Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển acanthaster planci tt

Trong đó, có các nghiên cứu về hợp chất steroid phân cực từ sinh vật biển đã thể hiện hoạt tính sinh học chống lại nhiều dòng tế bào ung thư, có thể ứng dụng trong y, dược học.. Hiện nay

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Trần Thị Thu Thủy Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Ngô Đại Quang

vào hồi … giờ …., ngày … tháng … năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam có nguồn tài nguyên sinh vật biển vô cùng đa dạng và phong phú với hàng trăm ngàn loài thực vật, động vật và vi sinh vật khác nhau Tuy nhiên, các giá trị cung cấp về nguồn dược liệu cho y học và dược học của các loài sinh vật biển vẫn còn rất hạn chế Trong đó, có các nghiên cứu về hợp chất steroid phân cực từ sinh vật biển đã thể hiện hoạt tính sinh học chống lại nhiều dòng tế bào ung thư, có thể ứng dụng trong y, dược học Các hoạt chất này cũng góp phần quan trọng cho lĩnh vực tổng hợp hữu cơ Chúng trở thành hình mẫu để tổng hợp từ các steroid phổ biến trong tự nhiên bằng các phương pháp hiệu quả và kinh tế

Lớp Sao biển thuộc ngành Da gai là một trong những nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất steroid phân cực Lớp chất này có cấu trúc rất đa dạng và chúng thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống virut, ức chế sự thụ tinh Steroid phân cực từ sao biển đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

Ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về lớp chất này Các nghiên cứu chỉ theo hướng phân lập các hợp chất từ tự nhiên và đánh giá một số hoạt tính sinh học của chúng Hiện nay, chưa có công trình nào đi sâu vào nghiên cứu phân lập, chuyển hóa hóa học và đánh giá hoạt tính của các steroid phân lập

được từ sinh vật biển Sao biển Acanthaster planci là loài sao biển phổ biến ở

vùng biển Việt Nam, chúng là mối đe dọa với sự tồn vong của các rạn san hô sống do đây là nguồn thức ăn ưu thích của chúng Các nghiên cứu bước đầu

cũng chỉ ra thành phần hóa học chính của sao biển Acanthaster planci là các

steroid, đặc biệt là các steroid phân cực Điều này định hướng cho tác giả lựa

chọn đề tài nghiên cứu của luận án là: “Nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và

đánh giá tác dụng sinh học của steroid từ loài sao biển Acanthaster planci”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci của

Việt Nam, thực hiện tổng hợp các dẫn xuất steroid theo định hướng hydroxyl

và oxime hóa từ một steroid phân lập được từ loài sao biển này và đánh giá

hoạt tính sinh học của chúng

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Để đạt được các mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau:

• Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài sao biển

Acanthaster planci, đặc biệt là các steroid

• Chuyển hóa các dẫn xuất theo định hướng hydroxyl hóa và oxime hóa từ 1

steroid có hàm lượng lớn trong sao biển Acanthaster planci

• Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất phân lập và tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần này tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

1.1 Giới thiệu chung về lớp sao biển (Asteroidea)

1.2 Các nghiên cứu về lớp chất steroid phân cực từ sao biển

1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực từ sao biển 1.4 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.5 Tình hình nghiên cứu tổng hợp các hợp chất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid từ steroid tự nhiên

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phần này mô tả thông tin của đối tượng nghiên cứu; các phương pháp phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất và các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài sao biển Acanthaster planci được thu thập ở độ sâu 5-10 m, tại

Vịnh Vân Phong, Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam Tên loài được giám định bởi PGS.TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mặt phía trên Mặt phía dưới

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập

Các phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập các hợp chất bao gồm: sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký cột silica gel (CC) pha thường hoặc pha đảo, sắc ký cột Polychrome 1, Sephadex LH-20, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), ngoài ra còn dùng phương pháp kết tinh

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất bao gồm: phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR ESI-MS), độ quay cực ([α]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H, 13C, DEPT, 1D TOCSY) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz hoặc Bruker Avance III 700 MHz, sử dụng TMS là chất chuẩn nội

2.2.3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp MTS thực hiện tại: Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện HLKHCNVN (Hep G2, HeLa); Trung tâm nghiên cứu Hợp chất tự nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Hàn Quốc (KIST) (T98G); Viện Hóa sinh hữu

cơ Thái Bình Dương (PIBOC) – Viện Hàn lâm Khoa học liên bang Nga – Vladivostok (HCT-116, HT-29, RPMI-7951, T-47D, MDA-MB-231)

