LUAN VAN NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NÉN METHYLPREDNISOLON 16MG SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

Định lượng methylprednisolon trong dịch sinh học Đặc thù của nghiên cứu SKD và TĐSH là mẫu phức tạp, lẫn nhiều tạpchất, nồng độ dược chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên các

ĐỖ QUỲNH NGÂN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

VIÊN NÉN METHYLPREDNISOLON 16MG

SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019

ĐỖ QUỲNH NGÂN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

VIÊN NÉN METHYLPREDNISOLON 16MG

SẢN XUẤT TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc

Mã số: 872.02.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Tạ Mạnh Hùng

2 PGS.TS Trịnh Nam Trung

HÀ NỘI - 2019

thành tới thầy giáo TS Tạ Mạnh Hùng và PGS.TS Trịnh Nam Trung đã

tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luậnvăn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc

TW, các anh chị đồng nghiệp công tác tại Trung tâm đánh giá Tương đươngsinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy cô đãdạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn luôn ủng hộ, độngviên tôi trong thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

DS Đỗ Quỳnh Ngân

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ METHYLPREDNISOLON 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý 3

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học 3

1.1.3 Định lượng methylprednisolon trong dịch sinh học 5

1.2 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC 8

1.2.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học 8

1.2.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 8

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học trên thế giới và ở Việt Nam 10

1.2.4 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

12

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 20

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 20

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Đánh giá chất lượng của thuốc thử 22

2.2.4 Đánh giá tương đương in vivo viên nén MPN 16mg 27

2.2.5 Xử lý số liệu 33

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CỦA THUỐC THỬ 34

3.1.1 Tính chất 34

3.1.2 Độ đồng đều khối lượng 34

3.1.3 Định tính 35

3.1.4 Tạp chất liên quan 35

3.1.5 Thử hòa tan 35

3.1.6 Định lượng 36

3.2. SO SÁNH ĐỘ HOÀ TAN IN VITRO 36

3.2.1 So sánh độ hoà tan in vitro ở pH 1,2 36

3.2.2 So sánh độ hoà tan in vitro ở pH 4,5 38

3.2.3 So sánh độ hoà tan in vitro ở pH 6,8 40

3.3. KẾT QUẢ THỬ TƯƠNG ĐƯƠNG IN VIVO 41

3.3.1 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS để định lượng MPN trong huyết tương 41

3.3.2 Đánh giá tương đương in vivo viên nén MPN 16mg 48

PHẦN 4 BÀN LUẬN 65

4.1 BÀN LUẬN 65

4.1.3 Về kết quả thử tương đương in vivo viên nén MPN 16mg 68

4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

2 AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian

3 BCS Biopharmaceutics Classification System

(Hệ thống phân loại sinh dược học)

4 Cmax Nồng độ dược chất tối đa trong máu

5 CV Coefficient of variation

(Hệ số biến thiên)

7 FDA Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ)

8 GCP Good clinical practice (Thực hành lâm sàng tốt)

9 GLP Good laboratory practice

22 Tmax Thời gian đạt được nồng độ dược chất tối đa trong

máu

24 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới)

nghiên cứu SKD, TĐSH đơn liều 42.1 Trình tự uống thuốc trong nghiên cứu đánh giá TĐSH 273.1 Kết quả kiểm tra độ đồng đều khối lượng thuốc thử 323.2 Kết quả thử hoà tan thuốc thử và thuốc chứng ở pH 1,2 363.3 Kết quả thử hoà tan thuốc thử và thuốc chứng ở pH 4,5 393.4 Kết quả thử hoà tan thuốc thử và thuốc chứng ở pH 6,8 403.5 Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng Rt của MP và

3.13 Nồng độ MPN trong huyết tương của NTN sau khi uống liều

đơn thuốc thử (T) viên nén MPN 16mg

54

3.14 Nồng độ MPN trong huyết tương của NTN sau khi uống liều

đơn thuốc đối chứng (R) Medrol® 16mg

56

3.15 Các thông số dược động học sau khi uống liều đơn MPN

16mg thuốc thử và thuốc chứng

58

3.16 Hằng số tốc độ thải trừ và thời gian bán thải của NTN sau

khi uống liều đơn MPN 16mg thuốc thử và thuốc chứng

59

3.17 Thống kê mô tả một số thông số dược động học 603.18 Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[Cmax] 603.19 Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[AUC0-] 623.20 So sánh giá trị Tmax theo phương pháp thống kê không tham

số

63

3.1 Đồ thị hàm lượng MPN (%) giải phóng theo thời gian của

mô hình bệnh tật tại Việt Nam Nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩmnên số người dân mắc các bệnh về khớp, dị ứng chiếm tỷ lệ cao.

Methylprednisolon được sản xuất dưới nhiều dạng bào chế, ngoài cácthuốc bột đông khô pha tiêm, viên nén 4 mg, còn có chế phẩm 16 mg Hiệnnay tại thị trường Việt Nam rất đa dạng số đăng kí các chế phẩm: viên nénmethylprednisolon hàm lượng 4 mg, 16 mg do các doanh nghiệp dược ViệtNam, Ấn độ, Hàn Quốc sản xuất

Đa số các chế phẩm viên nén đang lưu hành trên thị trường Việt Namđều chưa có các nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH với thuốc đối chứng Dovậy, cần thiết phải thực hiện các nghiên cứu so sánh SKD, TĐSH các thuốcnày để nâng cao chất lượng thuốc sản xuất và lưu hành trên thị trường ViệtNam, thực hiện sản xuất và cung ứng các thuốc có chất lượng, an toàn, hiệuquả với giá thành phù hợp tới tay người bệnh nhằm thực hiện chính sánh quốcgia về thuốc Đánh giá này cũng là cơ sở cho việc lựa chọn thuốc thay thế hayhiệu chỉnh liều dùng cho bác sĩ thực hành trên lâm sàng cũng như giúp hộiđồng thuốc lựa chọn được loại thuốc phù hợp nhằm đảm bảo nguyên tắc dùngthuốc: An toàn, hiệu quả và kinh tế

Medrol là thuốc gốc (brand name) nên có chi phí điều trị cao đối vớibệnh nhân cũng như hệ thống chi trả bảo hiểm các nước đang phát triển nhưViệt Nam Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các thuốc generic (các dượcphẩm có chứa các hoạt chất không còn được bảo hộ sở hữu trí tuệ, sở hữubằng phát minh do các công ty không sở hữu bằng phát minh sản xuất) manglại rất nhiều lợi ích cho bệnh nhân với mục đích tiết kiệm chi phí điều trị Tuynhiên, để chứng minh hiệu quả trị liệu và mức độ an toàn tương đương vớibiệt dược gốc, và tuân thủ hướng dẫn đăng ký thuốc mới, thì việc nghiên cứutương đương sinh học là bắt buộc đối với chế phẩm viên nén chứa hoạt chấtMethylprednisolon.

