Ứng dụng công nghệ gen động vật, vi sinh vật trong nông nghiệp, y tế

Ứng dụng công nghệ gen động vật, vi sinh vật trong nông nghiệp, y tế

ứng dụng công nghệ gen động

vật, vi sinh vật trong nông

1.1.ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

• Sử dụng các kỹ thuật của công nghệ gen để phát hiện,

chẩn đoán một cách chính xác, nhanh chóng các bệnh di truyền và truyền nhiễm gây ra do nấm, khuẩn, virus…

dựa trên cơ sở nguyên nhân gây bệnh làm xuất hiện axit nucleic ngoại lai trong cơ thể bị bệnh hay do xuất hiện sự biến đổi axit nucleic của chính các cơ thể đó

• Trong các kỹ thuật thao tác trên ADN, ARN kỹ thuật lai

axit nucleic và khuếch đại axit nucleic là 2 kỹ thuật cơ bản đ ợc sử dụng trong chẩn đoán bệnh bởi khả năng ứng dụng rộng trên nhiều loại bệnh, tốc độ chẩn đoán nhanh, chính xác

• Phổ biến hơn cả trong các ph ơng pháp khuyếch đại axit

nucleic là ph ơng pháp PCR và các dạng cải biến của nó (real time PCR, RT-PCR … ) Có hơn 100 bệnh có thể

chẩn đoán đ ợc bằng ph ơng pháp này.

Nguyên lý

• Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm : Xác định sự có mặt hay không

có mặt axit nucleic của tác nhân gây bệnh trong đối t ợng chẩn

đoán để xác định cá thể mang bệnh ở ngay những giai đoạn

sớm (ch a có triệu chứng và dấu hiệu bệnh lý)

• Chẩn đoán bệnh di truyền: phát hiện những biến đổi đặc tr ng

của axit nucleic liên quan đến bệnh ở đối t ợng chẩn đoán để có thể phát hiện bệnh ở các giai đoạn phát triển cá thể, thậm chí cả ở giai đoạn phôi

• Quá trình chẩn đoán bệnh nhờ lai và khuyếch đại axit nucleic

bao gồm các giai đoạn chính:

– Thu thập mẫu để chẩn đoán

– Tiến hành kỹ thuật phù hợp để phát hiện axits nuclei ngoại lai hay sự biến đổi của axits nuclei nội tại của tế bào chủ trong mẫu chẩn đoán

– Phân tích, đánh giá kết quả

PCR for Medical Diagnostics

ChÈn ®o¸n bÖnh truyÒn nhiÔm b»ng PCR

ë ViÖt nam

• BÖnh ung th vßm häng do Epstein-Bar virus víi cÆp måi:

–TH1: 5 -AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

–TH2: 5 -GCTTGGATGGCCGAGTCAGCGACGG-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• BÖnh viªm gan B do Hepatitis B virus b»ng PCR lång

víi hai cÆp måi:

Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng PCR

ở Việt nam

• Bệnh sốt rét: trên 80% tr ờng hợp sốt rét ở n ớc ta do nhiễm ký

sinh trùng Plasmodium falciparum, một số bệnh nhân nhiễm phối hợp 2-3 loại ký sinh trùng sốt rét khác nhau (P vivax, P

ovale, P.malariae) Sử dụng ph ơng pháp PCR lồng với cặp

mồi: Plu5-Plu6 (PCR lần1) và PCR lần 2 với các cặp mồi:

Fal1-Fal2 (P falciparum), Viv1-Viv2 (P vivax), Mal1-Mal2

(P.malariae), o va1-ova2 (P ovale) có thể chẩn đoán nhanh và

chính xác loài ký sinh trùng lây nhiễm ở bệnh nhân.

(primes) và đầu dò (DNA probes) đặc hiệu cho các locus khác nhau của gen HA phân lập từ mẫu bệnh phẩm của Việt nam

đã chẩn đoán nhanh, nhạy sự có mặt của chủng virus (bảng sau)

Giới thiệu về virut H5N1

• Thuộc họ orthomyxoviridae : gây bệnh đ ờng hô hấp

trên ng ời, động vật, gia cầm, chim.

• Gồm typ A, B, C trong đó A gây dịch cúm chính, B nhẹ

hơn, C ít nguy hiểm cho ng ời.

• Virut cúm typ A, B thuộc chi influenzavirus truyền

bệnh qua sol khí, dòng n ớc, tiếp xúc.

• Virion có vỏ đa hình thái, th ờng có hình cầu đ ờng kính

80-120nm.

