡng cực nên có thể thấm qua màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) và có tác dụng kháng beta-lactamase mạnh hơn thế III

Nesseria và Pseudomonas Kháng sinh này được sử dụng để điều trị viêm phổi, nhiễm

trùng máu và nhiễm trùng đường tiết niệu do các nhóm vi khuẩn trên gây ra Monobactam không có hiệu quả đối với vi khuẩn gram dương hoặc vi khuẩn kỵ khí [72]

1.1.3.4 Carbapenem

Hình 2 Cấu trúc hóa học của carbapenem [20]

Nhóm kháng sinh này được tìm ra vào năm 1976, chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại các bệnh nhiễm khuẩn Nguyên nhân là do chúng có khả năng kháng lại được sự thủy phân của các enzyme beta-lactamase Trong số hàng trăm loại kháng sinh beta-lactam đã biết, carbapenem có phổ rộng nhất và có hoạt tính mạnh lên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Hình 2) Chính bởi vậy chúng thường được gọi là “sự lựa chọn cuối cùng” và chỉ được chỉ định khi tình trạng của bệnh nhân trở nên trầm trọng hoặc nghi ngờ có sự kháng kháng sinh Một số đại diện trong nhóm này bao gồm:

Imipenem: có phổ tác dụng hiệu quả đối với cả tác nhân hiếu khí và kị khí, thường

dùng đường uống, hoạt động với liều thấp và ít tác dụng không mong muốn

Meropenem: có phổ tác dụng hiệu quả lên trực khuẩn Gram âm, đặc biệt có với các

bệnh nhiễm khuẩn cơ hội

Doripenem: có phổ tác dụng hiệu quả đáng kể đối với Pseudomonas aeruginosa Ertapenem: có phổ tác dụng giới hạn với các trực khuẩn Gram âm không lên men

Tuy nhiên, hiện nay tình trạng báo động về các vi khuẩn kháng lại dòng kháng sinh hiệu quả này đã được ghi nhận Đáng lo ngại hơn nữa, các vi khuẩn có khả năng kháng carbapenem đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu và nhanh chóng trở thành vấn đề đáng quan tâm của thế giới

1.1.3.5 Nhóm ức chế beta-lactamase

Các chất này cũng có cấu trúc beta-lactam, nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, mà chỉ có vai trò ức chế beta-lactamase của vi khuẩn bằng cách ức chế không thuận nghịch nhiều beta-lactamase làm thay đổi enzyme, bất hoạt và không cho chúng giải phóng trở lại Các chất hiện hay được sử dụng trên lâm sàng là acid clavulanic, sulbactam và tazobactam [72]

1.1.4 Phối hợp kháng sinh trong điều trị

Trên thực tế để nâng cao hiệu quả điều trị, việc phối hợp kháng sinh là rất cần thiết nhằm mục đích [58]:

Làm giảm khả năng xuất hiện các chủng đề kháng

Điều trị nhiễm khuẩn do nhiều chủng vi khuẩn gây ra

Làm tăng khả năng diệt khuẩn

Mỗi kháng sinh đều có ít nhiều tác dụng không mong muốn; khi phối hợp thì những tác dụng phụ này cũng sẽ cộng lại hoặc tăng lên Không nên hy vọng phối hợp thì hạ được liều lượng từng thuốc vì có thể dẫn đến nguy cơ xuất hiện vi khuẩn kháng kháng sinh Phối hợp kháng sinh có thể dẫn đến tác dụng cộng (addition) hoặc hiệp đồng

(synergism) hoặc đối kháng (antagonism) hay không thay đổi (indifference) so với một thuốc đơn lẻ Khi phối hợp, cần dùng đủ liều và nên lựa chọn những kháng sinh

có tính chất dược động học gần nhau hoặc có tác dụng hiệp đồng [58]

Việc phối hợp kháng sinh làm số kháng sinh cần sử dụng nhiều hơn dẫn đến giá cả điều trị tăng cao và nhất là tỷ lệ bị tác dụng phụ do thuốc nhiều hơn nên cần thận trọng và cân nhắc tối đa Nên khu trú một số trường hợp cần phối hợp kháng sinh, có thể kể như sau: Khi bị nhiễm nhiều loại vi khuẩn như bị áp-xe não, viêm màng não có khi phải phối hợp 3 loại kháng sinh Sốc nhiễm khuẩn hoặc nhiễm khuẩn nặng trong khi chờ kết quả xét nghiệm cấy vi khuẩn, kháng sinh đồ (thường phối hợp beta-lactam + aminosid) Nhiễm khuẩn giảm bạch cầu hoặc bị suy giảm miễn dịch (có khi phải phối hợp tobramycin + ticarcillin) Nhiễm loại vi khuẩn đặc biệt:

Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Listeria, Enterococcus do các loại vi khuẩn này rất dễ đột biến tạo chủng đề kháng nên cần

phối hợp nhiều kháng sinh vì nếu dùng một loại kháng sinh rất dễ bị đề kháng

Một trường hợp điển hình khác của việc phối hợp kháng sinh là sử dụng các chất ức chế beta-lactamase kết hợp với kháng sinh beta-lactam Hiện tại đây được coi

là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc đặc hiệu của vi khuẩn Phổ kháng khuẩn của kháng sinh được mở rộng trên các chủng vi khuẩn đề kháng do khả năng

