Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành:

VŨ THỊ BÍCH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 9.42.01.21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết

2: PGS.TS Phạm Thị Tâm

HÀ NỘI- NĂM 2020

Tôi là Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Xuân Viết và PGS.TS Phạm Thị Tâm

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh

Vũ Thị Bích Huyền

Để thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến hai thầy, cô giáo kính mến của mình, PGS.TS Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) và PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội) Thầy cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình chỉ bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Thầy cô luôn luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này

Tôi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu đã nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện đề tài của mình bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Công nghệ sinh học), Th.S Cao Thị Thanh Hương, ThS Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS Đặng Thị Hồng Thắm và các sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN), Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN)

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ - giảng viên - sinh viên trong bộ môn Di truyền học - Hóa Sinh, các cán bộ - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội đã ủng hộ tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện các nội dung trong đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng

Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành chương trình học Nghiên cứu sinh tại Trường

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học

- Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tôi có thể triển khai thuận lợi các nội dung của đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến gia đình và bạn

bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm

Nghiên cứu sinh

Vũ Thị Bích Huyền

6 BHI Brain Heart Infusion

7 CFU Colony Forming Units

23 NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung

tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia)

31 RNA Ribonucleic acid

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Đối tượng nghiên cứu 4

5 Phạm vi nghiên cứu 4

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

7 Tính mới, tính độc đáo của đề tài 4

8 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 5

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 6

1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio 6

1.1.2 Hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus 8

1.1.3 Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin 9

1.1.4 Gen rpoB và tính kháng rifampicin 12

1.1.5 Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 14

1.2 Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển 15

1.2.1 Triệu chứng 15

1.2.2 Chẩn đoán và điều trị 17

1.3 Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động 18

1.3.1 Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá 18

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương 21

1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá 23

1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá 25

1.4.3 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen 32

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá 35

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 35

1.5.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 38

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Vật liệu nghiên cứu 41

2.1.1 Cá bệnh 41

2.1.2 Cá thí nghiệm 41

2.1.3 Vi khuẩn 41

2.1.4 Hóa chất 41

2.1.5 Thiết bị 42

2.2 Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1 Sơ đồ các bước thực hiện chính 43

2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh 43

2.2.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn 44

2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram 44

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 44

2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn 44

2.2.7 Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn 47

2.2.8 Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin 48

2.2.9 Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 49

2.2.10 Nhóm phương pháp sinh học phân tử 50

2.2.10.1 Phương pháp thiết kế mồi 50

2.2.10.2 Phương pháp tách DNA tổng số 50

2.2.12 Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi

khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam 52

2.2.13 Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú 53

2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu 54

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận 55

3.1.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio 55

3.1.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập 58

3.1.3 Xác định chủng vi khuẩn V parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử 62

3.1.4 Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập 65

3.1.5 Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập 68

3.2 Kết quả tạo dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực 78

3.2.1 Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 78

3.2.2 Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực 90

3.2.3 So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại 90

3.2.3.1 So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại 90

3.2.3.2 So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực 99

3.3 Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực 104

3.3.1 Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực 104

3.3.2 Xác định tính an toàn của dòng L4650 106

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

4.1 Kết luận 112

4.2 Kiến nghị 113

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

Tài liệu tiếng Việt 115

PHỤ LỤC

Hình 2.2 Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú 48 Hình 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS 57 Hình 3.2 Phản ứng lên men trên môi trường KIA (A) và phản ứng sinh indol với

thuốc thử Kovac (B) của các mẫu vi khuẩn 59

Hình 3.3 Vi khuẩn VCTT 12233 (A) và HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi

bọt khi thử nghiệm với H2O2 60

Hình 3.4 Vi khuẩn LBT6 gây hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu (A)

và có khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (B) 60

Hình 3.5 Vi khuẩn N13.1.1 nuôi trên BHI agar với 5 đĩa giấy kháng sinh 61 Hình 3.6 DNA tổng số của các vi khuẩn điện di trên gel agarose 62

Hình 3.7 Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi

toxR-4, toxR-7 64

Hình 3.8 Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với

cặp mồi tlhF-tlhR 65

Hình 3.9 Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9

sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B) 66

Hình 3.10 Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn

với cặp mồi toxR2, toxR4 68

Hình 3.11 So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi

toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) 70

Hình 3.12 Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn

chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 71

Hình 3.13 Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn

với cặp mồi tlh1- tlh3 72

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn

chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 75

Hình 3.16 Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi

1110F-CM32b 76

Hình 3.17 Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn

phát sinh từ chủng dại A3.3 78

Hình 3.18 Cá ngựa vằn chết do nhiễm khuẩn A3.3 sau 12 giờ 79 Hình 3.19 Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại A3.3 80

Hình 3.20 Cá rô phi chết do nhiễm vi khuẩn (A) A3.3; (B) A400 80 Hình 3.21 Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại LBT6 83

Hình 3.22 Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm bằng các dòng vi khuẩn phát

sinh từ chủng vi khuẩn dại B3.13 87

Hình 3.23 Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực 90

Hình 3.24 Sản phẩm PCR gen toxR của các dòng giảm độc lực trên gel agarose 91 Hình 3.25 Sản phẩm PCR gen tlh của các dòng giảm độc lực trên gel agarose 91

Hình 3.26 Sự tương đồng vị trí các amino acid Ser152, Gly203, Asn247 và His392

của TLH ở 3 chủng vi khuẩn V parahaemolyticus LBT6, A3.3, B3.13 và VvPla của chủng V vulnificus 97

Hình 3.27 Mô hình cấu trúc 3D protein TLH của chủng vi khuẩn LBT6 (A) và

dòng L4650 (B) 98

Hình 3.28 Vị trí xoắn a 250-252 của TLH ở các dòng vi khuẩn và chủng dại khi

được xây dựng bằng phần mềm Phyre2 99

Hình 3.29 Sản phẩm PCR của gen rpoB ở các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus

giảm độc lực trên gel agarose 1% 100

106

Bảng 2.1 Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 51

Bảng 3.1 Các vi khuẩn phân lập từ mẫu cá bị bệnh 55

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập 58

Bảng 3.3 Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 mẫu vi khuẩn phân lập 61

Bảng 3.4 Sự có mặt của các gen độc tố ở các mẫu vi khuẩn phân lập 63

Bảng 3.5 Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với chủng vi khuẩn phân lập 66

Bảng 3.6 So sánh trình tự gen toxR của chủng V parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST 69

Bảng 3.7 So sánh trình tự gen tlh của chủng V parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST 73

Bảng 3.8 So sánh trình tự gen rpoB của chủng V parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST 76

Bảng 3.9 Giá trị LD50 của chủng A3.3 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 81

Bảng 3.10 Giá trị LD50 của chủng LBT6 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 84 Bảng 3.11 Giá trị LD50 của chủng B3.13 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 87 Bảng 3.12 Sự thay đổi nucleotide của gen tlh ở các dòng giảm độc lực so với các chủng dại 92

Bảng 3.13 Những vị trí amino acid thay đổi trong đoạn trình tự gen rpoB (930 bp) của các dòng giảm độc lực so với các chủng dại 101

Bảng 3.14 Đánh giá tính ổn định độc lực của dòng vi khuẩn L4650 104

Bảng 3.15 Đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam được tiêm vắc-xin L4650 sau 15 ngày và 60 ngày 107

Bảng 3.16 Tỉ lệ cá chết và tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá được tiêm vắc-xin L4650 ở các khoảng thời gian khác nhau 110

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Với lợi thế bờ biển dài (3.260 km) lại trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm năng kinh tế từ biển của nước ta là rất lớn Nghề đánh bắt và khai thác thủy hải sản có từ ngàn đời xưa đang ngày càng khẳng định vị trí và vai trò là ngành kinh tế mũi nhọn, đóng góp to lớn vào nền kinh tế quốc dân Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018 GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% toàn nền kinh tế và 23,57% toàn ngành nông nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong ngành nông nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào tăng trưởng chung toàn ngành nông nghiệp và cả nước [187]