Từ những vấn đề trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học của viên nén Methylprednisolon 16 mg sản xuất tại Việt Nam” nhằm mục tiêu chứng minh hiệu quả điều trị của

thuốc generic do công ty dược trong nước sản xuất, góp phần chăm sóc sứckhỏe và giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xây dựng phương pháp định lượng methylprednisolon trong dịch sinh học

và đánh giá chất lượng viên nén methylprednisolon theo Dược điển ViệtNam V

2 Đánh giá tương đương sinh học của viên nén methylprednisolon so vớithuốc đối chiếu Medrol®

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ METHYLPREDNISOLON

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Methylprednisolon

 Mảnh khối phổ (m/z): 375,4 (ion phân tử, mảnh mẹ); 160,8 (mảnh phổcon) [17]

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học

1.1.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng

MPN có tác dụng trên chuyển hóa glucid, protid, lipid và chuyển hóamuối nước Tác dụng trên các cơ quan và tuyến, thần kinh trung ương, tiêuhóa, trên máu và tổ chức hạt

Tác dụng chính là tác dụng chống viêm và chống dị ứng:

 Tác dụng chống viêm: Do thuốc ức chế phospholipase A2 thông qua kíchthích tổng hợp lipocortin, làm giảm tổng hợp cả leucotrien và

prostaglandin Ngoài ra nó còn có tác dụng ức chế dòng bạch cầu đơnnhân, đa nhân, lympho bào đi vào mô để gây khởi phát phản ứng viêm Vìvậy thuốc có tác dụng chống viêm do mọi nguyên nhân (cơ học, hóa học,miễn dịch và nhiễm khuẩn).

 Tác dụng chống dị ứng: Thuốc ức chế phospholipase C (là chất xúc táccho quá trình giải phóng ra các chất trung gian của phản ứng dị ứng nhưhistamin ) do đó làm giảm giải phóng các chất trung gian hoá học gây dịứng Vì vậy thuốc có tác dụng chống dị ứng [10]

1.1.2.2 Chỉ định và chống chỉ định

Chỉ định: Chống viêm và giảm miễn dịch trong viêm khớp dạng thấp,

lupus ban đỏ toàn thân, viêm mạch, viêm đại tràng mạn [3]

Chống chỉ định và thận trọng: Nhiễm khuẩn nặng, trừ sốc nhiễm khuẩn

và lao màng não; nhiễm nấm hoặc lao, virus; đang dùng vaccin virus sống,loét dạ dày, tá tràng, đái tháo đường, rối loạn tâm thần, tăng huyết áp [3]

Bảng 1.1 Một số thông số dược động học của MPN trong một số

nghiên cứu SKD, TĐSH đơn liều

Tài

liệu

Dạng thuốc, cách dùng Cmax (ng/

ml)

Tmax (h)

AUC 0-∞

(ng/ml.h) T1/2

(h)

[22] Viên nén thường 8 mg, dùng 1 liều duy

1.1.3 Định lượng methylprednisolon trong dịch sinh học

Đặc thù của nghiên cứu SKD và TĐSH là mẫu phức tạp, lẫn nhiều tạpchất, nồng độ dược chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên cácphương pháp phân tích methylprednisolon trong dịch sinh học có các yêu cầu

cơ bản sau:

 Tính đặc hiệu cao: Phân biệt được methylprednisolon với các tạp chất lẫntrong mẫu và các chất có công thức gần giống với methylprednisolon Nênyêu cầu phương pháp xử lý mẫu phải loại được hầu hết các tạp chất, độtinh sạch cao nhưng cần đơn giản, dễ thực hiện và tốn ít thời gian do lượngmẫu trong các nghiên cứu SKD và TĐSH là rất lớn

 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) thấp: Khoảng liều dùng củamethylprednisolon viên nén là 4 - 48 mg mỗi ngày Nồng độ thuốc MPNtrong dịch sinh học thấp cần phương pháp có độ nhạy khoảng 2 - 3 ng/ml(1/20 Cmax)

 Thời gian phân tích mẫu ngắn: Số lượng mẫu phân tích trong đánh giáTĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnh hưởng tới kếtquả phân tích

 Độ nhạy: Phương pháp phân tích methylprednisolon trong dịch sinh họccần có độ nhạy khoảng 2-3 ng/ml (1/20 Cmax) để đảm bảo giá trị AUC0-t >80% AUC0-∞ Do vậy dựa vào liều dùng và nồng độ Cmax khoảng nồng độxác định định lượng cần thiết là 2,5 – 500 ng/ml.

Trước đây đã có một số phương pháp định lượng methylprednisolontrong huyết tương được công bố, tuy nhiên các phương pháp này còn một sốhạn chế về thời gian phân tích dài và giới hạn định lượng dưới (LLOQ) và độnhạy

Tác giả Ursula Geister và cộng sự [22] đã xây dựng phương phápHPLC-UV để định lượng MPN trong huyết tương Phương pháp này có ưuđiểm là đơn giản, dễ thực hiện trong các phòng thí nghiệm thiết bị phân tíchđơn giản và rẻ hơn so với thiết bị MS Giới hạn định lượng 2,5 ng/ml và độđúng từ 96,1% – 103,5% đạt yêu cầu cơ bản đối với phương pháp phân tíchthuốc trong dịch sinh học Tuy nhiên, thời gian phân tích dài 13 phút nên khó

áp dụng phương pháp này để phân tích lượng mẫu lớn trong các nghiên cứuđánh giá TĐSH và SKD

Phương pháp HPLC – UV của Al-Habet và các cộng sự (nghiên cứu tạiAnh) [12] sử dụng detector UV = 254 nm có ưu điểm là thiết bị phân tích phổbiến có thể áp dụng ở nhiều cơ sở phân tích Tuy nhiên phương pháp này cónhược điểm là thời gian phân tích dài (trên 8,5 phút) và giới hạn định lượng(LLOQ) cao 25 ng/ml, độ nhạy 10 ng/ml, không phù hợp với việc phân tíchđịnh lượng methylprednisolon trong mẫu huyết tương thử TĐSH với liều thấp