ức chế dẫn đến bất hoạt đa số beta-lactamase tiết ra bởi vi khuẩn gram âm, gram dương và vi khuẩn kỵ khí

1.2 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii

1.2.1 Giới thiệu chung và vị trí phân loại

A baumannii được nhà vi sinh vật học Beijerinck người Hà Lan phân lập lần đầu tiên vào năm 1911 và được đặt tên là Micrococcus calcoaceticus Trong 50 năm

tiếp theo, loại vi khuẩn này cũng đã được phân lập nhiều lần và được báo cáo dưới

nhiều tên khác nhau như: Moraxella lwoffi, Alcaligenes hemolysans, Mirococcuscalco-aceticus, và Herellea vaginicola Vào năm 1968, Baumann và cộng

sự đã xếp tất cả vào cùng chi Acinetobacter và được hội đồng phân loại học chấp

nhận [8]

Hiện nay theo vị trí phân loại, A baumannii được xếp vào chi Acinetobacter,

họ Moraxellaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria [8]

1.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

A baumannii là cầu trực khuẩn Gram âm có đường kính từ 1-1,5 µm khi quan

sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Gram Loại vi khuẩn này kháng hoàn toàn với các thuốc tẩy màu và vì vậy có thể gây ra nhầm lẫn là cầu khuẩn Gram dương

Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A baumannii [79]

Về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, đây là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, không có

khả năng lên men và dễ nuôi cấy A baumannii không có khả năng di chuyển và

không sản xuất ra các loại enzyme như cytochrome oxidase, urease, citrate, và indole tuy nhiên lại có khả năng sinh enzyme catalase Chúng sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 35oC đến 37oC Ngoài ra, A baumannii là loài duy nhất có thể sinh trưởng

ở 44oC trong chi Acinetobacter Về khả năng sinh trưởng, loài này phát triển tốt trong

các môi trường nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm như: môi trường thạch máu, thạch chocolate và thạch MacConkey Trên môi trường thạch máu, chúng tạo thành các khuẩn lạc không màu, hơi nhày, không gây tán huyết hoặc ở dạng kết cấu nhẵn với đường kính từ 1-2 mm sau 18-24 giờ ủ ở 37oC Trên môi trường thạch MacConkey, các khuẩn lạc không màu, hơi nhày (Hình 4A) Trên môi trường thạch chọn lọc Leeds Acinetobacter, khuẩn lạc có màu hồng nhạt (Hình 4B) [8]

A Môi trường thạch máu [80] B Môi trường thạch chọn lọc Leeds A [81]

Hình 4: Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường thạch

A baumannii nói riêng và các loài thuộc chi Acinetobacter nói chung là các vi

khuẩn sống tự do và phân bố rộng trong các môi trường khác nhau như: nước, đất, nước thải, các loại rau củ và cả trên da người và động vật Trong môi trường bệnh

viện, A baumannii có thể được tìm thấy trên giường, rèm, tường, các dụng cụ và thiết

bị y tế và cũng có thể bám trên các dụng cụ chăm sóc cá nhân và thậm chí cả máy vi tính Vi khuẩn này có thể tồn tại lâu dài và tích lũy các gen kháng kháng sinh ngay trong bệnh viện nhờ vào việc tồn tại ở trạng thái không hoạt động và khả năng hình

thành biofilm Việc hình thành biofilm giúp cho A baumannii có thể bám vào bề mặt

các sinh vật sống và cả các bề mặt khác [21] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả

năng hình thành biofilm của A baumannii trên các bề mặt lỏng, rắn cao gấp 3 lần so với các loài Acinetobacter khác, tạo thành một lớp màng dày rõ ràng ở phía trên canh

thang nuôi cấy Đây chính là một trong những yếu tố quan trọng trong việc tồn tại và

gây bệnh của A baumannii

1.2.3 Dịch tễ học

A baumannii là nhân tố gây bệnh có mặt khắp nơi và có khả năng gây ra cả

bệnh nhiễm khuẩn cộng đồng và nhiễm khuẩn bệnh viện, mặc dù nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến hơn Vi khuẩn này gần đây đã được cảnh báo là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện với mức độ kháng kháng sinh cao và xu hướng có thể gây ra

sự bùng phát lớn trong các bệnh viện Khả năng tạo biofilm và kháng đa kháng sinh

đã giúp cho A baumannii tồn tại lâu dài trong môi trường bệnh viện tạo điều kiện cho việc gây nên dịch Đã có các báo cáo về A baumannii đa kháng thuốc từ các bệnh

viện ở Châu Âu, Bắc Mỹ, Argentina, Brazil, Trung Quốc, Đài Loan, Hồng Kông, Nhật Bản và Hàn Quốc và từ các khu vực xa xôi như Tahiti ở Nam Thái Bình Dương [42] Các chủng đa kháng thuốc này thường lây lan để gây ra dịch bệnh trên toàn bộ thành phố, quốc gia và lục địa Việc lan tràn các chủng đa kháng thuốc từ các khu vực có tỷ lệ kháng kháng sinh cao đến các khu vực có tỷ lệ thấp trong lịch sử, như từ Tây Ban Nha đến Na Uy, đã được ghi nhận Gần đây, các trường hợp nhân viên quân

sự và phi quân sự của Vương quốc Anh và Hoa Kỳ trở về từ các hoạt động ở Iraq và

Afghanistan và mắc các bệnh nhiễm khuẩn do A baumannii gây ra đang ngày càng

được chú ý [42]

