Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

VŨ THỊ BÍCH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH

HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI- NĂM 2020

nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết

PGS.TS Phạm Thị Tâm

Phản biện 1: PGS.TS Khuất Hữu Thanh

Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Trường ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội

Phản biện 3: PGS.TS Dương Minh Lam

Trường ĐHSP Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … giờ … ngày … tháng… năm…

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội

hoặc Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Bài báo đã công bố

1 Cao Thị Thanh Hương, Phạm Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Xuân Viết,

Vũ Thị Bích Huyền (2015) Đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ cá biển mắc bệnh hoại tử gan thận Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn

8/2015: 72-78

2 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Nguyễn Đăng Quang, Đỗ Thanh Vân, Đặng Thị Hồng Thắm,(2018) Tạo chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực bằng phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin, Báo

cáo khoa học Hội nghị nghiên cứu và giảng dạy Sinh học toàn quốc lần thứ ba, tháng 5/2018: 1156-1163

3 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Đặng Thị Hồng Thắm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm (2018) Đánh giá tính ổn định và khả năng đáp ứng miễn dịch của

chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus L4650 giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc - xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn

số 21/2018: 79-85

4 Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Huỳnh Việt Tùng, Phạm Thị Tâm, Mẫn

Hồng Phước (2019) Đặc điểm sinh hóa và di truyền của chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá mú nuôi tại Cát Bà, Hải Phòng Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y tập 26 số 7/2019: 62-73

5 Vu Thi Bich Huyen, Nguyen Xuan Viet, Pham Thi Tam,Man Hong Phuoc, Huynh

Viet Tung, Nguyen Dang Quang, Do Thanh Van (2020) Development of attenuated Vibrio parahaemolyticus mutant strains as potential live vaccines Asia Pacific Journal of

Molecular Biology and Biotechnology 28(1): 52-67

Trình tự gen đã công bố trên NCBI: 02 trình tự (đã được trích dẫn trong bài tại tạp

chí Khoa học Kỹ thuật Thú y)

- Gen toxR của chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047286

- Gen tlh của chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047289

Hội thảo Khoa học Quốc tế

Vu Thi Bich Huyen, Chu Dinh Toi, Nguyen Xuan Viet, Man Hong Phuoc, Pham Thi Tam (2019) Isolation and evaluation the potential as live attenuated vaccine candidate of

rifampicin-resistant Vibrio parahaemolyticus strains 2019 International Academic

Conference for Graduate Student of Nanjing Agricultural University in October 2019, Nanjing, China

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Với lợi thế bờ biển dài (3.260 km) trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm năng phát triển ngành nuôi trồng thủy sản là rất lớn Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018 GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% toàn nền kinh tế và 23,57% toàn ngành nông nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong ngành nông nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào tăng trưởng chung toàn ngành nông nghiệp

và cả nước [187] Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam cũng như trên thế giới luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt những tổn thất do bệnh dịch gây ra Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu hơn 6 tỷ USD mỗi năm, xảy ra ở hầu hết các nước đang phát triển Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm ngành thủy sản thiệt hại gần 1 tỷ USD do bệnh dịch gây ra [22]

Bệnh hoại tử gan thận trên cá được phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá, được biết

là do vi khuẩn Vibro parahaemotycus gây ra [112] Cá bị bệnh có triệu chứng: xuất hiện các

đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất huyết, đặc biệt ở gan và thận, gan chuyển thành màu vàng, cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến 90% [112, 138]

V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá chết hàng loạt với số lượng lớn được

báo cáo hằng niên các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu…[184, 185, 186]

Cho đến nay, việc kiểm soát và điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi của người

nuôi cá chủ yếu là sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V parahaemolyticus [34, 61]

Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh một cách thường xuyên và thiếu sự kiểm soát chặt chẽ đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc ở nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26] Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm cũng như sức khỏe của người tiêu thụ [107] Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh là một giải pháp hiệu quả và mang đến sự phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta

Vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125] Hầu hết các vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá đã được thương mại hóa trên thế giới là vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn cao của loại vắc-xin này Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt được đánh giá là có thời gian bảo hộ không dài [152] Mặc dù, đã có một vài nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-

xin tái tổ hợp hoặc vắc-xin DNA phòng bệnh do vi khuẩn V parahaemolyticus ở cá đã được

công bố, nhưng cho đến nay các vắc-xin như thế được cấp phép thương mại hóa để sử dụng trên cá là chưa có Vắc-xin nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực đang là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả năng cho tỉ lệ bảo hộ cao và thời gian bảo hộ dài