• Bề mặt virut có 2 loại gai: Hemaglutinin (H) và

neuraminidaza (N)

• Virut typ A có 16 loại gai H trong đó H1, H2, H3 gây

bệnh cho ng ời Có 9 loại gai N trong đó N1, N2 gây

bệnh cho ng ời.

Giới thiệu về virut H5N1

đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục:

–Thay đổi lớn: hoán vị kháng nguyên, xảy ra khi có 2

hay nhiều chủng virut có nhiều đoạn ARN khác biệt nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào Các đoạn này

có thể hoán vị cho nhau, thí dụ thay đoạn mã hoá

cho Hemaglutinin của ng ời bằng đoạn của động vật, kết quả tạo chủng virut mới với kháng nguyên thay

đổi, kháng lại đ ợc kháng thể đã hình thành tr ớc.

–Thay đổi nhỏ: biến thể kháng nguyên, do đột biến

ngẫu nhiên, gây khó khăn cho việc sản xuất vacxin hữu hiệu.

r

Thuèc ®iÒu trÞ: (G©y bÊt ho¹t enzyme neuraminidaza):

Amantadin Rimantadin Zanamivir Oseltamivir (Tamiflu)

The various types of influenza viruses in humans Solid squares show the appearance of a new strain, causing recurring influenza pandemics Broken lines indicate uncertain strain identifications [2]

Nguồn gốc gen của virus cúm A/H1N1 2009

HA Hemagglutinin Lợn (H1) Bắc Mĩ

NA Neuraminidase Lợn (N1) Châu Âu

PA RNA polymerase subunit PA[81][82] Chim Bắc Mĩ

PB1 RNA polymerase subunit PB1[83] Người 1993 H3N2 strain PB2 RNA polymerase subunit PB2[84] Chim Bắc Mĩ

NP Nucleoprotein [85] Lợn Bắc Mĩ

M Matrix proteinM1, M2 Lợn Âu-Á

NS/NEP

Non-structural proteins NS1, NEP (

Nuclear Export Pr otein

) [86][87]

Lợn Bắc Mĩ

Nguồn: “The identity card of a composite virus”, Le Monde, 2009/04/29 (Viết bằng tiếng

Pháp

Chẩn đoán bệnh di truyền bằng PCR

Bệnh máu khó đông (Hemophilia)

ba loại bệnh máu khó đông:

- Hemophilia A do đột biến gây mất chức năng gen mã hóa protein

đặc hiệu đ ợc gọi là yếu tốVIII (F.VIII) Tần số mắc bệnh 1/10.000

- Hemophilia B gây nên do rối loạn chức năng gen mã hóa yếu tố IX

(F.IX) Tần số mắc bệnh 1/50.000

(Hemophilia A và Hemophilia B khỏ phổ biến Tỷ lệ gặp khoảng 1 trong số 10.000 đàn

ụng Bệnh di truyền lặn, liờn quan đến nhiễm sắc thể giới tớnh X Chủ yếu bệnh nhõn là đàn ụng, 100 % con gỏi của người bệnh mang gen, chỏu trai ngoại cú biểu hiện bệnh Tỷ

• Có thể sử dụng nhiều kỹ thuật phân tử khác nhau để để

phát hiện nhanh bệnh máu khó đông: RFLP, PCR, lai ADN

• RFLP: phát hiện đột biến trên gen F.VIII với RE BclI (đột

biến ở intron 18), HindIII (đột biến ở intron 19), XbaI và MspI (đột biến ở intron 22) phát hiện đột biến trên gen F.IX với

RE TaqI (đột biến ở intron 4), XmnI (đột biến ở intron 3)

• PCR: nhân đoạn intron 18 bằng mồi 8.1 và 8.2, nhân đoạn intron 19 bằng mồi C3 và C4

Bệnh hồng cầu liềm

• Nguyên nhân gây bệnh là s thay đổi nucleotid trong codon của

axit amin thứ 6 của chuỗi  trong phân tử Hemoglobin (đổi

glutamic thành valin)

• Cá thể đồng hợp tử về đột biến này(S/S) có hồng cầu biến dạng

thành hình liềm, không vận chuyển đủ oxy gây thiểu máu

nghiêm trọng, tổn th ơng nội quan Thời gian tồn tại của thể

đồng hợp tử ngắn

• Thể dị hợp tử (B/S): hồng cầu dạng bình th ờng, triệu chứng

bệnh biểu hiện khi gặp điềukiện khắc nghiệt (nhiệt độ cao) làm giảm cung cấp oxy

• Đột biến điểm nêu trên làm mất vị trí nhận biết của RE Dde1

(CTNAG) Do đó sau khi nhân PCR, xử lý cắt bởi RE và điện

di sẽ phát hiện đ ợc thể đột biến (chỉ có 2 vi trí căt cho Dde1)