Ở hầu hết các trường hợp, phần lớn các chủng A baumannii được phân lập từ

các bệnh nhân mắc viêm phổi bệnh viện Trong nhiều trường hợp, rất khó để phân biệt các chủng phân lập từ đường hô hấp trên với viêm phổi thực sự Tuy nhiên, không

thể nghi ngờ về việc viêm phổi máy thở (VAP) thường do A baumannii gây ra Bên

cạnh đó, tỷ lệ viêm phổi mắc phải do nằm lâu tại phòng chăm sóc đặc biệt (ICU) do

A baumannii gây ra cao hơn nhiều Thông thường, bệnh nhân bị nhiễm A baumannii

đã ở lại ICU trong một thời gian dài, tuy nhiên trong một số tình huống, việc nhiễm khuẩn đã có thể xảy ra trước đó Ngoài viêm phổi bệnh viện các ca viêm phổi cộng

đồng gây ra A baumannii đã được mô tả cho các vùng nhiệt đới của Úc và Châu Á

Bệnh thường xảy ra nhất trong mùa mưa ở những người có tiền sử lạm dụng rượu và đôi khi có thể phải nhập viện tại phòng ICU với các biểu hiện lâm sàng nặng, nhiễm trùng máu thứ phát và tỷ lệ tử vong từ 40 đến 60% Nguồn lây nhiễm có thể xâm nhập

từ cổ họng, xảy ra ở 10% cư dân trong cộng đồng với mức tiêu thụ rượu quá mức [5]

Trong một nghiên cứu lớn về nhiễm trùng máu bệnh viện ở Hoa Kỳ (1995-2002), A baumannii là tác nhân gây bệnh phổ biến thứ 10, chịu trách nhiệm cho 1,3% các trường hợp nhiễm trùng máu bệnh viện do đơn tác nhân A baumannii là nguyên

nhân phổ biến của nhiễm trùng máu tại ICU, tỷ lệ cao so với nhiễm trùng không nằm

tại ICU Tỷ lệ tử vong từ nhiễm trùng máu do A baumannii là 34,0% đến 43,4% trong ICU và 16,3% bên ngoài ICU Nhiễm trùng máu A baumannii có tỷ lệ tử vong thô cao thứ ba trong ICU, chỉ xếp sau qua P aeruginosa và Candida spp [5]

A baumannii còn có khả năng gây ra một số bệnh nguy hiểm khác như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm giác mạc … A baumannii không phải là một vi khuẩn có khả năng gây bệnh với độc tính cao, tuy

nhiên với khả năng kháng đa kháng sinh đứng đầu trong các vi khuẩn kháng thuốc

hiện nay đã biến A baumannii đang trở thành mối đe dọa đối với mọi bệnh nhân trên

thế giới, đặc biệt là các bệnh nhân nằm trong ICU

1.2.4 Thực trạng kháng kháng sinh của A baumannii

1.2.4.1 Trên thế giới

Tình trạng kháng carbapenem ở A baumannii hiện là một vấn đề ở nhiều nước

châu Âu Thông tin về tỷ lệ kháng carbapenem ở nhiều nước châu Âu rất khó có được, tuy nhiên thông tin từ các tài liệu về dịch bệnh cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem cao nhất ở Thổ Nhĩ Kỳ, Hy Lạp, Ý, Tây Ban Nha và Anh và vẫn còn khá thấp ở Đức và

Hà Lan Trong một báo cáo giám sát từ 48 bệnh viện châu Âu trong giai đoạn

2002-2004, chỉ 73,1% các chủng phân lập nhạy cảm với meropenem và 69,8% nhạy cảm với imipenem Nhạy cảm với các kháng sinh khác cũng rất thấp, với 32,4%, 34,0%

và 47,6% mẫn cảm tương ứng với ceftazidime, ciprofloxacin và gentamicin A baumannii phân lập được kháng với các polymyxin đã được phát hiện ở châu Âu, mặc dù hiện tại chúng vẫn còn hiếm [5]

Trong một nghiên cứu giám sát gần đây bao gồm các chủng Acinetobacter

spp được thu thập từ năm 2004 đến 2005 từ 76 trung tâm trên khắp Hoa Kỳ, chỉ có 60,2% dễ bị tác động bởi imipenem Một nghiên cứu khác từ 15 trung tâm trên khắp Hoa Kỳ đã báo cáo mức độ nhạy cảm với carbapenem và aminoglycoside được cải thiện trong năm 2005 so với những năm 2004 Tuy nhiên, tỷ lệ không nhạy cảm vẫn còn đáng kể, như sau: 10% đến 15% đối với carbapenem, 35% đến 40% đối với ceftazidime /cefepime, 10% đến 30% đối với aminoglycoside và 35% đến 40% đối với ciprofloxacin/levofloxacin [5]

