ĐẶC TRƯNG CỦA LOÀI STREPTOMYCES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ LỚP MỎNG BỀ MẶT BIỂN (SML) Ở VỊNH TRONDHEIM,NA UY

Hạt thường tích tụ ở bề mặt biển. Neuston là một tên của nhóm các dạng sống trong lớp bề mặt của đại dương và hồ, và có thể được chia thành Epineuston và Hyponeuston. Các sinh vật Epineuston sống trên đỉnh mặt nước, và tự nhiên phụ thuộc vào sức căng bề mặt của nước. Sinh vật Hyponeuston sống trong vài cm đầu của cột nước. Hạt thường tích tụ ở bề mặt biển. Neuston là một tên của nhóm các dạng sống trong lớp bề mặt của đại dương và hồ, và có thể được chia thành Epineuston và Hyponeuston. Các sinh vật Epineuston sống trên đỉnh mặt nước, và tự nhiên phụ thuộc vào sức căng bề mặt của nước. Sinh vật Hyponeuston sống trong vài cm đầu của cột nước. Hạt thường tích tụ ở bề mặt biển. Neuston là một tên của nhóm các dạng sống trong lớp bề mặt của đại dương và hồ, và có thể được chia thành Epineuston và Hyponeuston. Các sinh vật Epineuston sống trên đỉnh mặt nước, và tự nhiên phụ thuộc vào sức căng bề mặt của nước. Sinh vật Hyponeuston sống trong vài cm đầu của cột nước.

ĐẶC TRƯNG CỦA LOÀI STREPTOMYCES ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ LỚP MỎNG BỀ MẶT BIỂN (SML) Ở VỊNH

TRONDHEIM,

NA UY

GVHD: Phan Thị Huyền Thực hiện: Nhóm 10

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

NỘI DUNG

1 Đặt vấn đề

2 Phương pháp tiến hành

3 Kết quả thu được

4 Kết luận

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

 Tìm kiếm các sản phẩm bậc hai mới từ vi khuẩn có hoạt tính sinh học rất

quan trọng => đáp ứng nhu cầu ngày càng cao về thuốc kháng sinh mới

 Xạ khuẩn (Actinomycetes), đặc biệt từ chi Streptomyces sản xuất lượng lớn

hợp chất có hoạt tính sinh học

 Các vi khuẩn Streptomyces có khả năng ra khoảng 70% các sản phẩm tự

nhiên đặc trưng cho loài Actinomycete.

 Tuy nhiên, phần lớn các vi khuẩn Streptomyces đặc trưng đến nay

vẫn được phân lập từ môi trường trên cạn.

 Gần đây, đã phát hiện các vi sinh vật biển, có rất nhiều trong môi

trường nước dinh dưỡng trung bình, giàu dinh dưỡng hoặc trong quá trình nở hoa của sinh vật phù du

Hạt thường tích tụ ở bề mặt biển

Neuston là một tên của nhóm các dạng sống trong lớp bề mặt của đại dương

và hồ, và có thể được chia thành Epineuston và Hyponeuston.

Các sinh vật Epineuston sống trên đỉnh mặt nước, và tự nhiên phụ thuộc vào

sức căng bề mặt của nước

Sinh vật Hyponeuston sống trong vài cm đầu của cột nước.

Mật độ vi khuẩn có hoạt tính chuyển hóa cao, thường được gọi là

bacterioneuston, được tìm thấy trong SML.

Các vi sinh vật này đã được chọn lọc tự nhiên và phát triển được trên môi trường

biển ở Na Uy với điều kiện thời tiết lạnh và khắc nghiệt

Trong nghiên cứu này, đã phân lập vi khuẩn Streptomyces từ SML ở vịnh

Trondheim (Na Uy)