Ngành nuôi trồng thủy sản nước ta liên tục tăng trưởng trong suốt 17 năm qua

cả về diện tích và sản lượng Tổng sản lượng thủy sản nước ta năm 2018 đạt 7,76 triệu tấn, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng đạt 4,15 triệu tấn (chiếm 53,48%); tăng 6,7% so với năm 2017 [183] Nhiều loài cá có giá trị kinh tế được nuôi phổ

biến như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epionephelus spp)… Sản lượng cá nuôi lồng đạt 32 nghìn tấn

trên diện tích nuôi 6.000 ha [183] Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam cũng như trên thế giới luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt những tổn thất do bệnh dịch gây ra Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu hơn 6 tỷ USD mỗi năm, xảy ra ở hầu hết các nước đang phát triển Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm ngành thủy sản thiệt hại gần 1 tỷ USD do bệnh dịch gây ra [22] Bệnh hoại tử gan thận cá phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá khác nhau,

trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được biết là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra [112] Cá bị bệnh này thường biểu hiện các triệu chứng

đặc trưng: xuất hiện các đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất huyết, đặc biệt ở gan và thận, cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến

90% [112, 138] Vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá

chết hàng loạt với số lượng lớn được báo cáo hằng năm ở cá nuôi lồng thuộc các

tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa - Vũng Tàu… [184, 185, 186]

Cho đến nay, việc kiểm soát và điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi của

người nuôi cá chủ yếu là sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V parahaemolyticus [34, 61] Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh một cách thường xuyên

và thiếu sự kiểm soát chặt chẽ trong điều trị bệnh trên cá đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc ở nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26] Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng chất lượng thực phẩm cũng như sức khỏe của người tiêu thụ [107] Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh là một giải pháp hiệu quả

và mang đến sự phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta

Vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125] Hầu hết các vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá đã được thương mại hóa trên thế giới là vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn cao của loại vắc-xin này Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt được đánh giá là có thời gian bảo hộ không dài [152] Mặc dù, đã có một vài nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tái tổ hợp hoặc vắc-xin DNA phòng bệnh

do vi khuẩn V parahaemolyticus ở cá đã được công bố, nhưng cho đến nay các

vắc-xin như thế được cấp phép thương mại hóa để sử dụng trên cá là chưa có Vắc-vắc-xin nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực đang là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả năng cho tỉ

lệ bảo hộ cao và thời gian bảo hộ dài

Tạo được chủng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc có khả năng gây đáp

ứng miễn dịch cho cá có ý nghĩa quan trọng và mang tính quyết định sự thành bại của việc phát triển loại vắc-xin nhược độc Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận là rất cần thiết, phù hợp với xu hướng và mang đến triển vọng ứng dụng cao trong phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin

phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển” được tiến hành nhằm tạo

làm cơ sở ban đầu cho việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Tạo được chủng vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả

năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Tạo được vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây

bệnh hoại tử gan thận cá phân lập được bằng phương pháp xử lý với kháng sinh rifampicin

- Xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự

nucleotide trong các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực

- Đánh giá được khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực đã tạo ra

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập và xác định các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus

gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi (cá mú, cá hồng, cá bớp) tại vùng biển miền Bắc Việt Nam

- Nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ các

chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp xử lý các chủng gây bệnh với rifampicin và phân tích những sai khác về trình tự nucleotide của một số gen mã

hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB của các dòng V parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng V parahaemolyticus trên loài cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) và chọn dòng V parahaemolyticus

làm ứng viên nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi

4 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số

loài cá biển

5 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng

biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) và các dòng đột biến giảm độc lực

được tạo ra

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp thêm cơ sở dữ liệu các chủng V parahaemolyticus gây bệnh

hoại tử gan thận cho cá nuôi ở một số vùng biển miền Bắc về các đặc điểm hình thái, hóa sinh và khả năng kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp chẩn đoán bệnh

Phát hiện những đột biến trong gen độc tố và gen ropB của các dòng V parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực là có ý nghĩa khoa học góp phần

định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển vắc-xin sống nhược độc sử dụng trong phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng

Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ (RPS) của dòng V parahaemolyticus giảm độc lực đối với bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam (E coioides) đã cung

cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng

miễn dịch sẽ là ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú chấm cam cũng như một số loài cá biển khác

7 Tính mới, tính độc đáo của đề tài

Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu tạo vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc

phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển bằng phương pháp xử lý kháng sinh

rifampicin

Lần đầu tiên kích thước đầy đủ của gen tlh ở vi khuẩn V parahaemolyticus

được nhân bản thành công Phát hiện được các sai khác trình tự nucleotide trong các

gen tlh và rpoB giữa các dòng giảm độc lực và chủng dại, cung cấp cơ sở di truyền chứng minh mối liên quan giữa các đột biến trong gen độc tố tlh và gen rpoB với tính giảm độc lực ở vi khuẩn V paraheamolyticus

Chọn được dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 là ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển nuôi lồng Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu

hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con, 105 CFU/ml đạt 100% Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng

8 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền - Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận

ở một số loài cá

1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio

Vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm

cả tôm, cá Theo khóa phân loại của Bergey, V parahaemolyticus thuộc [56]:

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Chi: Vibrio Loài: V parahaemolyticus

V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước

khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 -

9 phút [30] V parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu

hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở thủy sản bị bệnh [150] Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-

Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và

bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101] Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng

để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS

để chọn lọc vẫn không phân biệt được V parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và Vibrio mimicus [27] Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus có thể được phân biệt

với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype) Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6; O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn

có kiểu huyết thanh O3:K6 [101]

Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi

khuẩn cụ thể Vi khuẩn V parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng

như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng

lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1.1) [14]

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V parahaemolyticus [14]

Các phản ứng sinh hóa V parahaemolyticus

Sinh catalase

Sinh oxidase

Phản ứng lên men yếm khí

Phản ứng lên men hiếu khí

Sinh beta – galactosidase

+ + + +

-

- +

-

-

Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính

Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V parahaemolyticus

là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon) Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β (tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi

trường thạch máu [101] V parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh

trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53] Sự phân bố của V parahaemolyticus

trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường nước Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở 37℃ Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V parahaemolyticus xuất hiện quanh

năm, mật độ vi khuẩn tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [163] Độ pH

cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự vận động của V parahaemolyticus Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập được đều phát

triển được trên môi trường NB (Nutrient Broth) với pH từ 4,8 đến 11; tuy nhiên, ở

môi trường pH 9,0 vi khuẩn V parahaemolyticus không sản xuất ra haemolysin, pH tối ưu là 7,8 - 8,6 [159] Khả năng di động bằng tiên mao của vi khuẩn V parahaemolyticus bị hạn chế trong môi trường có tính kiềm, nhưng khả năng này

không bị ảnh hưởng trong môi trường trung tính và acid Sự sinh trưởng của vi

khuẩn này bị ức chế khi có mặt acid acetic 0,1%; pH 5,1 [49] V parahaemolyticus

là vi khuẩn ưa môi trường kiềm mặn, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl từ 0,5 - 10% và nồng độ NaCl 3% là tối ưu cho sự phát triển [30]; không mọc được môi trường thiếu muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao [14, 172] Theo Broberg và

cộng sự (2011), V parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận

tốc 60 μm/s trong môi trường độ mặn thích hợp và pH 8,0 [30]

Vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều động vật thủy sản: bệnh

hoại tử gan thận ở cá, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm, bệnh trên động vật có

vỏ (nghêu, trai, hàu) và gây bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) trên người khi bệnh nhân ăn hải sản chứa vi khuẩn chưa được nấu chín Trên mỗi vật chủ khác nhau vi khuẩn này sẽ có cơ chế gây bệnh và những triệu chứng đặc trưng [126]

1.1.2 Hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus

Hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus đã được xác định hoàn chỉnh [21,

68, 76] bao gồm 2 nhiễm sắc thể dạng vòng: Nhiễm sắc thể I có kích thước lớn khoảng 3,2 - 3,3 Mb, chứa hơn 3.000 gen; nhiễm sắc thể II có kích thước nhỏ hơn khoảng 1,7 - 1,8 Mb, chứa hơn 1.700 gen