Diagnosis of Sickle-Cell Anemia

lane 1 shows DNA size markers, lane 2 a no DNA control, and lane 3 a full length PCR product of the beta-globin gene Lanes 4 - 8 show beta- globin PCR products digested with the restriction endonuclease Dde I Lane 4 shows a no DNA control, lane 5 shows a normal individual (HbB/HbB), lane 6 a carrier mother (HbB/HbS), lane 7 her carrier fetus (HbB/HbS), and lane 8 the carrier

father (HbB/HbS) HbS carriers are detected by the presence of the 381 bp DNA fragment An

affected individual (HbS/HbS) would not have any 201 bp and 180 bp DNA fragments

Diagnosis of Sickle-Cell

Anemia by PCR (BÖnh hång cÇu liÒm)

1.2 Chẩn đoán giới tính

 Nguyên lý:

 Trên nhiễm sắc thể Y của ng ời và động vật có vú

mang gen đặc tr ng giới tính đực Sry (The sex

determining region Y gene) Gen này kích thích sản sinh kháng nguyên HY và phát triển tinh hoàn ở cá thể đực

 Đã tiến hành giải trình tự gen Sry của ng ời và nhiều

loài động vật có vú (chuột, lợn, bò, cừu … ) Dựa trên trình tự đặc hiệu của Sry thiết kế mồi để chẩn đoán giới tính sớm của phôi thai nhờ PCR

 Đây là ph ơng pháp chính xác, hiện đại và thông

dụng nhất hiện nay.

2 Chẩn đoán giới tính

• Để chẩn đoán sớm giới tính của phôi, ng ời ta sử dụng một tế

bào đơn của phôi vừa hình thành sau thụ tinh in vitro (giai

đoạn 6-10 tế bào) để tách ADN khuôn

• Cặp mồi dùng để phát hiện Sry của ng ời là:

 SRY1: 5 - AAGTCGGTGCTCCATTCTTGAG-3 ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

 SRY2: 5 - AATATTCCCGCTCTCCGGA- 3 ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• Cặp mồi để phát hiện Sry ở chuột:

 SRY1: 5 -GAGGCATGGAGGGCCAT-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

 SRY2: 5 -CCACTCCTCTGTGACACT-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ ’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• Trỡnh tự của mồi SE47, SE48 để xác định Sry ở cừu và h ơu đỏ

Châu Âu:

 5 - cagccaaacctccctctgc - 3 (SE47)’- cagccaaacctccctctgc - 3’ (SE47) ’- cagccaaacctccctctgc - 3’ (SE47)

 5 - cccgcttggtcttgtctgttgc - 3 (SE48)’- cagccaaacctccctctgc - 3’ (SE47) ’- cagccaaacctccctctgc - 3’ (SE47)

( I Pfeiffer and B Brenig – Department of Molecular Biology, Institute of Veterinary Medicine, Goettingen, Germany )