Tạo được chủng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc có khả năng gây đáp ứng

miễn dịch cho cá do đó sẽ có ý nghĩa quan trọng và mang tính quyết định sự thành bại của việc phát triển loại vắc-xin nhược độc Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận là rất cần thiết, phù hợp với xu hướng và mang đến triển vọng ứng dụng cao trong phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh

hoại tử gan thận trên một số loài cá biển” được tiến hành nhằm tạo làm cơ sở ban đầu cho

việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Tạo được chủng vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây

đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Tạo được vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây bệnh

hoại tử gan thận cá phân lập được bằng phương pháp xử lý với kháng sinh rifampicin

- Xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự nucleotide trong

các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực

- Đánh giá được khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực đã tạo ra

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập và xác định các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh

hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi (cá mú, cá hồng, cá bớp) tại vùng biển miền Bắc Việt Nam

- Nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực từ các chủng vi

khuẩn gây bệnh bằng phương pháp xử lý các chủng gây bệnh với rifampicin và phân tích

những sai khác về trình tự nucleotide của một số gen mã hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB của các dòng V parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng V parahaemolyticus trên loài cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) và chọn dòng V parahaemolyticus làm ứng viên nghiên

cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi

4 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển

5 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển

quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình);

vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) và các dòng đột biến giảm độc lực được tạo ra

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6 1 Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp thêm cơ sở dữ liệu các chủng V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử

gan thận cho cá nuôi ở một số vùng biển miền Bắc về các đặc điểm hình thái, hóa sinh và khả năng kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dịch tễ

và xây dựng các giải pháp chẩn đoán bệnh

Phát hiện những đột biến trong gen độc tố và gen ropB của các dòng V parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực là có ý nghĩa khoa học góp phần định

hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển vắc-xin sống nhược độc sử dụng trong phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng

Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ (RPS) của dòng V parahaemolyticus giảm độc lực đối với bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam (E coioides) đã cung cấp cơ sở khoa

học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Vi khuẩn V parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn

dịch sẽ là ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú chấm cam cũng như một số loài cá biển khác

7 Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi của đề tài

Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu tạo vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh

hoại tử gan thận trên cá biển bằng phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin

Lần đầu tiên kích thước đầy đủ của gen tlh ở vi khuẩn V parahaemolyticus được nhân bản thành công Phát hiện được các sai khác trình tự nucleotide trong các gen tlh và rpoB

giữa các dòng giảm độc lực và chủng dại, cung cấp cơ sở di truyền chứng minh mối liên

quan giữa các đột biến trong gen độc tố tlh và gen rpoB với tính giảm độc lực ở vi khuẩn V paraheamolyticus

Chọn được dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 là ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển nuôi lồng Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu hiện ổn định về độc lực,

tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con,

105 CFU/ml đạt 100% Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng

8 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền - Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Đại học

Mở Hà Nội

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một

số loài cá

1.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio

1.1.2 Hệ gen của vi khuẩn V parahaemolyticus

1.1.3 Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin

Ba loại protein haemolysin: TDH (thermostable direct haemolysin), TRH

(TDH-related haemolysin) và TLH (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen tdh, trh và tlh Gen toxR mã hóa cho protein điều hòa có vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tồn

tại và độc lực của vi khuẩn

1.1.4 Gen rpoB và tính kháng rifampicin

Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase Rifampicin có khả năng liên kết với tiểu đơn vị β - protein được mã hóa bởi gen rpoB, gây cản trở sự khởi đầu phiên

mã của vi khuẩn

1.1.5 Kháng nguyên của vi khuẩn V parahaemolyticus

1.2 Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

1.2.1 Triệu chứng

1.2.2 Chẩn đoán và điều trị

1.3 Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động

1.3.1 Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá

1.3.2 Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương

1.3.3 Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá

1.4 Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá

1.4.1 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý

1.4.2 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học

1.4.3 Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen

1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Những nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá do vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra hiện nay đang tập trung vào hướng tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-

xin tái tổ hợp với sản phẩm là các protein màng ngoài, vắc-xin DNA Tuy nhiên, vắc-xin

thương mại được cấp phép sử dụng cho cá trong phòng chống V parahaemolyticus đến

nay vẫn chưa có, kể cả vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạo dòng vi khuẩn giảm độc lực và đánh giá tiềm năng của các dòng tạo ra nhằm chọn được một vài dòng để sử dụng như một nguyên liệu cho sản xuất

vắc-xin nhược độc phòng chống vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho cá biển

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Cá bệnh

Cá biển (cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò) có các triệu chứng mắc bệnh hoại tử gan thận thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) Các mẫu được sử dụng để phân lập vi khuẩn trong 24 giờ kể từ thời điểm thu thập mẫu