Dữ liệu về mức độ kháng kháng sinh ở A baumannii ở Châu Phi phần lớn giới

hạn ở Nam Phi vào thời điểm hiện tại, mặc dù có những báo cáo rải rác từ các quốc

gia khác Một nghiên cứu đã đã chỉ ra rằng khoảng 30% A baumannii gây ra các ca

nhiễm khuẩn huyết ở Nam Phi có khả năng kháng carbapenem, 40% kháng với

cefepime và piperacillin-tazobactam và 30% kháng với ciprofloxacin và levofloxacin Các chủng kháng thuốc này là đặc hữu ở một số khoa bệnh cụ thể (ví dụ, bỏng và ICU) và đã được lan truyền sang các khoa khác [5]

Nhiều đợt bùng phát của A baumannii toàn kháng đã được ghi nhận ở các

bệnh viện châu Á và Trung Đông, và một loạt các carbapenemase đã được mô tả có nguồn gốc từ đó Tỷ lệ không nhạy cảm ở các chủng từ 2002-2004 vượt quá 25% đối với imipenem và meropenem, 40% đối với cefepime và ceftazidime, 40% đối với ampicillin-sulbactam, 35% đối với amikacin và 45% đối với ciprofloxacin Và đặc biệt các chủng kháng với tigecycline và polymyxin B đã xuất hiện tại các khu vực này [5]

1.2.4.2 Tại Việt Nam

Theo tổng kết bộ Y tế năm 2004, A baumannii cùng P aeroginosa là những

chủng vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi bệnh viện có khả năng kháng kháng sinh cao Những kháng sinh sử dụng thường xuyên đã bị kháng với tỷ lệ cao như ceftriaxon 70%, ceftazidime 64%, ciprofloxacine 55% gây khó khăn cho điều trị [73]

Thống kê về viêm phổi bệnh viện năm 2012 ở khoa Hồi sức tích cực bệnh viện 115 Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ nhạy của kháng sinh imipenem và meropenem cùng là

3% [66] Trong nghiên cứu của Nguyễn Viết Quang (2013) các chủng A baumanni

phân lập được từ 98 bệnh nhân viêm phổi thở máy tại Khu Hồi sức sau mổ tại Bệnh viện Trung Ương Huế cho thấy vi khuẩn này kháng 17 loại kháng sinh thử nghiệm với tỷ lệ trên 50% [67] Trong nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự (2017) tại hai Bệnh viện Trung Ương Huế và Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế, tỉ lệ

các chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem (imipenem, meropenem) là

88,3% [63]

Khảo sát về tình hình kháng thuốc của các bệnh nhân mắc viêm phổi bệnh viện

và viêm phổi thở máy 2017 tại bệnh viện Chợ Rẫy cho kết quả A baumannii là

nguyên nhân chính và có sự đề kháng cao với imipenem (100%), meropenem (98%) [61] Gần đây, nghiên cứu của Trần Diệu Linh (2018) đã phát hiện được các loại gen

mã hóa cho carbapenemase ở một số vi khuẩn Gram âm tại Bệnh viện Việt Đức và

Bệnh viện Trung Ương 108 đã chỉ ra A baumannii là vi khuẩn mang gen kháng với

tỷ lệ cao nhất là 92,12 % [71]

Các nghiên cứu ở Việt Nam gần đây chỉ tập trung đánh giá về mức độ kháng

kháng sinh của A baumannii, cũng như thống kê tần suất sự có mặt của các gen mà

ít để cập đến mối tương quan giữa hai yếu tố này Vì vậy, khi thực hiện đề tài này tôi hướng tới nghiên cứu dựa trên kết quả kháng sinh đồ và tần suất xuất hiện của 4 gen

mã hóa carbapenemase bao gồm OXA-23, OXA-51, VIM, IMP là những gen được

quan tâm nhiều với khả năng kháng kháng sinh phổ rộng nhằm mục đích giảm thời gian chẩn đoán và điều trị cho các bệnh nhân mắc các bệnh nguy hiểm liên quan đến

A baumannii đặc biệt là viêm phổi bệnh viện

1.2.4.3 Các cơ chế kháng kháng sinh

Các cơ chế kháng kháng sinh của A baumannii bao gồm: beta-lactamase, bơm

đẩy thuốc, thay đổi cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm của màng và thay thế

vị trí gắn của thuốc Các cơ chế này có thể hướng tới nhiều đích thuốc khác nhau và

có thể được vận hành cùng lúc để giúp A baumannii kháng toàn bộ các kháng sinh thuộc cùng một nhóm Ví dụ như trong các cơ chế của A baumannii đa kháng

carbapenem, ngoài cơ chế chính thủy phân carbapenem nhờ vào sự hoạt động carbapenemase, khả năng biến đổi các PBP của cũng liên quan tính kháng