4, 8, 16 mg

Trong nghiên cứu phân tích methylprednisolon trong huyết tương bằngphương pháp LC/MS/MS của Sridhar Siddiraju và các cộng sự [20] (nghiêncứu tại Ấn độ) có ưu điểm thời gian phân tích mẫu ngắn 2,8 phút nhưng

LLOQ = 10,1 ng/ml chưa phù hợp với các nghiên cứu SKD và TĐSH trên cácchế phẩm hàm lượng thấp Tương tự đối với phương pháp LC/MS/MS củaShuang-Qing Zhang và các cộng sự [23] có LLOQ là 20 ng/ml chưa thích hợp

để phân tích các mẫu cần độ nhạy thấp như đối với các mẫu TĐSH của viênnén MPN cần độ nhạy khoảng 2-3 ng/ml, thời gian phân tích mẫu là 4 phútcòn tương đối dài Phương pháp LC/MS/MS của Xingjiang Hu và các cộng sự[17] (nghiên cứu tại Trung Quốc) có độ thu hồi khá cao và ổn định Tuy nhiênphương pháp này cũng có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là 5,25 ng/ml lại

xử lý mẫu bằng cách tủa protein sau đó chiết pha rắn, thời gian xử lý mẫu vàthời gian phân tích mẫu 5,5 phút là tương đối dài đối với việc phân tíchnghiên cứu các mẫu TĐSH

Mới đây nhất Tạ Mạnh Hùng và cộng sự [11] đã nghiên cứu định lượngmethylprednisolon trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng – khốiphổ sử dụng chất chuẩn nội prednisolon; điều kiện sắc ký: C18 (100 x 2,1mm; 1,9 μm), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amonim), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amoniacetat 2 mM (90: 10), tốc độ dòng 0,35 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 5μm), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amonil, nhiệt

độ autosampler 20C; điều kiện khối phổ: kiểu khối phổ MS/MS, nguồn ionhóa HESI(+), thế mảnh 20 V với methylprednisolon và 23 V với prednisolon;chiết tách methylprednisolon từ huyết tương người bằng phương pháp chiếtlỏng – lỏng sử dụng dung môi tert-butyl methyl ether Phương pháp này cógiới hạn định lượng dưới nhỏ (2,5 ng/ml), khoảng nồng độ tuyến tính rộng(2,5 – 500,0 ng/ml), độ đúng cao (giá trị trung bình từ 91,7% - 118,9%); độlặp tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 10%), tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao và ổn định(96,6% - 111,3% ở ba khoảng nồng độ), và methylprednisolon ổn định trongcác điều kiện bảo quản khác nhau (5 giờ ở nhiệt độ phòng, 44 giờ trongautosampler, sau 3 vòng đông rã và 103 ngày ở nhiệt độ -40C)

Do vậy chúng tôi lựa chọn sử dụng phương pháp sắc ký lỏng – khốiphổ để định lượng methylprednisolon trong dịch sinh học trong đánh giátương đương sinh học của viên nén methylprednisolon 16mg.

1.2 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.2.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học

Theo cơ quan quản lý dược và thực phẩm của Mỹ (FDA), sinh khả dụng là tốc độ và mức độ dược chất hoặc chất chuyển hóa của dược chất có

tác dụng điều trị được hấp thu và trở nên sẵn sàng phát huy vai trò sinh học tạinơi tác dụng [18] Tuy nhiên để đánh giá nồng độ dược chất hoặc chấtchuyển hóa ở cơ quan đích rất khó khăn và không thể thực hiện được với

nhiều thuốc nên người ta chấp nhận định nghĩa sau về sinh khả dụng: Sinh khả dụng là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một chế

phẩm bào chế vào tuần hoàn chung một cách nguyên vẹn và đưa đến nơi tácdụng Trong đó, mức độ hấp thu được biểu thị bằng diện tích dưới đườngcong nồng độ - thời gian (AUC) và nồng độ thuốc tối đa (Cmax); tốc độ hấp thuđược xác định bằng thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa (Tmax)

Theo FDA, tương đương sinh học được định nghĩa là không có sự khác

biệt đáng kể về tốc độ và mức độ mà thành phần có hoạt tính trong các chếphẩm tương đương bào chế hoặc thế phẩm bào chế có sẵn tại nơi tác dụng khidùng cùng liều mol trong cùng điều kiện thử nghiệm [18] Hay nói cách khác

tương đương sinh học là khái niệm dùng để chỉ hai hay nhiều chế phẩm tương

đương bào chế có sinh khả dụng tương tự nhau trong cùng điều kiện thửnghiệm Nghĩa là ở cùng điều kiện thử nghiệm, các chế phẩm này phải có cácthông số dược động học AUC, Cmax và Tmax như nhau

1.2.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Để đánh giá sinh khả dụng của thuốc, người ta dùng sinh khả dụng invitro và sinh khả dụng in vivo Sinh khả dụng in vitro đánh giá giai đoạn giảiphóng, hòa tan của dược chất từ dạng thuốc [6] Do mới chỉ đánh giá giaiđoạn đầu tiên (giải phóng, hòa tan) của quá trình sinh dược học nên sinh khảdụng in vitro chưa phải là sinh khả dụng thực sự Sinh khả dụng in vivo đánhgiá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào chế vào tuần hoàn chung

Khi phân tích đồ thị nồng độ thuốc trong máu để đánh giá sinh khảdụng in vivo người ta thường xem xét 3 thông số dược động học: diện tíchdưới đường cong (AUC) biểu thị mức độ hấp thu của dược chất từ chế phẩm;nồng độ cực đại (Cmax) và thời gian đạt nồng độ cực đại (tmax) [6]

Đánh giá tương đương sinh học là so sánh khả năng sinh học của chếphẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu trong cùng điều kiện thử Mộtnghiên cứu tương đương sinh học về cơ bản là nghiên cứu sinh khả dụng sosánh được thiết kế để thiết lập sự tương đương của thuốc thử với thuốc đốichứng

Có hai phương pháp đánh giá tương đương sinh học:

 Đánh giá tương đương sinh học in vitro: thường dùng phép thử độ hòatan, so sánh tốc độ và mức độ hòa tan hoạt chất của thuốc thử với thuốcđối chứng