Phân tích hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus FORC_14, Ahn và cộng

sự (2016) đã ghi nhận 2 nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước 3.241.330 bp và 1.997.247 bp với 4.274 gen mã hóa protein, 160 gen RNA; 01 plasmid (51.383 bp)

và 01 phage (96.896 bp) [21]

Kim và cộng sự (2016) khi phân tích hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus

FORC_08 đã báo cáo hệ gen với 02 nhiễm sắc thể dạng vòng nhưng không có plasmid Nhiễm sắc thể I có kích thước 3.266.132 bp với 2.909 ORFs, 115 gen tRNA, 28 gen rRNA Trong số 2.909 ORFs có 2.513 ORFs (86,39%) mã hóa protein chức năng và 539 ORFs mã hóa cho các protein chưa xác định được Nhiễm sắc thể II có kích thước 1.772.036 bp chứa 1585 ORFs, 14 gen mã hóa tRNA và rRNA Trong số 1.585 ORFs có 1.245 ORFs mã hóa các protein chức năng và 340 ORFs mã hóa các protein giả định [68]

1.1.3 Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin

Độc tố tan huyết (haemolysin) là một trong những ngoại độc tố gây bệnh chủ

yếu của vi khuẩn V parahaemolyticus đối với vật chủ Haemolysin có khả năng

bám lên màng tế bào hồng cầu của vật chủ, gây thủng màng và giải phóng

haemoglobin, kết quả là tạo ra hiện tượng tan huyết (haemolysin) Phân tử

β-haemolysin có khả năng phân hủy sphingomyelin, một loại phospholipid màng tế bào hồng cầu của cừu Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của haemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào đa nhân làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô Hầu hết các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đều có khả năng gây hiện tượng tan huyết, trong khi chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn phân lập

từ môi trường là có khả năng gây hiện tượng tan huyết [63] Do vậy, haemolysin được coi là một trong những độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để nhận biết các chủng độc hại

Vi khuẩn V parahaemolyticus có thể sản sinh 3 loại protein haemolysin: TDH

bền nhiệt (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH-related haemolysin) và TLH không bền nhiệt (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen lần lượt

TDH có một lỗ trung tâm với đường kính là 23 Å và sâu 50 Å [169] Gen trh mã

hóa cho TRH không bền nhiệt, loại haemolysin này dễ dàng bị biến tính ở điều kiện nhiệt độ 60℃ trong thời gian 10 phút Các gen độc tố này được phát hiện

trong hệ gen của V parahaemolyticus bằng kĩ thuật PCR Tuy nhiên, sản phẩm PCR khuếch đại gen tdh, trh đã được công bố cho đến nay là không thống nhất,

tùy thuộc cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng Cụ thể: sản phẩm PCR khuếch

đại từ gen tdh có kích thước 223 bp [45]; 247 - 251 bp [50, 96, 99]; 269 bp

[134]; 460 bp [141] và 668 bp [171] Tương tự, sản phẩm PCR khuếch đại từ gen

trh cũng có kích thước rất khác nhau: 250 bp [24]; 354 bp [50]; 500 bp [33] và

623 bp [141]

Paria và cộng sự (2019) dựa trên các trình tự ở hệ gen của các chủng V parahaemolyticus khác nhau đã công bố xác định được kích thước 189 amino acid tương ứng với kích thước gen trh hoàn chỉnh là 570 nucleotide, đồng thời xây dựng

được cấu trúc không gian của phân tử protein TRH [118] Các kết quả công bố cũng

đã chỉ ra rằng, không phải bất cứ chủng vi khuẩn V parahaemolyticus nào cũng đều mang gen tdh, trh Theo Nishibuchi và cộng sự (1995), chỉ có 1 - 5% các chủng V parahaemolyticus mang các gen này [111] Tương tự, Rojas và cộng sự (2011) cũng nhận định trong các mẫu vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập trên con trai và con hàu chỉ có 10,5% mẫu được phát hiện có gen tdh và không được phát hiện thấy gen trh [134] Trong mẫu V parahaemolyticus phân lập từ hàu, Deepanjali và cộng sự (2005) báo cáo chỉ có 3/49 (chiếm 6,1%) phát hiện có gen tdh [43] Xie và cộng sự (2005) phân lập được 7 chủng V parahaemolyticus từ tôm, cá mắc bệnh và nước

biển thuộc đầm nuôi thủy sản tại Quảng Tây (Trung Quốc) Bẩy chủng vi khuẩn

phân lập này cùng 01 chủng V parahaemolyticus VPL4-90 được cung cấp từ viện

Vi sinh học Quảng Đông (Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của hai

gen độc tố tdh và trh [166] Gen tdh cũng không được phát hiện trong 23 mẫu vi khuẩn V parahaemolyticus do Chakraborty và cộng sự (2008) phân lập được từ

mẫu cá da trơn, động vật thân mềm dạng chân đầu (cephalopod), động vật có vỏ

Chỉ duy nhất 01 mẫu trong số đó là có chứa gen trh [33] Trong 39 mẫu vi khuẩn V

parahaemolyticus phân lập từ cá tại vùng Chengicherla, Hyderabad (Ấn Độ), chỉ có 5,7% và 26,6% chứa tương ứng lần lượt gen tdh và trh [109] Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) báo cáo sự vắng mặt của hai gen độc tố trh và tdh trong hệ gen của 05 mẫu vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập trên thủy sản ở

Nha Trang [3]

Gen tlh mã hóa haemolysin TLH có trình tự amino acid bảo thủ đặc trưng cho

Vibrionaceae Sản phẩm PCR khuếch đại gen này có kích thước 450 bp [70, 170],

hoặc 113 bp [52] Phân tích trình tự genome của V parahaemolyticus nhận thấy khung đọc mở (open reading frame, ORF) của gen tlh dài 1254 bp, mã hóa cho trình

tự 417 amino acid [68] Gen tlh có tiềm năng sử dụng làm chỉ thị trong chẩn đoán bệnh Vibrio cũng như trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin điều trị bệnh thủy sản [64] Protein TLH được phát hiện ở tất cả các chủng V parahaemolyticus phân lập từ mẫu bệnh phẩm cũng như từ môi trường và sự biểu hiện của gen tlh sẽ được tăng

lên một cách đáng kể khi vi khuẩn nhiễm bệnh cho vật chủ [49] TLH là loại protein không bền nhiệt (bị bất hoạt ở 60℃ sau 10 phút), có hoạt tính phospholipase; có khả năng làm tan huyết, phá hủy tế bào hồng cầu, tham gia vào quá trình gây độc của vi

khuẩn [158] Cấu trúc không gian của TLH ở V parahaemolyticus như thế nào hiện vẫn chưa có công bố nhưng TLH (VvPlpA) của Vibrio vulnificus đã được Wan và

cộng sự (2019) báo cáo Theo báo cáo này, TLH là một phospholipase A2, tiết ra

bởi vi khuẩn V vulnificus và các chủng vi khuẩn Vibrio khác VvPlpA có chứa đầu

N-terminal và C-terminal chưa rõ chức năng được đóng gói chặt với nhau, vùng gấp SGNH có hoạt tính hydrolase điển hình với 4 vị trí xúc tác có tính bảo tồn Ser152, Gly203, Asn247 và His392 và có thể liên kết với ion chloride nằm gần vùng xúc tác His392 Mô hình cấu trúc 3D này là đầu tiên và duy nhất cho đến nay được xây

dựng bằng phương pháp X-ray đối với họ protein TLH của Vibrio spp tính đến thời

điểm này [155]