Phân lớp A: Mặc dù có khá nhiều các beta-lactamase thuộc phân lớp A được phát hiện ở A baumannii như TEM, SHV, CTX-M, GES, SCO, VEB, CARB và KPC tuy

nhiên chúng được cho rằng chỉ đóng một vai trò nhỏ trong tính kháng beta-lactam của vi khuẩn này, đặc biệt là đối với khả năng kháng carbapenem [29,32,42]

Phân lớp B: Đây là phân lớp đóng vai trò quan trọng đối với khả năng các beta-lactam của A baumannii nhờ và phổ hoạt động rộng, hoạt tính tiềm năng của carbapenemase

và khả năng kháng với các chất ức chế Mặc dù các metallo-beta lactamase không

phải là các carbapenmase chiếm ưu thế ở A baumannii, tuy nhiên VIM, IMP và SIM

các metallo-beta lactamase đã được phát hiện tham gia vào khả năng kháng ở mức độ cao với các carbapenem [29,32,42]

Phân lớp D: Các OXA beta-lactamase thường được biết đến là các penicillinase (oxacillinase) Tuy nhiên một số OXA có khả năng thủy phân các cephalosporin phổ

rộng, và đáng lo ngại hơn một số có khả năng bất hoạt carbapenem nhờ việc hoạt động như một carbapenemase Có ít nhất 121 biến thể khác nhau của các beta-lactamase phân lớp D được phát hiện ở các cấp độ protein khác nhau, 45 trong số đó

thể hiện hoạt tính thủy phân carbapenem Các gen OXA có thể định vị trên nhiễm sắc

thể hoặc một plasmid và đôi khi có thể tìm thấy trong các yếu tố di truyền chuyển vị

Hiện nay có 9 phân nhóm chính của các OXA carbapenemase đã được xác định dựa trên sự tương đồng các acid amin Bốn phân nhóm OXA có hoạt tính của carbapenemase chiếm ưu thế ở A baumannii bao gồm OXA-23, OXA-40/24, OXA-51

và OXA-58 [29,32,42]

Ngoài beta-lactamase bơm đẩy thuốc cũng là cơ chế liên quan đến tính kháng

đối với nhiều nhóm kháng sinh khác nhau của A baumannii như imipenem và tigecycline (Hình 5) Hiện nay có bốn nhóm bơm đẩy chính liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của A baumannii bao gồm siêu họ RND, siêu họ MFS, họ MATE

và một họ nhỏ là SMR

AdeABC trong họ siêu họ RND liên quan đến khả năng kháng aminoglycoside và làm giảm nhạy cảm của A baumannii với tigecycline [29]

Enzyme biến đổi aminoglycoside (AMEs) là cơ chế kháng chính đối với các

kháng sinh aminoglycoside (Hình 5) Cơ chế này liên quan đến ba nhóm enzyme bao

gồm acetyltransferases, adenyltransferases và phosphotransferases, các enzyme này

có khả năng thay đổi hoặc đảo vị trí các nguyên tố trong cấu trúc hóa học của kháng sinh aminoglycoside Các gen mã hóa cho các enzyme này có thể chuyển giữa các loại vi khuẩn khác nhau thông qua các plasmid, transposon, các yếu tố biến đổi hoặc

di truyền tự nhiên [29]

Bên cạnh các cơ chế trên A baumannii cũng được ghi nhận khả năng kháng

kháng sinh với vai trò của các cơ chế khác như thay đổi tính thấm của màng và thay thế vị trí gắn thuốc

Hình 5: Các cơ chế kháng kháng sinh của A baumannii [8]

1.2.4.4 Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase

Như đã trình bày ở trên, các gen carbapenamase thuộc phân lớp A chỉ đóng vai trò nhỏ trong khả năng kháng carbapenemase nên các nghiên cứu liên quan đến

sự xuất hiện của các gen này còn khá hạn chế Trong nghiên cứu của Raghdaa và

cộng sự tại Ai Cập đã đề cập đến sự xuất hiện của gen GES thuộc phân lớp A với tỷ

lệ xuất hiện là 50 % [45] Một nghiên cứu cụ thể riêng với gen này tại Bỉ của Pierre

và cộng sự đã cho thấy sự xuất hiện của 9 chủng A baumannii mang GES tại 6 bệnh viện tại Bỉ chiếm 7,2 % trong số mẫu thu được [11] Ngoài GES một số gen khác trong phân lớp này cũng nhận được sự quan tâm như TEM và KPC Hai gen này đều

là đối tượng nghiên cứu của Zhao và cộng sự trong một nghiên cứu gần đây tại khoa hồi sức tích cực của một bệnh viện tại Trung Quốc, tuy nhiên trong nghiên cứu chỉ

nhận định sự có mặt của gen TEM và vắng mặt của KPC mà không đề cập cụ thể đến

tỷ lệ xuất hiện [57] Gen KPC đã xuất hiện trong nghiên cứu trong nước của Trần Diệu Linh (2018), tuy nhiên gen này chỉ được phát hiện ở E coli và K pneumonia

mà không được nhận diện ở các chủng A baumannii [71]