2.2.3.2 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm

Các chất thử nghiệm được thêm vào môi trường nuôi tế bào ở các nồng

độ không gây độc 5, 10 và 15 μM, ủ trong 4 tuần Các khối u hình thành được

đo bằng kính hiển vi và phần mềm ảnh theo phương pháp của Colburn Thực hiện tại PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga

2.2.3.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế sự di căn của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú bằng xét nghiệm chữa lành vết thương (wound-healing assay)

Các chất thử nghiệm (10 μM) được đưa vào môi trường đã được tạo một vết thương trên khối tế bào ung thư biểu mô tuyến vú MDA-MB-231 đã phát triển và để trong 48 giờ Độ đóng vùng tổn thương được đo và xác định phần trăm khoảng cách di chuyển của tế bào Thực hiện tại PIBOC – Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1 Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Acanthaster planci

Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A planci Việc phân tách các hợp chất được nêu tóm tắt trong sơ đồ hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ sao biển A.planci

3.2 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 3.3 Tổng hợp các dẫn xuất của cholesterol

Hợp chất AP7 được xác định là cholesterol, được lựa chọn là chất đầu

để chuyển hóa thành các dẫn xuất polyhydroxysteroid và hydroximinosteroid

3.3.1 Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxyl của cholesterol

3.3.2 Tổng hợp các dẫn xuất hydroximinosteroid từ cholesterol

3.4 Hoạt tính sinh học của các chất phân lập và các dẫn xuất tổng hợp được

3.4.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất steroid phân cực phân lập

từ sao biển Acanthaster planci

3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất tổng hợp từ cholesterol

Các hydroxysteroid (15c-21c), hydroximinosteroid (23c, 25c, 29c,

31c) và các chất trung gian (22c, 24c, 26c-28c, 30c) được đánh giá hoạt

tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào Hep G2, HeLa và T98G

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày các kết quả nghiên cứu phân lập, chuyển hóa và xác định cấu trúc của các hợp chất, kết quả hoạt tính sinh học của các hợp chất được thử nghiệm

4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học loài sao biển Acanthaster planci

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu

trúc hóa học của 14 hợp chất phân lập từ loài sao biển A.planci Trong đó

có 4 hợp chất mới và 8 hợp chất đã biết

Bảng 4.21: Bảng tổng hợp các chất phân lập từ sao biển A planci

AP1 Planciside A (chất mới) AP2 Planciside B (chất mới)

AP3 Planciside C (chất mới) AP4 Planciside D

AP5 3-O-sulfothornasterol A AP6 5-ergost-7-en-3-ol

* Dưới đây trình bày các phân tích phổ và xác định cấu trúc hóa học của

1 steroid glycoside mới đại diện là Acanthaglycoside G (AP11):

• Hợp chất AP11: Acanthaglycoside G (hợp chất mới)

Hợp chất AP11 được phân lập dưới dạng chất rắn, vô định hình Công thức phân tử của AP11 được xác định là C51H81O26SNa (M = 1164) từ pic ion

giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 1187,4533 (tính toán lý thuyết cho CTPT

C51H81Na2O26S = 1187,4532) trong phổ (+) HR-ESI-MS và pic ion giả phân

tử [M–Na]− tại m/z 1141,4735 (tính toán lý thuyết cho CTPT C51H81O26S =

1141,4737) trong phổ (-) HR-ESI-MS, trong đó M là khối lượng phân tử của

AP11 Ngoài ra, trên phổ (–) HR-ESI-MS/MS của pic ion [M–Na]− ở m/z

1141 xuất hiện tín hiệu của các pic ion tại m/z 995 [(M–Na)–C6H10O4]−, 849 [(M–Na)–2xC6H10O4]−, 703 [(M–Na)–3xC6H10O4]−, 557 [(M–Na)–4xC6H10O4]−, 411 [(M–Na)–5xC6H10O4]−, tương ứng với các tín hiệu này là sự mất lần lượt của 1, 2, 3, 4, và 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose, và pic ion tại

m/z 393 [(M–Na)–4 x C6H10O4 –C6H12O5]− tương ứng với sự mất của 1 chuỗi

oligosaccharide trong AP11 Từ dữ liệu phân tích phổ MS có thể dự đoán AP11 có chứa 5 đơn vị đường 6-deoxyhexose trong chuỗi carbohydrate

1269.4566 1+

1367.4546 +MS, 0.8-1.4min #44-83

570.2335 2-

849.3573 995.4151

1141.4735 1-

1163.4545

1127.4573 977.4046

-MS, 1.3-1.8min #76-100

0 1 2 3

4 x10 Intens.