2 Phương pháp tiến hành

2.1 Lấy mẫu và cô lập vi khuẩn Streptomyces từ màng mỏng trên bề

mặt biển

Thời gian: 22/3/2004

Địa điểm: vịnh Trondheim, Na Uy

-Steinvikholmen (mẫu 1) là một hòn đảo nhỏ nằm cách lục địa khoảng 200 m,

trong khi đó điểm lấy mẫu khác ở gần bờ

-Các màng mỏng trên bề mặt biển được thu thập bằng cách sử dụng các tấm Teflon như mô tả trước đó -Các tấm được ngâm trong nước, nhẹ nhàng nhấc lên qua mặt nước, và các vi khuẩn bám vào một cạnh cao su

Nhiệt độ nước 4,30

Thu thập mẫu

Trữ và ủ

• trên các đĩa agar (2% w/v)

Nuôi trên 3 môi trường

phân lập khác nhau

Chuyển mẫu sang môi trường

Ba môi trường khác nhau đã được sử dụng:

• ½ ISP2: Chiết xuất mạch nha (5 g), chiết xuất nấm men (2 g), glucose (2 g), nước

biển tự nhiên (0.5 L) và nước cất (0.5 L)

• Môi trường phân lập Kusters treptomycete (đã chỉnh sửa): Glycerol (10 g), Casein

(0.3 g), KNO3 (2 g), FeSO4.7H2O (0.25 mg), H2SO4 (0.5mg), nước biển tự nhiên (0.5 L) và nước cất (0.5 L).

• Môi trường phân lập Actinomycete không có MgSO4 (Sách)

pH của môi trường phân lập được điều chỉnh đến pH = 8,2

• 3 môi trường khác nhau có 1%

agarose (PM)

Nuôi cấy

hạt thủy tinh 3 mm

Lọc chân không

Thử nghiệm

Dịch chiết

• Trên 3 loại: Micrococcus luteus (M), Candida

albicans (C) và Escherichia coli K12 (E)

2.2 Tách dòng, giải trình tự và phân tích phát sinh loài

DNA

PCRTinh sạch

PCRTinh sạchBLAST

Primer: BP_F27 và BP_R1492

Primer M13 reverse QIAquick Spin Kits

Cây phát sinh

2.3 Khuếch đại PCR của gen PKS và NRPS

Gene PKS I của vi

khuẩn

PCR khuếch đại KS (β-ketoacyl synthase)

Mồi thoái hóa:

KSMA-F và KSMB-R

Xác định trình tự 16S rDNA

960C, 5 phút Lặp lại 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ:

Một tỷ lệ lớn các sinh vật Neuston Actinomycetes sản xuất được chất

Bảng 1 Kết quả phân lập vi khuẩn trong môi trường có 50% nước biển

Số lượng vi khuẩn Gram dương:

• Pháp 2,3x103 tế bào/ml

• Tây Ban Nha 3,0x104 tế bào/ml

Dựa vào hình thái khuẩn lạc mà các chủng phân lập có thể được chia thành 10

nhóm, được thể hiện trong Bảng 2

Đặc điểm

Khuẩn ty cơ chất Khuẩn ty khí sinh Khác

2 Không màu Trắng Sản sinh chất chuyển hóa màu vàng

khuếch tán trong môi trường rắn

3 Không màu Xanh lục – Trắng  

4 Không màu Xanh lục – Trắng Sản sinh chất chuyển hóa màu vàng

khuếch tán trong môi trường rắn

6 Màu nâu / xanh lục Xám  

7 Không màu / nâu nhạt Tím nhạt  

Bảng 2.Đặc điểm của các nhóm phân lập khác nhau, khi nuôi trên môi trường ½ISP2 với 50%

nước biển trong 14 ngày

So sánh trên hai môi trường có và không có 50% nước biển

Hình 1 Sự tăng trưởng của actinomycetes bị cô lập sau 7 ngày nuôi cấy ở 30oC trên môi trường ½ ISP2

(A) có 50% nước biển - (B) không có 50% nước biển.

Sau khi tế bào được làm khô và chiết xuất với DMSO, các thử nghiệm thực

hiện với các sinh vật kiểm định: Micrococcus luteus (M), Candida albicans (C) và Escherichia coli K12 (E).