 Đánh giá tương đương sinh học in vivo: So sánh một số thông số dượcđộng học hoặc hiệu quả sinh học trên cơ thể sống, có thể thực hiện trênngười tình nguyện hoặc trên động vật thí nghiệm

Tuy nhiên, FDA Hoa Kỳ yêu cầu phải tiến hành thử nghiệm bằng cách sửdụng phương pháp tiếp cận chính xác, nhạy cảm và có khả năng tái lập caonhất [18] Do đó, các phương pháp sau đây được đề xuất để đánh giá tươngđương sinh học với thứ tự ưu tiên giảm dần như sau:

(a) Nghiên cứu so sánh dược động học

(b) Nghiên cứu so sánh dược lực học

(c) Thử nghiệm so sánh lâm sàng

(d) Thử nghiệm so sánh in vitro

(e) Bất kỳ phương pháp nào khác được FDA cho là phù hợp

Kinh nghiệm cho thấy nghiên cứu dược động học so sánh chủ yếu được

sử dụng đánh giá tương đương sinh học cho các thuốc hấp thu vào tuần hoànchung trong khi các nghiên cứu dược lực học và thử nghiệm lâm sàng thườngđược sử dụng cho các thuốc tác dụng tại chỗ [18] Trước đây, các nghiên cứu

in vitro hiếm khi được sử dụng đơn độc để xác định tương đương sinh họcngoại trừ một số trường hợp đặc biệt:

 Thuốc được phê duyệt trước năm 1962 và được xác định là thuốc khôngđộc, hoặc

 Có bằng chứng khoa học cho thấy rằng dữ liệu thử nghiệm in vitro tươngquan với kết quả in vivo

Tuy nhiên, với những tiến bộ gần đây trong khoa học và công nghệhiện đại, các nghiên cứu so sánh in vitro đã bắt đầu có vai trò quan trọng hơntrong việc chứng minh tương đương sinh học cho một số chế phẩm nhất định

Đó là các thuốc chứa dược chất thuộc nhóm I trong hệ thống phân loại sinhhọc (BCS) (hòa tan cao và có khả năng thấm cao) được bào chế dưới dạngthuốc giải phóng ngay Ngoài ra một số phương pháp in vitro như cấy tế bàobiểu mô in vitro, có thể được sử dụng để xác định khả năng thấm của từngloại thuốc [18]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương

sinh học trên thế giới và ở Việt Nam

Ở các nước phát triển và một số nước đang phát triển việc đánh giá sinhkhả dụng và tương đương sinh học rất phổ biến, vì kết quả nghiên cứu sinhkhả dụng và tương đương sinh học là một trong những nội dung cần có trong

hồ sơ đăng ký cấp phép sản xuất và lưu hành thuốc Từ năm 1977, cơ quanquản lý thuốc và thực phẩm Mỹ đã ban hành quy chế về sinh khả dụng vàtương đương sinh học của thuốc [18], trong đó quy định:

 Những chế phẩm bắt buộc phải có hồ sơ đánh giá sinh khả dụng và tươngđương sinh học khi đăng ký xin phép lưu hành

 Những trường hợp được miễn thử tương đương sinh học

 Hướng dẫn về thực hành tương đương sinh học và các tiêu chuẩn đánh giá

Hiện nay các nước trên thế giới như Mỹ, các nước Châu Âu, Nhật Bản,Brazil, Australia, Canada…và trong khu vực như Thái Lan, Singapore,Philipin, Malaysia…đều có quy chế đánh giá sinh khả dụng và tương đươngsinh học Trong những năm gần đây, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cũng đãxây dựng các hướng dẫn cho nghiên cứu sinh khả dụng và đánh giá tươngđương sinh học Hiện nay ASEAN cũng có hướng dẫn về thực hiện nghiêncứu Sinh khả dụng và tương đương sinh học Theo hướng dẫn của ASEAN,cần thực hiện đánh giá tương đương sinh học in vivo khi có nguy cơ khácnhau về sinh khả dụng có thể dẫn đến không tương đương trị liệu [4], cụ thể:

 Thuốc uống giải phóng nhanh có tác dụng toàn thân: Miễn thử TĐSH vớithuốc chứa dược chất trong nhóm I theo phân loại sinh dược học (tan tốt,thấm tốt)

 Dạng giải phóng nhanh không dùng đường uống có tác dụng toàn thân

 Các dạng thuốc hấp thu qua da và dạng phóng thích biến đổi

 Các chế phẩm phối hợp với tỷ lệ cố định

 Dung dịch tiêm: miễn thử TĐSH cho dạng dung dịch thuốc tiêm nước

 Các sản phẩm dùng tại chỗ

Nhận thức được tầm quan trọng của đánh giá sinh khả dụng và tươngđương sinh học, trong những năm gần đây Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành cácquy định liên quan đến việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh họcnhư:

 Hướng dẫn thực hành tốt thử thuốc trên lâm sàng, ban hành kèm theo

Quyết định số 799/2008/QĐ-BYT ngày 07 tháng 03 năm 2008 của Bộtrưởng Bộ Y tế [9]

 Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học trong đăng ký thuốc, thông tư 08/2010/TT/BYT ban hành ngày 26/04/2010 [8] Tuy nhiên nội dung của thông tư còn khá ngắn gọn, đơn

giản Bộ Y tế đang tổ chức soạn thảo lại thông tư này và xin ý kiến cácchuyên gia qua các bản dự thảo lần 1, lần 2 và lần 3

 Hướng dẫn về thử thuốc trên lâm sàng, thông tư 03/2012/TT/BYT ban

và tương đương sinh học tại Việt Nam đều tuân theo các hướng dẫn chungASEAN

Đáp ứng các yêu cầu pháp lý của nhà nước trong đánh giá tương đươngsinh học, các trung tâm kiểm nghiệm, viện nghiên cứu và trường đại học cũng

đã có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này Các hoạt chất đã được nghiên cứu

đánh giá tương đương sinh học trong mười năm trở lại đây là: amoxicilin,cephalexin, cefixim, azithromycin, diclofenac, ranitidin, theophylin, kaliclorid, glucofin, gliclazid, amlodipin, metformin, atenolol.