2.1.2 Cá thí nghiệm

Cá ngựa vằn (Danio rerio) dài 3 - 3,5 cm và cá rô phi (Oreochromis niloticus) dài 6 -

6,5 cm do Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I (Từ Sơn, Bắc Ninh) cung cấp

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 5,5 - 6 cm do Trung tâm Giống thủy sản

(Hải Phòng) cung cấp

2.1.3 Vi khuẩn

Chủng V parahaemolyticus VTCC 12233 được cung cấp từ Viện Vi sinh vật và Công

nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội được sử dụng làm chủng đối chứng

2.1.4 Hóa chất

2.1.5 Thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ các bước thực hiện chính

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thực hiện chính

2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh

Gan, thận, da, vây của cá nghi bị bệnh hoại tử gan thận được nghiền nhỏ trong dung dịch nước muối 1,5%, pha loãng dung dịch này, cấy trải đều lên bề mặt môi trường TCBS Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái: tròn, bóng, lồi, có màu xanh đậm

Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập

Các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus kháng rifampicin

Các dòng vi khuẩn V parahaemolyticus giảm độc lực

Đánh giá tính ổn định, khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn

giảm độc lực tiềm năng

Chọn lọc chủng tiềm năng

Gây nhiễm

vi khuẩn lại cho cá mú chấm cam

2.2.3 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn

2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram

2.2.5 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

2.2.6 Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa sinh, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn

(a) Đánh giá đặc điểm sinh hóa: khả năng lên men, sinh khí, sinh H2S, sinh indol, sinh catalase, khả năng di động và khả năng gây dung huyết

(b) Xác định tính kháng kháng sinh: với kháng sinh ampicillin (25 µg), gentamycin (30 µg), norfloxacin (10 µg), enrofloxacin (5 µg) và erythromycin (15 µg)

2.2.7 Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn

Cá mú chấm cam được tiêm gây nhiễm các chủng V parahaemolyticus phân lập Xác

định tỉ lệ sống sót của cá sau 14 ngày

2.2.8 Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin

Nuôi cấy liên tục chủng vi khuẩn dại, gây bệnh trên môi trường chứa rifampicin với nồng độ tăng dần từ 10 đến 250 µg/ml Chọn lọc các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

2.2.9 Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

(a) Tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm chủng/dòng vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn kháng rifampicin chọn lọc được đánh giá về độc lực bằng phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên cá ngựa vằn và cá rô phi Xác định tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm (b) Giá trị LD50 của chủng/dòng vi khuẩn

Phương pháp xác định giá trị LD50 của chủng dại và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin được tiến hành trên cá rô phi theo phương pháp của Reed và Muench (1938)

2.2.10 Nhóm phương pháp sinh học phân tử

2.2.10.1 Phương pháp thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5 (QIAGEN Bioinformatics) để

thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh của chủng vi khuẩn V parahaemolyticus

2.2.10.2 Phương pháp tách DNA tổng số: DNA tổng được tách bằng kit i-genomic BYF

DNA Extraction Mini (iNtRON, Hàn Quốc)

2.2.10.3 Phương pháp PCR khuếch đại gen, giải trình tự gen

(a) PCR khuếch đại gen độc tố và rpoB

Bảng 2.1: Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR

Gen

đích Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)

Tm (℃)

Kích thước sản phẩm (bp) Nguồn

tdh tdhF GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC 53,3 269 Bej A.K &cs (1999) [29]

2.2.11 Phương pháp tin sinh: Kết quả giải trình tự gen được phân tích với phần mềm

BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)

CLC Genomics Workbench 8.5

Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)

Swiss model (https://swissmodel.expasy.org/interactive)

2.2.12 Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam

(a) Đánh giá tính ổn định của dòng giảm độc lực

(b) Đánh giá mức độ an toàn của dòng giảm độc lực

2.2.13 Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên

cá mú

(a) Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch cho cá

Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin theo công thức của Amend (1981) [23]:

RPS (%) = [1-(% cá được tiêm vắc-xin chết/% cá đối chứng chết)] x 100

(b) Đánh giá độ dài miễn dịch: đánh giá tỉ lệ bảo hộ sau 1, 2, 4, 6 tháng tiêm chủng cho cá

2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê trên Excel và phần mềm Stata 2.0

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận

3.1.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio

Phân lập được 26 mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio từ mẫu cá nghi mắc bệnh hoại tử

gan thận Sau đó, chọn lọc được 11 mẫu vi khuẩn: B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1;

B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6 có đặc điểm khuẩn lạc của V parahaemolyticus: màu xanh đậm, mặt bóng và có hình tròn đều, đường kính từ 2 - 3 mm