Bảng 3 Tổng số chủng giống như streptomycete từ bacterioneuston, mẫu 1 và 2, nhóm

và phân nhóm theo hoạt tính kháng khuẩn và hình thái khuẩn lạc Chiết xuất DMSO từ

tất cả các chủng được kiểm tra hoạt tính chống lại C albicans (C), M luteus (M) và E coli

(E) Các mẫu 1 và 2 chứa 134 và 83 chủng, mẫu 1 và mẫu 2 tương ứng là S1 và S2, và G1-G10 cho biết nhóm hình thái 1- 10 Các tỷ lệ phần trăm về hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và không có hoạt tính trong mỗi nhóm

Phân tích 16S rDNA từ vi khuẩn được phân lập cho thấy sự khác nhau nhóm

kiểu hình và phân loại phân tử.

Hình Cây phát sinh loài được xây dựng cho một phần các trình tự 16S rDNA của 46 chủng

Streptomycetes được phân lập

từ lớp mỏng bề mặt ở vịnh Trondheim, Na Uy

• (x-y-z): x nhóm hình thái,

y kiểu ức chế, z số mẫu

• Mũi tên: nhánh

• Chữ đậm: chuỗi đại diện cho một số chủng phân lập

`

Các chủng còn lại trong nhánh 1, tổng số 17/23 chủng trong nhánh này có hoạt tính kháng khuẩn, trong đó có 15 chủng có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram dương, và 2 chủng kháng với vi khuẩn Gram âm.

3.2 Phân tích các đoạn gen PKS từ các chủng

Streptomycetes được chọn để phân lập cho thấy việc

chuyển gen ngang giữa các loài liên quan chặt chẽ với nhau.

 Polyketide synthase (PKSs): PKS-I, PKS-II

Polyketide (PK) là tập hợp các đơn vị có cấu trúc carboxylic

 non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs)

Non-ribosomal peptide (NRP) là tập hợp các acid amin

 Phức hợp PKSs-NRPSs

Bảng 5 Tên và kiểu ức chế của mẫu được phân lập để phân tích PKS

Hoạt động ức chế trên C albicans (C), M luteus (M) và E coli (E)

Phân tích trình tự 16S rDNA

• Có những đoạn 16S rDNA giống hệt nhau nhưng đặc điểm

hình thái và kiểu ức chế khác nhau.

• Phân tích sự hiện diện của gen PKS-I

• Đại diện là chủng MP6A8 (nhánh 1-H2)

-Các đoạn gen PKS-I được khuyếch đại sử dụng các primer thoái hoá KSMAF và KSMB-R để khuyếch đại các đoạn mã hóa β-ketoacyl synthase (KS) khoảng 700 bp

Kết quả: Đều có sự khuếch đại các đoạn có kích thước mong muốn từ tất cả

các mẫu phân lập.

Các đoạn PCR của PKS-I được nhân vô tính trong vector của

E.coli

1. Thu được 13 trình tự khác nhau từ 7 chủng phân lập Trong đó có 6 trình tự mã hoá KS khác nhau được khuếch đại từ toàn bộ DNA của chủng MP8E7

2. Dựa vào BLAST tìm kiếm để biết trình tự aa

3. Mỗi chủng MP6A2 và MP6D1 cho 2 trình tự PKS

4. Mỗi chủng phân lập MP6A8, MP6C6, MP6C10 và MP9E12 cho mỗi trình tự có vùng mã hóa KS riêng biệt

Kết quả:

Chủng phân

lập Loại PKS

Tỉ lệ trình tự aa/nucleotide giống

Sản phẩm chưa

rõ PKSI-3

PKSI-1, 2, 3 và

6 68% - 95%

Có thể đã được khuếch đại từ cùng một cụm gen PKS.