1.2.4 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

1.2.4.1 Các nguyên tắc chung

a) Các thuốc generic có tác dụng toàn thân thì thiết kế nghiên cứu đánh giá

tương đương sinh học phải đơn liều, thực hiện trên người tình nguyện khỏe mạnh, dựa trên sự so sánh các thông số dược động học của dược chất có trong thuốc (còn gọi là chất mẹ) được hấp thu vào tuần hoàn

chung

b) Chỉ được thử trên người tình nguyện là bệnh nhân trong trường hợp thuốcchứa dược chất có tác dụng rất mạnh hoặc rất độc ngay cả khi sử dụng ởliều thấp hơn liều cao nhất trên người tình nguyện khỏe mạnh, gây ảnhhưởng dược lý nghiêm trọng trên người tình nguyện khỏe mạnh

c) Chỉ chấp nhận báo cáo nghiên cứu tương đương sinh học với thiết kế

nghiên cứu đa liều thay thế cho thiết kế nghiên cứu đơn liều đối với một

trong các trường hợp sau:

 Khi không thể tiến hành nghiên cứu trên người tình nguyện khỏe mạnhnhư đã nêu

 Khi độ nhạy của các kỹ thuật phân tích trong dịch sinh học hiện tạikhông cho phép đo được chính xác nồng độ thuốc trong dịch sinh họcsau khi dùng một liều đơn trong khi lại có thể đo được nồng độ thuốctrong dịch sinh học ở trạng thái ổn định sau khi dùng đa liều

d) Chỉ chấp nhận nghiên cứu tương đương sinh học dựa trên so sánh các thông số dược động học của chất chuyển hoá đối với một trong các

trường hợp sau:

 Dược chất có trong thuốc (chất mẹ) là chất không có hoạt tính trước khiđược chuyển hoá thành chất có hoạt tính trong cơ thể và nồng độ chất

mẹ trong dịch sinh học thấp và bị thải trừ rất nhanh gây khó khăn trongviệc chứng minh tương đương sinh học dựa vào các thông số dượcđộng học của chất mẹ Trong trường hợp này chấp nhận đánh giá tươngđương sinh học dựa trên các thông số đo được từ chất chuyển hoá cóhoạt tính chính

 Khi độ nhạy của các kỹ thuật phân tích trong dịch sinh học hiện tạikhông cho phép đo được chính xác nồng độ của chất mẹ trong dịch sinhhọc ngay cả khi nếu lựa chọn thực hiện nghiên cứu trên một liều caohơn một liều đơn, nhưng lại có thể đo được chính xác nồng độ chấtchuyển hoá

e) Chỉ chấp nhận nghiên cứu tương đương sinh học sử dụng số liệu nồng độthuốc thải trừ qua nước tiểu thay thế cho nồng độ thuốc trong máu để xácđịnh mức độ hấp thu thuốc vào tuần hoàn chung khi không có khả năng đođược chính xác nồng độ thuốc hấp thu theo thời gian, và đã có các số liệunghiên cứu chứng minh sự thải trừ của thuốc qua nước tiểu phản ánh đượcmức độ hấp thu thuốc vào tuần hoàn chung

f) Chỉ chấp nhận sử dụng nghiên cứu tương đương khác thay thế báo cáo cáonghiên cứu tương đương sinh học để thiết lập tương đương điều trị giữathuốc generic và thuốc đối chứng khi các kỹ thuật phân tích hiện tại không

đủ độ nhạy và độ chính xác để xác định được chính xác nồng độ thuốc và/hoặc chất chuyển hóa trong dịch sinh học (máu, huyết thanh, huyết tươnghoặc nước tiểu)

g) Báo cáo nghiên cứu tương đương sinh học của các thuốc phối hợp cố địnhliều phải thiết lập được tương đương sinh học của tất cả các thành phầndược chất có trong thuốc.

h) Nghiên cứu tương đương sinh học cần được thiết kế và thực hiện tuân thủ các nguyên tắc về thực hành tốt lâm sàng (GCP), trong đó pha phân tích của nghiên cứu phải được thực hiện tuân thủ các nguyên tắc thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP) áp dụng cho phân tích dịch sinh học.

1.2.4.2 Quy định về thuốc thử nghiệm và thuốc đối chứng

 Thuốc đối chứng là thuốc biệt dược gốc với đầy đủ các số liệu đã được

thiết lập về chất lượng, an toàn và hiệu quả, đã được cấp phép và đangđược lưu hành tại Việt Nam, có trong danh mục các thuốc đối chứng đãđược cấp số đăng ký tại Việt Nam do Bộ Y tế ban hành [4]

 Thuốc thử nghiệm phải được sản xuất theo các quy định GMP Với dạng

thuốc rắn dùng đường uống, thuốc thử thường được lấy từ lô nghiên cứusản xuất công nghiệp với cỡ lô ít nhất bằng 1/10 quy mô sản xuất hoặc100.000 đơn vị [4]

1.2.4.3 Thiết kế nghiên cứu

Trong đánh giá tương đương sinh học, để hạn chế ảnh hưởng của yếu tố

cá thể, thường áp dụng thiết kế nghiên cứu chéo, 2 chế phẩm, 2 trình tự, 2 giaiđoạn

Theo nguyên tắc chung, nghiên cứu tương đương sinh học được thựchiện theo mô hình đơn liều Đối với viên nén methylprednisolon 16mg, FDAhướng dẫn sử dụng đơn liều, chéo đôi [15]

1.2.4.4 Người tình nguyện

Người tình nguyện trong các nghiên cứu tương đương sinh học đượcchọn sao cho có thể hạn chế đến mức tối thiểu sự biến thiên và cho phép phát

hiện được sự khác biệt giữa các dược phẩm [4] Nói chung nên chọn ngườitình nguyện là nam giới, khỏe mạnh, trong độ tuổi từ 18-55, có cân nặngtrong khoảng trung bình tính theo bảng giá trị BMI với người châu Á là 18-25[4].