I Cơ chế kháng lactam

beta-A Biến đổi PBP

B Bơm đẩy thuốc

C Quá trình thủy phân của beta-lactamase

D Biến đổi OMP

II Cơ chế kháng

aminoglycoside

A Quá trình thủy

phân của AME

B Bơm đẩy thuốc

Phân lớp B và D là hai phân lớp được quan tâm hơn do được đánh giá là những

gen chính trong cơ chế kháng carbapenem của A baumannii Đây cũng là các gen

thường được nghiên cứu ở trong và ngoài nước, các gen phổ biến trong nhóm B

metallo beta-lactamase như VIM, IMP và NDM và nhóm D là các gen thuộc họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-24 Tuy nhiên tần số xuất hiện của

các gen thuộc phân lớp B thấp hơn rất nhiều cho so với các gen thuộc phân lớp D Các nghiên cứu tại Việt Nam cũng đã khẳng định điều này Trong nghiên cứu của Trần Huy Hoàng và cộng sự (2016), tác giả đã điều tra sự hiện diện phân lớp B, D

bao gồm NDM-1, OXA-23, OXA-24, OXA-58, IMP, VIM ở vi khuẩn A baumannii

kháng kháng sinh phân lập từ bệnh viện bệnh nhân của ba bệnh viện lớn ở Hà Nội và

phát hiện được 23/582 trường hợp (4%) dương tính với NDM-1, 550/582 trường hợp dương tính với OXA-23, 2/582 trường hợp dương tính với OXA-58 và 2/582 trường hợp dương tính với IMP Nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự lại phát hiện

sự có mặt của OXA-23, IMP và VIM lần lượt được tìm thấy là 85,3 %, 4,4 % và không

có mẫu nào có mặt VIM [63] Gần đây nhất là nghiên cứu của Trần Diệu Linh cũng

trên 3 gen này đã đưa ra tỷ lệ OXA-23 là 92,1 % nhưng VIM không xuất hiện trong bất cứ mẫu A baumannii phân lập nào, còn IMP chỉ xuất hiện với tần suất chưa đến

1 % [71] Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước nói trên không được thực hiện tại các bệnh viện chuyên khoa về viêm phổi như Bệnh viện Phổi Trung ương và chưa thực hiện điều tra mối tương quan giữa sự xuất hiện của các gen kháng kháng sinh và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kết quả kháng sinh đồ Ngoài ra, các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung sử dụng phương pháp PCR đơn mồi để phát hiện từng gen kháng kháng sinh và mất nhiều thời gian trong việc phát hiện từng gen kháng kháng sinh Do vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm phát hiện đồng thời nhiều gen kháng kháng sinh bằng kỹ thuật multiplex PCR từ đó rút ngắn thời gian phát hiện các gen kháng kháng sinh liên quan, cho phép xác định phổ gen kháng kháng sinh rộng hơn nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị

1.2.4.5 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A baumannii

Hiện nay, có rất nhiều định nghĩa về vi khuẩn đa kháng (MDR), siêu kháng (XDR) và toàn kháng (PDR) được sử dụng trong y học để xác định các kiểu kháng khác nhau ở các vi khuẩn kháng thuốc có liên quan đến lĩnh vực chăm sóc sức khỏe Một nhóm các chuyên gia quốc tế đã được thành lập với sự khởi đầu là Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật châu Âu (ECDC) và Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật của Mỹ (CDC) đã đưa ra các khái niệm chuẩn quốc tế nhằm mô tả

đặc tính kháng của các vi khuẩn Staphylococcus aureus, Enterococcus spp, Enterobacteriaceae (ngoại trừ Salmonella và Shigella), Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter spp [33] Các vi khuẩn trên đều là nhưng tác nhân gây bệnh đã được

chứng minh là có khả năng kháng kháng sinh mạnh

Không có bất cứ tiêu chuẩn nào dùng để xác định các loại, lớp hoặc nhóm kháng sinh được sử dụng nhằm xác định MDR, XDR và PDR Thông thường, để định nghĩa các khái niệm này người ta sử dụng chính phân loại các chất kháng sinh dựa

trên cấu trúc hóa học Đối với các vi khuẩn trong chi Acinetobacter, bao gồm cả A baumannii việc đánh giá MDR, XDR và PDR dựa theo bảng sau [33]:

Bảng 2 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A baumannii

Tobramycin Amikacin Netilmycin

Meropenem Doripenem

Levofloxacin Nhóm phối hợp penicillin – chất ức chế

beta-lactamase

Piperacillin – tazobactam Ticarcillin – clavulanic acid

Cephalosporin phổ rộng Cefotaxime

Ceftriaxone Ceftazidime Cefepime Kháng sinh ức chế con đường sinh tổng

Tiêu chí để xác định MDR, XDR, PDR của Acinetobacter spp

MDR: Không nhạy cảm với ≥ 1 kháng sinh cụ thể trong ≥ 3 nhóm kháng sinh

XDR: Không nhạy cảm với ≥ 1 kháng sinh cụ thể trong tất cả các nhóm trừ 1-2 nhóm còn có tác dụng