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z

Hình 4.21: Phổ (+) HR-ESI-MS của AP11 Hình 4.22: Phổ (-) HR-ESI-MS của AP11

Phổ 1H-NMR của AP11 xuất hiện tín hiệu của 3 nhóm –CH3 đặc trưng của khung steroid bao gồm 2 nhóm methyl góc CH3-18 (s, 0,58 ppm) và CH3-19 (s, 0,94 ppm); 1 tín hiệu ở vùng trường yếu hơn của CH3-21 (s, 2,08 ppm) Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 proton olefin ở δH

5,24 (brt, J 4,2 Hz); 1 nhóm oxymetin liên kết với một nhóm sulfate ở δH

4,87 (m) ppm; một nhóm oxymetin liên kết trực tiếp với một chuỗi

carbohydrate ở vị trí CH-6 với δH 3,78 (m) Ở vùng trường yếu quan sát

thấy 5 tín hiệu doublet của 5 proton anome của 5 đơn vị monosaccharide

ở δH 4,82 (1H, d, J = 7,6 Hz), 4,84 (1H, d, J = 7,9 Hz), 4,97 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,03 (1H, d, J = 7,7 Hz), 5,27 (1H, d, J = 7,7 Hz).

Hình 4.23: Phổ 1H-NMRcủa AP11 Hình 4.24: Phổ 13C-NMRcủa AP11

Phổ 13C-NMR của AP11 cho thấy sự có mặt của 51 nguyên tử carbon,

trong đó có 8 nhóm CH3, 7 nhóm CH2, 32 nhóm CH và 4 carbon bậc 4 Sự có

mặt của nối đôi bị thế ba lần trong phân tử được xác định tại δC 116,4/145,8 ppm 5 tín hiệu carbon nhóm CH tại δC 102,3; 103,6; 104,9; 104,9; 106,9 ppm

được xác định là các carbon anome của 5 gốc đường Ngoài ra, trong vùng từ

60 – 90 ppm có các tín hiệu cộng hưởng của 23 nguyên tử carbon liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy, bao gồm 22 carbon oximetin trong đó có 2 carbon của

phần aglycon tại δC 77,4 (C-3) liên kết với nhóm sulfate; δC 80,1 (C-6) liên kết với chuỗi carbohydrate; và 20 carbon thuộc các phân tử đường tại δC 73,8; 91,0; 74,4; 71,7; 82,3; 75,1; 85,7; 71,4; 84,3; 77,5; 75,7; 72,8; 73,7; 74,9; 72,3;

71,8; 76,2; 77,5; 75,5; 73,4 ppm; và 1 carbon bậc 4 của nhóm C=O tại δC

208,0 ppm Độ chuyển dịch hóa học trong phổ 1H và 13C chỉ ra rằng phần

aglycon của AP11 có dạng đã biết là

3β,6α-dihydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one (aster3β,6α-dihydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one) đã bị sulfate hóa ở vị trí C-3 và có liên kết glycoside ở vị trí C-6 trong nhân steroid

Các tương tác nhận được trên phổ COSY và HSQC cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc từ C-1 đến C-8, C-11 đến C-12, và C-8 đến C-17 của phần aglycon Trên cơ sở kết quả phổ COSY, cùng các tương tác HMBC giữa các proton với các carbon cho phép khẳng định vị trí của các nhóm H-

18, H-19, H-21 và một liên kết đôi ở vị trí 9(11) của phần khung steroid cũng như chứng minh cho toàn bộ cấu trúc của phần aglycon Phổ ROESY

cho thấy các tương tác chìa khóa giữa H-5 với H-3α, H-7α; H-14 với H-12α,

H-17; H3-18 với H-8, H-15β, H-16β; và H3-19 với H-2β, H-4β, H-6β, H-8 Điều này chứng minh cấu hình khung steroid ở các vị trí được xác định là

