kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction để nghiên cứu quy trình phát hiện virus H5N1

Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc... Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới...

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quantâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam,Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúmA/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong chohàng trăm người Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịchcúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế

kỷ 20 Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lạimột đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị

y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thựchiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới

Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầuhết các tỉnh thành trên toàn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêuhủy Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thếgiới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hìnhthành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường khôngđạt được hiệu quả cao Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ratrên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đâynhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch cóthể trở nên bùng phát

Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chínhxác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng

ra cộng đồng Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người

và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây là kỹ thuật sinh họcphân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệmkhoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT-

PCR và điện di trên gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thựchiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phảnứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứngxác định subtype N1 Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xétnghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR,cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vìphải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựngquy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hếtcác phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm

A/H5N1 Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường

Đại học Y Thái Bình với mục tiêu:

1 Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplexRT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1

2 Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR:nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,

3 Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một

số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1

1.1.1 Phân loại học và danh pháp

1.1.1.1 Phân loại virus cúm

Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on

Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3

type là A, B và C Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32]

Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính khángnguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệgen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA[36]

Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổbiến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và

cả con người [32] Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổigen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua.Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein làhaemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp giữa các subtype

HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khảnăng gây bệnh [2] Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng viruslưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất địnhthường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] CúmA/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm Các chủng củavirus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim,lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người

Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụdịch ở mức độ vừa và nhỏ

1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1

Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên

sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA Do có khả năng biến đổi ditruyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn đượcphân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade cócác đặc điểm di truyền đặc trưng [2]

Các genotype của virus cúm A/H5N1

Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền

và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype).Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hìnhthành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốcGoose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khácnhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từcác nguồn khác nhau Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xácđịnh bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26].Trong số cáckiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên

2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22] Kiểu gen Z là kiểu genlưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từnăm 2003 đến nay [14]

Các clade của virus cúm A/H5N1

Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation forAnimal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xâydựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50].Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau,mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46] Hiện tại chỉ cócác virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người Clade 2 gồm một sốsubclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5]

Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có

clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1(Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51].

1.1.1.3 Danh pháp virus cúm

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm

theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập Nếu là virus

cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trongdấu ngoặc đơn

Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phânlập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA làH5 và kháng nguyên NA là N1

A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tạiViệt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và khángnguyên NA là N1

1.1.2 Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1

Virus cúm H5N1 là một subtype của virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridea.

Virus cúm A/H5N1 mang các đặc điểm của virus cúm A (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc của virus cúm A http://thefutureofthings.com/news/6684/

human-antibodies-neutralize-avian-flu.html

Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ

80-120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm Vỏ bọc củavirus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500cấu trúc hình gai nhô ra Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt củavirus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA,

NA và M2 nằm xen kẽ với nhau Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt củahạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1 Bên trong màng lipid được lótbởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36]

Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA,

gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từngchủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB1-F2 ) Bên trong hạt virus, mỗiphân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzymepolymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợpribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37]

1.1.3 Hệ gen và các protein của virus A/H5N1

H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ1-8 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóatổng hợp là PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 vàNEP) (hình 1.2)

Hình 1.2 Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1

Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau:

Các phân đoạn mã hóa cho các kháng nguyên bề mặt của virus (đặc trưng theo từng chủng virus):

- Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 1704-1707 bases, mang gen

mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng nguyên bề mặt của virus cúm có bảnchất là glycoprotein Kháng nguyên này có vai trò trong việc giúp cho virus gắn với

tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ.Quá trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với cáckháng nguyên trên bề mặt của virus Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quantrọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặchiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus HA là proteinvừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo

vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điềuchế các vaccine phòng cúm hiện nay Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữavirus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thểalpha 2-3 sialic acid còn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 2-6 sialic acidtrên tế bào chủ Ở một số động vật (lợn, gà ) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bịnhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24] Người ta đã phát hiện ra sự độtbiến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bàongười và gây bệnh cho người [11] Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đãcho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 2-3 sialic acid với mật độ rất thấp và ởgia cầm cũng có các thụ thể alpha 2-6 sialic acid với mật độ rất thấp [28] Người tacũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin

182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27]

- Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 1350-1410 bases, mang gen

mã hóa cho neuraminidase, một kháng nguyên bề mặt của virus, có vai trò là mộtenzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tửcarbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ.Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan

loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóngtiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Giống khángnguyên HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ,sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm.Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccinephòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2]

Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóatổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerasecủa virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2] Nghiên cứu thấyrằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin ở vị trí 627 làglutamine, còn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứaaxit amin lysine ở vị trí 627 Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 sẽ tạo thuậnlợi cho virus phát triển ở cả đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới của động vật

có vú, là nguyên nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29]

- Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóatổng hợp protein PB1 và PB1-F2 PB1 là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enyzmepolymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5] PB1-F2 liên quan đến độc lực củavirus và có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịchcúm [43] Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người

ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trênPB1-F2 liên quan đến độc lực của virus Sự thay đổi axit amin N66S cũng đượcphát hiện trên PB1-F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17]

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn genbảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, là một tiểu đơn vị của enzymepolymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus[40]

Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm:

- Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợpnucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tếbào chủ NP có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong cáchạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA

- Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóatổng hợp protein nền M1 và M2 của virus Các protein này kết hợp với 2 khángnguyên bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus Hai protein này được tạo ra từ cùngmột phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau Protein M1 gắn với RNAcủa virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạnRNA vào tế bào chất của tế bào chủ M2 là protein xuyên màng có bản chất là mộtkênh ion, cần thiết cho quá trình xâm nhiễm của virus [36] Sự thay thế axit amin ở

vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quanđến tình trạng kháng amantadin của virus [25]

- Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, chứa gen mã hóa cho

2 protein không cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thườngđược gọi là protein NS2) Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39] NS1 làprotein có vai trò trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tếbào NEP có vai trò trung gian trong quá trình vận chuyển các ribonucleoprotein củavirus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ

1.1.4 Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1

Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp,đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3)

Hình 1.3 Chu trình tái bản của virus cúm A

Khởi đầu chu trình là sự gắn kết của virus với các thụ thể có chứa nhómsialic acid trên bề mặt tế bào nhiễm nhờ kháng nguyên HA Khi virus bám gắn đượcvới tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi thực bào (endosome) Túi thực bàogiảm dần pH để giúp cho quá trình hoà nhập màng virus với màng túi thực bào vàgiải phóng các phức hợp RNP của virus vào tế bào chất của tế bào chủ Sau đó, cácphức hợp RNP được vận chuyển vào nhân tế bào để tổng hợp sợi dương RNA Sợidương RNA được làm khuôn để sao mã tạo mRNA và tái bản sợi âm RNA củavirus mRNA được đưa ra tế bào chất để tổng hợp protein của virus Quá trình tổnghợp protein và tái bản hệ gen của virus là quá trình phức tạp được điều hoà bởinhiều yếu tố của virus cũng như của tế bào Các protein PB1, PB2, PA và NP củavirus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virushình thành các phức hợp RNP và phức hợp được đưa ra tế bào chất Các proteinkhác (HA, NA và M2) được glycosyl hoá nhờ mạng lười nội sinh chất và phức hệgolgi của tế bào Sau khi hoàn thiện, các protein này được đưa đến màng tế bào gắnvào lớp lipid kép và khi mật độ đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M1 cũngtập hợp lại trên màng để hình thành hạt virus thế hệ con gắn trên bề mặt tế bào nhờliên kết giữa HA với nhóm sialic acid của glycoprotein màng tế bào Các hạt virussau đó giải phóng khỏi màng nhờ tác dụng cắt nhóm sialic acid của enzymeneuraminidase

Thời gian từ khi virus xâm nhiễm tế bào đến khi hình thành thế hệ virus con trungbình khoảng 6 giờ Sự giải phóng các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm,nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quátrình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [48].