3.1.2 Phân tích đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn phân lập

Mười một mẫu vi khuẩn phân lập đều có các đặc điểm sinh hóa giống với chủng đối

chứng dương V parahaemolyticus VTCC 12233 và phù hợp với các đặc điểm của V parahaemolyticus: lên men glucose, không lên men lactose, không sinh H2S, không sinh khí, sinh indol, khả năng di động, sinh catalase, gây tan huyết kiểu β

Tính kháng một số loại kháng sinh của các mẫu phân lập được thể hiện trong bảng 3.3

Tính kháng kháng sinh ở chủng V parahaemolyticus cũng được nhiều tác giả ghi nhận [167,

182] Có thể nhận thấy, sử dụng kháng sinh một cách phổ biến và thiếu kiểm soát trong điều trị các bệnh thủy sản đang là một mối lo ngại rất lớn đối với ngành nuôi trong thủy sản Sử dụng vắc-xin phòng bệnh một cách chủ động cho động vật thủy sản là giải pháp bền vững

và rất cần thiết để giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh do sử dụng quá thường xuyên và thiếu hợp lý hiện nay ở các trang trại nuôi thủy sản

Bảng 3.3 Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 vi khuẩn phân lập

STT Chủng

vi khuẩn

Tính kháng kháng sinh

Erythromycin (15 µg)

Gentamycin (30 µg)

Norfloxacin (10 µg)

Ampicillin (25 µg)

Enrofloxacin (5 µg)

Ghi chú: S - mẫn cảm; I - nhạy trung bình; R – kháng

3.1.3 Xác định chủng vi khuẩn V parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử

Các mẫu vi khuẩn phân lập (11 mẫu) và mẫu đối chứng dương VTCC 12233 đã được tách DNA tổng số và kiểm tra chất lượng trên gel điện di agarose Kết quả cho thấy một băng điện di DNA tổng số trên gel agarose gọn và sắc nét (hình 3.6) Kết quả tỉ lệ

OD260/OD280 của 12 mẫu DNA tổng số đều nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0 Như vậy, những mẫu DNA tổng số này là tinh sạch, đủ tiêu chuẩn để dùng trong các phản ứng PCR

Hình 3.6 DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn điện di trên gel agarose 1%

Ghi chú: giếng 1-12: VTCC12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1;

A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1kb

Gen độc tố toxR và tlh đã được khuếch đại từ DNA tổng số của 11 mẫu vi khuẩn

nghiên cứu (hình 3.7; 3.8) Tuy nhiên, sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu của 2 gen

độc tố còn lại, tdh và trh, không quan sát thấy trên gel điện di Có lẽ trong hệ gen của 11 mẫu V parahaemolyticus phân lập được không mang 2 gen độc tố tdh và trh Sự không có

mặt gen tdh và trh trong hệ gen của V parahaemolyticus cũng đã được một số nhà khoa học

A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 100 bp, M1: Marker 1 kb

3.1.4 Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các mẫu vi khuẩn phân lập

Mười một chủng vi khuẩn phân lập được tiêm vào cá mú chấm cam với liều lượng 107

CFU/ml, 100 µl/con Quan sát các triệu chứng của cá bị mắc bệnh và ghi nhận tỉ lệ sống sót

của các cá mú sau 14 ngày tiêm với các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập cho

thấy: 100% cá được gây nhiễm biểu hiện triệu chứng xuất huyết, gốc vây xuất huyết, tuột vẩy, tuột nhớt, loét da, vây cụt, vùng cơ quanh khu vực tiêm gây nhiễm và da đổi màu đậm hơn Giải phẫu và quan sát các nội quan của cá thấy gan và thận cá bị hoại tử nghiêm trọng

Tỉ lệ sống sót của cá mú sau 14 ngày gây nhiễm (bảng 3.5) dao động từ 2,22% đến 22,22%, trong đó, cá gây nhiễm bằng chủng vi khuẩn B5M3 và N9.2 có tỉ lệ cá sống sót thấp nhất (2,22%) và tỉ lệ sống sót cao nhất ghi nhận ở cá được gây nhiễm chủng vi khuẩn B13M1 (22,22%) Tỉ lệ này ở cá gây nhiễm bằng chủng vi khuẩn LBT6, B3.13, A3.3, B5M2, B5M4 lần lượt tương ứng là là 13,33%; 6,67%; 10%; 18,9%; 18,9% Tỉ lệ sống sót này 16,67% quan sát thấy ở cá gây nhiễm bằng một trong 3 chủng vi khuẩn B20M2, N13.1.1, HH3-34 Tỉ lệ cá chết cao thường ở tuần đầu tiên, nhất là ở ngày thứ 1 đến ngày

thứ 3 sau gây nhiễm Ở tuần tiếp theo, tỉ lệ cá chết thấp dần và khoảng dao động cũng ít hơn

giữa các ngày theo dõi Kết quả này cũng phù hợp các báo cáo về đặc điểm gây bệnh của V paraheomolyticus, nó có thể làm cá chết hàng loạt khi ở thể cấp tính hoặc chết rải rác khi cá