PDR: Không nhạy cảm với bất cứ kháng sinh nào trong danh mục trên

1.3 Các phương pháp nghiên cứu A baumannii

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp kinh điển dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong các môi trường thích hợp Hầu hết các căn nguyên vi khuẩn thông thường đều có thể phát triển dễ dàng trong các môi trường rắn không chọn lọc như thạch máu, thạch chocolate Những bệnh phẩm có tạp nhiễm nên được nuôi cấy trên các

môi trường chọn lọc đặc biệt, đối với A baumannii có thể sử dụng các môi trường

như MacConkey hoặc môi trường chọn lọc Leeds Acinetobacter [8] Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hầu hết các vi khuẩn sẽ phát triển và tạo thành khuẩn lạc sau 24-48 giờ, lúc này có thể sơ bộ định hướng loại tác nhân gây bệnh Nhuộm Gram

là phương pháp định danh sơ bộ, giúp phân biệt hai nhóm vi khuẩn khác nhau dựa

trên các đặc tính sinh hóa của thành tế bào vi khuẩn, vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+) Nhuộm Gram có thể sử dụng bệnh phẩm là đờm, các dịch sinh học và mẫu

mô sinh thiết Việc phân tích kết quả nhuộm Gram đòi hỏi phải có kiến thức và kinh nghiệm về hệ vi sinh vật Một mẫu đờm với sự xuất hiện của nhiều loại vi khuẩn hình thái khác nhau phù hợp với hệ vi sinh vật ở khoang miệng bình thường [59] Việc xác định chính xác loại vi khuẩn gây bệnh còn phải dựa trên các hóa chất xác định tính chất sinh học, hóa học của vi khuẩn Hiện nay trên thị trường nhiều test thử sinh hóa đã được thương mại hóa thuận tiện cho việc xác định nhiều loại vi khuẩn gây bệnh Một trong các test sinh hóa thường được sử dụng hiện nay là các kit API của BioMérieux Sau thời gian dài thử nghiệm các kit API đã được đánh giá là đáng tin cậy trong các nghiên cứu vi sinh API 20E và API 20NE [76] là hai kit thử được sử dụng rộng rãi để xác định các vi khuẩn Gram (-) trong các phòng nghiên cứu vi sinh

trong đó có A baumannii Ngoài các phương pháp định danh cổ điển, việc định danh

vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử Malditof cũng đang được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới tại các viện nghiên cứu, bệnh viện và trung tâm y khoa hàng đầu hiện nay Một ưu điểm vô cùng quan trọng của phương pháp nuôi cấy so với các phương pháp khác là sau khi phân lập và xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh, người ta có thể tiến hành làm kháng sinh đồ để đánh giá tình trạng nhạy cảm hay đề kháng của vi khuẩn gây bệnh với các thuốc kháng sinh, từ đó sẽ hướng dẫn lựa chọn các kháng sinh thích hợp cho điều trị tối ưu Các phương pháp xác định khả năng đề kháng của

vi khuẩn thường được sử dụng như khuếch tán đĩa và E-test

Khuếch tán đĩa dựa trên nguyên tắc đĩa tẩm kháng sinh, đặt trên môi trường thạch trước đó đã được cấy vi khuẩn thử nghiệm, lấy độ ẩm và khuếch tán kháng sinh

ra bên ngoài qua môi trường thạch tạo ra gradient nồng độ kháng sinh Nồng độ của kháng sinh ở rìa đĩa cao và giảm dần khi khoảng cách từ đĩa tăng lên đến một điểm nơi mà nó không còn ức chế cho sinh vật, sau đó sinh vật phát triển tự do Một vùng hoặc vòng rõ ràng được hình thành xung quanh đĩa kháng sinh sau khi ủ nếu tác nhân

ức chế sự phát triển của vi khuẩn [59,68]

Phương pháp E-test là một phương pháp được thiết lập tốt để thử nghiệm độ nhạy cảm của thuốc kháng khuẩn trong các phòng thí nghiệm vi

sinh trên toàn thế giới E-test bao gồm một dải nồng độ kháng sinh được xác định trước trên một dải nhựa và được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh, thuốc chống nấm.[77]

1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng trong định danh vi khuẩn và hỗ trợ chuẩn đoán đang ngày càng phổ biến do thời gian phân tích ngắn và hiệu quả cao Các phương pháp phổ biến thường gặp như PCR, LAMP, Real-time PCR

LAMP là một phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ đặc hiệu cao, bằng cách tận dụng ưu điểm một bộ mồi được thiết kế đặc biệt do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng Phương pháp khuếch đại acid nucleic này diễn ra

ở điều kiện đẳng nhiệt (trong khoảng 60-65˚C) cho phép phát hiện gen đích trong vòng một giờ, đơn giản về mặt thao tác Lợi thế lớn của LAMP so với PCR truyền thống là độ nhạy cao (có thể gấp 10 lần) và cho kết quả nhanh (20-60 phút so với 2-