Gen toxR nằm trong operon toxRS (Vp-toxRS) mã hóa cho protein điều hòa có

vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tồn tại cũng như độc lực của vi khuẩn Gen

toxR tham gia kiểm soát biểu hiện của một số gen như gen độc tố tdh, gen mã hóa

protein màng ompU [81], các gen thuộc hệ thống bài tiết loại III (T3SSs): T3SS1 trên NST số II và T3SS2 trên NST số II [59, 93] Các protein của hai hệ thống này

có vai trò trong sự vận chuyển các tác nhân hoặc protein độc tố một cách trực tiếp

vào tế bào chất của tế bào chủ [41] Gen toxR kìm hãm hoạt động phiên mã của các

gen thuộc hệ thống T3SS1 thông qua việc kích hoạt chất ức chế CalR [114, 180]

Trình tự gen toxR có tính bảo tồn đặc trưng loài nên được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh V parahaemolyticus trong mẫu thủy sản

bằng kỹ thuật PCR [181] Hầu hết các nghiên cứu đều công bố sản phẩm PCR

khuếch đại gen toxR trong hệ gen của V parahaemolyticus bằng cặp mồi

F-GTCTTCTGACGCAATCGTTG và R-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG cho sản phẩm có kích thước 368 bp [70, 141, 182]

1.1.4 Gen rpoB và tính kháng rifampicin

Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase, enzyme lõi

RNA polymerase (RNA polymerase core enzyme) gồm 5 tiểu đơn vị: 2 chuỗi α,

1 chuỗi β, 1 chuỗi β' và 1 chuỗi ω Hai chuỗi α có vai trò gắn kết các tiểu đơn vị Tiểu đơn vị β và β' là trung tâm xúc tác của enzyme RNA polymerase, trong đó tiểu đơn vị β có vai trò liên kết DNA khuôn, trình tự RNA đang tổng hợp và các ribonucleotide tự do Trong quá trình phiên mã, enzyme lõi liên kết với DNA khuôn, sau đó yếu tố σ liên kết với tiểu đơn vị β, hình thành dạng holoenzyme nhận biết và liên kết vào trình tự khởi đầu (promoter) để bắt đầu quá trình phiên

mã [108]

Một số kháng sinh (đặc biệt là rifampicin và fidamomicin) có thể liên kết vào enzyme RNA polymerase gây ức chế quá trình phiên mã [108] Rifampicin có khả

năng liên kết với tiểu đơn vị β - protein được mã hóa bởi gen rpoB, gây cản trở sự

khởi đầu phiên mã của vi khuẩn [32] Cơ chế, vị trí liên kết của kháng sinh với enzyme RNA polymerase là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu phát triển kháng sinh tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Sự mất tương đồng về cấu trúc của rifampicin với tiểu đơn vị β dẫn đến rifampicin không thể liên kết được với enzyme là nguyên nhân dẫn đến việc kháng rifampicin ở các vi khuẩn gây bệnh Đã có nhiều nghiên

cứu phát hiện những đột biến xảy ra ở trong gen rpoB và được xem là nguyên nhân đưa đến xuất hiện tính kháng rifampicin ở một số vi khuẩn như Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, V parahaemolyticus [54, 102, 124, 175]

Kích thước gen rpoB là 4.029 bp mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 1.342

amino acid Vị trí nucleotide bị đột biến có thể ảnh hưởng đến mức độ kháng

rifampicin của vi khuẩn Vùng trình tự 81 bp trên gen rpoB (từ bộ ba mã hóa 507

đến bộ ba 533, mã hóa 27 amino acid) được gọi là vùng xác định kháng rifampicin (rifampicin-resistance determining region, RRDR) [175] Những đột biến xuất hiện trong vùng RRDR có liên quan đến tính kháng rifampicin của vi khuẩn Các bộ ba

513, 516, 526, 531 của vùng này có tần suất đột biến rất cao [131, 175] Đột biến cũng được báo cáo xuất hiện ở bộ ba 509, 511, 512, 521, 522, 523, 528, 530, 533

[175] Những đột biến xảy ra trên gen rpoB đặc biệt trong vùng RRDR sẽ ảnh

hưởng lớn đến cấu trúc tiểu đơn vị β của RNA polymerase Sự thay đổi cấu trúc này gây trở ngại cho sự nhận diện rifampicin, làm rifampicin không thể liên kết vào cấu trúc của phân tử RNA polymerase, quá trình phiên mã tổng hợp protein của vi khuẩn vì thế vẫn diễn ra Những vi khuẩn này không bị diệt, sống sót và sinh sản trên môi trường có rifampicin Đây là hiện tượng vi khuẩn kháng rifampicin

Những đột biến nằm ngoài vùng RRDR của gen rpoB cũng được phát hiện ở một số chủng vi khuẩn M tuberculosis kháng rifampicin Cụ thể là, đột biến phát

sinh ở bộ ba 413, 435, 451, 490, 505, 535, 536, 538, 550, 572 và 645 [175] Tuy nhiên, vai trò của những đột biến ngoài vùng RRDR chưa được xác định rõ ràng Perez-Varela và cộng sự (2017) cho rằng những đột biến xảy ra trên tiểu đơn vị β của RNA polymerase dẫn đến suy giảm khả năng di động cũng như độc lực của vi

khuẩn Acinetobacter baumannii [124] Những chủng giảm độc lực, kháng

rifampicin của các loài vi khuẩn khác nhau có những thay đổi về sự sinh trưởng, sự giảm độc lực và thay đổi về kiểu hình so với chủng dại [97, 102] Đặc điểm kháng rifampicin thường đi kèm với những biến đổi làm thay đổi cấu trúc của một số protein [58] Những dòng vi khuẩn kháng rifampicin xuất hiện những biến đổi ở

gen rpoB là có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của RNA polymaerase Từ đó, gây

cản trở quá trình phiên mã của nhiều gen trong đó có các gen gây độc của vi khuẩn, dẫn đến tính giảm độc lực của vi khuẩn

Đối với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus, Hazen và cộng sự (2009) phát hiện những điểm đột biến trên gen rpoB, cụ thể là ở các bộ ba 513, 526, 529,

531, 586 ở các chủng vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường chứa 100 µg/ml rifampicin Trong đó, 3/4 vị trí amino acid đột biến thuộc vùng RRDR và 1/4 vị trí không thuộc vùng RRDR [54]

Peramachi và cộng sự (2018) qua phân tích về trình tự gen rpoB của các chủng

vi khuẩn đã xác định một số vị trí amino acid thuộc tiểu đơn vị β của RNA polymerase giữ vai trò xúc tác của enzyme RNA polymerase: amino acid bảo tồn R (Arg) và cặp amino acid YG (Tyr-Gly) có vài trò liên kết với mạch DNA khuôn

“gatekeeper/DNA template binding” YG Khoảng cách của amino acid R và YG được duy trì là 7 amino acid Trong đó, 03 vị trí amino acid YG được xác định bao gồm 555-556, 584-585 và 1281-1282 [123]

1.1.5 Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Kháng nguyên O và K là hai loại kháng nguyên được phát hiện rất sớm ở V parahaemolyticus Kháng nguyên lipopolysaccharides bền với nhiệt (kháng nguyên

O) và kháng nguyên nang chịu nhiệt kém (kháng nguyên K) Theo FDA (Cục quản

lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ), V parahaemolyticus có 12 nhóm O và 65

loại K đã được xác định Trong đó, ba kiểu kháng nguyên O4: K48; O1: K56 và O3: K6 là phổ biến hơn [162]

Tính kháng nguyên của các protein màng khác cũng được nhiều nhà khoa học

nghiên cứu ở các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus Các protein màng ngoài

(OMPs) của vi khuẩn Gram âm thường được nghiên cứu để phát triển vắc-xin hoặc phát triển thuốc chống lại vi khuẩn gây bệnh Shyne và cộng sự (2016) phát hiện 01 kháng nguyên bề mặt màng tế bào với trọng lượng phân tử 34 kDa ở trên 9 chủng

V parahaemolyticus gây bệnh cho cá song điểm gai (Epinephelus malabaricus) và

cá mú chấm cam (E coioides) [139] Một số protein màng đã được xác định là

kháng nguyên và có khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch bao gồm VPA1435, VP0764, VPA1186, VP1061 VP2850 [78]; PsuA, PvuA [94]; OmpW, OmpV, OmpU, OmpK [95] Li và cộng sự (2014) đã phát hiện tám OMPs bao gồm LptD, LamB, OmpA, OmpK, OmpU, VP0802, VP1243 và VP0966 là những kháng

nguyên của vi khuẩn V parahaemolyticus Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng khẳng