Người tình nguyện cần được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh

và các xét nghiệm toàn diện Để giảm thiểu ảnh hưởng của các yếu tố khácngoài mẫu thuốc thử nghiệm, chế độ ăn, uống và hoạt động thể lực của ngườitình nguyện cần được tiêu chuẩn hóa [4]

1.2.4.5 Thời điểm lấy mẫu

Thiết kế thời điểm lấy mẫu có ý nghĩa quan trọng để thu được đườngcong SKD đáp ứng yêu cầu Đường cong SKD phải thể hiện rõ pha hấp thu vàpha thải trừ Với hầu hết các thuốc, chỉ lấy 12-18 mẫu là đủ, ví dụ 1 điểm lúcthời gian bằng 0, 2 điểm trước Cmax, 4-5 điểm xung quanh Cmax, và 7-8 điểmtrong pha thải trừ Tuy nhiên khi thời gian bán thải của thuốc quá dài, nên lấymẫu máu ít nhất 72 giờ [4]

1.2.4.6 Tiêu chuẩn đánh giá tương đương sinh học

Các thông số dược động học cơ bản:

 Cmax và Tmax thu được trực tiếp từ kết quả thí nghiệm

 AUC0-t (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang, với t là thờiđiểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được

 AUC 0−∞ (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0đến vô cùng) được tính theo công thức:

AUC 0−∞=AUC 0−t+C m/ ❑z

Trong đó: Cm là nồng độ thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng

z là hằng số tốc độ thải trừ

z được tính bằng hệ số góc đường hồi quy giữ lg[nồng độ] và thờigian.

Tiêu chuẩn đánh giá tương đương sinh học

Trong các nghiên cứu xác định tương đương sinh học phải sử dụngphương pháp thống kê để xác định khoảng tin cậy 90% của các tỷ lệ giá trịtrung bình thuốc thử/ thuốc đối chứng với các thông số cần quan tâm

Khoảng chấp nhận cho các thông số chính như sau:

 Tỷ lệ AUC: khoảng tin cậy 90% trong khoảng 0,80 – 1,25 Với cácthuốc có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận này có thể phải hẹphơn [4]

 Tỷ lệ Cmax: Khoảng tin cậy 90% trong khoảng 0,80 – 1,25 Với cácthuốc có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận này có thể phải hẹphơn [4]

Các thông số khác như tmax chỉ yêu cầu với thuốc giải phóng nhanh,hoặc liên quan đến hiệu quả phụ

1.2.4.7 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương phápđánh giá sinh khả dụng trực tiếp và chính xác nhất Mẫu sinh học thường cónhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ chất phân tích thường rất thấp Dovậy phương pháp phân tích trong dịch sinh học phải được thẩm định trước khi

áp dụng vào phân tích mẫu Mục đích của thẩm định phương pháp là chứngminh phương pháp có đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại tốt

Hiện nay ở Việt Nam, thẩm định phương pháp phân tích trong dịchsinh học được tiến hành theo US-FDA, EMA… và gồm các chỉ tiêu sau:

a) Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là khả năng phương pháp phân tích có thể nhận diện vàphân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu

Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích

và chuẩn nội (IS) khi:

 Trên sắc khí đồ mẫu chuẩn, các pic của chất phân tích và chuẩn nội phảiđược nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác (tỷ số tínhiệu/ nhiễu phải lớn hơn hoặc bằng 3)

 Tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng của từng mẫu LLOQ phảigấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng; tại thời điểm trùngvới thời gian lưu của chuẩn nội, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp

ít nhất 20 lần đáp ứng của pic trắng tương ứng

b) Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tíchhay chiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trongmột đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giátrị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính, có hệ số tương quan r  0,98(xác định bằng phương pháp bình phương tối thiểu) và phải đáp ứng các điềukiện sau:

 Độ đúng nằm trong khoảng 85-115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất củađường chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80-120%

 Ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn đạt tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu

có nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất của đường chuẩn

c) Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Mẫu tự tạo được coi là giới hạn định lượng dưới khi:

 Pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, tỷ số tín hiện/nhiễu lớn hơnhoặc bằng 3, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác.

 Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic củamẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng

 Nồng độ chất phân tích tính được từ đường chuẩn phải đạt từ 80-120% sovới nồng độ lý thuyết

d) Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ chất phân tích địnhlượng được so với nồng độ lý thuyết Độ chính xác phản ánh độ chụm giữacác kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng mộtmẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị hệ số biến thiên CV (%) Độchính xác bao gồm độ chính xác trong ngày và độ chính xác khác ngày

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 05 mức nồng độ khácnhau (LLOQ, LQC, SQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu

Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 – 115%; độchính xác trong ngày và giữa các ngày với giá trị CV  15% Riêng nồng độLLOQ cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 – 120% và giá trị CV  20%

e) Độ ổn định

Quá trình phân tích đánh giá tương đương sinh học thường kéo dài vì

số lượng mẫu lớn Do vậy phải đánh giá độ ổn định của hoạt chất cần phântích trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu dịch sinh học Cần xác định cácloại độ ổn định sau:

 Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông,

 Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng,

 Độ ổn định sau khi xử lý mẫu, chiết tách hoạt chất,

 Độ ổn định trong thời gian dài

Đánh giá độ ổn định trên các mẫu tự tạo Độ ổn định của hoạt chấtđược xác định bằng cách so sánh hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu huyếttương được phân tích ngay sau chuẩn bị so với hàm lượng hoạt chất có trongcác mẫu dịch sinh học tương ứng đã được bảo quản trong những điều kiện xácđịnh trước khi tiến hành phân tích.

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

a Chất chuẩn và nội chuẩn (IS):

 Methylprednisolon (MPN) chuẩn: Chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung ương – Bộ Y tế, hàm lượng 99,69% C22H30O5 (khan), độ ẩm0,15%; Số kiểm soát: 0104177

 Chất chuẩn nội: Chất chuẩn Prednisolon của Viện Kiểm nghiệm thuốcTrung ương – Bộ Y tế, hàm lượng 99,94% C21H28O5 (khan); độ ẩm 0,20% ;

Số kiểm soát: 0296024

b Dung môi, hóa chất:

 Terbutylmethylether, Methanol, Acetonitril, Amoni acetat đạt tiêu chuẩntinh khiết dùng cho phân tích hoặc sắc ký

 Các dung môi, hóa chất khác đều đạt tiêu chuẩn do các nguồn tin cậy cungcấp theo yêu cầu của thực nghiệm

c Huyết tương trắng

Huyết tương trắng không có methylprednisolon của Viện Huyết học vàtruyền máu Trung ương Số lô : 16P010698, 16P015518, 16P015539,16P015543, 16P015544, 16P015565, 16P014517, 16P014519

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

2.1.2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong phân tích

Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo qui định của ISO/IEC 17025-2005 và GLP, bao gồm:

 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS, model TSQ Quantum Ultra vớinguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt – HESI, Thermo FisherScientific;