3 giờ PCR-điện di thông thường) Với những ưu điểm kể trên, LAMP có tiềm năng được ứng dụng ở các bệnh viện để phục vụ cho các xét nghiệm lâm sàng cần kết quả nhanh và chính xác [62] Tuy nhiên do phương pháp có độ nhạy cao nên quá trình thực nghiệm đòi hỏi mức độ chính xác cao để tránh xảy ra hiện tượng dương tính giả

Phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhất được sử dụng là PCR, được dùng

để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ có thể khuếch đại chính xác một lượng lớn lên đến hàng triệu bản copy nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng Đặc biệt, phương pháp PCR có

độ nhạy đặc nhạy và độ đặc hiệu cao khi so sánh với phương pháp nuôi cấy (tiêu chuẩn vàng) Xét nghiệm bằng PCR cho kết quả chính xác cao hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống Nó có thể giúp phát hiện ra nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và tiết kiệm được nhiều thời gian hơn

Hiện nay phương pháp PCR đã được phát triển thành nhiều kỹ thuật khác nhau, trong đó có PCR đa mồi (multiplex PCR) và Realtime PCR được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu chẩn đoán Trong phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được

khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex PCR Quá trình thiết kế mồi liên quan đến chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, độ đặc hiệu và tránh hình thành dimer Ngoài ra kỹ thuật multiplex PCR còn đòi hỏi quả trình tối ưu hóa các thành phần của phản ứng, thời gian, nhiệt độ gắn mồi để có thể xác định đồng thời nhiều gen với kết quả chính xác Multiplex PCR được coi như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm (Hình 6)

Đối với Realtime PCR, đây là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real-time Với đặc điểm này khi thực hiện real-time người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại hay không vì kết quả cuối cùng của quá trình khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi phản ứng hoàn tất Như vậy phương pháp này không những có thể dùng để định tính mà còn có thể định lượng được số bản sao DNA có trong mẫu thử nghiệm [69]

Hình 6: Nguyên tắc của kỹ thuật multiplex PCR [78]

Bên cạnh phát hiện sự có mặt của các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn, việc tìm hiểu về trình tự của các gen để tìm ra những biến đổi cũng mang ý nghĩa lớn trong nghiên cứu Sự phát triển của các phương pháp giải trình tự đã giúp các nghiên cứu

giải quyết vấn đề này Đối với việc phân tích các biến đổi trong trình tự DNA của A baumannii, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp giải trình tự Sanger để xác định trình

tự các nucleotide trong sản phẩm PCR thu được Phương pháp này thực hiện dựa trên

kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene [82]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân được thu thập, xử lý, nuôi cấy và xác định

dương tính với A baumannii Các mẫu DNA được tinh sạch từ mẫu dương tính với

A baumannii ở Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương sau đó được chuyển về

Phòng Thí nghiệm Enzyme và phân tích hoạt tính sinh học để phân tích bằng kỹ thuật multiplex PCR và một số mẫu được giải trình tự

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm (đờm) của các bệnh nhân được xử lý và nuôi cấy theo quy

trình để xác định sự có mặt của A baumannii Các mẫu dương tính với A baumannii

sẽ được tách DNA, 63 mẫu trong đó được chỉ định làm kháng sinh đồ theo yêu cầu

của bác sĩ Tất cả các mẫu DNA được tinh sạch từ mẫu dương tính với A baumannii được tiến hành multiplex PCR với bốn gen đích bao gồm: OXA-23, OXA-51, VIM và IMP Các mẫu cần lưu ý được gửi đi giải trình tự Các kết quả được phân tích và xử

lí số liệu theo đúng mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2.2.1 Nuôi cấy và định danh A baumannii từ mẫu bệnh phẩm

2.2.1.1 Nguyên tắc

Mẫu bệnh phẩm (đờm) của các bệnh nhân được xử lý và thực hiện nuôi cấy phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu, thạch Mac Conkey theo phương pháp bán định lượng và ủ ấm ở nhiệt độ 35 – 37oC (tủ ấm có 5 – 7 % CO2 cho đĩa thạch máu) theo đúng quy trình thường quy của Khoa vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương

2.2.1.2 Hóa chất sinh phẩm

Bộ hóa chất nhuộm Gram, thạch máu cừu và thạch Mac Conkey được dùng để phân lập là nhuộm vi khuẩn Khoanh giấy optochin, oxidase và kit API 20NE [76] được sử dụng trong các test thử sinh hóa định danh vi khuẩn

2.2.1.3 Các bước tiến hành

Nuôi cấy vi khuẩn: Tiến hành nuôi cấy với các mẫu bệnh phẩm đạt chất lượng

Các đĩa thạch được ghi số xét nghiệm, tên bệnh nhân, loại bệnh phẩm, ngày cấy Dùng que tre vô trùng hoặc que cấy nhựa lấy mẫu đờm nhày mủ nhất, cấy vùng nguyên ủy vào 1 đĩa thạch máu, 1 đĩa thạch Mac Conkey Mỗi đĩa thạch cấy 4 vùng