định những protein này có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cá Trong số các protein này, LptD là một loại protein có khả năng tạo phản ứng miễn dịch cao nhất [77] Dong và cộng sự (2014) đã xây dựng được cấu trúc phân tử của LptD với 26

nếp gấp β cùng với 6 protein khác (LptA, B, C, E, F và G) tạo thành một phức hợp

trên màng tế bào - phức hợp chịu trách nhiệm vận chuyển lipopolysaccharide qua màng (LPS) [44] LptD có tính bảo tồn và tương đồng với các protein trên bề mặt tế

bào của các vi khuẩn Vibrio Đây là một loại protein kháng nguyên có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển vắc-xin phòng bệnh do các loài Vibrio gây ra [176]

1.2 Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

1.2.1 Triệu chứng

V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận trên nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế, từ cá biển được nuôi lồng làm hải sản như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epionephelus spp) đến một số loài cá cảnh biển như cá hề Sebae (Amphiprion sebae), đồng thời cũng gây bệnh trên một số loài cá nước ngọt như cá ngựa vằn (Danio rerio) Vi khuẩn V parahaemolyticus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước

và gây bệnh trên khoảng 48 loài cá biển [6, 7, 100, 103, 112]

Bệnh hoại tử gan thận có biểu hiện đặc trưng như xuất hiện các đốm đỏ, vẩy

cá bị tróc, rụng dẫn đến vết lở loét ngày càng lan rộng và sâu, vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác Giải phẫu cá bị bệnh phát hiện xuất huyết nội tạng (đặc biệt là ở gan và thận) và cả trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể chết hàng loạt khi ở thể cấp tính hoặc chết rải rác khi cá ở thể thứ cấp tính [16, 112, 138] Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở hầu hết các nơi có nghề nuôi thủy sản nước lợ và nước mặn Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả năng gây chết rất cao Bệnh thường xuất hiện

vào mùa nóng và đầu mùa mưa, khi môi trường thay đổi đột ngột làm cá dễ bị sốc

Ở nhiệt độ cao, vi khuẩn sinh trưởng mạnh trong môi trường nước, xâm nhập và gây bệnh cho cá, gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi

Cá mú chấm cam (E coioides) bị bệnh hoại tử gan thận xuất hiện các triệu

chứng ban đầu như cá bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá chuyển sẫm mầu, các đốm đỏ xuất hiện trên thân Sau đó, các đốm đỏ này phát triển thành những vết loét rộng kèm theo biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi Cá

mú bị bệnh thường phát hiện hiện tượng gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp bệnh nặng [16] Đối với cá giò

(Rachycentron canadum) bị bệnh có hiện tượng lở loét, xuất huyết gan, thận, vết

loét phát triển ăn sâu vào cơ, thân cá chuyển mầu đen, gan cá mầu xanh nhạt hoặc mầu nâu, một số cá thể có các đốm trắng trong gan, dạ dày thường không có thức

ăn, có thể gây chết đến 45% ở cá giống và 90% ở cá thương phẩm [5] Vi khuẩn V parahaemolyticus cũng là nguyên nhân gây xuất huyết cho cá Song giai đoạn

thương phẩm [6]

Ở Việt Nam, bệnh hoại tử gan thận được ghi nhận xuất hiện và làm cá chết hàng loạt vào mùa hè năm 2008, 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu (Phú Yên), Cam Ranh (Khánh Hòa) Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất hiện vào mùa hè, lúc giao mùa làm cá chết với tần suất cao tại nhiều cơ sở nuôi cá

mú trong ao và trong lồng nổi trên biển ở các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Quảng Ninh, Hải Phòng Tháng 7 năm 2017, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT) Phú Yên thông báo có dịch bùng phát làm cá nuôi lồng tại tỉnh

này bị lở loét và chết hàng loạt, nguyên nhân là do vi khuẩn Vibrio gây ra, tại một

số thời điểm mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước tại khu vực thôn Phú Lương, An

Ninh Đông vượt giới hạn cho phép từ 1,37 - 2,42 lần; các chỉ tiêu khác đều nằm trong giới hạn cho phép Tính đến cuối tháng 7 năm 2017, tại vùng biển này, ước khoảng 24.600 con cá bị chết, chiếm tỷ lệ 20% số cá nuôi, kích thước cá bị bệnh từ 0,4 - 1 kg/con [184] Tháng 8 năm 2017, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Ngãi báo cáo về hiện tượng cá mú nuôi lồng chết với số lượng lớn có các triệu

chứng đặc trưng của bệnh hoại tử gan thận tại thôn Tuyết Diêm 1, xã Bình Thuận (huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi) Qua phân tích nguyên nhân là do người dân nhập nguồn giống từ tỉnh Khánh Hòa chưa qua kiểm dịch [185] Cũng trong tháng 8 năm 2017, Sở NN&PTNT tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu báo cáo về tình trạng cá nuôi trong lồng bè bị chết hàng loạt ở xã đảo Long Sơn (thành phố Vũng Tàu) với hơn 241.000 con cá (tương đương gần 90 tấn cá), chủ yếu là cá mú, cá chim, cá ria, cá bớp của 23 hộ nuôi lồng bè trên sông Chà Và (xã Long Sơn, thành phố Vũng Tàu) Qua phân tích cho thấy, cá có hiện tượng lột da, xuất huyết, tuột nhớt, biểu hiện lờ

đờ, bỏ ăn, nổi lên mặt nước và chết, các mẫu cá chết được phát hiện dương tính với

khuẩn Vibrio [186]

V parahaemolyticus không chỉ gây bệnh cho cá biển nuôi lồng, nó còn có thể

gây bệnh cho cá biển cảnh Nghiên cứu của Marudhupandi và cộng sự (2017) đã chỉ

ra rằng vi khuẩn này gây hoại tử trên vây và đuôi của cá hề Sebae (Amphiprion sebae) Đây là một loại cá cảnh biển phân bố ở Ấn Độ Dương có giá trị kinh tế cao,

chiếm 20% giá trị kinh tế của ngành kinh doanh cá cảnh biển ở Ấn Độ [100]

1.2.2 Chẩn đoán và điều trị

Để chẩn đoán bệnh hoại tử gan thận do vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra

trên cá cần dựa vào những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: xuất hiện các đốm đỏ, vẩy cá

bị tróc, rụng dẫn đến vết lở loét, vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác, xuất huyết nội

tạng (đặc biệt là ở gan và thận) Vi khuẩn V parahaemolyticus được phát hiện trong

mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc TCBS và phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa đặc trưng [27] Về phương pháp phân tử, vi

khuẩn V parahaemolyticus được xác định bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S rDNA [28], hoặc các gen độc tố đặc trưng (toxR, tlh, trh, tdh) [67, 158, 169,

178] của chủng vi khuẩn này

Để điều trị bệnh hoại tử gan thận, sử dụng kháng sinh là phương pháp phổ biến mà người nuôi cá sử dụng Cá được cho ăn thức ăn trộn tetracycline, streptomycine và oxolinic acid với liều lượng tương ứng 75 - 100 mg/kg cá, 50 - 75 mg/kg cá và 10 mg/kg cá liên tục trong 7 - 10 ngày [34] Mặc dù, sử dụng kháng

sinh điều trị bệnh mang lại hiệu quả nhất định nhưng việc sử dụng kháng sinh thường xuyên đã tạo ra các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc [26] Shyne và

cộng sự (2008) báo cáo rằng trong các mẫu vi khuẩn V parahaemolyticus phân

lập từ cá mú bệnh cho thấy hầu hết các mẫu đều kháng lại sulphadiazine và amoxicillin, 87% kháng lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và oxytetracycline [138] Bên cạnh đó, lượng kháng sinh tồn dư trong cơ thể cá gây