1.1.5 Hiện tượng biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Virus cúm A là loại virus đặc biệt nhất trong các virus đường hô hấp do có hệgen phân thành 8 đoạn và khả năng biến đổi kháng nguyên nhanh chóng Khả năngbiến đổi kháng nguyên của virus cúm A là hệ quả của các quá trình biến đổi ditruyền của virus Các cơ chế biến đổi di truyền của virus bao gồm:

- Hiện tượng trao đổi kháng nguyên (antigenic shift): Antigenic shift là các

biến đổi di truyền lớn của virus cúm, tạo ra chủng virus mới từ các chủng virus banđầu bằng cách sắp xếp lại hệ gen Quá trình này xảy ra khi virus cúm của các loàikhác nhau đồng nhiễm trên cùng một vật chủ (ví dụ như hai chủng virus cúm người

và virus cúm gia cầm đồng nhiễm trên lợn) trao đổi hệ gen cho nhau, tạo ra các thế

hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp từ các chủng ban đầu Sự trao đổi khángnguyên có thể tạo ra các chủng virus cúm mới có khả năng lây nhiễm các loài vậtchủ mới hoặc gia tăng động lực gây bệnh [2]

- Hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift): Antigenic drift là quá trình

tích lũy các đột biến gen trên gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng củavirus (kháng nguyên HA và NA) Do enzyme polymerase của virus không có cơ chếđọc sửa nên trong quá trình tái bản tần số đột biến ở virus rất cao, trung bình mỗilần tái bản hệ gen của virus sẽ có 1 nucleotid bị biến đổi [21] Qua nhiều thế hệvirus, các đột biến này dần dần được tích lũy lại và đến một lúc nào đó sẽ làm thayđổi đặc tính kháng nguyên của virus [21] Chủng virus cúm với các đặc tính khángnguyên mới có thể thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể và dễ dàng lan truyềntrong quần thể

- Hiện tượng glycosyl hóa: Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của

một chuỗi oligosaccharide với amino acid asparagine ở một số vị trí nhất định trongchuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông

thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = asparagine; X =amino acid bất kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) [7] Đây là những vị tríđược cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của khángnguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biếnđiểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đồ cho hiện tượng glycosyl hóa xảy

ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi đặc tính kháng nguyêncủa HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ

và điều hoà sự nhân lên của virus [7]

Hiện tượng lệch kháng nguyên và glycosyl hóa tạo ra những biến đổi di truyền

nhỏ nhưng diễn ra liên tục trong quá trình lưu hành của virus trong tự nhiên Ngược

lại, hiện tượng trao đổi kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus

cúm A khi có hiện tượng đồng nhiễm, tạo ra các biến đổi di truyền lớn và hìnhthành chủng virus mới Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúmA/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ởngười, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người với tỉ lệ tử vong rất cao Nếu nhưchủng virus A/H5N1 trao đổi gen HA hay NA, hoặc cả hai gen với một chủng viruscúm A đã thích nghi ở người (ví dụ như H1N1 hoặc H3N2) có thể tạo ra chủngvirus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, là nguy cơ của một đại dịch cúmmới [25]

1.1.6 Khả năng thích ứng vật chủ của virus cúm A

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A là các loài thủy cầmhoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiênrất khó kiểm soát Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúngtrong quá trình lây truyền ở tự nhiên (hình 1.4)

Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của

virus cúm A.

http://www.medicalecology.org/diseases/influenza/print_influenza.ht

Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A cókhả năng xâm nhiễm nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một

số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn…) và cả con người, tạo nên

tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn;

gà - lợn - người Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho viruscúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn genkháng nguyên (HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới cókhả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng

vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm

sang người và giữa người với người [15]

Các nghiên cứu về virus H5N1 trong thời gian gần đây cho thấy virus đã cónhững biến đổi để thích nghi lây nhiễm trên người Hai chủng virus H5N1 phân lậptrên người năm 2003 (Hong Kong) cho thấy có hiện tượng giảm ái lực với thụ thểcủa gia cầm và có ái lực (mặc dù chỉ ở mức thấp) với thụ thể của người và sự thayđổi axit amin ở vị trí 227 (Ser thành Asn) là nguyên nhân làm thay đổi tính đặc hiệuvới thụ thể của virus [23] Đột biến ở vị trí 182 hoặc 192 (Asn182Lys hoặc

Gln192Arg) làm cho H5N1 thay đổi đặc tính gắn thụ thể, từ dạng có ái lực với thụthể của gia cầm chuyển thành dạng có ái lực với thụ thể của người [52].

Trong thế kỷ 20, chỉ có các chủng virus H1N1, H2N2, H3N2 và H1N2 lưuhành trên người Tuy nhiên trong những năm gần đây có nhiều subtype virus cúmgia cầm như H5N1, H7N3, H7N7, H9N2 và H10N7 đã lây nhiễm cho người

Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây nhiễm và gây bệnh cho nhiều loài độngvật có vú khác như chó, mèo, hổ, báo…

1.1.7 Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1

Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích ứngvật chủ của từng chủng virus Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gâybệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm, nhưng một sốchủng thuộc subtype H5, H7, H1, H2 và H3 có thể gây bệnh nặng ở nhiều cơ quantrong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và người [52] Dựa vào khả năng gâybệnh của virus trên gia cầm, virus cúm A được chia thành 2 nhóm là nhóm có độclực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) và nhóm có độc lực thấp (LowPathogenic Avian Influenza - LPAI) Nhóm LPAI thường chỉ gây ra các bệnh nhẹ ởđường hô hấp, giảm sức đẻ và/hoặc giảm trọng lượng, mặc dù đôi khi có thể gâybệnh với tỉ lệ cao nhưng tỉ lệ chết thường thấp Trái lại, virus HPAI thường gây chếtgia cầm với tỷ lệ cao, ít nhất 75% gia cầm nhiễm đều bị chết [45] Cho đến nay, tất

cả các chủng HPAI đã biết đều thuộc subtype H5 hoặc H7, tuy nhiên không phải tất

cả mà chỉ có một số ít các chủng virus thuộc subtype H5 và H7 là HPAI Protein

HA của LPAI có đặc điểm là chỉ có một axit amin kiềm là arginine tại vị trí phâncắt và một axit amin kiềm khác ở trước vị trí phân cắt 3 hoặc 4 axit amin (tùy thuộcvào từng subtype) Do đó, protein HA của LPAI chỉ bị phân cắt bởi các proteasengoại bào (extracellular proteases) do các tế bào hoặc vi khuẩn tại vị trí xâm nhiễm(ví dụ như khí quản và ruột) tiết ra Trái lại, protein HA của HPAI lại có nhiều axitamin kiềm tại vị trí phân cắt, do đó có thể chịu tác dụng của các protease nội bào(intracellular protease) phổ biến như furin [44] Chính vì vậy mà HPAI có thể gây

bệnh ở nhiều mô, cơ quan khác nhau trên cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứngnặng nề và tỉ lệ tử vong cao

Độc lực và khả năng gây bệnh của virus A/H5N1 được quyết định chủ yếu bởicác protein của virus là HA, PB2, NS1 và PB1-F2: Protein HA là kháng nguyên bềmặt quan trọng của virus cúm, giúp cho virus có thể gắn với các thụ thể sialic acidđặc hiệu trên bề mặt tế bào, hòa màng và xâm nhiễm tế bào chủ Vị trí phân cắtprotein HA của A/H5N1 mang nhiều axit amin kiềm nên dễ dàng bị phân cắt bởicác protease, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhautrong cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng nặng nề Protein PB2 là một thànhphần quan trọng của phức hợp RNP của virus, tham gia vào quá trình sao mã và táibản của virus Protein NS1 có thể tham gia điều hòa đáp ứng miễn dịch ở vật chủ,

do đó cũng là một yếu tố quyết định độc lực của virus đối với con người PB1-F2 cóvai trò gây ra hiện tượng apoptosis làm tổn thương mô, cơ quan của cơ thể nhiễm

1.1.8 Sức đề kháng của virus cúm A

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân vật lí hay hóa học Các hạt virustồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6.5 đến 7.9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả nănglây nhiễm của virus bị giảm mạnh Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, cónguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩyrửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride,acid loãng và hydroxylamine Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tạiđược 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủyđược kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở

100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), vàtới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25-

30 ngày nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC); trong nước, virus cóthể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC

1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 1.2.1 Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1

Ở gia cầm, thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến trên hai mươi ngày, biểu hiện cáctriệu chứng sốt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, datím tái, chân xuất huyết, chảy nước dãi ở mỏ Con vật khi sốt cao có biểu hiệnkhông bình thường ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, sinh sản và thần kinh Triệu chứngchung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu Trường hợp nặng có biểuhiện ho, khó thở, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con có biểu hiện co giật hoặc ở

tư thế không bình thường Những triệu trứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặcriêng rẽ [3, 4]

Ở người, thời gian ủ bệnh bệnh của virus cúm A/H5N1 có thể kéo dài hơn sovới cúm mùa, trung bình hầu hết các trường hợp nhiễm A/H5N1 là từ 2-4 ngày,nhưng một số trường hợp có thể kéo dài hơn, 8-17 ngày [16] Các triệu chứng lâmsàng nhiễm cúm A/H5N1 có thể không biểu hiện hoặc biểu hiện các triệu chứng ởcác mức độ khác nhau, từ nhẹ như bệnh cúm thông thường (khó thở, ho, sốt) chođến biểu hiện viêm phổi nặng, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS- Acute RespiratoryDistress Syndrome) hay hội chứng suy đa tạng (MODS- Multiorgan DisfunctionSyndrome) Các nghiên cứu cho thấy một số bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng(phát hiện qua xét nghiệm) và cũng có trường hợp biểu hiện các triệu chứng khôngđiển hình (viêm não hoặc viêm đường tiêu hóa) [6] Không giống như cúm mùa,bệnh nhân nhiễm A/H5N1 thường không có biểu hiện nhiễm trùng đường hô hấptrên mà thường biểu hiện tình trạng viêm phổi và nhiễm trùng đường hô hấp dưới.Đặc điểm lâm sàng này có thể là do các thụ thể đặc hiệu với HA của virus cúmA/H5N1 có nhiều ở đường hô hấp dưới Triệu chứng cận lâm sàng thường gặp là:giảm số lượng bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu lympho, giảm số lượng tiểu cầu, giảmalbumin huyết; tăng hàm lượng một số protein huyết thanh như aminotransaminase,lactate dehydrogenase và creatine phosphokinase; đường huyết tăng rõ, có thể liênquan đến việc sử dụng corticosteroid và có thể tăng creatinine máu [31] Ở nhữngbệnh nhân có tải lượng virus cao trong dịch mũi và dịch nội khí quản, những bệnh

nhân ở giai đoạn cuối của bệnh thì hàm lượng cytokin và chemokin trong máuthường tăng cao, đặc biệt là các yếu tố như interleukin-6, yếu tố hoại tử u và cácinterferon, chứng tỏ hiện tượng virus đang phát tán trong cơ thể [19] Ở những bệnhnhân tử vong, người ta đã phát hiện các kháng nguyên và/hoặc RNA của virus ở hầuhết các mô trong cơ thể, bao gồm: phổi, khí quản, gan, niêm mạc ruột non, ruột già,tủy xương và não

Tỉ lệ tử vong đối với bệnh nhân nhiễm cúm A/H5N1 nhập viện tương đối cao,xấp xỉ 60% [13, 16], mặc dù tỷ lệ tử vong chung có lẽ thấp hơn nhiều Trái ngượcvới năm 1997, khi phần lớn các ca tử vong xảy ra ở bệnh nhân trên 13 tuổi, cúm A/H5N1 hiện nay gây tỷ lệ tử vong cao ở trẻ nhỏ Ở trẻ dưới 15 tuổi, tỷ lệ tử vong là89% [16] Thời gian trung bình từ khi có triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong là 9-

10 ngày (thay đổi từ 6-30 ngày) và hầu hết bệnh nhân tử vong do suy hô hấp tiểntriển [5, 16]

1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm và chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1

Chẩn đoán lâm sàng nhiễm cúm A/H5N1 là rất khó vì triệu chứng của bệnh rất

đa dạng và tương tự như một số bệnh khác Để chẩn đoán xác định người ta thườngphải dựa vào các kết quả xét nghiệm xác định sự có mặt của virus, kháng nguyên,kháng thể hoặc RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm

1.2.2.1 Các phương pháp xét nghiệm phát hiện cúm A/H5N1

Với đặc điểm cấu tạo và khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1, kỹ thuậtxét nghiệm không chỉ đòi hỏi có độ tin cậy và độ nhạy cao mà thời gian xét nghiệmphải nhanh [34] Các kỹ thuật xét nghiệm có thể áp dụng trong chẩn đoán virus cúmA/H5N1 bao gồm: phân lập virus; phát hiện kháng nguyên; phát hiện RNA củavirus bằng kỹ thuật RT-PCR, realtime RT-PCR và phát hiện sự tăng hiệu giákháng thể trong huyết thanh bệnh nhân Trong giai đoạn dịch cúm A/H5N1 đangbùng phát thì việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện với nhiềumẫu bệnh phẩm cùng một lúc có vai trò hết sức quan trọng

Phương pháp phân lập virus

Hiện nay, phân lập virus là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán cúm A/H5N1 vìcác chủng virus sau khi phân lập có thể được dùng trong các nghiên cứu về sau như:giải trình tự, xác định subtype, xác định clade, phân tích các đột biến và hiện tượngtái tổ hợp để tìm hiểu về khả năng tái bản, khả năng lây nhiễm của virus và hiệntượng kháng thuốc của virus Virus A/H5N1 có thể phân lập bằng cách nuôi cấytrên phôi gà SPF (specific pathogenic free) hoặc nuôi cấy trên tế bào thận chó(Mardin-Darby canine kidney - MDCK) hoặc các dòng tế bào cảm nhiễm với viruscúm khác

Phân lập từ trứng: hầu hết các virus cúm phát triển ổn định trong khoang túi

niệu hoặc túi ối của phôi gà 10-12 ngày tuổi Sau khi gây nhiễm trứng 48-72 giờ,thu dịch khoang niệu mô, xác định sự có mặt và xác định subtype virus bằng cácphản ứng miễn dịch (HA, HI) hoặc RT-PCR Với chủng virus có độc lực cao, phôi

có thể bị chết trong vòng 24 giờ sau khi gây nhiễm

Phân lập từ tế bào: Khi nuôi cấy các virus cúm mùa LPAI trên tế bào MDCK,

người ta phải bổ sung trypsin để virus có thể tái bản Tuy nhiên, đối với các viruscúm A/H5N1, vì là HPAI nên virus có thể tái bản mà không cần bổ sung trypsin

Là tiêu chuẩn vàng, nhưng phân lập virus đòi hỏi phải có phòng an toàn sinhhọc cấp 3 (BioSafety Level 3 - BSL3) và thời gian nuôi cấy tương đối lâu, từ 2-6ngày Ngoài ra, sau khi phân lập được virus vẫn phải thực hiện các xét nghiệm khác

để chẩn đoán xác định subtype virus

Phương pháp phát hiện kháng nguyên

Là phương pháp dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên virus.Người ta có thể phát hiện kháng nguyên của virus trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằngmột số kỹ thuật khác nhau, tuy nhiên kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn do thờigian xét nghiệm nhanh là:

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (direct immunofluorescence assay):

Tế bào niêm mạc đường hô hấp được cố định trên lam kính, kháng nguyên của virus

được phát hiện bằng kháng thể đặc hiệu có gắn huỳnh quang và quan sát dưới kínhhiển vi huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch gắn men (EIA: Enzyme-linhked Immunosorbent Assay):

Kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu gắn enzyme để phát hiện kháng nguyên virus.Mẫu bệnh phẩm được gắn lên thành giếng, sau khi được ủ với kháng thể có gắnenzyme thì bổ sung cơ chất phù hợp Nếu có kháng nguyên virus trong mẫu bệnhphẩm thì enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm đổi màu

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên virus nhanh, đơn giản nhưng chỉ phát hiệnđược các kháng nguyên bảo thủ của virus cúm như NP và M Do đó, kết quả xétnghiệm dương tính cũng chỉ có thể kết luận là nhiễm virus cúm A, không xác địnhđược có phải là A/H5N1 hay không Độ nhạy của các kỹ thuật có thể chấp nhậnđược khi áp dụng trong chẩn đoán cúm mùa ở người, tuy nhiên để chẩn đoán cúmA/H5N1 thì chưa đạt yêu cầu [9, 34] Hiện nay một số bộ sinh phẩm phát hiệnkháng nguyên đặc hiệu của H5N1 đã được đưa ra thị trường và đang được thửnghiệm trong chẩn đoán cho gia cầm

Phương pháp phát hiện kháng thể (chẩn đoán huyết thanh học)

Là phương pháp dùng kháng nguyên chuẩn virus (virus) để phát hiện khángthể đặc hiệu kháng virus trong huyết thanh hoặc trong các dịch cơ thể Một số kỹthuật chẩn đoán huyết thanh có thể áp dụng trong chẩn đoán cúm A/H5N1:

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory): Thành

phần phản ứng bao gồm kháng nguyên virus chuẩn, kháng huyết thanh cần kiểm tra(đã loại bỏ các yếu tố ức chế và các yếu tố gây ngưng kết hồng cầu) và hồng cầupha loãng 0.4-0.5% (hồng cầu gà, hồng cầu lợn guinea, hoặc hồng cầu người nhómmáu O) Kháng nguyên virus chuẩn được ủ với kháng huyết thanh ở các nồng độkhác nhau, sau đó bổ sung hồng cầu Mẫu dương tính là mẫu có chứa kháng thể đặchiệu với HA, là các giếng có hồng cầu không bị ngưng kết mà lắng xuống đáygiếng Hiệu giá HI chính là tỉ lệ pha loãng huyết thanh thấp nhất có thể ức chếngưng kết hồng cầu [33]

Phản ứng HI thường được sử dụng để phát hiện kháng thể đặc hiệu của viruscúm mùa trong huyết thanh bệnh nhân nhưng ít được sử dụng để phát hiện khángthể kháng virus H5N1 trong huyết thanh người và động vật có vú do có độ nhạythấp [8]

Western Blot (WB): là kĩ thuật có độ nhạy cao, được sử dụng để phát hiện

kháng thể kháng virus cúm trong các mẫu huyết thanh Kháng nguyên toàn phầncủa virus hoặc protein HA tinh chế được chạy điện di trên gel, sau đó chuyển sangmàng nitrocellulose hoặc nylon Màng chứa kháng nguyên được cắt thành các băngnhỏ, ủ với mẫu huyết thanh pha loãng, kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh sẽ liênkết với kháng nguyên gắn trên màng Tiến hành ủ các băng nêu trên với khángkháng thể đặc hiệu có gắn enzyme, chất chỉ thị màu (phosphatase kiềm hoặcperoxidase cải củ cay) hoặc biotin và được nhận biết bằng streptavidin-HRP Vị trígắn kháng thể kháng virus sẽ được xác định khi ủ các băng này với cơ chất củaenzyme hoặc chất tạo màu WB có độ nhạy cao, thường được sử dụng kết hợp với

kĩ thuật HI hoặc EIA để làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu [42]

Kĩ thuật trung hoà virus: Mẫu virus được ủ với huyết thanh bệnh nhân sau đó

hỗn hợp được sử dụng để gây nhiễm trong hệ thống phù hợp (tế bào nuôi cấy, phôitrứng) để xác định sự xâm nhiễm của virus Nếu không có sự xâm nhiễm của virus,tức là kết quả dương tính, khi đó huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với virus.Người ta đã áp dụng kỹ thuật này trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997 để pháthiện kháng thể kháng H5N1 trong huyết thanh bệnh nhân và có thể phát hiện được

14 ngày sau khi bệnh nhân biểu hiện triệu chứng [35] Kỹ thuật này có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện kháng thể kháng H5N1 ở người nhưng

do sử dụng mẫu virus cúm gia cầm nên cũng phải thực hiện trong phòng an toànsinh học cấp độ 3

Kỹ thuật trung hòa vi lượng (Microneutralization - MN): là kĩ thuật trung hoà

virus được thực hiện trên tấm 96 giếng, kết quả được đọc bằng phản ứng EIA sau18-22 giờ kể từ khi gây nhiễm Kĩ thuật MN dựa trên phản ứng trung hòa virus vớikháng thể đặc hiệu Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng ở các nồng độ khác

nhau và được ủ cùng một lượng virus nhất định trước khi tiến hành gây nhiễm tếbào Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể đặc hiệu kháng H5N1 thì khángthể sẽ trung hòa virus và virus không thể gây nhiễm tế bào Sau khi ủ, các tế bàođược gắn cố định và tiến hành xác định sự có mặt của protein NP của virus trongcác tế bào nhiễm virus bằng phản ứng EIA Hiện nay, kỹ thuật MN là kỹ thuật pháthiện kháng thể kháng H5N1 tốt nhất Nhược điểm là kỹ thuật áp dụng với mẫu virussống nên phải thực hiện trong phòng an toàn sinh học cấp độ 3 So với kĩ thuậttrung hoà virus thông thường, kỹ thuật MN cho kết quả nhanh, chính xác hơn và cóthể thực hiện đồng thời nhiều mẫu trên một tấm 96 giếng.

Chẩn đoán huyết thanh học có vai trò quan trọng trong các nghiên cứu dịch tễhọc Các kỹ thuật này đòi hỏi phải có hai mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và giaiđoạn phục hồi, do đó ít có giá trị trong chẩn đoán nhiễm H5N1 cấp mà thường chỉđược sử dụng để khẳng định chẩn đoán trên bệnh nhân đang điều trị

Giai đoạn 2: Dùng sợi đôi cDNA làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCRkhuếch đại đoạn gen mong muốn

Có 2 phương pháp thực hiện RT-PCR Đó là phương pháp RT-PCR một bước

và phương pháp RT-PCR hai bước Trong phương pháp RT-PCR hai bước, phảnứng phiên mã ngược tạo cDNA thực hiện trong một tube phản ứng, sau đó lấy sảnphẩm cDNA cho vào tube PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy PCRkhuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phương pháp này sẽ có nguy cơ ngoạinhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm cDNA củagiai đoạn RT vào Tuy nhiên, nguy cơ ngoại nhiễm có thể loại bỏ hoàn toàn bằng

việc cho dUTP và UNG (uracil-N-glycosylase) vào PCR mix của giai đoạn PCR.Với phương pháp RT-PCR một bước, cả hai giai đoạn RT và PCR được thực hiệntrong một tube phản ứng, tất cả các thành phần của 2 giai đoạn được cho vào cùngmột lần Ở đây, toàn bộ sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiếtphải có mồi riêng cho RT vì chính mồi của PCR sẽ được sử dụng làm mồi cho RT.RT-PCR một bước thuận tiện hơn và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩmkhuếch đại.

Kỹ thuật RT-PCR phát hiện các trình tự gen đặc trưng cho virus cúm A (genM) hoặc cho subtype HA và NA của virus dựa trên các cặp mồi được thiết kế đặchiệu với từng gen, do đó có thể xác định được các subtuye virus cúm A với độ nhạy

và độ đặc hiệu cao Để chẩn đoán các trường hợp nghi nhiễm cúm A/H5N1, người

ta thường phải thực hiện vài phản ứng RT-PCR, bao gồm phản ứng xác định nhiễmcúm A và các phản ứng xác định subtype HA và NA Thời gian để thực hiện xétnghiệm bằng kỹ thuật này mất khoảng từ 12-24 giờ hoặc hơn, tùy thuộc vào từngphòng thí nghiệm Kỹ thuật realtime RT-PCR chẩn đoán A/H5N1 giúp rút ngắn thờigian xét nghiệm xuống còn 4-6 giờ, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu đồng thời có thểxác định được mật độ virus trong mẫu bệnh phẩm [18, 41] Do không phải điện diphân tích kết quả nên kỹ thuật realtime RT-PCR hạn chế được hiện tượng dươngtính giả do nhiễm sản phẩm PCR Kỹ thuật này cho kết quả nhanh và chính xácnhưng chi phí cao, tốn kém

Kỹ thuật multiplex RT-PCR: Sử dụng cả 3 cặp mồi đặc hiệu phát hiện cả 3 gen

M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng Kỹ thuật này khắcphục được nhược điểm của hai kỹ thuật trên nhưng để xây dựng được phản ứngmultiplex RT-PCR thì quan trọng nhất là phải thiết kế được các mồi có nhiệt độ gắnmồi (Ta- Annaeling temperature) vào DNA đích tương đương nhau và quan trọngnữa là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm so với độ nhạy của RT-PCR đơn mồi

Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.Tuy nhiên, do virus cúm A/H5N1 có tần suất đột biến cao và trong thời gian gần

đây đã hình thành nhiều subclade khác nhau [14] nên việc chẩn đoán A/H5N1 bằng

kỹ thuật RT-PCR đòi hỏi phải thường xuyên chuẩn hóa, thay đổi các cặp mồi chophù hợp với sự biến đổi của virus cúm A/H5N1

1.2.2.2 Chẩn đoán

Ngày 19/08/2008, Bộ trưởng Bộ Y tế đã ra quyết định số: 30/2008/QĐ-BYT

về việc ban hành “Hướng dẫn chẩn đoán, xử trí và phòng lây nhiễm cúm A/H5N ở người” Theo đó, việc chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 ở người dựa vào yếu tố dịch

tễ, các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng, trong đó tiêu chuẩn quan trọng nhất

để chẩn đoán xác định một trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 là kết quả xét nghiệmdương tính với cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật RT-PCR

1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 ở người

Hai dòng thuốc kháng virus được sử dụng để điều trị các trường hợp nhiễmvirus cúm gia cầm là các thuốc ức chế neuraminidase (oseltamivir và zanamivir) vàcác thuốc ức chế kênh ion M2 (amantadine và rimantadine) Các thuốc ức chế NAđược sử dụng phổ biến hơn do thuốc có ít tác dụng phụ và ít bị kháng thuốc hơn sovới các thuốc dòng adamantane Do còn thiếu các nghiên cứu thử nghiệm nên liềulượng và thời gian điều trị của các thuốc kháng virus còn chưa được chuẩn hóa Tuynhiên WHO khuyến cáo rằng các trường hợp có biểu hiện các triệu chứng về tiêuhóa, các trường hợp nặng hoặc điều trị ở giai đoạn muộn cần phải sử dụng thuốc vớiliều cao và thời gian điều trị dài hơn các trường hợp thông thường [5]

Những nguyên tắc khi điều trị bằng các thuốc kháng virus bao gồm: Bệnhnhân nghi ngờ nhiễm cúm A/H5N1 cần được điều trị ngay bằng thuốc kháng virus

mà không chờ kết quả xét nghiệm [49] Oseltamivir là lựa chọn hàng đầu, đối vớinhững trường hợp nhiễm A/H5N1 thể nặng có thể dùng oseltamivir với liều gấp đôi(150 mg x 2 lần/ngày) và tăng thời gian dùng thuốc [49] Oseltamivir vẫn có tácdụng tốt đối với các trường hợp điều trị muộn nếu có dấu hiệu virus vẫn đang nhânlên [49, 20] Điều trị phối hợp các thuốc kháng virus với nhau hoặc phối hợp thuốc

kháng virus với thuốc kháng viêm hoặc thuốc điều trị miễn dịch cũng được áp dụng,tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp điều trị phối hợp đều chưa được đánh giáđầy đủ Corticosteroid là thuốc được sử dụng phổ biến nhưng hiệu quả điều trị chưa

rõ ràng Thậm chí một nghiên cứu còn cho thấy trong số 7 bệnh nhân được điều trịbằng corticosteroid có tới 6 bệnh nhân tử vong [47] Rõ ràng là cần phải có nhữngnghiên cứu tiếp theo để đánh giá về hiệu quả điều trị khi phối hợp thuốc kháng virusvới các thuốc khác Ở giai đoạn toàn phát của bệnh, đặc biệt là khi bệnh nhân đãbiểu hiện ARDS và/hoặc MODS, thì bệnh nhân cần phải được chăm sóc đặc biệtvới sự hỗ trợ thở máy, dùng thuốc vận mạch và liệu pháp thận thay thế [16] Đối vớinhững trường hợp viêm phổi tiến triển thành ARDS thì không nên áp dụng thở máythông thường mà cần đặt nội khí quản ngay khi bệnh nhân có biểu hiện suy hô hấp

1.2.4 Kiểm soát lây nhiễm và dự phòng

Mỗi đợt dịch cúm HPAI H5N1 ở người thường khởi đầu bằng các vụ dịchcúm trên gia cầm Do vậy, để phòng chống sự lây lan từ gia cầm sang con ngườichúng ta cần tăng cường các biện pháp nhằm ngăn chặn và diệt trừ nguồn bệnh trêngia cầm Các biện pháp này bao gồm công tác tiêm chủng, tăng cường các biệnpháp an toàn sinh học và tiêu hủy gia cầm khi xảy ra dịch Ở các quốc gia chưa xảy

ra dịch, công tác giám sát, các biện pháp an toàn sinh học và kế hoạch phòng chốngdịch có vai trò quan trọng để ngăn chăn sự xuất hiện của virus và thiết lập tình trạngsẵn sàng trong phòng chống dịch cúm gia cầm Các biện pháp phòng ngừa ở mức độquốc gia có thể làm giảm nguy cơ lây lan dịch cúm gia cầm qua đường biên giới;tuy nhiên, các biện pháp phòng ngừa ở mức độ xử lý dịch có vai trò quan trọng đểngăn chặn sự lây lan dịch bệnh ở người Các biện pháp phòng ngừa này do WHO vàCDC (Centers for Disease Control and Prevention) đưa ra nhằm làm giảm tỉ lệ mắccúm gia cầm ở người bằng cách thực hiện các biện pháp bảo vệ cá nhân phù hợp tạicác cơ sở y tế Hiện tại, CDC và WHO khuyến cáo sử dụng khẩu trang N-95 khichăm sóc bệnh nhân cúm gia cầm Trong quá trình thực hiện các thủ thuật có nguy

cơ cao như soi phế quản, thông khí không xâm lấn, đặt nội khí quản, cho bệnh nhânthở ôxy hoặc khí dung thuốc thì nhân viên y tế cần phải được trang bị các phương

tiện chuyên dụng hơn như mặt nạ kín hoàn toàn hoặc mặt nạ lọc khí kết hợp với cácdụng cụ bảo hộ khác như áo choàng không thấm nước, găng tay và kính bảo vệ mặt[12] Rửa tay trước và sau khi tiếp xúc với bệnh nhân bằng các dung dịch khử trùngtại bồn rửa ngay trong phòng bệnh nhân Ngay khi bệnh nhân nhập viện, cần phảitiến hành cách ly bệnh nhân trong phòng áp lực âm Các nhân viên y tế cần đượctiêm phòng vaccine cúm mùa hàng năm để ngăn chặn hiện tượng đồng nhiễm viruscúm Các nhân viên y tế tiếp xúc với bệnh nhân cần được điều trị dự phòng bằngthuốc kháng virus ngay lập tức, nếu ai có biểu hiện nhiễm bệnh phải nghỉ và giámsát chặt chẽ Với các biện pháp phòng ngừa như vậy thì nguy cơ lây lan virus cúmgia cầm sẽ giảm tới mức thấp nhất, ngăn chặn nguy cơ lây nhiễm sang các bệnhnhân khác, sang người nhà và nhân viên y tế

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Trước tình hình lây lan của dịch cúm gia cầm, thế giới và Việt Nam đã cónhiều công trình nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán, điều trị và dự phòng bệnhcúm Ngay khi dịch cúm A/H5N1 xảy ra trên gia cầm vào cuối năm 2003, cácphòng thí nghiệm trọng điểm của nước ta đã nhanh chóng hoàn thiện kỹ thuật pháthiện virus cúm A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR đồng thời triểnkhai kỹ thuật giải trình các gen của cúm A/H5N1 nhằm tìm hiểu sâu hơn về chủngvirus đang lưu hành tại Việt Nam Những chuỗi gen giúp xác định subtype H5,subtype N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP

Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trênNgân hàng gen [30, 38] Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1,các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và ngườitại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [30] Các biếnchủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và HànQuốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng(A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủngthuộc dòng Quảng Đông [30] Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và

người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản vềgen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý NamTrung Quốc và Hồng Kông Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã đượcnghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trongvùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộcnhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinhhọc nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [15] Năm 2007,xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đanglàm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ

lệ tương đồng kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) thấp so với các chủng phân dòngQuảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo vệ miễn dịch [1]

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệtcúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt cácsubtype HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiêncứu với các tổ chức thế giới Phát hiện nhanh cúm A/H5N1 và các subtype khác baogồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xâydựng thành phương pháp Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học ViệtNam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạovaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của ViệtNam [1]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu vật

- Để thiết kế mồi chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng các trình tựgen M, HA và NA của virus cúm gia cầm đã công bố trên Ngân hàng gen(GenBank)

- Để nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cúmA/H5N1, chúng tôi sử dụng RNA virus cúm A/H5N1 do Viện Công nghệ Sinh họccung cấp Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng, chúng tôi sử dụng RNA virusA/H3, A/H1N1, cúm B do viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương cung cấp; RNA virusA/H5 do Trung tâm chẩn đoán Thú Y Trung Ương cung cấp

- Để thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR chúng tôi sử dụng 14 mẫudương tính với cúm A/H5N1 (Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và Trung tâmchẩn đoán thú y Trung ương cung cấp) và 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bịbệnh trong các vụ dịch cúm năm 2009 ở một số tỉnh phía Bắc

2.1.3 Thiết bị

- Các thiết bị dùng thu thập mẫu bệnh phẩm từ gia cầm bị bệnh: Trang bị bảo

hộ cá nhân (găng tay các cỡ, khẩu trang N95, kính bảo vệ mắt, ủng, quần áo bảohộ), ống falcon 1.5 ml (đựng bệnh phẩm), catheter (lấy dịch tỵ hầu hoặc hút dịchđường hô hấp dưới), tăm bông, đè lưỡi, túi nylon, pipet 1 ml, 5 ml, đĩa petri, lọnhựa, túi đá, hộp bảo quản lạnh, phiếu thu thập bệnh phẩm…

- Thiết bị dùng trong các xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N1: Máy ly tâm

(Eppendorf), pipette các loại (Eppendorf), vortex, đầu côn (filter) các loại, tubePCR (RNase free) các loại, găng tay dùng 1 lần, máy luân nhiệt C1000 (BIORAD),Bio Safety Cabinet level 2 (BIOAIR), máy soi gel và chụp ảnh, bộ nguồn và bể điện

di, khay đổ gel, bể nhuộm gel, cốc đong 500 ml, lò vi sóng, cân điện tử, nồi khửtrùng,…và các phần mềm thiết kế mồi (clustal X 2.0.11, fastPCR 5.4, BioEdit)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chọn mẫu

Cách chọn mẫu:

Khi có dịch cúm xảy ra, đối với mỗi đàn gia cầm chúng tôi sẽ chọn ngẫunhiên từ 2-3 con gia cầm chết hoặc bị bệnh để lấy mẫu Mẫu bệnh phẩm thu thập cóthể là mẫu mô (khí quản, phổi, ruột, lách, thận, não, gan, tim) hoặc dịch ngoáyhọng, ổ nhớp Bệnh phẩm được thu thập trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm mắcbệnh vì khi đó sẽ có mật độ virus cao nhất

2.2.2 Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu:

- Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ổ nhớp: Đưa tăm bông mềm vào vùng họng hoặc

ổ nhớp của gia cầm, ngoáy kỹ vùng định lấy mẫu Nếu lấy mẫu ngoáy họng, cầnđưa đầu tăm bông vào đến khí quản để lấy được dịch trong đường hô hấp Sau đóđưa đầu tăm bông vào tube chứa 3 ml môi trường vận chuyển và nhúng kỹ trongmôi trường vận chuyển Nhấc đầu tăm bông lên khỏi môi trường, ép nhẹ vào thànhtube để lượng dịch còn lại ở đầu tăm bông xuống hết

- Mẫu mô: Đối với gia cầm chết hoặc bị bệnh, tiến hành mổ gia cầm và thuthập mẫu mô (phổi, khí quản, ruột ) và cho vào tube chứa môi trường vận chuyểnvirus.

Bảo quản mẫu: Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập được bảo quản bằng đá

lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong vòng 48 giờ Nếu không vậnchuyển được mẫu về phòng thí nghiệm trước 48 giờ thì bảo quản ở -20oC hoặc -

70oC Khi vận chuyển, mẫu vẫn giữ ở trạng thái đông băng

Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm:

Bệnh phẩm trước khi vận chuyển được đóng gói kỹ trong 3 lớp nhằm bảo vệbệnh phẩm trong quá trình vận chuyển: Vặn chặt nắp tube bệnh phẩm, bọc kỹmiệng tube bằng giấy parafin, bọc riêng từng tube bệnh phẩm bằng giấy thấm, đặttube vào túi nylon vận chuyển, buộc chặt Tiếp tục bọc bên ngoài túi vận chuyểnbằng giấy thấm hoặc bông thấm nước, cho vào một túi nylon khác và buộc chặt.Phiếu thu thập bệnh phẩm được cho cùng với túi bệnh phẩm vào lớp túi nylon thứ 3,buộc chặt Cho các túi bệnh phẩm đã đóng gói kỹ vào hộp bảo quản lạnh và vậnchuyển về phòng thí nghiệm

2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm

Xử lý mẫu

- Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thập trên gia cầm được cho vào tube 2

ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sạch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút vàthu lấy dịch nổi để tách chiết RNA

- Đối với mẫu ngoáy họng và ngoáy hậu môn được cho vào tube có chứadung dịch vận chuyển virus Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi để tách chiết RNA

Tách chiết RNA

Sử dụng 0.14 ml dịch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bộ sinhphẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol

Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫncủa nhà sản xuất Và các bước tách chiết như sau:

- Hút 560 μl dung dịch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml

- Thêm 140 μl bệnh phẩm đã được xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier

RNA Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây

- Để ở nhiệt độ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn,

ly tâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy tube

- Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, lytâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy tube

- Hút 630 μl dung dịch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đặt sẵn

trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt miệng tube Đóng chặt nắp và ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút Nhấc QIAamp spin column ra đặt column vào một tube 2

- Đặt QIAamp spin column vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube cũ Bổ sung

60 μl buffer AVE Đóng chặt nắp, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút

RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoặc –70°C

2.2.4 Thiết kế mồi

Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổsung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại Mồi có vai trò khởi độngenzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và

độ chính xác của phản ứng PCR

Để có thể phát hiện được virus trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCRvới độ đặc hiệu cao thì một trong những yếu tố quyết định chính là việc thiết kế

mồi Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xácđịnh Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi pháthiện 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm:

- Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen M của tất cả cácsubtype của virus cúm A

- Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen HA của virus cúm

A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype

HA khác

- Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen NA của virus cúm

A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype

NA khác

Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủngvirus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kíchthước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau;

tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn;tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi đểgiảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàntoàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bêntrong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNAđích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di

Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó

là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11 Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cácgen M, HA và NA như sau:

+ Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information)

( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/request.cgi ), lựa chọn

các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vật chủ (bất kỳ), khu vực (bấtkỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thời gian lưu hành, subtype (H5N1),

+ Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đãđược công bố trên GenBank dưới dạng FASTA file Các chủng virus chọn để thiết

kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau

+ Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11+ Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit, lựa chọn các đoạn trình

tự có độ lặp lại cao để thiết kế mồi cho các gen

+ Phân tích các trình tự có độ lặp lại cao bằng phần mềm FastPCR 5.4 để lựachọn các trình tự mồi đặc hiệu sử dụng được trong cùng một phản ứng multiplexRT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1

+ Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với cáctrình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI

Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trêngen M của các subtype virus cúm A khác nhau Trong khi đó, các mồi phát hiện genH5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình

tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1

2.2.5 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA

Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR vớitừng cặp mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng độ mồi, nhiệt độ và thời gian gắnmồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lặp lại) thích hợp nhất để phát hiện được từnggen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bộsinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiệt C1000 (Biorad) Theo bộsinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giaiđoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng,nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ đượcthực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases vàtiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase Như vậy, tất cảcác thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trongcùng một lần Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 l bao gồm cácthành phần trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR

1 RNase free water

Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.2):

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

(phút)

Nhiệt độ ( o C)

2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase,

ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính

cDNA ban đầu

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi:

Muốn mồi có thể bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu trên sợi khuôn thì phải xác địnhđược nhiệt độ gắn mồi (Ta- annealing temperature) tối ưu cho từng cặp mồi Nhiệt

độ bắt cặp mồi tối ưu có thể nhỏ hơn hoặc lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm melting temperature) Bắt đầu tối ưu nhiệt độ gắn mồi ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm mồi

-khoảng 4-5oC Chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ 51oC đến 60oC để thử nghiệm tìm ranhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mỗi cặp mồi

Tối ưu nồng độ mồi:

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng

và hiệu quả của phản ứng Nồng độ mồi thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bắt cặp,sẩn phẩm khuếch đại thấp Ngược lại, nồng độ mồi quá cao sẽ hình thành những bắtcặp không đặc hiệu trên các vị trí khác nhau của mẫu và xuất hiện các primer -dimer, làm giảm sản phẩm PCR của các đoạn cần khuếch đại Để tìm được nồng độmồi tối ưu cho mỗi phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi đã thiết kế, chúng tôi thửnghiệm ở các nồng độ 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM; 0.6 µM; 0.7 µM; 0.8 µM và 0.9µM

Tối ưu thời gian gắn mồi và kéo dài chuỗi:

Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dàisản phẩm và loại template Thời gian kéo dài thử nghiệm ở 30 giây, 45 giây và 60giây để xác định thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất ở mỗi chu trình nhiệt củatừng phản ứng

Thời gian gắn mồi cũng được lựa chọn kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây

Tối ưu số chu kỳ phản ứng RT-PCR:

Để phân tích được bằng điện di, thì sản phẩm PCR phải đạt lượng nhất định

Số chu kỳ của phản ứng quá thấp sẽ không đủ để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện,còn số chu kỳ quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu và tốnnhiều thời gian đối với các xét nghiệm cần chẩn đoán nhanh Trung bình số chu kỳphản ứng khoảng 25-30 chu kỳ, nhưng trong phản ứng RT-PCR số chu kỳ phụthuộc vào nồng độ mẫu RNA cao hay thấp và lượng sản phẩm cDNA của phản ứngphiên mã ngược Để có số chu kỳ thích hợp cho mỗi phản ứng RT-PCR phát hiệntừng riêng rẽ, chúng tôi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ

Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA:

Độ nhạy của phản ứng RT-PCR là số bản copy RNA nhỏ nhất mà phản ứngPCR cho kết quả dương tính Để đánh giá độ nhạy của mỗi phản ứng RT-PCR,

chúng tối sử dụng các gen HA, NA và M của chủng virus cúm A/H5N1 gắn vào

plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp theo bộ sinh phẩmCloneJET™ PCR Cloning Kit Các bước như sau:

- Gắn các gen M, HA, NA vào vector pJET1.2/blunt (2974 bp): Làm tan đông

sản phẩm PCR, các sinh phẩm trong bộ kit CloneJet PCR Cloning và đặt trên đábào Hút 6 l (Nuclease free water), 10 l (2X reaction buffer), 1 l (sản phẩmPCR), 1 l (DNA blunting enzyme) vào tube PCR 0.2 ml, vortex và ly tâm nhẹtrong 3-5 giây Sau đó ủ ở 70oC trong 5 phút rồi đặt ngay lên đá lạnh Tiếp theo,thêm vào mỗi tube PCR 1 l (pJET 1.2/blunt cloning vector – 50 ng/l) và 1 l (T4DNA ligase - 5 u/l), vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây rồi để ở nhiệt độ phòngtrong 5 phút Sản phẩm phản ứng được sử dụng trực tiếp để biến nạp vào vi khuẩnE.coli

- Tạo tế bào khả biến: Sau khi gắn trình tự gen của virus cúm A/H5N1 vào

plasmid pJET1.2, để nhân lượng plasmid thì cần phải biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào E.coli TOP10 và nuôi cấy tế bào để plasmid có thể nhân lên với số lượnglớn Để tế bào E.coli có thể dung nạp plasmid, chúng tôi tạo tế bào E.coli khả biếnbằng phương pháp CaCl2 để làm cho vi khuẩn E.coli trở nên khả biến Các bước:Nuôi tế bào E.coli trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm Sau đócấy chuyển 40 l dịch cấy tế bào sang tube chứa 2 ml LB, lắc 200 vòng/phút ở 37oCtrong 2 giờ rồi để trên đá 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC Hút bỏdịch nổi, thu lấy cặn Bổ sung 1 ml CaCl2 100 mM (để ở 4oC từ trước) Tiếp theo lytâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn Bổ sung mộtlần nữa 1 ml CaCl2 100 mM, ly tâm, thu cặn tế bào Bổ sung 200 l CaCl2 100 mM

và 30 l glycerol Trộn đều, chia vào các tube, mỗi tube 50 l Giữ trên đá 1-2 giờtrước khi biến nạp (hoặc đông lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở -85oC)

- Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến: Lấy tế bào khả biến từ -85oC, đểtrên đá 30 phút (hoặc sử dụng tế bào khả biến vừa chuẩn bị) Bổ sung 5 l hỗn hợp

lai vào 50 l tế bào khả biến, để trên đá 30 phút Sốc nhiệt ở 42oC trong 2 phút, sau

đó đặt ngay lên đá bào trong 2 phút Bổ sung 200 l LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở

37oC trong 1 giờ Trải dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin(100 g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm

- Tách chiết plasmid với GeneJET Plasmid Miniprep Kit: Lấy 1 khuẩn lạc

riêng rẽ, nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC, 12-16 giờ trong tube falcon (chứa 3 ml LBlỏng đã bổ sung Ampicillin) Ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi,thu lấy cặn, sử dụng cặn này để tách chiết plasmid tái tổ hợp Các bước: hòa tan cặn

tế bào trong 250 l Resuspension Solution, bổ sung 250 l Lysis Solution và trộnđều Thêm 350 l Neutralization Solution, trộn đều Ly tâm 13000 vòng/phút trong

5 phút để làm lắng các thành phần của tế bào và DNA nhiễm sắc thể Chuyển dịchnổi chứa plasmid sang GeneJET spin column Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1phút, đổ bỏ dịch và đặt column trở lại Thêm 500 l Wash Solution vào column, lytâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch và đặt column trở lại (làm 2 lần) Lytâm 13000 vòng/phút, 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong column Chuyểncolumn sang một tube 1.5 ml, bổ sung 50 l Elution Buffer vào chính giữa mànglọc của cột Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút và vứt bỏ cột lọc Điện di 5 ltrên gel agarose 1% để kiểm tra sự tinh sạch của plasmid Bảo quản plasmid tinhsạch ở -20oC Để chắc chắn trình tự gen của virus cúm A/H5N1 đã được gắn vớiplasmid chúng tôi kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR

- Sau khi có plasdmid gắn các gen M, HA và NA của virus A/H5N1 tiến hànhtổng hợp RNA với bộ sinh phẩm TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit(Fermentas) Các bước:

+ Chuẩn bị 20 µl thể tích phản ứng RT ở nhiệt độ phòng gồm các thành phần: 4

µl (5X TranscriptAid Reaction Buffer); 8 µl (ATP/CTP/GTP/UTP mix); 1 µg(Template DNA); 2 µl (TranscriptAid Enzyme Mix); to 20 µl (DEPC-treated water).+ Trộn đều, ly tâm nhẹ và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ

Tinh sạch RNA được phiên mã: Các plasmid tái tổ hợp (DNA) sau phiên mã

được loại bỏ nhờ DNase I RNA phiên mã được tách chiết với phenol:chloroform, kếttủa RNA bằng ethanol:

+ Bổ sung 115 µl DEPC-treated water và 15 µl dung dịch Sodium Acetate 3 M,

pH 5.2 vào 20 µl hỗn hợp phản ứng phiên mã Trộn đều

+ Bổ sung hỗn hợp phenol/chloroform với tỷ lệ 1:1, sau đó xử lý 2 lần vớichloroform tho tỷ lệ 1:1 Ly tâm và hút dịch ở pha trên sang một tube mới

+ Tủa RNA bằng với 2 thể tích ethanol Ủ ở -20oC ít nhất 30 phút và ly tâm đểthu RNA

+ Loại bỏ dịch nổi, thêm 500 µl ethanol 70% lạnh để rửa tủa

+ Hoà tủa RNA với 20 µl DEPC-treated water, bảo quản RNA ở -20oC hoặc-70oC

Xác định chất lượng (độ tinh khiết) RNA bằng cách đo khả năng hấp thụ ánhsáng tử ngoại (mật độ quang - OD: Optical density) ở bước sóng 260nm và 280nm trênmáy Biophotometer (Eppendorf) Nếu tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1.8 - 2.0 thìRNA là tinh khiết Từ giá trị OD260nm, xác định nồng độ của RNA theo công thức:

Nồng độ dung dịch RNA (ng/µl) = OD260 x 40 ng/µl

Dựa vào nồng độ RNA và kích thước của đoạn RNA được phiên mã tính được sốbản sao RNA trong một đơn vị thể tích theo công thức:

Số bản copy/l = [Nồng độ RNA (ng/µl) x 6.023x1023]/[L x 330 x 109 (ng)] Với: L: số nucleotide của RNA; 330x109: Khối lượng 1 nucleotide tính ra ng;6.023x1023: Số Avogadro

Sau đó, mẫu RNA được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ giảm dần 10lần đến 101 bản sao RNA/µl và sử dụng làm mẫu chuẩn để đánh giá độ nhạy của phảnứng

Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng:

Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M, HA và NAchúng tôi sử dụng các mẫu RNA của virus cúm A/H1N1, cúm A/H3, cúm B (Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp), cúm A/H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú YTrung ương cung cấp) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phòng thí nghiệm đểkiểm tra xem có hiện tượng phản ứng chéo xảy ra hay không

2.2.6 Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1