5α/8β/10β/13β/14α/17α và cấu hình tương đối của các nhóm thế ở 3 và

C-6 là 3β và C-6α Trên phổ HMBC có xuất hiện tương tác của proton anome

H-1 của đơn vị đường QuiH-1 ở δH 4,82 ppm với C-6 ở δC 80,H-1 ppm của aglycon

và trong phổ ROESY có xuất hiện tương tác của proton anome H-1 của

Qui1 ở δH 4,82 ppm với H-6 ở δH 3,78 ppm của aglycon Điều này chứng tỏ

vị trí liên kết của chuỗi oligosaccharide với phần aglycon là vị trí C-6

Hình 4.25: Phổ 1D TOCSYcủa hợp chất AP11

Phổ 1D TOCSY cho thấy sự có mặt của 4 đơn vị đường Qui và 1 đơn vị đường Fuc do có các tín hiệu cộng hưởng của H-1 – H-6 của 4 đơn vị quinovose và H-1 – H-4 của 1 đơn vị fucose, chiếu xạ 1 nhóm methyl tương ứng dẫn đến tín hiệu H-5 của đơn vị fucose Thứ tự liên kết giữa các phân tử đường và phần aglycon được khẳng định dựa trên

các tương tác trong phổ HMBC Từ các tương tác chìa khóa giữa H-1 của Quip1 và H-6 (C-6) của aglycon, H-1 của Quip2 và H-3 (C-3) của Quip1, H-1 của Quip3 và H-4 (C-4) của Quip2, H-1 của Fucp và H-2 (C-2) của Quip3, H-1 của Quip4 và H-2 (C-2) của Quip2 có thể suy ra vị trí liên kết giữa các phân tử đường với nhau và giữa phần đường với phần aglycon của hợp chất steroid là Fuc(1→2)-Qui3(1→4)-[Qui4(1→2)]-Qui2(1→3)-Qui1-Aglycon Dựa vào các tín hiệu trên phổ 1D-, 2D-NMR

ta xác định được các giá trị carbon và proton của phần đường (bảng 4.9)

Hình 4.26: Cấu trúc hóa học của AP11

Hình 4.27: Các tương tác chính trong phổ HMBC và ROESY của AP11

Cấu hình của các đơn vị đường trong AP11 được chứng minh

bằng phương pháp của Leontein và cs, kết quả phân tích phổ GC thu

được chứng minh các đơn vị đường của AP11 đều có cấu hình D

Từ các kết quả phân tích dữ liệu phổ AP11 được xác định là: muối natri

quinovo-pyranosyl-(1→2)]-β-D-quinovopyranosyl-(1→3)-β-D-quinovo-

6α-O-{β-D-fucopyranosyl-(1→2)-β-D-quinovopyranosyl-(1→4)-[β-D-pyranosyl}-6α-hydroxy-5α-pregn-9(11)-en-20-one-3β-yl sulfate Đây là

asterosaponin hiếm với chuỗi carbohydrate gồm duy nhất hai dạng đơn vị

đường β-D-fucopyranosyl và β-D-quinovopyranosyl Như vậy, AP11 là chất

mới và lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là

Bảng 4.9: Dữ liệu phổ NMR của chuỗi đường của hợp chất AP11

3 77,5 4,12 (t, J 8,8 Hz) H-1 Qui4

4 75,5 4,01 (t, J 8,7 Hz) H-6 Qui4

5 73,4 3,70 m H-1 Qui4

6 17,8d 1,79 (d, J 6,1 Hz) H-4 Qui4 C-4, C-5 Qui 4

a C 5 D 5 N, b 500,13 MHz, c 125,75 MHz, d các vị trí có thể hoán đổi cho nhau

4.2 Chuyển hóa hóa học của cholesterol

Các hợp chất polyhydroxysteroid, hydroximinosteroid có mạch nhánh giống cholesterol được đánh giá là các hợp chất tiềm năng có hoạt tính gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư Vì vậy, cholesterol (hợp

chất AP7) được lựa chọn làm nguyên liệu đầu cho các phản ứng chuyển hóa tạo các sản phẩm hydroxyl và oxime hóa

4.2.1 Chuyển hóa các dẫn xuất polyhydroxysteroid

Cholesterol được hydroxyl hóa để tạo ra nhiều nhóm OH xung quanh

vị trí nối đôi C5/C6 Các tác nhân hydroxyl hóa được sử dụng chủ yếu là các tác nhân oxy hóa và có khả năng tạo sản phẩm dạng diol Bảy hợp chất

polyhydroxysteroid (15c-21c) đã được tổng hợp từ cholesterol theo sơ đồ 4.1

dưới đây

Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các dẫn xuất polyhydroxysteroid từ cholesterol