ức chế hệ thống miễn dịch của cá, ảnh hưởng đến chất lượng thịt cá, từ đó gây ảnh hưởng sức khỏe người tiêu thụ [107] Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho động vật thủy sản cần được cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi áp dụng bao gồm sát trùng bể, ao nuôi cá và dụng cụ trong mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ đề phòng các loại bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lượng thức ăn là những biện pháp người dân thường sử dụng để phòng bệnh Đây là những biện pháp phòng bệnh đơn giản, tổng hợp với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh và không mang tính chất phòng chống đặc hiệu cho loại tác nhân gây bệnh xác định Do vậy, trong một số hoàn cảnh nhất định, dịch bệnh cho cá vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho giống thủy hải sản bằng cách sử dụng vắc-xin là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Bên cạnh đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh chủ động cho động vật thủy sản sẽ hạn chế được việc sử dụng kháng sinh cũng như hạn chế việc gia tăng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Song, để sản xuất ra các loại vắc-xin đặc hiệu đem lại hiệu quả bảo hộ cao cho các loài động vật thủy sản vẫn là một thử thách không nhỏ đối với các nhà khoa học

1.3 Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động

1.3.1 Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá

Nghề nuôi cá, đặc biệt là cá biển nuôi lồng, là một ngành kinh tế mũi nhọn của nhiều quốc gia trên thế giới Tuy nhiên, ngư dân luôn phải đối mặt với dịch bệnh

bùng phát ở động vật thủy sản Kháng sinh sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra cho cá được đánh giá là có hiệu quả cao, nhưng cũng là tác nhân chọn lọc các gen kháng thuốc gây ra hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh, ức chế hệ thống miễn dịch của cá và kháng sinh có thể vẫn tồn dư trong thịt cá [107] Vắc-xin phòng bệnh cho cá được đánh giá là giải pháp hiệu quả và mang tính chất bền vững

Một vắc-xin phòng bệnh cho cá cần đạt được những tiêu chuẩn như : (1) có thể tạo được kháng thể bảo hộ cho cá, (2) sự bảo hộ của vắc-xin phải bền vững, lâu dài, (3) có tính an toàn, (4) có tính ổn định và một số tiêu chuẩn khuyến khích khác như, (5) có hiệu quả cho nhiều loài động vật thủy sản, (6) chi phí sản xuất thấp, (7)

dễ dàng sản xuất với số lượng lớn (8) dễ được chấp nhận cấp phép Hiện nay, hầu như các nghiên cứu tạo vắc-xin trên thế giới tập trung cho các loài cá đã được nuôi

công nghiệp: cá hồi coho (Oncorhynchus kisutch), cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss), cá chẽm (Lates calcarifer), cá bơn (Scophthalmus maximus), cá da trơn (Ictalurus punctatus), cá rô phi (Oreochromis spp.) [136].

Vắc-xin cho thủy sản gồm nhiều loại, căn cứ vào bản chất loại vắc-xin có thể phân loại như sau [125, 136, 140]:

(1) Vắc-xin bất hoạt (inactivated vaccines): Vi khuẩn hoặc virus độc bị giết bởi nhiệt hoặc hóa chất (formalin, phenol, kháng sinh)

(2) Vắc-xin sống nhược độc (attenuated live vaccines): Vi sinh vật sống, suy yếu về độc lực hoặc không còn độc lực

(3) Vắc-xin tiểu phần (sub-unit vaccines): Một phần nhỏ của vi sinh vật gây bệnh có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch

(4) Vắc-xin tái tổ hợp (recombinant vaccines): Protein kháng nguyên tinh khiết được sản xuất bởi công nghệ tái tổ hợp DNA

(5) Vắc-xin DNA (DNA vaccines): DNA tinh khiết có chứa gen của protein có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch được đưa vào một plasmid

(6) Vắc-xin xóa gen bằng công nghệ gen (gene deleted live vaccines): Virus hoặc vi khuẩn loại bỏ các gen mã hóa protein liên quan đến độc lực, đạt được các chủng suy yếu một cách an toàn và ổn định

Các chủng vi khuẩn bị bất hoạt có tính an toàn cao nên được sử dụng để sản xuất cho vắc-xin thương mại (vắc-xin bất hoạt) cho cá Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch cho cá từ loại vắc-xin này là không tối ưu, đặc biệt là thời gian bảo hộ cho cá khá ngắn [140] Ngược lại, vắc-xin sống, nhược độc được đánh giá là có hiệu quả hơn trong việc tạo ra các đáp ứng miễn dịch lâu dài so với vắc-xin bất hoạt [148] Hiện nay, số lượng vắc-xin thương mại được cấp phép sử dụng trên thế giới cho các loài cá còn khá khiêm tốn

Bảng 1.2 Danh sách một số vắc-xin được cấp phép sử dụng cho cá [136, 140] STT Vắc-xin Loại vắc-xin Sử dụng cho cá Khu vực sử dụng

Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Chile, Canada,Mỹ

4 Vibrio anguillarum- Ordalii Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi, cá hồi cầu vồng Mỹ

5 Yersinia Bacterin ruckeri Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Châu âu, Chile, Canada, Mỹ

6 Edwardsiella ictalurii Vaccine Vi khuẩn sống, giảm độc lực Cá da trơn Mỹ

7 Edwardsiella ictaluri

Bacterin Vi khuẩn bất hoạt

Cá trê kênh, cá bơn Nhật Bản Mỹ

8 Flavobacterium columnare Vaccine Vi khuẩn sống, giảm độc lực Cá trê,cá hồi, cá da trơn Mỹ

Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi, cá chẽm, cá đuôi vàng Toàn cầu

11 Vibrio salmonicida Bacterin Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Châu âu, Chile, Canada, Mỹ

12 Vibrio anguillarum- salmonicida Bacterin Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Europe, Mỹ

13 Free-cell Aeromonas hydrophila Vaccine Vi khuẩn bất hoạt Cá chép Ấn độ Ấn độ

14 Lactococcus

garvieae Vaccine Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi cầu vồng, cá đuôi vàng

Italy, Pháp , Anh, Nhật

15 Streptococcus agalactiae Vaccine Vi khuẩn bất hoạt Cá rô phi Châu Á

16 Streptococcus iniae Vaccine Vi khuẩn bất hoạt Cá rô phi Châu Á

17 Piscirickettsia salmonis Vaccine Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Chile

18 Moritella viscosa

Vaccine Vi khuẩn bất hoạt Cá hồi Bắc âu

19 Pasteurella piscicida Vaccine Vi khuẩn bất hoạt

Cá ayu, cá đuôi vàng, cá vược,

cá chép

Mỹ, Nhật Bản, Châu âu,Đài Loan

Bắc Mỹ, Châu Á, Châu Âu, Nhật Bản

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương

Miễn dịch ở cá xương gồm hai loại là miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch không đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch tự nhiên, miễn dịch bẩm sinh) là khả năng cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh bằng các phản ứng không đặc hiệu, mang tính bẩm sinh, di truyền giữa các cá thể cùng loài Đây là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể trong lúc các phản ứng miễn dịch đặc hiệu chưa đáp ứng kịp trước sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh Ba hàng rào bảo vệ chính của hệ miễn dịch không đặc hiệu bao gồm: hàng rào bề mặt, hàng rào dịch thể và hàng rào tế bào không đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch mắc phải, miễn dịch thích nghi) là đáp ứng miễn dịch được tạo ra do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên, có vai trò quan trọng trong cơ chế chống lại sự tái nhiễm bệnh Kháng nguyên tiếp xúc với cơ thể thông qua hai phương thức: tiếp xúc ngẫu nhiên trong môi trường và tiếp xúc chủ động bằng cách tiêm vắc-xin phòng bệnh

Tuyến ức, tiền thận và lá lách là các cơ quan lympho có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá [174] Tuyến ức nằm trong xoang mang của cá là nơi biệt hóa tế bào lympho T, ngoài ra nó còn chứa các đại thực bào,

dưỡng bào Ở các loài cá khác nhau, thời điểm hoàn thiện tuyến ức khác nhau, phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi trường [85] Tiền thận (head kidney) của cá là nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể, đại thực bào, dưỡng bào Tương

tự, đại thực bào, tế bào lympho, kháng thể và dưỡng bào cũng được tìm thấy ở lách của cá [151]