 Thiết bị thử hòa tan 6 cốc, kết nối hệ thống tự động lấy mẫu và đoquang, ERWEKA;

 Cân phân tích Sartorius CP224S (d=0,1mg), Đức;

 Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2-16K, Đức;

 Thiết bị bay hơi dung môi Reacti-Therm III, Thermo scientific;

 Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific;

 Tủ lạnh sâu -35 ± 50C, Sanyo MDF-236, Nhật Bản;

 Tủ lạnh bảo quản chuẩn Haier, Trung Quốc ;

 Micropipet Eppendorf loại 10-100μm), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amonil, 100-1000μm), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amonil, 500-5000μm), nhiệt độ cột 400C, pha động Acetonitril - dung dịch amonil;

 Ống nghiệm lấy máu chứa EDTA

 Bình định mức, pipet thủy tinh class A, Đức

2.1.2.2 Dụng cụ, thiết bị dùng trong lâm sàng (xét nghiệm, lấy mẫu máu

NTN)

 Các xét nghiệm lâm sàng (sinh hóa, huyết học, nước tiểu, miễn dịch)tiến hành tại Công ty công nghệ xét nghiệm y học, 42 Nghĩa Dũng, HàNội hoặc Công ty TNHH Medelab Việt Nam, số 86-88 Nguyễn LươngBằng, Hà Nội

 Các dụng cụ lấy mẫu: kim luồn, bơm và kim tiêm vô khuẩn dùng 1 lần

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

VN-13806-Sản xuất bởi: Pfizer Italia Srl, Ý.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đánh giá chất lượng của thuốc thử

Thuốc thử được đánh giá về các chỉ tiêu chất lượng: tính chất, độ đồngđều khối lượng, định tính, tạp chất liên quan, độ hoà tan và định lượng

2.2.1.1 Tính chất: Quan sát bằng mắt thường để đánh giá về hình thức viên,

 Đo phổ hồng ngoại và so sánh với phổ chuẩn Methylprednisolon

 Hoà tan một lượng cắn tương ứng 5mg Methylprednisolon trong 2ml dungdịch acid sulfuric

2.2.1.4 Tạp chất liên quan: thử theo DĐVN V [2].

2.2.1.5 Độ hòa tan

Tiến hành thử hoà tan với các điều kiện như hướng dẫn của Dược điển

Mỹ USP 41 [21]:

 Thiết bị kiểu cánh khuấy

 Môi trường hòa tan: 900ml nước cất

 Tốc độ quay: 50 vòng/phút

 Thời gian: 30 phút

Định lượng MPN hoà tan bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc

ký dựa theo Dược điển Châu Âu 7.0 [14] :

Yêu cầu không ít hơn 70% lượng MPN so với lượng ghi trên nhãn đượchòa tan trong 30 phút

 Dung dịch chuẩn nội : Hoà tan lượng prednisolon trong dung dịch acid

acetic 3% trong cloroform để có nồng độ khoảng 0,2mg/ml

 Dung dịch thử : Hoà tan lượng Methylprednisolon chuẩn trong dung

dịch chuẩn nội để có nồng độ khoảng 0,2 mg/ml

 Dung dịch thử : Cân 20 viên, nghiền viên thành bột mịn Cân chính xác

môt lượng bột viên tương ứng 10mg MPN, thêm 2,5ml nước, lắc bình

để thu được dung dịch sền sệt, thêm 50ml dung dịch chuẩn nội, lắc 15phút, ly tâm nếu cần thiết, sử dụng phần dịch trong

 Tiến hành tiêm sắc ký dung dịch chuẩn :

 Độ phân giải giữa MPN và chất chuẩn nội  4,0

 Độ lệch chuẩn tương đối giữa các lần tiêm  2,0%

 Thời gian lưu tương đối của Prednisolon khoảng 0,7 ; MPN là1,0

 Tiến hành sắc ký dung dịch thử, dung dịch chuẩn

 Tính hàm lượng MPN (C22H30O5) dựa trên tỷ lệ diện tích pic MPN vàPrednisolon của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, độ pha loãng dungdịch chuẩn, dung dịch thử, hàm lượng chuẩn

X (%)= S t ×C × M C × f t × P× 100

S C × M t × f C ×a

Trong đó :

St ; SC : tỷ lệ diện tích pic trong mẫu thử và mẫu chuẩn

Mt ; MC : khối lượng cân mẫu thử và mẫu chuẩn

ft ; fc : hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

C : hàm lượng của chuẩn (%)

P : Khối lượng trung bình viên

a : Hàm lượng của hoạt chất ghi trên nhãn

Yêu cầu: hàm lượng MPN phải đạt từ 92,5-107,5% so với hàm lượng

ghi trên nhãn

2.2.2 So sánh độ hoà tan tương đương sinh học invitro

Tiến hành thử hoà tan thuốc thử và thuốc chứng ở các môi trường pHkhác nhau là 1,2 ; 4,5, 6,8 nhằm so sánh khả năng hoà tan của thuốc thử vàthuốc chứng trong điều kiện mô phỏng pH ở các vùng khác nhau của đườngtiêu hoá

Điều kiện thử hoà tan tương tự như mục 2.2.1.5, chỉ khác nhau về pHcủa môi trường hoà tan Số lượng viên được thử là 12 viên/ mẫu Tại mỗi pHkhác nhau, tiến hành lấy mẫu ở nhiều thời điểm cho tới khi hàm lượng dượcchất giải phóng đạt >85% Cụ thể :

Chỉ số f2 được tính theo công thức :

n là số điểm lấy mẫu.

R t và T t là tỷ lệ (%) dược chất giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu và mẫu thử.

