Sàng lọc vi sinh vật phân rã rơm lúa và hoạt động enzyme cellulase của chúng

Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn. Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn.

Sàng lọc vi sinh vật phân rã rơm lúa và hoạt động enzyme

cellulase của chúng

GVHD: Phan Thị

Huyền

Trần Thị Loan Anh 1510110

Cấu tạo Chứa khoảng 39% cellulose, 27% hemicellulose và 12%

lignin Cellulose và hemicellulose

Khi thủy phân bằng chất hóa học hay bằng enzym, biến đổi thành glucose và đường có thể lên men đc để sản xuất etanol

RƠM LÚA

Cấu tạo

Thành phần chính của tế bào bền chắc, bao bọc các tế bào thực vật.

Trên quy mô toàn cầu, thực vật tạo ra khoảng 100 tỷ tấn

cellulose mỗi năm.

Cellulose là polymer của -D-glucose

Phân tử Cellulose không bao giờ phân nhánh

Các phân tử cellulose nằm song song liên kết với nhau giữa các CELLULOSE

Cấu tạo

Cellulase là enzym đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21) hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành

glucose

Cellulase được ứng dụng để cải thiện gía trị dinh dưỡng của thức

ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol

CELLULASE

Cơ chế tổng quát được đề xuất trong phản ứng thủy

phân cellulose bằng phức hệ enzyme C1: Exocellulase;

Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa

Vi khuẩn

Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes,

Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium,

Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans,

Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia

riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter

freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh

vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ

làm nguồn thức ăn.

Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa

Xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm

57-75 % [22] Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô [23] Xạ khuẩn còn được biết

đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như

streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp

Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh

cellulase được quan tâm nghiên cứu Một số loài đáng chú ý thuộc giống này như

Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans.

Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium

trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân hủy cellulose.

Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa

Nấm

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản

phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose [30] Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không

có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi khuẩn

Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride,

penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy cellulose

ở nhiều môi trường khác nhau [7, 30]

Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa

Bacillus

sp

Bacillus sp

PA1: Serratia sp PA2: Pseudomonas sp

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose

90ml NaCl 0.85%

10g

mẫu

nước

thải và

đất

Vortex 5 phút

 Chọn 3 mẫu để bắt đầu sàng lọc

 Mỗi mẫu pha loãng lấy 0,1ml truyền trên NA 0,1%

cellulose agar hay 2% rơm agar.

 Ủ 3-5 ngày ở 37°C

 Thu thập khuẩn lạc và nấm

 Vi khuẩn nằm rải rác và ổn định trên môi trường

thạch

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Phân tích các hoạt động cụ thể của cellulase

 Chuẩn bị enzyme thô

 Một vòng lặp của mỗi vi khuẩn được phân lập là cấy

trong 25 ml môi trường 0,1% cellulose, ủ 24 giờ ở 37 o C,

150 vòng / phút

 Dịch tế bào được đo bằng OD 600 và điều chỉnh tới OD

600 = 0,1, sau đó 5 ml dung dịch tế bào đã được điều

chỉnh được tiêm vào 45 ml môi trường 0,1% cellulose và

ủ trong 24 giờ ở 37 oC, 150 vòng / phút

 10 ml dung dịch tế bào được ly tâm trong 10 phút ở 4°C

với 5.000 vòng / phút

 Dịch ở trên chứa enzym thô được sử dụng để khảo sát

các hoạt động cụ thể của enzyme

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Khảo nghiệm hoạt động cụ thể của cellulase

 Tổng lượng protein của enzym thô được xác định bằng

phương pháp Lowry và nồng độ protein (mg / ml) sau đó

được sử dụng để tính toán hoạt độ cụ thể (UI / mg

protein)

 Các enzyme thô sau đó được kiểm tra khả năng thủy

phân các chất nền sau: Giấy lọc 1x1cm (Whatman No.1),

1% carboxymethyl cellulose (1% CMC) và 0,1%

cellobiose

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Khảo nghiệm hoạt động cụ thể của cellulase

 Tất cả các chất nền này được phân tán trong dung dịch

đệm natri acetate 0,2 M pH 5 Mỗi phản ứng được chuẩn

bị trong 2 bộ ủ ở 30°C và 50°C bằng cách trộn 1 ml

enzym thô với 1 ml đệm, ủ trong 1 giờ khi sử dụng giấy

lọc như chất nền và trong 10 phút khi CMC hoặc

cellobiose được sử dụng làm chất nền

 Giảm đường được đo bằng phương pháp Somogyi-Nelson

(Nelson, 1944) (cho giấy lọc và CMC) hoặc phương pháp

DNS (Miller, 1959) (cho cellobiose)

 Các hoạt động enzyme được báo cáo bằng đơn vị UI/ ml

của enzym thô

Từ tám mẫu thử ( chất bẩn và nước thải ):

+ 11 chủng vi khuẩn ( BC1-11) và 9 chủng vi nấm ( FC1-9) đã được tìm thấy trong 0.1%

cellulose agar ( nguồn carbon lấy từ cellulose )

+ 19 chủng vi khuẩn (BR1-19) và 20 chủng vi

nấm ( FR1-20) có thể phát trển trên 2% RƠM

agar ( rơm đã qua tiền xử lý )

Do đó, tổng số chủng là 59, trong đó 30 là chủng

vi khuẩn và 20 là chủng vi nấm Những chủng này

Tuyển chọn các loại vi sinh vật sinh tổng

hợp từ cellulose.