Cá xương có dạng kháng thể là IgM và IgD [57, 160] Gần đây, một số loại kháng thể Ig mới được phát hiện trên các đối tượng khác nhau như IgT trong cá hồi [51] hoặc IgZ ở cá ngựa vằn và cá chép [135] Cả IgZ và IgT đều có vai trò trong phản ứng của niêm mạc chống lại ký sinh trùng và các mầm bệnh khác [135] Cheng và cộng sự (2006) xác định IgM ở cá mú chấm cam có khối lượng chuỗi nặng và chuỗi nhẹ lần lượt là 78 và 27 kDa, bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng tìm thấy thêm một chuỗi polypeptide có khối lượng là 50 kDa và phán đoán đây là chuỗi nặng thứ hai của phân tử IgM của loài cá này [36]

Một đặc tính quan trọng của hệ thống miễn dịch ở cá là khả năng phát triển trí nhớ miễn dịch Khi lần đầu tiên tiếp xúc với kháng nguyên, cơ thể cá tạo ra các tế bào phản ứng lại với kháng nguyên (lympho B, lympho T gây độc, lympho T hỗ trợ) có thời gian tồn tại tương đối ngắn Tế bào lympho B đáp ứng miễn dịch dịch thể thông qua việc sản sinh kháng thể nhận diện kháng nguyên và loại bỏ vi sinh vật gây bệnh Đáp ứng miễn dịch thông qua trung gian tế bào là cơ chế miễn dịch của tế bào lympho T Tế bào lympho T hỗ trợ tiết ra chất kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho B và T, các đại thực bào; trong khi đó, tế bào lympho T gây độc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh và loại bỏ các ổ nhiễm trùng [8] Ngoài ra, các tế bào lympho còn

có chức năng nhớ và tồn tại lâu dài qua các thế hệ của tế bào lympho Các tế bào nhớ này có khả năng “ghi nhớ” các kháng nguyên cụ thể mà cơ thể đã gặp phải Khi

cơ thể này gặp lại kháng nguyên đó, những tế bào nhớ này có thể khởi động đáp ứng miễn dịch một cách mạnh mẽ cho cơ thể chống lại mầm bệnh Sự phát triển của trí nhớ miễn dịch thường được đánh giá bằng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch thứ cấp Trong trường hợp trí nhớ chủ động (trí nhớ miễn dịch được tạo ra thông qua tiêm chủng vắc-xin) thì đáp ứng miễn dịch thứ cấp sẽ nhanh hơn và mạnh mẽ hơn

so với đáp ứng miễn dịch sơ cấp khi kháng nguyên tiếp xúc với cơ thể lần đầu tiên Mức độ của phản ứng miễn dịch thứ cấp phụ thuộc vào lượng kháng nguyên trong vắc-xin [107]

Có 2 nhân tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ở cá: nhân tố nội tại và nhân

tố ngoại cảnh Nhân tố nội tại liên quan đến sự phát triển của cơ thể cá Chỉ vài ngày sau khi cá nở ra từ trứng thì hệ miễn dịch của cá phát triển và hoàn hoàn thiện, điều này được xác định nhờ sự xuất hiện các tế bào lympho tại các cơ quan lympho

Vì vậy, việc xác định thời điểm mà hệ miễn dịch của cơ thể cá hoàn thiện có ý nghĩa rất lớn đến việc xác định thời điểm sử dụng vắc-xin cho cá, nó ảnh hưởng một cách trực tiếp đến tỉ lệ bảo hộ của vắc-xin Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin bất hoạt

Vibrio rất thấp ở cá hồi 2 tuần tuổi nhưng tỉ lệ này tăng lên 100% với cá hồi 10 tuần

tuổi Nhiệt độ là nhân tố ngoại cảnh chính tác động đến đáp ứng miễn dịch của cá Trong giới hạn chịu đựng của loài, nhiệt độ càng cao thì đáp ứng miễn dịch diễn ra càng nhanh và với cường độ càng cao Ở nhiệt độ thấp, quá trình tổng hợp kháng thể của cá sẽ bị ngưng trệ, đặc biệt khi có sự giảm đột ngột của nhiệt độ thì quá trình này có thể bị rối loạn Nhiệt độ thích hợp để sử dụng vắc-xin ở các loài cá có thể khác nhau [125] Với cá hồi Đại Tây Dương, ở nhiệt độ 10 - 12℃ là nhiệt độ thích hợp để tạo kháng thể sau khi tiêm vắc-xin từ 4 - 6 tuần; nhưng đối với cá chẽm, kháng thể tạo ra chỉ sau 1 tuần tiêm chủng khi được nuôi nhiệt độ 22℃ Ngoài hai yếu tố trên, hiệu quả đáp ứng miễn dịch của cá có thể bị tác động bởi trạng thái sức khỏe của cá, giới tính, điều kiện nuôi và chế độ dinh dưỡng [136]

1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá

Có ba phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể của cá: tiêm vắc-xin, ngâm vắc-xin

và đưa vắc-xin vào cơ thể qua đường tiêu hóa

(a) Phương pháp tiêm chủng vắc-xin

Vắc-xin được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm có thể cung cấp trực tiếp một lượng kháng nguyên xác định cho cơ thể cá Tiêm vắc-xin cho cá có thể tiêm dưới màng bụng (tiêm phúc mạc) hoặc tiêm cơ Vắc-xin được đưa theo phương pháp này

có hiệu quả bảo hộ tốt và thời gian bảo hộ dài, không tiêu tốn một lượng lớn vắc-xin

như các phương pháp khác [125] Tuy nhiên, tiêm vắc-xin cũng tồn tại một số hạn chế như việc gây mê cá để tiêm gây stress cho cá, tốn nhiều công sức, tốn kém, khó

áp dụng cho cá có kích thước nhỏ Việc tiêm cá có kích thước nhỏ và số lượng lớn

là rất ít khả thi [106]

(b) Phương pháp ngâm vắc-xin

Vắc-xin thương mại sử dụng phương pháp ngâm chủ yếu ở dạng vi khuẩn bất hoạt hoặc vắc-xin vi khuẩn nhược độc Phương pháp ngâm vắc-xin bao gồm hai loại: cá được ngâm trong dịch kháng nguyên với nồng độ cao và thời gian ngắn (dip vaccination) hoặc cho cá được ngâm trong dịch kháng nguyên với nồng độ thấp và thời gian dài (bath vaccination) Nhiều loại vắc-xin được báo cáo có hiệu quả khi ngâm cá ở độ pha loãng 1/10 dịch huyền phù vắc-xin đậm đặc với thời gian xử lý từ

30 đến 60s hoặc ở độ pha loãng 1/100 trong thời gian xử lý 02 giờ [31] Phương pháp ngâm vắc-xin có ưu điểm là có thể dễ dàng được thực hiện trên số lượng cá lớn, cá có kích thước nhỏ, giảm việc gây stress cho cá, ít tốn công sức và thời gian, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn vắc-xin và thời gian bảo hộ không dài [125]