1 aagctttgtt tttttaaaga taacatacac atatattgat aatgataaac aattcatata

61 gctttttgtg tcctctcgtt ttgtgacata aaaggtcaat gaaaaaattg gcgattaagt

121 caaattcgca tttttcagga cagcagtaga gcagtcaggg aggcagatca gcagggcaag

181 tagtcaacgt tactgaatta ccatgttttg cttgagaatg aatacattgt cagggtacta

241 gggggtaggc tggttgggcg gggttgaggg ggtgttgagg gcggagaaat gcaagtttca

301 ttacaaaagt taacgtaaca aagaatctgg tagaagtgag ttttggatag taaaataagt

361 ttcgaactct ggcacctttc aattttgtcg cactctcctt gtttttgaca atgcaatcat

421 atgcttctgc tatgttaagc gtattcaaca gcgatgatta cagtccagct gtgcaagaga

481 atattcccgc tctccggaga agctcttcct tcctttgcac tgaaagctgt aactctaagt

541 atcagtgtga aacgggagaa aacagtaaag gcaacgtcca ggatagagtg aagcgaccca

601 tgaacgcatt catcgtgtgg tctcgcgatc agaggcgcaa gatggctcta gagaatccca

661 gaatgcgaaa ctcagagatc agcaagcagc tgggatacca gtggaaaatg cttactgaag

721 ccgaaaaatg gccattcttc caggaggcac agaaattaca ggccatgcac agagagaaat

781 acccgaatta taagtatcga cctcgtcgga aggcgaagat gctgccgaag aattgcagtt

841 tgcttcccgc agatcccgct tcggtactct gcagcgaagt gcaactggac aacaggttgt

901 acagggatga ctgtacgaaa gccacacact caagaatgga gcaccagcta ggccacttac

961 cgcccatcaa cgcagccagc tcaccgcagc aacgggaccg ctacagccac tggacaaagc

1021 tgtaggacaa tcgggtaaca ttggctacaa agacctacct agatgctcct ttttacgata

1081 acttacagcc ctcactttct tatgtttagt ttcaatattg ttttcttttc tctggctaat

1141 aaaggcctta ttcatttcag ttttactggt atttcatttt aaacttaatt tcaagacaag

1201 ttgtgtcaac acgattaaca tgcaaagaaa taagacatcc agaagtgagc ctgcctatgt

1261 ttgtggccgt cagagtacta acttgataca aacggacact gtggcttact ttaaatgctc

1321 taatgagaaa cacacttgaa aattgtacca aaaaaaatca cacttctata tgcagcgtgt

1381 taagcagtcc tctctagacc gtgtattcat tggtctttca gctactttgt acgtgtctat

1441 aaattgcagg taactaagga atggatatgt aagcaggatc aaacttgttt ctttctctcc

1501 ccttcacgct gtggaaaaaa ccagttttac ctccacttgc aattcagttc ctttactcca

1561 tataaatcca aacggttgac atttcctttc aactagttat aaaatgcctc tggtaaaaca

1621 aaatatttaa ttccttgtca tttttgtatc tctatgaaac ttatcatttt gcctttcttc

1681 tgaaaactat cttttaaaat ggcaatctac ttgtttccat ggcctattaa cttttaagcc

1741 tgtggaatga aaaatacaga attttcattc tcaacaggaa tgttgagaac gccgactacc

1801 cagattatgg agatggaagg gcgggggctg gtgacccaac tggtttaatt tgatgggatt

1861 taaataaaaa tgtaatgcca agacttcata aaatttgcac ataagctaaa gcaggaaact

1921 agaagtttac aaataactgt aaaccacagt ttaaagtata aattacaaat aaatttttct

1981 acaataaaaa taaatcaaaa gtcaaaatta atggtatgta tcaaagtcag ctttccaata

2041 tttcaaaact tttcagagac attaccttaa ataataaaac tcaaacacta aaagagtgta

2101 tattagagat ggatgtcatg tttctcaaag ttcagggttt aaaaaaagct t

Tr×nh tù Sry ë ng êi

BASE COUNT

689 a

420 c

428 g

614 t

3D

structure

of human Sry-DNA complex (PDB

accession : 1HRY)

1.3 Nhận dạng cá thể qua giám định ADN

3.1.Cơ sở khoa học

• Các intron có chứa các trình tự lặp Tuỳ mức độ

hiện diện của chúng trong phân tử ADN, các trình

tự lặp này đ ợc chia thành 2 loại:

 Các trình tự lặp nhiều lần: chiếm 10-15% bộ gen

động vật có vú Đó là những trình tự lặp ngắn 20Kb) th ờng tập trung ở những vùng chuyên biệt trên nhiễm sắc thể nh vùng tâm động (trình tự

(10-CEN) hay ở đầu các nhiễm sắc thể (trình tự TEL)

 Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm

khoảng 25-40% bộ gen ng ời Chúng có kích th ớc lớn hơn (100-1000Kb) và đa dạng hơn các trình tự lặp lại nhiều lần Các trình tự này không tập trung

mà phân tán trên toàn bộ hệ gen

 Hệ gen ng ời có một nhóm ADN lặp lại liên tiếp, có

số l ợng đoạn lặp khác nhau ở các locut khác nhau theo từng cá thể Cấu trúc này đ ợc gọi là VNTR

(Variable number tandem repeats) hay còn gọi là minisatellite DNA (ADN tiểu vệ tinh) Các locut

VNTR ở ng ời bao gồm 1 đoạn từ 1-5Kb và có các

đơn vị lặp thay đổi Mỗi đơn vị lặp thay đổi này có khoảng 15-100 nucleotit

 Ngoài ra, trong hệ gen ng ời còn có các cấu trúc d ới

nhóm VNTR đ ợc gọi là STR (short tandem

repeats) Chúng có đơn vị lặp từ 2-6bp Các cấu

trúc VNTR và STR đều bảo thủ ở mức t ơng đối, đ

ợc di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc tr ng cho từng cá thể