Chỉ số f2 càng lớn thì hai đồ thị càng giống nhau

Chỉ số f1 được tính theo công thức:

j : số thứ tự điểm lấy mẫu

n : số điểm lấy mẫu

Rj và Tj là tỷ lệ (%) dược chất giải phóng của mẫu đối chiếu và mẫu thửtại thời điểm lấy mẫu thứ j

Theo FDA và EMA nếu f2  [50 ; 100] và f1  [0 ; 15] thì có thể coihai đồ thị giải phóng là tương đương nhau với yêu cầu cần có dữ liệu giảiphóng của ít nhất 12 đơn vị liều của các mẫu khảo sát khi tính f2 Chỉ số f1, f2được tính bằng phần mở rộng (Add-ins) Ddsolver 1.0 tích hợp với phần mềmMicrosoft Excel 2016

2.2.3 Thẩm định sự phù hợp của phương pháp LC-MS/MS để định

lượng MPN trong huyết tương

Tham khảo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hạnh [11] đểchọn ra quy trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký – khối phổ cho địnhlượng MPN trong huyết tương

Thẩm định độ phù hợp của phương pháp LC-MS/MS để định lượngMPN trong huyết tương người tình nguyện khi đánh giá tương đương sinhhọc

2.2.3.1 Thẩm định độ đặc hiệu chọn lọc của phương pháp

Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xác định trên 06mẫu huyết tương trắng và 06 mẫu tự tạo có chứa MPN ở nồng độ thấp củađường chuẩn và chuẩn nội Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic củamẫu trắng /mẫu chuẩn tại thời gian lưu của MPN và IS

2.2.3.2 Xây dựng đường chuẩn

Phân tích 6 – 8 mẫu chuẩn có nồng độ bao phủ khoảng tuyến tính đãxác định Ghi lại sắc ký đồ và tính tỷ lệ đáp ứng pic MPN/IS tại các nồng độtương ứng Xây dựng phương trình hồi qui giữa tỷ lệ đáp ứng pic MPN/IS vànồng độ MPN có trong mẫu sử dụng hệ số tỷ trọng (weighting factor) phùhợp Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ MPNđịnh lượng được với nồng độ thực

2.2.3.3 Thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Xác định độ đúng độ chính xác trong ngày bằng cách tiến hành phântích trong cùng một ngày trên 03 lô mẫu LQC (có nồng độ MPN bằng khoảng

3 lần LLOQ), MQC (có nồng độ MPN bằng khoảng 50% ULOQ), HQC (cónồng độ MPN bằng khoảng 80 – 90% ULOQ) Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 05mẫu độc lập Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Tính nồng độ MPN có trongcác mẫu dựa trên tỷ lệ đáp ứng pic MPN/IS và đường chuẩn được phân tíchcùng ngày Độ đúng được xác định bằng cách tính tỷ lệ % giữa nồng độ MPNđịnh lượng được so với nồng độ thực trong mẫu, độ chính xác được xác địnhbằng cách tính CV giữa nồng độ định lượng được của các lần phân tích trêncùng lô mẫu

Xác định độ đúng, độ chính xác khác ngày bằng cách tiến hành lặp lạitheo cách xác định độ đúng, độ chính xác trong ngày ít nhất 03 ngày phân tíchkhác nhau

2.2.4 Đánh giá tương đương in vivo viên nén MPN 16mg

2.2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, đơn liều, nhãn mở, 2 thuốc, 2 trình tự, 2giai đoạn Uống thuốc sau khi nhịn ăn ít nhất 10 giờ Thời gian nghỉ giữa 2giai đoạn là 08 ngày Nghiên cứu thực hiện trên 24 NTN

2.2.4.2 Người tình nguyện

Người tình nguyện (NTN) tham gia vào nghiên cứu phải đáp ứng tất cảcác tiêu chuẩn sau:

 Nam hoặc nữ, khỏe mạnh, đủ năng lực hành vi dân sự tuổi từ 18 – 45

 Chỉ số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 18,5 – 25,0 kg/

m2, theo cách tính chiều cao, cân nặng của Metropolitan Index 1983 chongười lớn

 Xét nghiệm HIV/AIDS, HbsAg âm tính (test nhanh hoặc phép thử điệnhóa quang ECLIA hoặc Elisa)

 Với nữ giới: Không có thai, không đang cho con bú, không dự định có thaihoặc hiến trứng trong vòng 1 tháng sau khi kết thúc nghiên cứu, không cókinh nguyệt trong ngày tuyển chọn và trong các ngày uống thuốc lấy mẫucủa 2 giai đoạn

 Các dấu hiệu sinh tồn nằm trong giới hạn bình thường: huyết áp tâm thutrong khoảng 90-140 mmHg, huyết áp tâm trương 60-90 mmHg, nhịp timtrong khoảng 60-100 lần/phút, nhịp thở trong khoảng 14-20 lần/phút, nhiệt

độ cơ thể trong khoảng 36,0 – 37,5C (đo bằng nhiệt kế điện tử tại trán)

 Các kết quả xét nghiệm nằm trong giới hạn bình thường hoặc nằm trongkhoảng sai lệch cho phép (khoảng chấp nhận) và được bác sĩ đánh giá làkhông có ý nghĩa lâm sàng

 Người tình nguyện không nghiện thuốc lá, rượu, không sử dụng các chấtgây nghiện, không mắc các bệnh mãn tính: tim mạch, hô hấp, thận, tiêuhóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh hoặc tâm thần; không cótiền sử dị ứng với methylprednisolon hoặc các thuốc cùng nhóm

 Đồng ý thực hiện các yêu cầu của nghiên cứu và tự nguyện ký vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu.

2.2.4.3 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu

Phân nhóm NTN và trình tự uống thuốc theo giai đoạn như sau:

Bảng 2.1 Trình tự uống thuốc trong nghiên cứu đánh giá TĐSH

Liều dùng: 1 viên methylprednisolon 16mg thuốc Thử hoặc thuốc

Chứng cho mỗi giai đoạn

Cách dùng: Uống nguyên vẹn viên thuốc với 240ml nước ấm Trong

vòng 2 giờ sau khi uống thuốc NTN không được nằm

Lấy mẫu máu: Lấy một điểm trong vòng 1,5 giờ trước khi uống thuốc

(điểm 0 giờ) và 15 điểm sau khi uống thuốc 0,25 giờ; 0,5 giờ; 0,75 giờ; 1,0giờ; 1,33 giờ; 1,67 giờ; 2,0 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 4 giờ; 5 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 10giờ; 12 giờ Lấy máu qua kim luồn đặt cố định ở cánh tay NTN Lấy khoảng5ml máu sau khi đã loại bỏ khoảng 0,5ml máu chứa dung dịch chống đông

Xử lý và bảo quản mẫu : Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống có ghi

nhãn chứa chất chống đông EDTA Lắc ống bằng cách lật ngược ống 3 - 4 lầnngay sau khi cho máu vào Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút.Tách lớp huyết tương cho vào các ống polyethylen có dán nhãn, bảo quảnngay ở – 35oC  5oC cho đến khi phân tích Nhãn trên ống đựng máu và ống