Hoạt tính trên giấy lọc ( Hoạt tính FPase )

Chúng ta đo hoạt tính của những enzyme đã thủy phân giấy lọc Đối tượng enzyme chính là exoglucanase Vài chủng vi sinh vật cho thấy hoạt tính FPase cao ở 30 độ C và một vài cái cho thấy hoạt tính cao ở 50 độ C

  Tuy nhiên, nhìn chung thì hoạt tính của các chủng trên giấy lọc tương đối thấp, hoạt tính trung bình đối với vi khuẩn là 0,0049 unit/mg protein và với nấm là 0,0041 unit/mg protein

Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với

nhiều cơ chất khác nhau.

Summary of bacteria (B) or fungi (F) isolates with

high specific activity of filter paper cellulase

(FPase)

0

0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

0.04

0.03

0.02

0.02 0.02 0.02

Tất cả các chủng đều được khảo sát hoạt tính exoglucanase, endoglucanase và

beta-glucosidase Các chất nền được sử dụng là : giấy lọc ( whatman No.1 ), Carboxymethy cellulose và Cellobiose

Hoạt tính trên CMCase và Cellobios

Việc tuyển chọn được thực hiện trên 0,1%

cellulose agar (C) và 2% rơm agar (R) ở 30 độ C

và 50 độ C Chủng FR14 và BR14 có hoạt tính cao

ở 30 độ C, trong khi đó BR15, BR11 và FR9 có hoạt tính cao ở 50 độ C Các cơ chất

''carboxylmethyl cellulase'' ( CMCase) và ''cellobiase'' sẽ cho ta thấy hoạt tính

endoglucanase và beta-glucosidase theo thứ tự lần lượt Một vài chủng VSV có hoạt tính thủy phân cellulose ở nhiệt độ thấp ( 30C) và vài chủng cho hoạt tính cao ơn ở nhiệt độ cao ( 50C)

Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với

nhiều cơ chất khác nhau.

Hoạt tính trên CMCase và Cellobios

Chủng vi khuẩn hướng tới việc tổng hợp ra nhiều enzyme thủy phân cellulose hơn enzyme thủy phân carboxymethyl cellulose hydrolyzing

enzymes (CMC), trong khi đó chủng nấm lại có khả năng tổng hợp số lượng lớn enzymes như chủng vi khuẩn Một vài nấm có khả năng tổng hợp CMCase hoặc cellobiase, trong khi đó một vài nấm khác có tể tổng hợp cả hai loại enzymes này

ở cùng một mức độ giống nhau Hoạt tính CMCase

và cellobiase trung bình của chủng vi khuẩn là 0.06 và của chủng nấm là 0,062 unit/mg protein

Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với

nhiều cơ chất khác nhau.

Kết luận

Áp dụng các enzyme cellulolytic trong phân hủy các vật liệu lignocellulosic cần điều phối các

hoạt động của các loại xenlulaza khác nhau Như vậy, có 2 cách thực hiện được từ việc sử dụng các enzym được phân lập trong nghiên cứu này

- Cách thứ nhất là chọn các chất phân lập với phạm vi hoạt động riêng cao của cá nhân enzyme

và sử dụng chúng như là sự kết hợp giống

- Cách khác là chỉ sử dụng một chất phân lập có thể sản xuất ra nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó vấn đề điều kiện tăng trưởng tối ưu của từng chất phân lập bằng cách tránh đồng lên men Các hoạt động cụ thể của xenlulaza được khảo sát trong nghiên cứu vẫn còn rất thấp so

với các nghiên cứu khác đã được báo cáo Tuy nhiên, sản xuất cellulase từ những phân lập này phải được tối ưu hoá dưới các điều kiện khác nhau để tăng cường xenluloza suy thoái và do đó làm cho chúng hữu ích cho các ứng dụng khác

Kết luận

 Sàng lọc vi sinh vật cellulolytic từ rơm rạ đã được nghiên cứu Có 29 vi khuẩn phân lập và 30 loài nấm phân lập được nghiên cứu trên các hoạt động xenlulit Phân lập FR14 cho thấy hoạt động đặc biệt với cellulase lọc giấy cao nhất (FPase) với 0,032 đơn vị protein / mg protein,

trong khi FR4 cao nhất,

 Hoạt tính CMCase đặc hiệu với 0,5 đơn vị protein / mg

 Tốc độ tăng trưởng FC1 với 0.6 đơn vị protein / mg

 Sản xuất Cellulase từ những phân lập này phải được tối ưu hoá dưới điều kiện khác nhau