(c) Qua đường tiêu hóa

Đưa vắc-xin vào cơ thể qua đường tiêu hóa là phương pháp trộn kháng nguyên vào thức ăn cho cá để cung cấp vắc-xin Loại vắc-xin được sử dụng theo phương pháp này thường là dạng huyền phù để có thể phủ trực tiếp lên thức ăn hoặc trộn kháng nguyên vào thức ăn trong quá trình chế biến Loại vắc-xin này thường được

bổ sung một số thành phần khác như vi tảo, các hạt nano, alginate, chitosan nhằm làm tăng khả năng hấp thu và dẫn truyền vắc-xin trong cơ thể cá [125] Hiệu quả phương thức này thường phụ thuộc vào: (1) hàm lượng kháng nguyên trong thức ăn (2) khả năng chống lại sự phân hủy cũng như hấp thụ vắc-xin ở dạ dày (3) hiệu suất hấp thu kháng nguyên ở ruột cá Ưu điểm của vắc-xin được đưa vào qua đường tiêu hóa là không gây stress cho cá, tiến hành đơn giản, dễ áp dụng, có thể áp dụng với

số lượng lớn cá ở các kích cỡ khác nhau, ít tốn kém công lao động Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tiêu tốn một lượng vắc-xin lớn, hiệu quả bảo

hộ thu được chỉ đạt ở mức độ trung bình, hiệu quả của vắc-xin bị giảm do tác dụng của các men tiêu hoá của cá, lượng kháng nguyên cung cấp cho mỗi con cá là không đồng đều So với phương pháp tiêm vắc-xin cho cá, phương thức này cho tỉ lệ bảo

hộ thấp hơn và thời gian bảo hộ ngắn hơn

1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá

Vắc-xin nhược độc là hướng nghiên cứu mang nhiều triển vọng ứng dụng sản xuất vắc-xin thương mại cho cá Vi khuẩn giảm độc lực có nguồn gốc là những vi khuẩn dại, gây bệnh được nuôi cấy hoặc xử lý trong phòng thí nghiệm để tạo thành chủng giảm độc lực Chủng giảm độc lực phải có khả năng sinh trưởng nhưng không có khả năng gây bệnh hoặc có thể gây bệnh ở mật độ vi khuẩn rất cao Để chủng vi khuẩn giảm độc lực được sử dụng như là vắc-xin sống, nhược độc thì chúng cần giữ được cấu trúc kháng nguyên, tạo được đáp ứng miễn dịch mạnh cho

cá với thời gian bảo hộ dài Có ba phương pháp tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực bao gồm sử dụng tác nhân vật lý, tác nhân hóa học và công nghệ gen [5]

1.4.1 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý

Một số tác nhân vật lý được sử dụng để tác động vào chủng vi khuẩn dại, làm cho chủng vi khuẩn này giảm độc lực:

Nhiệt độ: Trong giới hạn sinh trưởng, nếu nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ nằm ngoài khoảng nhiệt độ không thuận lợi trong khoảng thời gian dài, vi khuẩn sẽ giảm độc lực nhưng tính kháng nguyên của nó vẫn còn để tạo phản ứng miễn dịch cho cơ thể được tiêm chủng [5]

Tia phóng xạ: bao gồm tia phóng xạ gây ion hóa (tia X, tia gamma) và tia phóng xạ không ion hóa (tia cực tím) Tia phóng xạ có khả năng xuyên sâu vào

cơ thể, gây ion hóa tác động đến cấu trúc của DNA, có thể gây đột biến điểm hoặc làm đứt gẫy cấu trúc phân tử DNA Lê Minh Hải và cộng sự (2017) đã sử

dụng tia UV để gây đột biến chủng vi khuẩn Photobacterium damsalae dại, tạo dòng

đột biến giảm độc lực T4.3U6 Vi khuẩn giảm độc lực này được đánh giá có tiềm năng trong việc phát triển vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài cá biển

Dòng T4.3U6 có thể tạo đáp ứng miễn dịch trên cá mú ở các liều tiêm từ 105 - 108

CFU/ml với lượng kháng thể tạo ra tương tự nhau, tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 70 - 90% Mật độ vi khuẩn giảm độc lực thích hợp nhất để sử dụng tạo đáp ứng miễn dịch là 107

CFU/ml [4]

1.4.2 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học

Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục qua nhiều thế hệ hoặc nuôi cấy liên tục trên môi trường bổ sung các chất hóa học, kháng sinh có thể tạo được các dòng vi khuẩn giảm độc lực so với chủng dại Một số chất có khả năng tác động đến cấu trúc DNA hoặc quá trình biểu hiện gen liên quan đến độc lực của chủng vi khuẩn được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn dại để gây đột biến

(a) Nuôi cấy liên tục vi khuẩn dại

Chủng vi khuẩn Renibacterium salmoninarum dại gây bệnh thận (Bacterial

Kidney Disease - BKD) ở cá hồi chỉ phát triển trên môi trường thạch KDM-2 Hai

chủng vi khuẩn đột biến dinh dưỡng R salmoninarum (RsTSA1; RsBHI1) được tạo

ra bằng cách nuôi cấy chủng dại liên tục trên hai loại môi trường trypticase soy agar (TSA) và brain heart infusion agar (BHI) Vi khuẩn RsTSA1 được đánh giá có khả năng bảo hộ tốt với tỷ lệ bảo hộ (RPS) 50% trên cá hồi sau 60 - 74 ngày tiêm chủng, trong khi, 100% cá hồi đối chứng được tiêm bởi chủng dại đều bị bệnh [42]

Swain và cộng sự (2010) đã chọn lọc được hai dòng vi khuẩn Aeromonas hydrophila Ahv và Ah1v bằng cách nuôi cấy liên tục chủng vi khuẩn dại trên môi

trường BHI agar trong thời gian là 8 năm, qua hơn 100 thế hệ Hai dòng vi khuẩn này được đánh giá là dòng giảm độc lực vì chúng không gây bệnh cũng như gây

chết cho cá được tiêm Đáp ứng miễn dịch của cá chép Ấn Độ (Labeo rohita) được

tạo ra sau 15 và 21 ngày tiêm chủng [144]

Li và cộng sự (2015) đã tạo được chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae YM001 giảm độc lực bằng phương pháp cấy chủng dại S agalactiae HN016 liên tục qua nhiều thế hệ trong ống nghiệm Chủng giảm độc lực S agalactiae

YM001 cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên cá rô phi là 96,88%; 67,22% và 71,81% sau

15 ngày hoặc 93,61%; 60,56% và 53,16% sau 20 ngày với phương thức đưa

vắc-xin vào cơ thể cá rô phi lần lượt tương ứng là tiêm, tắm và cho ăn vắc-vắc-xin với liều 108 CFU/con [83]

(b) Nuôi cấy liên tục vi khuẩn dại trên môi trường bổ sung các chất hóa

A hydrophila (9 dòng); E tarda (9 dòng); S iniae (9 dòng); và S agalactiae (11

dòng) Trong các dòng kháng gossypol không phát hiện dòng giảm độc lực khi đánh giá trên cá rô phi và cá da trơn Phần lớn các dòng kháng proflavine hemisulfate đều

giảm độc lực nhưng không tạo đáp ứng miễn dịch cho cá Vi khuẩn S iniae và S agalactiae kháng novobiocin hoặc ciprofloxacin (8 dòng) là dòng giảm độc lực và tạo được đáp ứng miễn dịch với tỉ lệ bảo hộ không cao hơn 70% Dòng vi khuẩn E tarda 30305 kháng novobiocin có tính an toàn (tỉ lệ sống sót ở cá sau tiêm vắc-xin

là 100%) và tỉ lệ bảo hộ (RPS) ở cá rô phi lần lượt là 100% và 92% sau 14 và 28 ngày tiêm chủng [128] Để phát triển vắc-xin sống nhược độc, Pridgeon và cộng sự

(2013) lựa chọn 40 dòng S agalactiae kháng sparfloxacin để đánh giá độc lực trên

cá và lựa chọn dòng giảm độc lực Trong 40 dòng kháng kháng sinh có 31 dòng vi khuẩn là giảm độc lực khi chúng được đánh giá độc lực trên cá rô phi sông Nile Đánh giá về khả năng bảo hộ, 6/31 dòng vi khuẩn cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) 100% ở cá

rô phi sông Nile [127]

Chủng Edwardsiella ictaluri S97-773 giảm độc lực được Wise và cộng sự

(2015) tạo ra bằng cách nuôi cấy liên tục chủng dại trên môi trường chứa rifamycin với nồng độ tăng dần Vi khuẩn này được trộn vào thức ăn của cá nheo Mỹ

(Ictalurus puncatus) với hàm lượng 5 x 106 và 5 x 107 CFU/g cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) lần lượt là 82,6%; 100% sau 30 ngày cá ăn vắc-xin [161]