ở thể thứ cấp tính

Bảng 3.5 Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với 11 mẫu vi khuẩn

Chủng Tỉ lệ sống sót của cá sau ngày gây nhiễm (%)

Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 14

LBT6 82,22 ±

1,25

55,56 ± 0,47

28,89 ± 0,47

17,78 ± 0,47

13,33 ± 0,00

14,44 ± 0,47

13,33 ± 0,82

13,33 ab ± 0,47 B3.13 81,11 ±

1,70

53,33 ± 1,24

35,56 ± 0,47

14,44 ± 0,47

7,78 ± 0,47

6,67 ± 0,00

6,67 ± 0,00

6,67 ab ± 0,00 A3.3 78,89 ±

0,67

70,00 ± 0,00

48,89 ± 0,47

31,11 ± 0,47

13,33 ± 0,47

11,11 ± 0,47

11,11 ± 0,00

10,00 ab ± 0,00 B5M2 85,56 ± 0,47 67,78 ± 0,47 45,56 ± 0,47 33,33 ± 0,00 22,22 ± 1,25 20,00 ± 0,82 18,89 ± 0,47 18,890,47 b ± B5M3 55,56 ±

0,47

27,78 ± 0,82

17,78 ± 0,47

8,89 ± 0,47

4,44 ± 0,00

2,22 ± 0,47

2,22 ± 0,47

2,22 a ± 0,47 B5M4 74,44 ± 1,25 47,78 ± 0,47 38,89 ± 0,94 26,67 ± 0,82 20,00 ± 0,0 18,89 ± 0,47 18,89 ± 0,47 18,890,47 b ± B13M

1

82,22 ±

0,82

55,56 ± 0,47

35,56 ± 1,25

25,56 ± 0,47

24,44 ± 0,47

22,22 ± 0,47

22,22 ± 0,47

22,22 b ± 0,47 B20M

2

71,11 ±

0,47

55,56 ± 2,05

44,44 ± 2,05

30,00 ± 1,63

21,11 ± 0,47

18,89 ± 0,47

16,67 ± 0,00

16,67 ab ± 0,00 N9.2 55,56 ±

0,47

45,56 ± 0,47

35,56 ± 0,47

13,33 ± 0,82

4,44 ± 0,47

2,22 ± 0,47

2,22 ± 0,47

2,22 a ± 0,47 N13.1

1

60,00 ±

1,41

48,89 ± 1,25

30,00 ± 0,82

23,33 ± 1,41

18,89 ± 0,94

17,78 ± 0,47

17,78 ± 0,47

16,67 ab ± 0,00 HH3-

34

62,22 ±

0,94

48,89 ± 1,25

28,89 ± 0,47

23,33 ± 0,82

21,11 ± 1,63

20,00 ± 1,41

20,00 ± 1,25

20,00 b ± 1,41 PBS 100 100 100 100 100 100 100 100 c

Ghi chú : chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p<0,05

Giải phẫu và quan sát các nội quan của cá thấy gan và thận cá bị hoại tử nghiêm trọng Phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu cá chết trên môi trường TCBS đã phát hiện 30/30 (100%)

mẫu cá bệnh phát hiện có vi khuẩn với đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn V parahaemolyticus: khuẩn lạc mầu xanh đậm, mặt bóng và có hình tròn đều, là vi khuẩn

Gram âm, có khả năng lên men glucose, không lên men lactose không sinh H2S, không sinh khí, sinh indol, có khả năng di động, sinh catalase Đặc biệt, với cá mú bị gây nhiễm bằng vi khuẩn LBT6, A3.3 và B3.13 thì hiện tượng nội quan bị tổn thương nghiêm trọng, có nhiều trường hợp cá chết được giải phẫu và cấu trúc gan thận không còn nguyên vẹn, bị phân hủy

Dựa vào kết quả đánh giá độc lực của các chủng V parahaemolyticus phân lập được, triệu

chứng bệnh trên cá, chúng tôi chọn được 3/7 chủng vi khuẩn có độc lực cao, bao gồm LBT6, A3.3 và B3.13 Các chủng này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo