nghiên cứu y học Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật

C˜n Bianchi vˆ CS 1997 tiến hˆnh kỹ thuật PCR định lượng dựa tr•n c‡c tế bˆo nguy•n vẹn trong m‡u thai phụ đ‹ ph‡t hiện được khoảng 1 tế bˆo thai c— nh‰n/1ml m‡u toˆn phần của thai phụ m

Tiền sản giật t‡c động nhiều đến mẹ vˆ thai nhi, hậu quả c— thể g‰y biến chứng nặng cho mẹ: sản giật, rau bong non, rối loạn đ™ng m‡u, suy gan, suy thận,É., cho đến nay tiền sản giật vẫn lˆ nguy•n nh‰n hˆng đầu g‰y tử vong cho mẹ; đối với thai nhi c— thể g‰y hậu quả: thai chậm ph‡t triển, suy thai, É

Hiện nay, c•ng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật th“ c‡c kỹ thuật sinh học ph‰n tử kh™ng ngừng được ứng dụng rộng r‹i trong lĩnh vực y học Việc ph‡t hiện ra DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ đ‹ mở ra một hướng mới đ— lˆ chẩn đo‡n trước sinh bằng c‡c kỹ thuật kh™ng x‰m lấn [4] Nhiều nghi•n cứu cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương, huyết thanh thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai, tăng cao bất thường li•n quan đến c‡c biến chứng của thai kỳ (tiền sản giật, đẻ non, thai lệch bội nhiễm sắc thể 21, ) vˆ được thải trừ nhanh ch—ng sau sinh [5],[6] Nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ tăng cao c— ý nghĩa lần đầu ti•n từ tuần thai thứ 17 vˆ lần thứ 2 vˆo thời điểm 3 tuần trước khi c— triệu chứng l‰m sˆng của tiền sản giật [7] Điều nˆy gợi ý khả năng ứng dụng kỹ thuật định lượng DNA ph™i thai tự do để sˆng lọc vˆ ph‡t hiện sớm c‡c thai phụ c— nguy cơ tiền sản giật Một số nghi•n cứu đ‹ sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng được DNA thai từ tuần thứ 5 vˆ 6 của thai kỳ vˆ tr•n cơ sở kỹ thuật nˆy đ‹ được

‡p dụng vˆo chẩn đo‡n trước sinh kh™ng x‰m lấn một c‡ch ch’nh x‡c vˆ hiệu

quả hơn trong việc theo d›i, dự đo‡n c‡c nguy cơ của cả mẹ vˆ thai nhi trong qu‡ tr“nh thai nghŽn [8],[9],[10]

Ở Việt Nam, hiện tại chẩn đo‡n tiền sản giật dựa vˆo triệu chứng của bệnh: huyết ‡p cao, protein niệu, b•n cạnh đ— việc theo d›i ph‡t hiện tiền sản giật dựa vˆo c‡c triệu chứng của bệnh nh‰n ph‡t hiện ra vˆ tự đến kh‡m: ph•, nhức đầu,É C‡c xŽt nghiệm sˆng lọc định lượng c‡c dấu ấn như αFP, HCG, uE3 nhưng t’nh đặc hiệu, chẩn đo‡n vˆ theo d›i dọc kh™ng cao [11] Với mục đ’ch nghi•n cứu vai tr˜ của DNA ph™i thai tự do trong tiền sản giật để giœp thầy thuốc l‰m sˆng c— th•m một dấu ấn sinh học trong dự b‡o sớm, theo d›i

vˆ ti•n lượng tiền sản giật nhằm n‰ng cao chất lượng cuộc sống, chœng t™i tiến

hˆnh nghi•n cứu đề tˆi "Nghi•n cứu DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự b‡o sớm tiền sản giật" với

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1.! TỔNG QUAN VỀ DNA PHïI THAI TỰ DO LƯU HËNH TRONG HUYẾT TƯƠNG THAI PHỤ

1.1.1.!Nguồn gốc của DNA ph™i thai tự do

Mặc d• DNA ph™i thai trong huyết tương thai phụ đ‹ được biết đến với nhiều ứng dụng tiềm năng nhưng cơ chế sinh học lại c˜n nhiều điều chưa s‡ng

tỏ C— khả năng một trong những nguồn gốc của DNA ph™i thai tuần hoˆn lˆ c‡c tế bˆo thai c— nh‰n trong m‡u mẹ [12] Nghi•n cứu của Sekizawa vˆ CS (2000) thấy rằng c— một lượng lớn tế bˆo thai c— nh‰n chết theo chương tr“nh

vˆ c— thể giải ph—ng DNA ph™i thai vˆo huyết tương thai phụ [13] Đ— cũng lˆ

lý do mˆ số lượng tế bˆo thai vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ bị tiền sản giật hoặc c— nguy cơ sinh con lệch bội đều tăng cao bất thường [14],[15],[16] Theo Lo vˆ CS (1999), DNA ph™i thai tự do được giải ph—ng ở c‡c thời kỳ kh‡c nhau kh™ng chỉ theo một c‡ch hoặc từ một nguồn gốc [14] C— nhiều giả thuyết về nguồn gốc m™ học của DNA ph™i thai tuần hoˆn thai phụ, trong đ— c— 3 khả năng: từ những tế bˆo thai c— nh‰n lưu hˆnh trong v˜ng tuần hoˆn mẹ, từ rau thai vˆ sự trao đổi trực tiếp của c‡c ph‰n tử DNA

1.1.1.1.! Nguồn gốc của DNA ph™i thai tự do từ những tế bˆo thai c— nh‰n lưu hˆnh trong tuần hoˆn mẹ

Theo Rudin vˆ CS (1997) hˆng ngˆy c— sự ph‰n chia 1011Ð1012 tế bˆo vˆ một lượng tương đương sẽ mất đi để duy tr“ sự c‰n bằng m™, do vậy c— khoảng 1Ð10g DNA c— thể bị thải trừ mỗi ngˆy vˆ c— mặt trong huyết tương [17] C˜n Bianchi vˆ CS (1997) tiến hˆnh kỹ thuật PCR định lượng dựa tr•n c‡c tế bˆo nguy•n vẹn trong m‡u thai phụ đ‹ ph‡t hiện được khoảng 1 tế bˆo thai c— nh‰n/1ml m‡u toˆn phần của thai phụ mang thai b“nh thường Từ đ—, t‡c giả

cho rằng c‡c tế bˆo thai c— nh‰n trong tuần hoˆn thai phụ c— thể lˆ nguồn gốc m™ học th’ch hợp của DNA ph™i thai tự do [12] Căn cứ vˆo nghi•n cứu của Fournie vˆ CS (1993) vˆ Sekizawa vˆ CS (2000), Bianchi vˆ CS (2004) cho rằng DNA ph™i thai tự do được giải ph—ng vˆo m‡u mẹ lˆ do t‡c động của hệ thống miễn dịch của mẹ đối với c‡c tế bˆo thai chết theo chương tr“nh [13],[18],[19]

C‡c tế bˆo vˆ c‡c acid nucleic của thai trong tuần hoˆn thai phụ đều tăng trong c‡c biến chứng thai nghŽn như tiền sản giật vˆ thai lệch bội, điều nˆy cho phŽp nghĩ rằng giữa chœng c— thể tồn tại một mối li•n quan nˆo đ— Để t“m hiểu

về mối li•n quan giữa c‡c tế bˆo hồng cầu c— nh‰n của thai với nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ, Zhong vˆ CS (2002) đ‹ sử dụng m‡u toˆn phần của c‡c thai phụ mang thai nam (gồm: nh—m b“nh thường vˆ nh—m c— nguy cơ tiền sản giật, đẻ non), tiến hˆnh đồng thời 2 phương ph‡p: lai tại chỗ huỳnh quang để đếm số tế bˆo thai vˆ kỹ thuật PCR x‡c định nồng độ DNA ph™i thai tự do [20] Kết quả cho thấy kh™ng c— mối li•n quan giữa c‡c tế bˆo thai vˆ DNA ph™i thai tự do trong c‡c trường hợp nˆy Điều đ— gợi ý rằng, c‡c

tế bˆo hồng cầu c— nh‰n của thai kh™ng phải lˆ nguồn gốc của DNA ph™i thai

tự do trong m‡u thai phụ c— nguy cơ đẻ non, v“ trong nh—m nˆy lượng DNA ph™i thai tự do tăng một c‡ch c— ý nghĩa mˆ kh™ng c— sự tăng tương ứng của c‡c tế bˆo hồng cầu c— nh‰n của thai

Angert vˆ CS (2003) đ‹ giả sử rằng sau khi lấy m‡u vˆo ống nghiệm, c‡c

tế bˆo thai chết theo chương tr“nh sẽ tan r‹ hết trong ống nghiệm vˆ giải ph—ng DNA của chœng; hoặc c‡c tế bˆo thai bị tan r‹ sau khi tiếp xœc với hệ thống miễn dịch của mẹ vˆ dẫn đến giải ph—ng DNA ph™i thai nhiều hơn; sau đ— tiến hˆnh nghi•n cứu c‡c mẫu huyết tương thai phụ được lấy 2 lần vˆo 2 thời điểm kh‡c nhau lˆ 3 th‡ng đầu vˆ 3 th‡ng cuối rồi định lượng DNA tr•n nhiễm sắc thể (NST) Y - dấu ấn của thai vˆ DNA β-globin - dấu ấn của DNA của cả thai

vˆ mẹ ở c‡c thời điểm trong v˜ng 24 giờ Kết quả lˆ c‡c thời điểm trong v˜ng

24 giờ ở cả 2 giai đoạn của thai kỳ đều kh™ng c— sự tăng DNA ph™i thai trong ống nghiệm [21] Như vậy, những tế bˆo huyết học của thai ở trong ống nghiệm kh™ng phải lˆ nguồn gốc duy nhất vˆ quan trọng nhất của DNA ph™i thai tự do

1.1.1.2.! Nguồn gốc của DNA ph™i thai tự do từ rau thai

Rau thai lˆ nguồn gốc hợp lý của DNA ph™i thai tự do v“ k’ch thước của n— cũng như c‡c tế bˆo hoạt động phong phœ Rất nhiều nghi•n cứu đ‹ thấy rằng c— mối li•n hệ giữa nồng độ DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn

mẹ với tuổi thai [13],[22],[23] Sekizawa vˆ CS (2003) nghi•n cứu ở 15 thai phụ (h“nh thức đẻ lˆ mổ lấy thai) c— c•ng tuổi thai trong đ— gồm 5 thai phụ tiền sản giật vˆ 10 thai phụ b“nh thường, t‡c giả đ‹ ph‰n t’ch c‡c cặp mẫu huyết tương của mẹ vˆ huyết tương của con (lấy từ m‡u d‰y rốn của con), sử dụng 7 dấu ấn kh‡c nhau tr•n c‡c NST 13, 18 vˆ 21 để ph‰n biệt DNA ph™i thai tự do với DNA mẹ Kết quả cho thấy nồng độ trung b“nh của DNA ph™i thai trong huyết tương ở d‰y rốn (trung vị 0.9%, khoảng 0.2 - 8.4%) thấp hơn đ‡ng kể so với DNA trong huyết tương mẹ (14.3%, 2.3 - 64%) với p = 0,007; từ đ—, t‡c giả khẳng định rằng DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ c— nguồn gốc từ rau thai [24]

Với mục đ’ch để chứng minh giả thuyết DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương của thai phụ c— nguồn gốc chủ yếu từ rau thai, nghi•n cứu năm 2007 tiến hˆnh tr•n hai nh—m: nh—m 1 gồm 15 thai phụ b“nh thường ở tuần thứ 11 của thai kỳ (11 thai phụ mang thai nam vˆ 04 thai phụ mang thai nữ) vˆ nh—m 2 gồm 9 thai phụ ở tuần thứ 8 của thai kỳ được chẩn đo‡n lˆ mang thai kh™ng ph™i (c— tœi thai nhưng kh™ng c— ph™i thai), trong thực tế, nồng độ DNA ph™i thai tự do c— xu hướng cao hơn tập trung ở nh—m thai phụ mang thai kh™ng ph™i, c— lẽ ở những thai phụ nˆy th“ qu‡ tr“nh c‡c tế bˆo rau thai chết theo

chương tr“nh tăng cao hơn Kết quả nˆy ủng hộ giả thuyết rằng rau thai lˆ nguồn ch’nh của c‡c DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ [8]

1.1.1.3.! Nguồn gốc từ sự trao đổi trực tiếp của c‡c ph‰n tử DNA ph™i thai

độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương của thai phụ, tuy nhi•n, c‡c nghi•n cứu đ‹ cho thấy kh™ng c— sự tương quan giữa nồng độ DNA ph™i thai tự do trong dịch ối vˆ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương của thai phụ

Zhong vˆ CS (2006) cũng đ‹ nghi•n cứu về mối tương quan của nồng độ của DNA ph™i thai tự do trong dịch ối vˆ trong huyết tương thai phụ mang thai

dị tật bằng kỹ thuật Realtime PCR, kết quả cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự

do trong nước ối trung b“nh lˆ 3978 copy/ml nước ối vˆ trong huyết tương lˆ 96,6 copy/ml huyết tương của thai phụ, tuy nhi•n, kh™ng c— sự tương quan đ‡ng

kể giữa nồng độ DNA ph™i thai tự do trong dịch ối vˆ huyết tương của thai phụ Như vậy, mˆng ối kh™ng g—p phần vˆo sự hiện diện của DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ [27] Một nghi•n cứu định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương, trong dịch ối vˆ trong khoang mˆng ối

ở thai phụ tuần thứ 7 - 9, kết quả nồng độ DNA ph™i thai tự do trong dịch ối cao nhất, trong khoang mˆng ối thấp hơn vˆ trong huyết tương thai phụ lˆ thấp nhất [29] Một số t‡c giả cho rằng k’ch thước của DNA ph™i thai tự do trong tuần hoˆn thai phụ 100 - 300bp, tương đương khoảng 30 - 90kDa, cˆng khẳng định DNA ph™i thai tự do trong dịch ối kh™ng thể trao đổi trực tiếp với tuần hoˆn thai phụ

Như vậy, sự c— mặt của DNA ph™i thai tự do trong dịch ối vˆ trong tuần hoˆn lˆ qu‡ tr“nh trao đổi trực tiếp từ thai vˆo dịch ối vˆ từ thai vˆo tuần hoˆn

mẹ Điều nˆy cho phŽp nghĩ đến sự trao đổi trực tiếp của c‡c ph‰n tử DNA ph™i thai tự do qua rau thai hoặc qua dịch ối C— thể cho rằng phần lớn DNA ph™i thai tự do trong tuần hoˆn thai phụ c— nguồn gốc từ rau thai, một ngoại lệ c— nguồn gốc từ c‡c tế bˆo thai c— nh‰n trong tuần hoˆn thai phụ vˆ c— khả năng

từ ch’nh thai th™ng qua trao đổi trực tiếp

1.1.2.!K’ch thước của DNA ph™i thai tự do

Để ph‰n biệt DNA ph™i thai tự do hay DNA c— nguồn gốc từ thai phụ lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ, nhiều nghi•n cứu đ‹ được tiến hˆnh Năm

2004, Chan KC vˆ CS đ‹ nghi•n cứu để x‡c định sự ph‰n bố về k’ch thước của DNA lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe với cặp mồi của gen leptin (gồm 1 mồi xu™i vˆ 9 mồi ngược với k’ch thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng lˆ 105bp, 145bp, 201bp, 280bp, 356bp, 449bp, 576bp, 697bp, 798bp), đồng thời với cặp mồi của gen SRY x‡c định sự ph‰n bố k’ch thước của DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ (gồm 1 mồi xu™i vˆ 6 mồi ngược với k’ch thước sản phẩm sau Realtime PCR tương ứng lˆ: 107bp, 137bp, 193bp, 313bp, 392bp, 524bp) Kết quả cho thấy: 57% DNA của người mẹ c— k’ch thước > 201bp; hầu hết k’ch thước của DNA ph™i thai tự do ngắn ≤ 193bp, 20% k’ch thước > 193bp, 0% k’ch thước > 313bp vˆ ngắn hơn DNA c— nguồn gốc từ của mẹ [30] Theo nghi•n cứu của Li Y vˆ CS, khi sử dụng cặp mồi của gen SRY th“ k’ch thước của DNA ph™i thai tự do < 300bp c˜n DNA c— nguồn gốc từ mẹ c— k’ch thước ph‰n tử >1kb [31] Nghi•n cứu của Fan HC vˆ CS (2010), khi sử dụng cặp mồi của gen SRY x‡c định được k’ch thước của DNA ph™i thai tự do khoảng 130 - 150bp, nhưng kh™ng dˆi hơn 250bp [32]

1.1.3.!Thời gian b‡n hủy t/2 của DNA ph™i thai tự do

DNA ph™i thai tự do chiếm khoảng 11 - 13% của tổng số DNA lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ Thời gian xuất hiện DNA ph™i thai tự do đầu ti•n lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ tại thời điểm thai 5 - 7 tuần vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự do tăng dần theo tuổi thai [33] Tốc độ thay thế của DNA ph™i thai tuần hoˆn cũng đ‹ được c‡c t‡c giả nghi•n cứu về sự thải trừ DNA ph™i thai tuần hoˆn sau sinh Năm 1999, Lo vˆ CS nghi•n cứu ở c‡c thai phụ mang thai nam, thấy rằng thời gian b‡n hủy t/2 của DNA ph™i thai tự do khoảng 16,3 phœt (từ 4Ð30 phœt) [14] Nghi•n cứu của Smid vˆ CS (2003), nồng độ DNA thai sau sinh rất thấp vˆ kh™ng ph‡t hiện được DNA thai sau sinh 2 ngˆy [34] Nghi•n cứu gần đ‰y của Tsui vˆ CS (2012) c— thể ph‡t hiện được DNA thai trong nước tiểu của thai phụ bằng kỹ thuật MPS (massively parallel sequencing) nhưng cũng thải trừ hết sau sinh 2 ngˆy [35] Năm 2013, Stephanie vˆ CS thấy rằng tốc độ giải ph—ng DNA ph™i thai tự do vˆo tuần hoˆn thai phụ sau khi sinh xảy

ra 2 giai đoạn với cơ chế động học kh‡c nhau: giai đoạn ban đầu nhanh với thời gian b‡n hủy t/2 khoảng 1h, trong khi giai đoạn chậm với thời gian b‡n hủy t/2 khoảng 13h, tuy nhi•n sau sinh 1-2 ngˆy cũng kh™ng ph‡t hiện được DNA ph™i thai tự do [36]

Do đ—, với giả thuyết kh™ng c— những thay đổi đột ngột sự thải trừ DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn mẹ do qu‡ tr“nh chuyển dạ vˆ đẻ, c‡c t‡c giả t’nh to‡n rằng để duy tr“ t“nh trạng ổn định, DNA ph™i thai tự do c— thể được giải ph—ng tiếp tục vˆo tuần hoˆn mẹ với tốc độ trung b“nh 2,24Ð104 bản copy/phœt Với tốc độ giải ph—ng vˆ thải trừ nhanh ch—ng, số lượng DNA ph™i thai đ‹ cung cấp một bức tranh toˆn cảnh vˆ chi tiết theo thời gian về sự sản xuất vˆ thải trừ DNA ph™i thai tự do, v“ vậy sẽ c— ’ch cho gi‡m s‡t thai nghŽn

1.1.4.!T“nh h“nh nghi•n cứu DNA ph™i thai tự do ở nước ngoˆi vˆ ở Việt Nam

1.1.4.1.! Ở nước ngoˆi

a, DNA ph™i thai tự do vˆ tiền sản giật

Hai năm sau khi ph‡t hiện được c— DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương của thai phụ, Lo vˆ CS tiến hˆnh nghi•n cứu ở 20 thai phụ tiền sản giật (TSG), sử dụng kỹ thuật Realtime PCR định lượng nồng độ DNA ph™i thai

tự do vˆ chứng minh rằng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong nh—m thai phụ TSG đ‹ tăng gấp 5 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường c— tuổi thai tương ứng [14] Kết quả nˆy tương tự như nghi•n cứu của một số t‡c giả kh‡c như Leung

vˆ CS (2001) khi nghi•n cứu 18 thai phụ c— tuần thai trung b“nh lˆ 17 tuần (dao động từ 11 - 22 tuần) được định lượng nồng độ DNA ph™i thai trước khi c— triệu chứng của TSG lˆ 42 copy/ml (dao động 36 Ð 2375 copy/ml) trong khi đ—

ở nh—m chứng (33 thai phụ) nồng độ DNA ph™i thai tương ứng lˆ 22 copy/ml (dao động từ 4,2 - 300 copy/ml) vˆ Zhong vˆ CS (2002) thấy c— sự gia tăng nồng độ DNA ph™i thai trong huyết tương của những thai phụ TSG [16],[20] Một nghi•n cứu được tiến hˆnh với cỡ mẫu lớn hơn bao gồm 120 thai phụ b“nh thường vˆ 120 thai phụ TSG, t‡c giả cũng thấy rằng nồng độ DNA ph™i thai tự

do trong huyết tương thai phụ TSG tăng cao gấp 2-5 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường c— c•ng tuổi thai tương ứng, đồng thời ở những thai phụ tiến triển thˆnh TSG nồng độ DNA ph™i thai tự do tăng đột ngột vˆo thời điểm tuần 17

vˆ tuần 28, khoảng 3 tuần trước khi c— triệu chứng của TSG [37] Năm 2004, Bianchi vˆ CS ph‡t hiện thấy nồng độ DNA ph™i thai tự do trong c‡c mẫu huyết tương tăng l•n một c‡ch c— ý nghĩa lần đầu ti•n từ tuần thai thứ 17 vˆ lần thứ hai vˆo thời điểm 3 tuần trước khi c— triệu chứng l‰m sˆng của TSG T‡c giả đưa ra giả thuyết rằng: nồng độ DNA tăng lần đầu ti•n lˆ do sự hoại tử của rau thai hoặc c‡c tế bˆo chết theo chương tr“nh, c˜n nồng độ DNA tăng lần thứ hai

lˆ do c‡c triệu chứng của TSG lˆm rối loạn c‡c chức năng của mẹ kŽo theo rối loạn sự bˆi tiết DNA ph™i thai [19] Zhong vˆ CS (2004) định lượng được nồng

độ DNA ph™i thai trước khi c— triệu chứng của TSG lˆ 423 copy/ml (dao động

97 - 1642 copy/ml), nh—m chứng: 129 copy/ml (dao động từ 31 - 318 copy/ml) [38] Trước đ—, Lo vˆ CS (1999) cũng đ‹ chứng minh: b•n cạnh nồng độ DNA ph™i thai tự do tăng cao c˜n k•m theo tăng lưu hˆnh của những tế bˆo thai c— nh‰n trong huyết tương thai phụ TSG [14]

Nghi•n cứu năm 2005, định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương của c‡c thai phụ b“nh thường vˆ thai phụ TSG bằng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi của gen DYS14 thay v“ cặp mồi của gen SRY như c‡c nghi•n cứu trước lại thấy rằng nồng độ DNA ph™i thai trong huyết tương của nh—m thai phụ TSG tăng cao gấp 10 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường [39] Ban đầu, c‡c t‡c giả cho rằng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương của thai phụ tăng cao lˆ do sự kết hợp của rau thai bất thường dẫn tới lˆm gia tăng nồng độ DNA ph™i thai tự do vˆ do chức năng của gan vˆ thận

bị suy giảm dẫn tới lˆm giảm độ thanh thải DNA ph™i thai tự do trong tuần hoˆn [7],[40] Một nghi•n cứu kh‡c đ‹ chứng minh nồng độ của DNA ph™i thai

tự do lưu hˆnh trong huyết tương của nh—m thai phụ TSG cao hơn nh—m thai phụ b“nh thường ở tuần 17 - 20 của thai kỳ, tuy nhi•n, sự kh‡c biệt kh™ng đ‡ng

kể về nồng độ DNA ph™i thai tự do giữa hai nh—m nˆy ở tuần từ 25 - 28 của thai kỳ vˆ kh™ng c— sự kh‡c biệt ở tuần từ 13 - 16 của thai kỳ [37] Theo nghi•n cứu của Sifakis vˆ CS (2009), ở những thai phụ c— nồng độ DNA ph™i thai tự

do lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ tăng ở tuần 11- 13 của thai kỳ th“ tiến triển thˆnh TSG nặng ở giai đoạn sau của thai kỳ, tuy nhi•n, đối với những thai phụ tiến triển thˆnh TSG nhẹ th“ nồng độ DNA ph™i thai tự do tương đương với nh—m thai phụ b“nh thường [9] Seval M.M vˆ CS (2015) d•ng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA ph™i thai tự do của 16 thai phụ c— thai từ

tuần thứ 28 đến 32 của thai kỳ trong đ— c— 8 thai phụ b“nh thường vˆ 8 thai phụ TSG, kết quả cho thấy nồng độ DNA ph™i thai ở nh—m thai phụ TSG tăng cao hơn so với nh—m thai phụ b“nh thường [41]

Như vậy, việc ph‡t hiện vˆ định lượng được c‡c gen bằng kỹ thuật Realtime PCR lˆ một vấn đề quan trọng trong nghi•n cứu vˆ trong thiết lập qui tr“nh chẩn đo‡n l‰m sˆng Nồng độ DNA ph™i thai tự do tăng c— li•n quan đến c‡c giai đoạn của qu‡ tr“nh thai nghŽn vˆ tăng cao trước khi c— triệu chứng l‰m sˆng của TSG n•n c— gi‡ trị dự b‡o sớm TSG

b, Một số ứng dụng l‰m sˆng kh‡c của DNA ph™i thai tự do

DNA ph™i thai tự do vˆ sˆng lọc thai lệch bội

Chẩn đo‡n kh™ng x‰m lấn ph‡t hiện thai lệch bội được c‡c nhˆ khoa học rất quan t‰m, đ— lˆ do nguy cơ sảy thai mˆ c‡c quy tr“nh chẩn đo‡n c— x‰m lấn (chọc dịch ối, sinh thiết tua rau, ) c— thể g‰y ra D•ng c‡c tế bˆo trong m‡u toˆn phần của thai phụ, Bianchi vˆ CS thấy rằng DNA được giải ph—ng từ những tế bˆo thai nguy•n vẹn trong m‡u thai phụ tăng gấp 6 lần khi thai bị lệch bội NST 21 [12] Vˆ nồng độ DNA ph™i thai ở c‡c thai phụ mang thai lệch bội NST 21 vˆ thai nam lệch bội lần lượt lˆ 48,2 copy/ml vˆ 16,3 copy/ml [19] Số liệu tương ứng của Lo vˆ CS (1999) lần lượt: 46 copy/ml vˆ 23,3 copy/ml [14]

Năm 2003, Wataganara vˆ CS (2003) định lượng DNA ph™i thai từ c‡c mẫu huyết thanh được bảo quản đ™ng lạnh của 5 thai phụ mang thai nam bị lệch bội NST 18; 5 thai phụ mang thai nam bị lệch bội NST 13 vˆ 5 thai phụ b“nh thường để lˆm chứng (đ‹ được chọn lựa tương ứng về tuổi thai, giới t’nh thai vˆ thời gian bảo quản) Kết quả cho thấy nồng độ DNA ph™i thai huyết thanh trong c‡c trường hợp lệch bội NST 13 lˆ 97,5 copy/ml (dao động 29,2Ð187,0 copy/ml), lệch bội NST 18 lˆ 31,5 copy/ml (dao động 18,6Ð77,6 copy/ml)

vˆ mẫu chứng lˆ 40,3 copy/ml (dao động 3,7Ð127,4 copy/ml) Như vậy, nồng

độ DNA ph™i thai trong c‡c trường hợp lệch bội NST 13 tăng cao trong khi ở

c‡c trường hợp lệch bội NST 18 kh™ng kh‡c so với c‡c mẫu chứng Đồng thời, sˆng lọc huyết thanh mẹ trong 3 th‡ng giữa kh™ng ph‡t hiện được thai c— nguy

cơ lệch bội NST 13 [42] V“ vậy, định lượng DNA ph™i thai tự do nếu được bổ sung vˆo sˆng lọc huyết thanh mẹ cơ bản c— thể n‰ng cao gi‡ trị ph‡t hiện c‡c thai c— nguy cơ bị lệch bội NST 13

DNA ph™i thai tự do vˆ thai chậm ph‡t triển trong tử cung

Thai chậm ph‡t triển trong tử cung (IUGR - Insufficiency in Intrauterine Growth Restriction) lˆ một rối loạn phức tạp trong thai kỳ với nhiều nguy•n nh‰n kh‡c nhau Nghi•n cứu của Sekizawa vˆ CS (2003) định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ ở 2 nh—m: nh—m thai phụ mang thai c— thai chậm ph‡t triển trong tử cung vˆ nh—m thai phụ mang thai b“nh thường c— c•ng tuổi thai, kết quả cho thấy kh™ng c— sự kh‡c biệt nồng độ DNA ph™i thai tự do giữa 2 nh—m nˆy [43] Một nghi•n cứu tiếp theo vˆo năm 2006 của Smith vˆ CS lại chứng minh rằng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ ở nh—m thai phụ mang thai c— thai chậm ph‡t triển trong tử cung tăng cao hơn so với nh—m thai phụ b“nh thường mˆ nguy•n nh‰n một phần lˆ

do suy rau thai [44] Kết quả nˆy cũng tương tự như nghi•n cứu của một số t‡c giả kh‡c khi nghi•n cứu với cỡ mẫu lớn hơn [45],[46] Như vậy, việc định lượng DNA ph™i thai tự do trong tuần hoˆn thai phụ cũng lˆ một dấu ấn c— gi‡ trị gợi

ý chẩn đo‡n những trường hợp thai phụ mang thai mˆ thai chậm ph‡t triển trong

tử cung

DNA ph™i thai tự do vˆ đẻ non

Nghi•n cứu năm 2013 gồm 60 thai phụ mang thai tuần từ 28 - 32 của thai

kỳ trong đ— 30 thai phụ c— nguy cơ đẻ non vˆ 30 thai phụ b“nh thường, định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR, kết quả cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự do của nh—m thai phụ đẻ non tăng gấp 6 lần so với nh—m thai phụ b“nh thường với p<0,05, điều

nˆy c— nghĩa: khi nồng độ DNA ph™i thai tự do tăng cao bất thường ở tuần từ

28 - 32 của thai kỳ c— li•n quan với tăng nguy cơ đẻ non ở c‡c thai phụ [47] Quezada vˆ CS (2014) đ‹ định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong tuần hoˆn của thai phụ tại tuần 10 - 19 của thai kỳ, cho thấy việc định lượng DNA ph™i thai ở tuần 11 - 13 của thai kỳ kh™ng c— gi‡ trị dự đo‡n đẻ non ở thai phụ [48] Tuy nhi•n, c— một nghi•n cứu lˆm s‡ng tỏ về một cơ chế hợp lý giữa đẻ non vˆ nồng độ DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ, trong nghi•n cứu nˆy Scharfe-Nugent vˆ CS (2012) cho rằng DNA ph™i thai tự do đ—ng vai tr˜ g‰y vi•m th™ng qua TLR-9, n— k’ch hoạt yếu tố hạt nh‰n kB th™ng qua suy tho‡i IkB n•n lˆm tăng yếu tố tiền vi•m lˆ IL-6 trong m‡u ngoại vi[49]

Ph‡t hiện bệnh di truyền li•n kết với nhiễm sắc thể X

Ứng dụng l‰m sˆng sớm nhất của DNA ph™i thai tự do lˆ ph‡t hiện c‡c thai nam c— nguy cơ mắc bệnh di truyền li•n kết với NST X bằng kỹ thuật kh™ng x‰m lấn dựa tr•n việc ph‡t hiện tr“nh tự của gen SRY

Điều trị bằng dexamethason trước khi sinh đ‹ được đề xuất từ năm 1984

để ngăn chặn nam h—a bộ phận sinh dục ở nữ trong trường hợp thai nhi bị tăng sản thượng thận bẩm sinh Nghi•n cứu hồi cứu từ 2002 - 2011 của Tardy Guidolle V vˆ CS quản lý 258 thai nhi (134 nam vˆ 124 nữ) c— nguy cơ mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, kết quả cho thấy việc x‡c định được giới t’nh thai nhi th™ng qua định lượng DNA ph™i thai tự do c— trong huyết tương thai phụ c— thể cho phŽp chỉ định điều trị chấm dứt sớm việc điều trị bằng dexamethason đối với những thai phụ mang thai nam vˆ x‡c định việc chỉ định điều trị bằng dexamethason đối với thai phụ mang thai nữ [50]

Thalassemia lˆ bệnh thiếu m‡u tan m‡u di truyền g‰y ra do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp của một loại chuỗi globin Năm 2012, Sirichitiyakul vˆ

CS, định lượng DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương của thai phụ

từ những cặp vợ chồng được chẩn đo‡n lˆ �-thalassemia-1, kết quả thấy rằng

sự thay đổi nồng độ DNA ph™i thai tự do c— gi‡ trị chẩn đo‡n trước sinh đồng hợp tử � -thalassemia-1 [51]

Năm 2010, Nguyễn Thanh Thœy vˆ CS d•ng PCR lồng ph‡t hiện DNA ph™i thai từ huyết thanh mẹ vˆ ứng dụng trong chẩn đo‡n trước sinh [54]

Năm 2014, Triệu Tiến Sang vˆ CS đ‹ bước đầu x‰y dựng được quy tr“nh chiết t‡ch DNA tự do ứng dụng trong sˆng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh, sˆng lọc bệnh teo cơ Duchenne vˆ sự bất đồng nh—m m‡u Rh giữa mẹ vˆ thai nhi [55]

Tuy nhi•n, chưa c— t‡c giả nˆo nghi•n cứu nồng độ DNA ph™i thai tự do trong huyết tương thai phụ lˆ bao nhi•u ở c‡c quý của thai kỳ? Tăng trong tiền sản giật như thế nˆo? Chưa c— mốc để so s‡nh cho thai phụ ở Việt Nam V“ vậy, nghi•n cứu vai tr˜ của DNA ph™i thai tự do trong TSG để giœp thầy thuốc l‰m sˆng c— th•m một dấu ấn sinh học trong dự b‡o sớm, theo d›i vˆ ti•n lượng TSG nhằm giảm thiểu c‡c biến chứng nặng nề ở thai phụ vˆ thai nhi, giảm chi ph’ bệnh tật cho x‹ hội vˆ n‰ng cao chất lượng cuộc sống lˆ điều cần thiết

1.2.! TỔNG QUAN VỀ TIỀN SẢN GIẬT

1.2.1.!Kh‡i niệm tiền sản giật

Tiền sản giật lˆ t“nh trạng bệnh lý do thai nghŽn g‰y ra ở nửa sau của thai

kỳ bắt đầu từ tuần thứ 20 của qu‡ tr“nh mang thai Bệnh thường được biểu hiện

ở hội chứng gồm 3 triệu chứng ch’nh lˆ tăng huyết ‡p, protein niệu vˆ ph• [3],[56]

1.2.2.!Yếu tố nguy cơ vˆ cơ chế bệnh sinh của tiền sản giật

1.2.2.1.! C‡c yếu tố nguy cơ

Tr•n toˆn thế giới, tỷ lệ mắc TSG ở c‡c thai phụ mang thai khoảng 2-8% của tất cả c‡c lần mang thai Tiền sản giật vẫn lˆ nguy•n nh‰n hˆng đầu g‰y bệnh tật vˆ tử vong mẹ vˆ trẻ sơ sinh tr•n toˆn thế giới [57] Nguy cơ mắc TSG tương tự nhau ở cả phụ nữ chưa từng sinh đẻ vˆ đ‹ sinh con [58] Ngoˆi ra, ở những thai phụ c— tiền sử TSG ở lần mang thai trước th“ c— nguy cơ cao bị TSG trong lần mang thai sau

Một số bệnh lý lˆm tăng nguy cơ TSG: tăng huyết ‡p mạn t’nh, đ‡i th‡o đường, bệnh thận, bệnh bŽo ph“ vˆ t“nh trạng tăng đ™ng m‡u, v’ dụ hội chứng kh‡ng phospholipid, Tuổi của thai phụ cũng lˆ một yếu tố nguy cơ đối với TSG [59] Những trường hợp c— tăng khối lượng của b‡nh rau như đa thai vˆ chửa trứng cũng lˆm cho thai phụ c— khả năng bị TSG tăng l•n Ở đ‰y chưa thấy c— mối li•n hệ r› rˆng giữa quan hệ huyết thống vˆ tỷ lệ mắc hoặc mức độ nặng của TSG [60] Tuy nhi•n, đ‹ c— những nghi•n cứu thấy rằng nguy cơ TSG tăng ở những thai phụ c— thai chậm ph‡t triển trong tử cung vˆ c— tiền sử gia đ“nh TSG, kể cả mẹ chồng của thai phụ [61],[62] Mặc d• những yếu tố nguy

cơ dịch tễ học chưa được hiểu r› nhưng chœng cũng g—p phần tham gia vˆo cơ chế bệnh sinh của TSG

Bảng 1.1 Một số yếu tố nguy cơ của tiền sản giật [63]

Hội chứng kh‡ng phospholipid 9.7 (4.3Ð21.7)

Yếu tố nguy cơ OR hoặc RR (95%CI)

Sống ở v•ng nœi cao so với mặt nước biển 3.6 (1.1Ð11.9)

Tiền sử gia đ“nh mắc c‡c bệnh lý tim mạch

(bệnh tim hoặc đột quị ở 2 người th‰n trở l•n)

Giai đoạn 1 Sự biến đổi của b‡nh rau khi bị giảm tưới m‡u

B“nh thường, khi c— thai hệ thống tuần hoˆn tử cung chịu nhiều thay đổi quan trọng về mặt giải phẫu vˆ chức năng để đảm bảo cung cấp m‡u cho sự h“nh thˆnh vˆ ph‡t triển của ph™i thai: tăng số lượng c‡c mạch m‡u ở trong lớp

cơ tử cung, tăng k’ch thước c‡c mạch m‡u nằm dọc theo lớp cơ tử cung Quan trọng nhất lˆ phần tận c•ng của c‡c động mạch xoắn ốc bị thay đổi cấu trœc do t‡c dụng của sự x‰m lấn của tế bˆo l‡ nu™i sau khi trứng lˆm tổ C‡c tế bˆo l‡ nu™i ph‡ hủy lớp ‡o cơ chun gi‹n của động mạch xoắn ốc ở cơ tử cung vˆ lớp mˆng rụng, thay thế chœng bằng một lớp sợi xơ, những tế bˆo l‡ nu™i x‰m lấn thay thế c‡c lớp của động mạch xoắn ốc của người mẹ v“ vậy lˆm cho thˆnh mạch mềm mại vˆ trở thˆnh động mạch tử cung - rau, đường k’nh của động mạch c— thể tăng l•n đến 1000 µm vˆ kh™ng nhạy cảm với những chất c— t‡c dụng co gi‹n mạch, c— khả năng cung cấp oxy vˆ c‡c chất dinh dưỡng qua rau thai để duy tr“ thai nhi đang ph‡t triển Như vậy, ở thai phụ c— sự ph‡t triển mạch m‡u từ hai ph’a: ph’a người mẹ lˆ mạch m‡u trong ni•m mạc tử cung vˆ ph’a thai nhi lˆ mạch m‡u trong c‡c gai rau, do đ— sự t‰n tạo mạch m‡u rất quan trọng cho sự h“nh thˆnh vˆ ph‡t triển của thai nhi trong thai kỳ

Sự giảm tưới m‡u cho rau thai lˆ nguy•n nh‰n dẫn tới TSG, điều nˆy đ‹ được hỗ trợ bởi c‡c ph‡t hiện tr•n l‰m sˆng, tiến triển của bệnh vˆ thực nghiệm, v’ dụ: d•ng si•u ‰m doppler động mạch tử cung ph‡t hiện thấy c— hiện tượng tăng đề kh‡ng ở những nh‡nh xa của động mạch tử cung [67] Những bệnh li•n quan đến vi mạch m‡u như tăng huyết ‡p, đ‡i th‡o đường cũng lˆm tăng nguy

cơ TSG Ngoˆi ra, nghi•n cứu tr•n thực nghiệm ở một số loˆi khi giảm lưu lượng m‡u qua rau thai cũng sẽ tạo n•n một hội chứng giống như TSG [68]

Nguy•n nh‰n phổ biến của giảm tưới m‡u rau thai lˆ do bất thường trong qu‡ tr“nh x‰m lấn của l‡ nu™i C‡c động mạch xoắn ốc vẫn c˜n giữ nguy•n lớp

‡o cơ chun gi‹n hoặc qu‡ tr“nh nˆy chỉ xảy ra ở đoạn mạch m‡u nằm ở dưới lớp mˆng rụng, điều nˆy lˆm giảm tưới m‡u cho b‡nh rau dẫn đến thiếu m‡u

H“nh 1.1 Động mạch xoắn ốc ở thai phụ b“nh thường

vˆ thai phụ tiền sản giật [69]

Giai đoạn 2 Biểu hiện đa hệ thống ở mẹ

Nghi•n cứu cơ chế bệnh sinh vˆ biến đổi bệnh lý ở phụ nữ khi mang thai, c‡c t‡c giả thấy ở những thai phụ TSG c‡c thay đổi r› nŽt về bệnh lý vˆ sinh lý bệnh đặc trưng xuất hiện rất sớm trước khi c— c‡c triệu chứng l‰m sˆng của TSG, ở những thai phụ nˆy c— biểu hiện của co mạch thứ cấp dẫn tới tăng huyết

‡p, hoạt h—a c‡c yếu tố đ™ng m‡u do đ— lˆm tăng huyết khối trong l˜ng mạch

vˆ mất nước nội bˆo từ đ— dẫn tới giảm lưu lượng tuần hoˆn [70],[71],[72] Khi nghi•n cứu c‡c cơ quan bị tổn thương ở thai phụ TSG thấy c— nhiều tổn thương: xuất huyết vˆ hoại tử ở c‡c cơ quan (n‹o, gan, thận, ), cho thấy ở đ‰y c— sự giảm tưới m‡u cho c‡c cơ quan vˆ tổn thương tế bˆo nội m™ của mao mạch cầu thận nếu k•m theo tăng huyết ‡p [73],[74] Bằng chứng tổn thương tế bˆo nội m™ đ‹ được minh chứng bởi c‡c h“nh th‡i tổn thương đặc trưng nhất trong TSG,

do đ—, c‡c nghi•n cứu thấy rằng rối loạn chức năng của c‡c tế bˆo nội m™ lˆ yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của TSG [75],[76]

Như vậy, cơ chế bệnh sinh của TSG ban đầu lˆ do rối loạn qu‡ tr“nh thay đổi của tuần hoˆn tử cung - rau trong thai nghŽn Nguy•n nh‰n lˆ do x‰m nhập bất thường của tế bˆo l‡ nu™i dẫn tới giảm cấp m‡u cho c‡c gai rau Sau đ— thiếu oxy của b‡nh rau, rối loạn c‡c chất oxy h—a dẫn tới rối loạn chức năng của hợp bˆo l‡ nu™i Tiếp theo lˆ rối loạn chức năng của nội mạc mạch của người mẹ li•n quan đến c‡c chất được giải ph—ng ra từ b‡nh rau vˆo tuần hoˆn người mẹ như: c‡c gốc tự do, lipid oxy h—a, c‡c cytokin (IL-6, ), ch’nh những chất nˆy tạo ra c‡c dấu hiệu l‰m sˆng ở người mẹ

H“nh 1.2 T—m tắt cơ chế bệnh sinh của tiền sản giật

Nguồn: http://physiologyonline.physiology.org/content/24/3/147

1.2.3.!Một số triệu chứng điển h“nh của tiền sản giật

1.2.3.1.! Triệu chứng l‰m sˆng

Tăng huyết ‡p (THA)

Tăng huyết ‡p lˆ triệu chứng cơ bản của TSG, n— li•n quan đến việc ph‰n loại vˆ ti•n lượng cho cả mẹ vˆ con Ph‰n độ theo JNC 7 (Joint National

Committee 7) năm 2003 th“ THA được x‡c định khi huyết ‡p t‰m thu (HATT)

≥ 140mmHg vˆ/hoặc huyết ‡p t‰m trương (HATTr) ≥ 90mmHg

Ph• vˆ tăng c‰n

Ph• trong TSG biểu hiện li•n tục vˆ ngˆy cˆng tăng, lˆ loại ph• trắng, mềm, ấn l›m, ph• kh™ng giảm cả khi nằm nghỉ, c— nhiều mức độ ph• kh‡c nhau: ph• nhẹ ở chi đến ph• toˆn th‰n, ph• đa mˆng Їnh gi‡ ph• hay kh™ng

ở thai phụ trong qu‡ tr“nh thai nghŽn th“ ngoˆi việc kh‡m l‰m sˆng cần phải c‰n

để theo d›i trọng lượng cơ thể, nếu tăng > 500gam/1 tuần hoặc 2250 gam/1

th‡ng th“ được coi lˆ ph• trong khi mang thai [77]

C‡c dấu hiệu kh‡c: thiếu m‡u (da xanh, ni•m mạc nhợt), triệu chứng

thần kinh (đau đầu, rối loạn tri gi‡c), triệu chứng ti•u h—a (đau hạ sườn phải, n™n, buồn n™n), rối loạn thị gi‡c (nh“n mờ, ),

1.2.3.2.! XŽt nghiệm cận l‰m sˆng

Protein niệu

Љy lˆ dấu hiệu quan trọng trong TSG, xuất hiện muộn hơn tăng huyết

‡p Protein niệu ≥ 0,3g/l ở mẫu 24h hoặc ≥ 0,5g/l ở mẫu ngẫu nhi•n lˆ c— gi‡ trị chẩn đo‡n

Bất thường c‡c xŽt nghiệm thăm d˜:

- Si•u ‰m thai (đ‡nh gi‡ sự ph‡t triển của thai, độ trưởng thˆnh của b‡nh rau), si•u ‰m Doppler động mạch tử cung (giảm tưới m‡u tử cung - rau c— thể quan s‡t thấy trước khi c— c‡c triệu chứng l‰m sˆng),

- Một số dấu ấn sinh học: PlGF, sFlt-1, tỷ số sFlt-1/PIGF, DNA ph™i thai

tự do, endoglin h˜a tan,É c— vai tr˜ trong dự b‡o sớm TSG trước khi c— c‡c triệu chứng l‰m sˆng [37],[78],[79]

1.2.4.!Ph‰n loại vˆ chẩn đo‡n tiền sản giật

Theo Hướng dẫn chẩn đo‡n vˆ điều trị c‡c bệnh sản phụ khoa năm 2015 của Bộ Y tế [80], TSG được ph‰n loại vˆ chẩn đo‡n như sau:

Bảng 1.2 Ph‰n loại tiền sản giật

-! Huyết ‡p (HA) ≥ 140/90 mmHg sau tuần 20 của thai kỳ

-! Protein niệu ≥ 0,3g/24 giờ hay que thử nhanh (+)

Tiền sản giật nhẹ -! Huyết ‡p ≥ 160/110 mm Hg

-! Protein niệu ≥ 0,5g/24 giờ hay que thử 3+ (2 mẫu thử

chứng HELLP, ph• phổi, tan huyết vˆ đ™ng m‡u rải r‡c trong l˜ng mạch, suy thận cấp vˆ biến chứng mắt [81],[82],[83],[84]

Hội chứng HELLP (Hemolysis - Elevated liver enzyme - Low platelate count) lˆ biến thể nặng của TSG bao gồm c‡c triệu chứng tan huyết, suy giảm chức năng gan, giảm tiểu cầu Љy lˆ một trong những t“nh trạng bệnh lý nguy hiểm đối với cả mẹ vˆ thai nhi Chẩn đo‡n x‡c định hội chứng HELLP dựa vˆo c‡c triệu chứng l‰m sˆng: tăng huyết ‡p, protein niệu, ph• vˆ k•m theo c‡c dấu hiệu cận l‰m sˆng theo ti•u chuẩn xŽt nghiệm chẩn đo‡n hội chứng HELLP của đại học Tennessee, Memphis, Mỹ: vết mờ tr•n ti•u bản m‡u, bilirubin toˆn phần

> 20,52 µmol/L (>1,2mg/dl), lactic dehydrogenase > 700 U/L, AST > 70U/L

vˆ tiểu cầu < 100G/L [85]

Tại Việt Nam theo một b‡o c‡o về sản giật từ 1991 đến 1995 tại Viện Bảo vệ Bˆ mẹ Trẻ sơ sinh c— 83 thai phụ bị sản giật vˆ chỉ c— một số trường hợp bị tử vong chiếm 1,2% [86] C‡c nghi•n cứu kh‡c cho thấy sản giật kết hợp với tan huyết vˆ đ™ng m‡u rải r‡c trong l˜ng mạch, suy thận cấp, ph• phổi cấp

lˆ những nguy•n nh‰n ch’nh của tử vong mẹ do TSG

Sản giật: đ‰y lˆ biến chứng nguy hiểm của TSG, thường lˆ do ph• n‹o,

mạch m‡u bị co thắt g‰y tăng huyết ‡p, c— thể xảy ra trong khi c— thai, trong chuyển dạ vˆ sau đẻ, lˆ 1 trong 5 tai biến sản khoa vˆ hậu quả để lại rất nặng

nề, thai phụ vˆ thai nhi c— thể chết ngay trong cơn sản giật nếu kh™ng được xử

tr’ kịp thời

Rau bong non: rau bong non, thể nặng nhất lˆ phong huyết tử cung rau

hay lˆ hội chứng khối huyết tụ sau rau kh™ng những chảy m‡u do bong rau mˆ c˜n c— nhồi huyết vˆ chảy m‡u ở cơ tử cung vˆ c‡c phủ tạng kh‡c: buồng trứng, tụy, thận, phổi những trường hợp nặng, thai nhi sẽ chết, t“nh trạng mẹ bị đe dọa nghi•m trọng [87]

Suy giảm chức năng gan vˆ rối loạn đ™ng m‡u

Suy giảm chức năng gan thường hay gặp ở thai phụ TSG đặc biệt lˆ hội chứng HELLP

1.2.6.2.! Biến chứng với con

Tử vong sơ sinh ngay sau đẻ: tại Việt Nam theo Phan Trường Duyệt vˆ

Ng™ Văn Tˆi (1999) tỷ lệ tử vong sơ sinh ngay sau đẻ ở sản phụ TSG lˆ 13,8% [88] Theo L• Thị Mai (2004) tỷ lệ nˆy lˆ 6,4% [87]

Nhẹ c‰n, chậm ph‡t triển trong tử cung: trẻ sơ sinh chậm ph‡t triển trong

tử cung lˆ những trẻ sinh ra c— trọng lượng dưới đường b‡ch ph‰n vị thứ 10 ở c•ng tuổi thai tương ứng Tại Việt Nam, nghi•n cứu năm 2010 cho thấy tỷ lệ trẻ đủ th‡ng nhẹ c‰n lˆ 30,8% [89]

Đẻ non: lˆ hiện tượng gi‡n đoạn thai nghŽn khi thai c— thể sống được

(hiện nay theo chuẩn quốc gia lˆ tuổi thai từ 22 đến 37 tuần) Tại Việt Nam, nghi•n cứu của Phan Trường Duyệt vˆ Ng™ Văn Tˆi cho thấy tỷ lệ sơ sinh nhẹ c‰n dưới 2500g chiếm vˆo khoảng 52% vˆ sơ sinh thiếu th‡ng chiếm khoảng 24% c‡c trường hợp thai phụ TSG [88] Nghi•n cứu của Ng™ Văn Tˆi ở 320 thai phụ TSG từ năm 1997 - 2000 th“ thấy tỷ lệ đẻ non lˆ 36,3% vˆ sơ sinh c‰n

nặng dưới 2500g lˆ 51,5% [90]

Thai chết lưu trong tử cung:

Љy lˆ một biến chứng nặng nề của TSG g‰y n•n cho trẻ sơ sinh Theo nghi•n cứu của Sibai B.M vˆ CS những thai phụ c— hội chứng HELLP th“ tỷ

lệ thai chết trong tử cung lˆ 19,3%; tỷ lệ nˆy tăng l•n 41,2% nếu như tuổi thai

nhỏ hơn 30 tuần [91] Tại Việt Nam, nghi•n cứu của Ng™ Văn Tˆi năm 2001 cho thấy tỷ lệ thai chết lưu ở những thai phụ bị TSG lˆ 5,3% [90]

1.2.7.!Một số dấu ấn sinh học được sử dụng trong chẩn đo‡n, theo d›i tiền sản giật

Hiện nay, ngoˆi dấu ấn sinh học lˆ DNA ph™i thai tự do c˜n một số dấu

ấn sinh học đ‹ được nghi•n cứu vˆ ứng dụng trong l‰m sˆng để giœp dự b‡o sớm, chẩn đo‡n vˆ theo d›i TSG

1.2.7.1.! PlGF vˆ sFlt1

PlGF (Placental Growth Factor - yếu tố ph‡t triển rau thai) lˆ một protein thuộc nh—m yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch m‡u (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) PlGF đ—ng vai tr˜ quan trọng đến sự h“nh thˆnh mạch

vˆ x‰m lấn l‡ nu™i của c‡c động mạch xoắn ốc ở thai phụ đặc biệt lˆ trong qu‡ tr“nh h“nh thˆnh ph™i [92] Nồng độ giảm PlGF giảm đ‡ng kể trong thời gian 5 tuần trước khi khởi ph‡t của bệnh lˆ dấu ấn quan trọng để dự b‡o sớm tiền sản giật [69],[92],[93]

sFlt-1 (Soluble FMS like tyrosine kinase 1) lˆ một protein c— vai tr˜ kh‡ng t‰n tạo mạch m‡u Nghi•n cứu thực nghiệm của Burke S.D vˆ CS (2016) đ‹ chứng minh khi nồng độ của sFlt1 ở chuột TSG tăng cao sẽ lˆm suy giảm qu‡ tr“nh tổng hợp nitric oxide của tế bˆo nội m™ vˆ thœc đẩy qu‡ tr“nh oxy h—a trong c‡c mạch m‡u hậu quả lˆm tăng sự nhạy cảm của mạch m‡u với angiotensin II vˆ tăng huyết ‡p Như vậy, rối loạn chức năng nội mạc lˆm nồng

độ sFlt1 tăng cao c— thể lˆ nguy•n nh‰n ban đầu dẫn tới độ nhạy với yếu tố co mạch tăng l•n, đ‰y lˆ dấu hiệu đặc trưng của TSG [94] Một số nghi•n cứu đ‹ khẳng định về nồng độ của sFlt-1 tăng cao trong huyết tương thai phụ TSG vˆ c— mối li•n hệ tỷ lệ thuận giữa nồng độ sFlt-1 vˆ mức độ của TSG [95],[96],[79]

1.2.7.2.! Pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A)

PAPP-A lˆ protein gồm 1628 aa, c— nguồn gốc từ hợp bˆo l‡ nu™i, lˆ yếu

tố tăng trưởng giống insulin protein protease C‡c hệ thống yếu tố tăng trưởng giống insulin được cho lˆ đ—ng một vai tr˜ quan trọng trong sự tăng trưởng vˆ ph‡t triển của nhau thai Khi nồng độ của PAPP-A trong huyết tương thấp c— li•n quan đến sự tiến triển của TSG [97],[98] Nồng độ của PAPP-A khi bằng hoặc giảm hơn 5% so với b“nh thường, tương ứng với t“nh trạng của thai phụ

lˆ c— thai chậm ph‡t triển trong tử cung, TSG, sinh non vˆ thai chết lưu [99]

1.2.7.3.! Endoglin h˜a tan (Soluble Endoglin - sEng)

Endoglin h˜a tan lˆ một glycoprotein xuy•n mˆng, lˆ yếu tố kh‡ng tạo mạch m‡u, lˆ đồng thụ thể đối với yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β (Transforming growth factor β - TGF-β), c— nhiều tr•n mˆng tế bˆo của nội mạch mạch m‡u vˆ tr•n nhung mao của rau thai [93],[100] Chức năng của endoglin lˆ truyền t’n hiệu TGF-β vˆ li•n quan đến yếu tố sinh mạch vˆ điều hoˆ trương lực mạch m‡u vˆ do đ— ảnh hưởng đến sản xuất oxit nitric, gi‹n mạch, vˆ sự h“nh thˆnh mao mạch bởi c‡c tế bˆo nội m™ trong ống nghiệm [101],[102] Nồng độ endoglin tăng cao ở những thai phụ TSG vˆ tăng cao nhất

ở thai phụ TSG c— hội chứng HELLP (Hemolyse - Elevated liver - low platelets

Ð tan huyết, tăng enzyme gan, giảm tiểu cầu) [103]

1.2.7.4.! PP-13

PP-13 thuộc nh—m lˆ galectin, một nh—m protein gắn carbohydrat được gọi lˆ b-galactoside lectin trong hợp bˆo l‡ nu™i [104],[105] Ở thai phụ b“nh thường, nồng độ PP-13 trong huyết tương tăng dần l•n theo c‡c quý của thai kỳ nhưng lại giảm bất thường ở tuần thai 11 - 13 của những thai phụ tiến triển TSG [106],[107],[108] Nghi•n cứu của De Muro vˆ CS (2016) định lượng PP-13 ở

62 thai phụ trong đ— c— 24 thai phụ TSG, protein niệu, cao huyết ‡p vˆ 38 thai phụ b“nh thường ở tuần 11 - 13 của thai kỳ, kết quả cho thấy nồng độ PP-13

giảm đ‡ng kể so với nh—m chứng với p=0,022 [109] PP-13 c— gi‡ trị dự b‡o TSG với độ nhạy tương ứng lˆ 79% với độ đặc hiệu lˆ 90% [110] Hiện tại, đ‹ c— bộ kit thương mại PP-13 (Diagnosis Technologies, Haifa) đ‹ được ph‡t triển

để sˆng lọc TSG trong 3 th‡ng đầu ti•n của thai kỳ

Tuy nhi•n, kh™ng c— một xŽt nghiệm đặc hiệu vˆ duy nhất đủ để chẩn đo‡n vˆ dự b‡o sớm tiền sản giật được sử dụng l‰m sˆng [111] XŽt nghiệm kết hợp của hai hay nhiều dấu ấn sẽ phản ‡nh một qu‡ tr“nh sinh lý bệnh kh‡c nhau

sẽ giœp tăng gi‡ trị dự b‡o sớm TSG [112] C‡c nghi•n cứu vẫn tiếp tục t“m kiếm sự kết hợp của c‡c yếu tố nguy cơ của mẹ vˆ c‡c yếu tố nguy cơ của con giœp dự b‡o sớm TSG bằng kỹ thuật kh™ng x‰m lấn

1.3.! KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỊNH LƯỢNG DNA

1.3.1.!Kỹ thuật PCR

Năm 1985, Kary Mullis đ‹ ph‡t minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) đ‹ mở ra triển vọng ph‡t triển nhanh ch—ng c‡c kỹ thuật sinh học ph‰n

tử [113]

Nguy•n lý của kỹ thuật PCR: dựa tr•n đặc t’nh của DNA polymerase cho

phŽp tổng hợp một đoạn DNA bổ sung với DNA khu™n nhờ đoạn mồi tương ứng Điều quan trọng lˆ phải tổng hợp được cặp mồi c— khả năng lai trong giới hạn của n— vˆ đảm bảo cho việc khuếch đại đoạn DNA mong muốn Muốn thực hiện được điều đ— th“ phải biết tr“nh tự nucleotid của đoạn DNA cần khuếch đại nˆy Số lượng đoạn DNA được khuếch đại trong kỹ thuật nˆy tăng l•n theo

lũy thừa

C‡c giai đoạn của phản ứng Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến

t’nh: chuỗi DNA th‡o xoắn duỗi ra thˆnh 2 sợi đơn ở nhiệt độ cao; giai đoạn gắn mồi: c‡c mồi đặc hiệu sẽ lai cặp theo nguy•n tắc bổ sung vˆo hai đầu của đoạn DNA đ’ch, giai đoạn kŽo dˆi chuỗi: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp c‡c nucleotid vˆo DNA mồi dựa DNA ban đầu lˆm khu™n Như vậy, sau n

chu kỳ nhiệt c— thể nhận được 2n bản sao của chuỗi DNA đ— Lượng DNA nˆy

đủ để ph‡t hiện bằng điện di tr•n gel agarose hay lai tạo với c‡c đoạn d˜ đ‹ được đ‡nh dấu bằng đồng vị ph—ng xạ hoặc enzym

Đọc kết quả: sau khi thực hiện phản ứng PCR, cần tiến hˆnh điện di tr•n gel agarose để x‡c định chất lượng c‡c đoạn DNA

Ưu điểm vˆ nhược điểm của kỹ thuật PCR

Ưu điểm PCR lˆ một kỹ thuật tương đối đơn giản, c— thể ph‡t hiện một

đoạn DNA vˆ khuếch đại tr“nh tự nˆy

-! Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần sau vˆi giờ lˆ c— thể khuếch đại được một tr“nh tự đ‡ng quan t‰m

-! Thực hiện đơn giản vˆ ’t tốn kŽm (n— được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thˆnh phần tối thiểu được thực hiện đồng thời)

-! Y•u cầu về độ tinh sạch của mẫu kh™ng cao (vết m‡u kh™, )

-! Đọc kết quả sau PCR bằng điện di tr•n gel agarose dựa tr•n k’ch thước của sản phẩm PCR vˆ dựa vˆo cường độ ph‡t s‡ng của vạch đ— so với vạch DNA chuẩn c— thể b‡n định lượng được nồng độ DNA của mẫu thử

-! Ở giai đoạn sau PCR khi hoˆn tất khuếch đại đoạn DNA đ’ch, phải tiếp tục điện di sản phẩm PCR tr•n gel agarose để kiểm tra xem c— vạch sản phẩm khuếch đại đœng k’ch thước mong muốn hay kh™ng Đọc kết quả dựa tr•n sự

ph‰n biệt k’ch thước, mˆ c— thể kh™ng ch’nh x‡c vˆ độ ph‰n giải của gel agarose thấp ch’nh v“ vậy kh— c— thể ph‡t hiện được sự thay đổi của sản phẩm sau khi khuếch đại Đồng thời, kết quả kh™ng thể hiện bằng số

-! Khả năng ngoại nhiễm lớn, c— thể nhiễm chŽo từ mẫu sang mẫu, v’ dụ

từ mẫu (-) thˆnh (+), ngoại nhiễm c‡c sản phẩm khuếch đại

-! Sử dụng nhuộm gel nhờ Ethidium bromide (đ‰y lˆ chất dễ g‰y ung thư)

1.3.2.!Kỹ thuật Realtime PCR

Kỹ thuật Realtime PCR lần đầu ti•n được giới thiệu vˆo năm 1992 bởi Higuchi vˆ CS [114],[115] Kỹ thuật Realtime PCR dựa tr•n nền tảng của kỹ thuật PCR nhưng kết quả khuếch đại DNA đ’ch hiển thị được ngay sau mỗi chu

kỳ nhiệt của phản ứng [113],[116],[117]

1.3.2.1.! Nguy•n tắc kỹ thuật Realtime PCR

Chất huỳnh quang được th•m vˆo hỗn hợp của phản ứng PCR (mix PCR), chất huỳnh quang nˆy sẽ được ch•n vˆo sợi đ™i của DNA hoặc bắt cặp

bổ sung với một tr“nh tự đặc hiệu tr•n DNA đ’ch, nếu trong ống phản ứng nˆy c— sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của PCR từ DNA đ’ch được nh‰n bản đủ

số lượng để lˆm cho ống phản ứng ph‡t huỳnh quang khi nhận được nguồn s‡ng k’ch th’ch vˆ sẽ kh™ng thể ph‡t được huỳnh quang nếu kh™ng c— sản phẩm khuếch đại trong ống Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA đ’ch nhiều th“ sẽ cần ’t chu kỳ nhiệt hơn để đạt đến số lượng bản sao đủ để ống phản ứng cho được t’n hiệu huỳnh quang mˆ m‡y sẽ ghi nhận được, c˜n nếu số lượng DNA đ’ch ’t hơn th“ cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn T’nh to‡n số copy của DNA đ’ch ban đầu c— trong ống phản ứng phải dựa vˆo đường biểu diễn chuẩn (được tạo n•n bởi c‡c mẫu chuẩn đ‹ biết trước nồng độ), x‡c định mối quan hệ giữa chu

kỳ ngưỡng với số lượng copy DNA đ’ch ban đầu c— trong ống phản ứng [113],[117],[118]

1.3.2.2.! Biểu đồ chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR

Phản ứng được thực hiện tr•n m‡y Realtime PCR diễn ra qua 2 giai đoạn: giai đoạn ủ vˆ giai đoạn lũy thừa về cường độ huỳnh quang Giai đoạn ủ: DNA đ’ch đ‹ nh‰n bản thˆnh c‡c bản sao nhưng do số lượng c˜n ’t n•n ‡nh s‡ng huỳnh quang ph‡t ra chưa đủ cường độ để m‡y ghi nhận Khi số lượng bản sao của DNA đ’ch đạt đến một ngưỡng nhất định th“ m‡y sẽ bắt đầu đo được mức

độ huỳnh quang ph‡t ra, từ lœc nˆy cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng

sẽ tăng gấp đ™i sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đ’ch tăng gấp đ™i sau mỗi chu kỳ đ‰y lˆ giai đoạn lũy thừa về cường độ huỳnh quang Sự tăng trưởng nˆy sẽ chậm dần vˆ đạt đến b“nh nguy•n khi c‡c bản sao của DNA đ’ch kh™ng c˜n gia tăng số lượng theo cấp số 2 nữa do cạn dần dNTP vˆ enzym Taq polymerase kh™ng hoạt động hiệu quả nữa, đ‰y lˆ giai đoạn b“nh nguy•n [116],[118]

H“nh 1.3 Minh họa biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận

cường độ huỳnh quang ph‡t ra từ ống phản ứng khi nhận được ‡nh s‡ng k’ch th’ch vˆo mỗi chu kỳ nhiệt [113]

Ph‰n t’ch một đường biểu diễn khuếch đại của một ống phản ứng sau khi hoˆn tất, th™ng số quan trọng nhất lˆ chu kỳ ngưỡng của một phản ứng Realtime PCR xuất hiện sớm hay muộn (Ct cao hay thấp) Chu kỳ ngưỡng lˆ chu kỳ nhiệt

mˆ tại thời điểm nˆy thiết bị Realtime PCR ghi nhận được t’n hiệu huỳnh quang

ph‡t ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền Chu kỳ ngưỡng t•y thuộc vˆo số lượng bản DNA đ’ch ban đầu c— trong ống phản ứng Љy lˆ một đặc điểm vượt trội của Realtime PCR so với PCR, dựa vˆo đặc điểm nˆy mˆ c— thể x‡c định được số copy của t‡c nh‰n đ’ch c— trong mẫu thử

Tuy nhi•n, để Realtime PCR c— thể x‡c định được ch’nh x‡c số lượng bản đ’ch ban đầu c— trong mẫu thử th“ cần phải tiến hˆnh c•ng lœc với c‡c mẫu chuẩn đ‹ biết trước số lượng DNA đ’ch ban đầu Đường biểu diễn thể hiện mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA đ’ch ban đầu c— trong c‡c mẫu chuẩn được gọi lˆ đường biểu diễn chuẩn (standard curve) Љy lˆ một đường thẳng tuyến t’nh đi qua c‡c điểm tọa độ x‡c định bởi số lượng bản DNA đ’ch ban đầu của từng mẫu chuẩn vˆ chu kỳ ngưỡng tương ứng [113],[116].

H“nh 1.4 Minh họa biểu đồ khuếch đại thể hiện c‡c đường biểu diễn khuếch đại của mẫu chuẩn vˆ mối quan hệ giữa số lượng bản DNA đ’ch

c— trong c‡c mẫu chuẩn vˆ chu kỳ ngưỡng tương ứng

Nguồn: http://www.bloodjournal.org/content/101/5/1698?sso-checked=true

1.3.2.3.! Một số kỹ thuật Realtime PCR thường được sử dụng

Kỹ thuật Realtime PCR d•ng mˆu huỳnh quang ch•n SYBR green I

SYBR green I thường được sử dụng v“ mˆu huỳnh quang nền rất thấp, khả năng ch•n vˆo sợi đ™i DNA cao nhưng kh™ng lˆm cho sợi đ™i DNA gắn chặt vˆo nhau khi bị biến t’nh

H“nh 1.5 T—m tắt cơ chế hoạt động khi sử dụng chất huỳnh quang

SYBR green I trong Realtime PCR [113]

Ưu vˆ nhược điểm khi sử dụng mˆu huỳnh quang ch•n SYBR green I trong Realtime PCR

Ưu điểm

Mˆu huỳnh quang ch•n vˆo sợi đ™i DNA c— ‡i lực rất cao khi c— sự mặt của sợi đ™i DNA vˆ ‡i lực nˆy lˆ do khả năng ch•n của mˆu vˆo giữa sợi đ™i DNA lˆm cho sợi đ™i DNA nˆy ph‡t được ‡nh s‡ng huỳnh quang khi nhận được nguồn s‡ng k’ch th’ch

Nhược điểm

Kh— ph‰n biệt được sản phẩm đặc hiệu hay kh™ng đặc hiệu do SYBR green I lˆ mˆu ch•n cho bất cứ sợi đ™i DNA nˆo n•n n— c— thể ch•n vˆo sợi đ™i DNA kh™ng phải khuếch đại đặc hiệu từ DNA đ’ch

SYBR green I t’n hiệu ph‡t huỳnh quang kh™ng cao vˆ c— thể ức chế PCR, biểu đồ chuẩn kh— đạt, sản phẩm khuếch đại c— tr“nh tự kh‡c biệt hay/vˆ chiều dˆi kh‡c biệt cũng rất thấp

Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng probe lˆm chất ph‡t huỳnh quang

Probe lˆ những đoạn oligonucleotid sợi đơn c— tr“nh tự c— thể bắt cặp bổ sung với sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đ’ch vˆ sự bắt cặp nˆy sẽ ph‡t

huỳnh quang khi nhận được nguồn s‡ng k’ch th’ch

Realtime PCR sử dụng Taqman Probe

Taqman Probe lˆ những đoạn oligonucleotid sợi đơn c— tr“nh tự c— thể bắt cặp bổ sung với một tr“nh tự đặc hiệu tr•n DNA đ’ch, dˆi khoảng 24 - 30 bases, c— đầu 5' gắn chất ph‡t huỳnh quang (reporter) vˆ đầu 3' gắn chất hấp thụ tương ứng (quencher) để hấp thụ được ‡nh s‡ng huỳnh quang ph‡t ra từ reporter

H“nh 1.6 T—m tắt cơ chế hoạt động của Taqman Probe trong Realtime PCR [113]

Ưu vˆ nhược điểm khi sử dụng Taqman Probe trong Realtime PCR

Nhược điểm: Gi‡ thˆnh cao

Realtime PCR sử dụng Beacon Probe

Beacon Probe lˆ probe c— tr“nh tự dˆi khoảng 25 - 40 bases, c— đầu 5' gắn với reporter vˆ đầu 3' gắn với quencher Probe c— tr“nh tự 15-39 ở giữa lˆ

bổ sung với 1 tr“nh tự đặc hiệu tr•n sợi đơn vủa DNA đ’ch, c˜n 2 đầu c˜n lại của probe c— tr“nh tự 5 - 6 bases bổ sung với nhau lˆm cho probe tạo thˆnh cấu trœc h“nh kẹp t—c

H“nh 1.7 T—m tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe

trong Realtime PCR [113]

Ưu vˆ nhược điểm khi sử dụng Beacon Probe trong Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng probe lai

Trong kỹ thuật nˆy d•ng 2 probe: probe lai 1 c— đầu 3Õ gắn một chất ph‡t huỳnh quang D (donnor) vˆ probe lai 2 c— đầu 5Õ gắn một chất ph‡t huỳnh quang A (acceptor) [113],[116]

H“nh 1.8 T—m tắt cơ chế hoạt động của probe lai trong Realtime PCR [113]

Ưu điểm khi sử dụng Probe lai trong Realtime PCR

Ứng dụng để định lượng t‡c nh‰n đ’ch c— trong mẫu vˆ định kiểu gen của t‡c nh‰n đ’ch hay lˆ định được sự kh‡c biệt chỉ một nucleotid (SNP) của

t‡c nh‰n đ’ch

1.3.2.4.! Ưu điểm vˆ nhược điểm của kỹ thuật Realtime PCR

Ưu điểm Kỹ thuật Realtime PCR c— những ưu điểm so với PCR b‡n định lượng như sau:

-! PCR b‡n định lượng chỉ x‡c định được điểm cuối (cao nguy•n) trong khi Realtime PCR thu thập dữ liệu trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nh‰n;

sự gia tăng t’n hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng c‡c bản sao DNA được tạo thˆnh, độ ch’nh x‡c cao; tăng rộng phạm vi ph‡t hiện, c— khả năng ph‡t hiện xuống ’t nhất lˆ một sự thay đổi 2 lần; kh™ng phải xử lý sau khi kết thœc PCR