 Đó là nền tảng cho giám định gen

3.2.Giám định ADN nhân

• Một locut STR đ ợc sử dụng cho mục đích xác

định huyết thống cần thoả mãn các điều kiện sau:

 Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao

 Các số liệu về tần số kiểu gen cần đ ợc biết tr ớc để

đánh giá mức độ chính xác của kết luận

 Di truyền độc lập, tốt hơn hết là chúng nằm trên

những nhiễm sắc thể khác nhau

 ít bị biến tính bởi các điều kiện tự nhiên

 Các allen dễ phân biệt

 Dễ nhân dòng bằng kỹ thuật PCR

C¸c locus dïng trong khoa häc h×nh sù

vµ vÞ trÝ trªn NhiÔm s¾c thÓ

CSF1PO D5S818

D21S11

TH01 TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179 D3S1358

Các bộ KIT th ơng mại đã sản xuất đến năm 2000

1 TH01, TPOX, CSF1PO

monoplex (Silver stain) Promega 1993 TH01, TPOX, CSF1PO

2 AmpFLSTR Blue PE Applied Biosystem 1996 D3S1358, vWA, FGA

3 AmpFLSTR Green PE Applied Biosystem 1997 TH01, TPOX, CSF1PO

4 CTTv Promega 1997 CSF1PO, TH01, TPOX,

5 Profiler Plus PE Applied Biosystem 1997

D3S1358, vWA, FGA, Amel, D8S1179, D21S11, D13S317, D5S818, D7S820

D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, vWA, D8S1179, TPOX, FGA, Penta E

• Ví dụ về một số locut STR đ ợc sử dụng trong nghiên

cứu huyết thống của ng ời:

 F13A: tên khác FXIIIA01, chứa 7 đoạn lặp lại và đơn vị lăp lại là

[AAAG]

• Mồi xuôi: 5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ - GAGGTTGCACTCCAGCCTTT-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• Mồi ng ợc: 5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’- ATGCCATGCAGATTAGAAA- 3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

 FES : tên khác FPS, có 11đoạn lặp lại, đơn vị lặp là [AAAT] với

sợi trên và [ATTT] với sợi d ới

• Mồi xuôi: 5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ - GGGATTTCCCTATGGATTGG-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• Mồi ng ợc: 5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ - GCGAAAGAATGAGACTACAT-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

 vWA: tên khác VWF, VWA31A, có 18 (20) đoạn lặp, đơn vị lặp

lại là [AGAT] với sợi d ới, [TCTA] với những trình tự xen,

[TCTG] và [TCCA] với sợi trên

• Mồi xuôi: 5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ – CCCTAGTGGATAGAATAATC-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

• Mồi ng ợc:

5’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’ – GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG-3’-AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG-3’

Tế bào có 1 nhân chứa hầu nh

toàn bộ AND của

tế bào

Tế bào có nhiều (1000) ty thể chứa 5-10 phân tử ADN dạng vòng giống hệt nhau

Phân tích

1.4.Xác định quan hệ huyết thống

qua giám định ADN ty thể

ADN ty thể

- Có vài trăm đến vài nghìn ty thể trong 1 tế bào

- Mỗi ty thể chứa vài phân tử ADN

- Tất cả các phân tử ADN ty thể trong 1 cơ thể đều hoàn toàn đồng nhất

- ADN ty thể có mạch vòng với 16.569 cặp nucleotide, mã hoá cho 13 polypeptide của quá trình hô hấp.

Các đặc điểm của ADN

+ ADN ty thể rất bảo thủ, ít biến động theo thời gian

 có thể đ ợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá các tộc ng ời

+ Mặt khác, có 2 vùng siêu biến động

HV1: 342 bp (vị trí 16024 - 16365)

HV2: 268 bp (vị trí 73 - 340)

- biến động giữa các phả hệ (theo dòng mẹ)

- hầu nh không biến động trong 1 phả hệ

 có thể đ ợc sử dụng trong phân tích phả hệ

II.S¶n xuÊt c¸c chÊt phßng

2.1.Kü thuËt gen trong s¶n

xuÊt vacxin

2.1.1 Khái niệm

không độc có trong tự nhiên hoặc các dòng

gây bệnh yếu đ ợc tạo ra do nuôi cấy nhân tạo liên tục nhiều thế hệ

xử lý các tác nhân hoá, lý khác nhau

ợc sản xuất thông qua công nghệ AND tái tổ hợp