Bảng 6 Kết quả

Chủng

phân lập Loại PKS

Tỉ lệ trình tự aa/nucleotide giống nhau

So sánh Sản phẩm tổng hợp Nhận

xét

MP8E7

PKSI-4 và -5 Khá khác nhau

PKSI-4 72% so với PKS từ Amycolatopsis

Chủng phân

lập Loại PKS

Tỉ lệ trình

tự aa giống nhau

So sánh

Sp tổng hợp

Chủng phân

lập Loại PKS

Tỉ lệ trình tự aa/nucleotide giống

MP6A8

Giống 83% so với PKS-I từ

cụm gen lạ chưa biết ở S

coelicolor

Có sự chuyển gen ngang mới

MP6C6

Chủng phân

lập Loại PKS

Tỉ lệ trình tự aa/nucleotide giống

nhau

So sánh Sản phẩm tổng

hợp Nhận xét

MP6C10

Tất cả PKS Quan hệ gần nhau

96% so với protein kết hợp

NRPS-PKS từ Streptomyces griseus subsp griseus NBRC

13350

MP9E12

98% so với protein kết hợp

NRPS-PKS từ Streptomyces griseus subsp griseus NBRC

Hình 3 Quan hệ phát sinh giữa các chuỗi amino acid PKS-I từ chủng Streptomycete được phân lập với các trình tự 16S rDNA

giống hệt nhau, bao gồm những sự tương đồng mới nhất từ các BLAST tìm kiếm

Các tên KS khác nhau được kí hiệu với các chữ cái (A, B, C,…)

Số tại các nút cây đại diện cho số lần mà hình dạng bố trí của nút ở bên phải đã được khôi phục trong 1000 lần lấy mẫu Số lượng bổ sung cho các dãy được đặt trong ngoặc đơn

Tỉ lệ thanh đại diện cho số lần thay đổi mỗi vị trí axit amin.

Giải thích

• Cụm PKS tương ứng có thể không được biểu hiện trong các điều kiện được kiểm tra, hoặc điều khiển sự tổng hợp của một hợp chất mà không thể phát hiện bằng các phương pháp được sử dụng

Ví dụ: Điều tương tự có thể đúng đối với cụm KS C đại diện bởi các dãy MP6A2 PKSI-1 và MP6D1 PKSI-1, vì các chủng phân lập tương ứng có các kiểu ức chế khác nhau (xem Bảng 5)

Kết luận

đại thể.

phân tử, từ đó hình thành cây phát sinh loài.

hệt nhau không cho phép kết luận chắc chắn về tính chất của các hợp chất có thể được tạo ra.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Sigrid Hakvåg, Espen Fjærvik, Kjell D Josefsen, Elena Ian, Trond E Ellingsen và

Sergey B Zotchev Characterization of Streptomyces spp Isolated from the Sea Surface Microlayer in the Trondheim Fjord, Norway Marine Drugs 2008, 6,

620-635

2. Nguyễn Tú Anh, Một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên thuộc nhóm

polyketide- nonribosomal peptide, Tạp chí dược học, 5/2011 (số 421 năm 51),

16-20

Các môi trường sản xuất (PM) là

• PM2: Mannitol (20g), bột đậu nành (20g), clerol (antifoam, 0.5g), men khô

(3.4g), agarose (10.0g), nước máy (1l)

• PM3: bột yến mạch (20g) glycerol (2,5 g), FeSO4.7H2O (0,1 mg),

MnCl2.4H2O (0,1 mg), ZnSO4.7H2O (0.01mg), H2SO4 (0,1 mg), agarose (10g), nước máy (1L)

• PM4: glucozơ (0,5g), glycerol (2,5g), chiết xuất yến mạch oatmeal (1g), axit

casaminoid (2.0g), CaCO3 (1.0g), Clerol (0.2g), agarose (10g) và nước máy (1l)

- Môi trường agarose LB được sử dụng cho E coli, M19 đối với Nấm C albicans và M1 đối với M luteus

Các môi trường bao gồm:

bò (1,5 g), dextrose (1,0 g), agarose (10g) và nước máy (1l), pH 6,6

(10,0g), NaCl (10,0g), agarose (10g) và nước máy (1l), pH 6,1.

940C, 4 phút: Biến tính chuỗi DNA Lặp lại 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ:

BP_F27: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’

BP_R1492: 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’

QIAamp Mini Spin

960C, 3 phút: Biến tính chuỗi DNA Lặp lại 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ:

KSMA-F 5'-TS GCS ATG GAC CCS CAG CAG-3 '