-! Thời gian ph‡t hiện sản phẩm nhanh, cho phŽp theo d›i tiến tr“nh phản ứng vˆ biết được lượng DNA đ‹ tạo thˆnh ở từng thời điểm

-! Ph‰n t’ch kết quả phản ứng PCR mˆ kh™ng cần bước điện di tr•n gel -! Ph‰n t’ch kết quả th™ng qua t’n hiệu huỳnh quang ph‡t ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng m‡y t’nh

-! Tiến hˆnh được nhiều mẫu/ngˆy

gen kết hợp cả độ nhạy cao vˆ độ đặc hiệu với hiệu quả ph‡t hiện t’n hiệu [36],[116],[119]

Nhược điểm

- Sự gia tăng của DNA trong mỗi chu kỳ sẽ phản ‡nh một sự gia tăng tỷ

lệ thuận với sự ph‡t s‡ng của huỳnh quang, tuy nhi•n, chất huỳnh quang c— thể li•n kết với c‡c sản phẩm kh™ng đặc hiệu hoặc dimer primer, v“ vậy, việc thiết

kế primer cho Realtime PCR phải rất cẩn thận vˆ phải sử dụng c‡c điều kiện PCR tối ưu để c— thể giảm thiểu độ kh™ng đặc hiệu nˆy

- Việc sử dụng c‡c probe cho phŽp x‡c định t’nh đa h“nh th‡i vˆ c‡c đột biến Tuy nhi•n, đ‰y lˆ kỹ thuật thực hiện phức tạp, gi‡ thˆnh cao hơn so với c‡c kỹ thuật PCR định lượng kh‡c

1.3.2.5.! Ứng dụng của kỹ thuật Realtime PCR

Định lượng t‡c nh‰n đ’ch c— trong mẫu thử

Sử dụng kỹ thuật Realtime PCR c— thể biết được số lượng bản DNA đ’ch ban đầu dựa vˆo sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức lˆ chu kỳ ngưỡng lớn hay nhỏ T•y thuộc vˆo mục đ’ch cần định lượng mˆ

sử dụng định lượng tuyệt đối hay định lượng tương đối [113]

Định lượng tuyệt đối Phương ph‡p nˆy đ˜i hỏi phải biết r› lượng (thể

t’ch, trọng lượng, ) của mẫu thử Thực hiện Realtime PCR của mẫu thử c•ng lœc với c‡c mẫu chuẩn đ‹ biết trước số lượng rồi t’nh ra số copy DNA của t‡c

nh‰n đ’ch

Định lượng tương đối çp dụng phương ph‡p nˆy khi muốn định lượng

được t‡c nh‰n đ’ch nhưng kh™ng thể c‰n đo đong đếm được mẫu thử để c— được

số liệu ch’nh x‡c, v’ dụ: gen t‡ch ra từ m™ ung thư, khối u

Ph‡t hiện kh‡c biệt SNP vˆ x‡c định kiểu di truyền

Sản phẩm khuếch đại của c‡c tr“nh tự đ’ch c— thể kh‡c biệt chỉ một nucleotid, gọi lˆ SNP, hay lˆ c— thể kh‡c biệt một số nucleotid của một tr“nh tự

Realtime PCR hoˆn toˆn c— thể ứng dụng để ph‡t hiện kh‡c biệt SNP vˆ x‡c định kiểu di truyền [113]

T—m lại, việc ph‡t hiện sự c— mặt của DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh

trong tuần hoˆn của thai phụ đ‹ mở ra hướng chẩn đo‡n trước sinh bằng kỹ thuật kh™ng x‰m lấn Với sự hiểu biết về DNA ph™i thai tự do vˆ c‡c kỹ thuật định lượng DNA th“ việc định lượng được DNA ph™i thai tự do cˆng dễ dˆng, nhanh ch—ng vˆ đỡ tốn kŽm Kết quả của c‡c nghi•n cứu cho thấy nồng độ DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ tăng l•n r› rˆng trước khi khởi ph‡t c‡c triệu chứng l‰m sˆng của c‡c biến chứng của thai kỳ DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong tuần hoˆn thai phụ n•n được coi như lˆ một dấu

ấn quan trọng trong sˆng lọc trước sinh kh™ng x‰m lấn để giœp ti•n lượng c‡c biến chứng nghi•m trọng li•n quan đến thai nghŽn

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VË PHƯƠNG PHçP NGHIæN CỨU

2.1.! Đối tượng nghi•n cứu

- Đối tượng nghi•n cứu lˆ những thai phụ mang thai từ tuần thứ 12 đến kh‡m tại Bệnh viện Phụ Sản Hˆ Nội, Ph˜ng kh‡m Vạn Phœc vˆ Bệnh viện Phụ Sản Trung ương, thời gian từ th‡ng 1 năm 2013 đến th‡ng 6 năm 2015, bao gồm 2 nh—m: nh—m thai phụ b“nh thường vˆ nh—m thai phụ tiền sản giật

- Chất liệu nghi•n cứu: 5ml m‡u tĩnh mạch được lấy vˆo ống c— chứa EDTA, ly t‰m t‡ch huyết tương vˆ bảo quản ở -800C đến khi sử dụng

2.1.1! Ti•u chuẩn lựa chọn đối tượng nghi•n cứu

-!Nh—m thai phụ tiền sản giật: bao gồm c‡c thai phụ được chẩn đo‡n tiền

sản giật theo Hướng dẫn chẩn đo‡n của Bộ Y tế (2015), c— ’t nhất 2 triệu chứng

sau:

o! C— tăng huyết ‡p HATT ≥ 140mmHg, HATTr ≥ 90mmHg

o! Protein niệu ≥ 0,5 g/l ở mẫu nước tiểu ngẫu nhi•n hoặc 0,3 g/l ở mẫu nước tiểu trong 24h

2.1.2! Ti•u chuẩn loại trừ

Thai phụ c— mắc c‡c bệnh từ trước, bao gồm: đa thai, đa ối, thai dị dạng; c‡c thai phụ c— c‡c bệnh mắc k•m: bệnh tim, bệnh thận, bệnh tăng huyết ‡p,

bệnh đ‡i th‡o đường, bệnh Basedow, bệnh gan

2.2.! Cỡ mẫu nghi•n cứu

Cỡ mẫu cho nh—m thai phụ b“nh thường

Đối với nh—m thai phụ b“nh thường, chœng t™i thu thập mẫu m‡u với cỡ mẫu tối thiểu cho mỗi lứa tuổi của thai kỳ, bao gồm:

30 mẫu m‡u của thai phụ b“nh thường c— tuổi thai từ tuần 12-15 (quý 1)

30 mẫu m‡u của thai phụ b“nh thường c— tuổi thai từ tuần 16-25 (quý 2)

30 mẫu m‡u của thai phụ b“nh thường c— tuổi thai từ tuần 31-35 (quý 3) Trong thời gian nghi•n cứu, chœng t™i thu thập được 101 thai phụ b“nh thường (41 thai phụ c— thai tuần 12 - 15, 30 thai phụ c— thai tuần 16 - 25 vˆ 30 thai phụ c— thai tuần 31 - 35) lˆm đối tượng nghi•n cứu

Cỡ mẫu cho nh—m thai phụ tiền sản giật

Đối với nh—m thai phụ tiền sản giật, chœng t™i thu thập mẫu m‡u với cỡ mẫu tối thiểu lˆ 30 thai phụ được chẩn đo‡n tiền sản giật c— thai tuần 22 - 40 lˆm đối tượng nghi•n cứu

Trong thời gian nghi•n cứu, chœng t™i thu thập được 50 thai phụ tiền sản giật (4 thai phụ c— thai tuần 22 - 25 vˆ 46 thai phụ c— thai tuần 26 - 40) lˆm đối tượng nghi•n cứu

2.3.! Phương ph‡p nghi•n cứu

2.3.1.!Thiết kế nghi•n cứu

Nghi•n cứu m™ tả cắt ngang Kết hợp với đối chiếu thực tế (biểu hiện l‰m sˆng của thai phụ, t“nh trạng của trẻ khi sinh ra, )

2.3.2.!C‡c bước tiến hˆnh nghi•n cứu

- Thai phụ đến kh‡m được phỏng vấn để thu thập th™ng tin về đặc trưng c‡ nh‰n, tiền sử sản phụ khoa vˆ tiền sử mắc c‡c bệnh trong ti•u chuẩn loại trừ đ‹ n•u ở tr•n

- Thu thập c‡c th™ng tin để đ‡nh gi‡ về c‡c triệu chứng l‰m sˆng của tiền sản giật như: ph•, tăng huyết ‡p vˆ c‡c biến chứng của mẹ vˆ của thai nhi

- Thu thập c‡c th™ng tin để đ‡nh gi‡ về c‡c chỉ số huyết học vˆ h—a sinh

cơ bản dựa tr•n c‡c xŽt nghiệm của thai phụ

- Kết hợp lấy m‡u thai phụ để định lượng DNA ph™i thai tự do:

* Đối với nh—m thai phụ b“nh thường: lấy m‡u vˆ định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong m‡u thai phụ tại c‡c thời điểm thai phụ đến kh‡m (bắt đầu từ tuần thứ 12 của thai kỳ)

* Đối với nh—m thai phụ tiền sản giật: lấy m‡u vˆ định lượng nồng độ DNA ph™i thai tự do trong m‡u thai phụ bắt đầu tại thời điểm thai phụ đến kh‡m vˆ được chẩn đo‡n lˆ tiền sản giật

* Hoˆn chỉnh vˆ x‰y dựng đường chuẩn của kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman Probe để định lượng DNA ph™i thai tự do lưu hˆnh trong huyết tương thai phụ Quy tr“nh như sau:

Chiết t‡ch DNA ph™i thai vˆ tiến hˆnh nested PCR (PCR lồng):

-! PCR kiểm tra DNA (HouseÕs keeping): PCR lồng với cặp mồi X1X3;

X2X3 (gen tr•n NST X)

-! PCR kiểm tra c— mặt đoạn gen cần định lượng: PCR lồng với cặp mồi

Y1.5Y1.6; Y1.7Y1.8 (gen tr•n NST Y) để kiểm tra DNA chiết t‡ch vˆ chỉ lựa chọn những mẫu nghi•n cứu cho sản phẩm dương t’nh ở PCR lồng lần nˆy để tiến hˆnh định lượng DNA

Chọn đoạn tr“nh tự cần quan t‰m tr•n gen SRY (minigene), thiết kế mồi

vˆ đầu d˜