Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông
Trang 1BÁO CÁO TIỂU LUẬN
MÔN: VI SINH VẬT
ĐỀ TÀI: HỢP CHẤT KHÁNG NẤM TỪ STREPTOMYCES SP.3265 - KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CHO THỰC VẬT
GVHD: Cô Phan Thị Huyền
Ngô An Mai Phương
Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ thuật Hóa học
Trang 21 Đặt vấn đề
2 Các phương pháp sử dụng
4 Thu nhận các hợp chất chống nấm
5 Xác định cấu trúc các hợp chất chống nấm
6 Hoạt tính kháng nấm
Nội dung báo cáo
Trang 31 Đặt vấn đề
Nhân Sâm
Trang 41 Đặt vấn đề
Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác
Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác
Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi
Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông
Trang 5Sản lượng nhân sâm bị hạn chế bởi nhiều yếu tố, trong đó có bệnh thối rễ và bệnh úng nước trong quá trình trồng cũng như tích trữ trước khi tiêu thụ
Một số tác nhân gây bệnh là: Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides
◦ Rhizoctonia solani: Gây bệnh úng nước Điều hòa bằng những hợp chất kháng nấm như iprodione, benomyl, fentin hydroxide, benodianil,
difenoconazole và pencycuron
◦ Botrytis cinerea: Gây ra bệnh thối rễ nguyên nhân của đa số tổn thất sau thu hoạch ở nhân sâm Việc kiểm soát B cinerea thường được
thực hiện bằng cách sử dụng thuốc trừ nấm Tuy nhiên sử dụng thuốc kháng nấm dấy lên lo ngại ở người tiêu dùng, cũng như sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc đòi hỏi cần có các phương pháp để kiểm soát các bệnh này
Khống chế sinh học là cách hiệu quả và thân thiện với môi trường để tránh tình trạng bệnh thối rễ và úng nước ở cây nhân sâm
1 Đặt vấn đề
Trang 6Phân lập
Các hợp chất này biểu hiện hoạt tính kháng nấm mạnh đối với nhiều loại nấm gây bệnh thực vật
cũng như chống lại vi khuẩn
Hai hợp chất chống
nấm
Methyl Guanidylfungin A Guanidylfungin A
Xác định được Streptomyces sp.A3265 thể hiện hoạt tính kháng nấm mạnh đối với nhiều loại nấm gây bệnh thực vật
1 Đặt vấn đề
Trang 7 Sắc ký cột Diaion HP-20 và Sephadex LH-20
Sắc ký lỏng trung áp (MPLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp phân tích quang phổ
◦ Phương pháp khổi phổ (Mass spectrometry – MS)
◦ Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance – NMR)
2 Các phương pháp sử dụng
Trang 8 Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định
Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối
với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta
dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó
Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên
nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp
Trang 9 Streptomyces sp A3265 được nuôi trên một đĩa môi trường thạch Bennett’s biến đổi trong vòng 5 ngày.
Nhân giống cấp 1: Lấy chủng trên môi trường thạch cấy vào hai bình erlen 1 L chứa 200 mL môi trường nhân giống
Thành phần môi trường: 20g glucose, 10g tinh bột hòa tan, 1g dịch chiết thịt bò, 4g dịch chiết nấm men, 2g NaCl, 0.05g KH2PO4 và 25g bột đậu nành trong 1L nước cất (pH=7.0)
Nuôi ở 27°C trong 2 ngày trên máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min
Nhân giống cấp 2: Chuẩn bị 15 bình erlen chứa 200mL môi trường nhân giống, hút vào mỗi bình 2mL môi trường nhân giống cấp 1
trên Lên men ở 27°C trong 5 ngày trên máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min
3 Cultivation
Trang 10Rửa giải với methanol 40-100%
phần dịch
Dịch nuôi cấy của Streptomyces sp.A3265
Ly tâm 6000 vòng trong 20 phút
Chiết với acetone
Sắc ký cột Diaion HP-20
Sắc kí cột sephadex LH-20
Cô đặc chân không
Sắc kí lỏng trung áp (MPLC)
rửa giải với methanol 70%
Đem tủa thu trong acetonitrile 30%
phần tủa
4 Tách hợp chất chống nấm
Trang 114 Tách hợp chất chống nấm
cao với cột C18
Sắc ký điều chế lỏng hiệu năng
cao với cột C18
Sắc ký điều chế lỏng hiệu năng
cao với cột C18
Sắc ký điều chế lỏng hiệu năng
Rửa giải với acetonitrile 33%
Rửa giải với 58%
methanol+0,04%TFA
Trang 12 Phân tích khối phổ (ESI-MS) quét điện tích dương
để xác định trọng lượng phân tử: thu được các
peak m / z là 1130.4[M + H]+ và 1152.3
[M + Na]+đối với hợp chất A3265-1.
Trọng lượng phân tử A3265-1 là 1129
Hình 2.1: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-1 in positive mode
5 Xác định cấu trúc của chất chống nấm
Tương tự, thu được phổ khối lượng của hợp chất
A3265-2 trong hình A3265-2.A3265-2 với các peak m/z là 1144.4[M + H]+ và
1166.3 [M + Na]+
Trọng lượng phân tử A3265-2 là 1143
Hình 2.2: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-2 in positive mode
Trang 135 Xác định cấu trúc các hợp chất
• Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR) của
hợp chất A3265-1 thể hiện tín hiệu cho các nhóm
chức sau :
4 nhóm olefinic methine
ở δ 5,55, 5,44, 5,33 và 5,32.
Nhiều nhóm oxygenated methine ở δ 3.5-4.2.
Một nhóm N-methyl ở δ 2.82
Chín nhóm methyl ở δ 0.5-1,5
Trong đó: δ là độ chuyển dịch hóa học
Hình 3: H-NMR spectra of compounds A3265-1 1
Trang 14• Phổ carbon 13-NMR cung cấp thông tin trực tiếp về bộ sườn carbon
của phân tử
• Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon (13C-NMR) của A3265-1
có tổng cộng 58 carbon, bao gồm :
ba carbonyl carbon ở δ 177,0, 170,5, và 169,1;
một carbon guanidyltại δ 158,3
sáu olefinic carbon ở δ 120-140
một hemiketal carbon ở δ 102,9
carbon oxy hoá ở 60-85;
methylene và methine carbons at δ 20-60
chín methyl carbon ở δ 10-18
Hình 4:13C-NMR spectra of compounds A3265-1 and A3265-2 in CD3OD
Những dữ liệu quang phổ này tương đồng với dữ liệu của guanidylfungin A hợp chất A3265-1 là guanidylfungin A
Những dữ liệu quang phổ này tương đồng với dữ liệu của guanidylfungin A hợp chất A3265-1 là guanidylfungin A
Trang 15• Phổ 1H-NMR của hợp chất A3265-2 tương tự như hợp chất A3265-1,
• Ngoại trừ sự có mặt của một nhóm methoxyl ở δ 3,98 có thể dễ dàng trao đổi bằng dung môi -OCD3
2
• Trong phổ 13C-NMR của hợp chất A3265-2, 59 cacbon đã được quan sát.
• Phổ 13C-NMR của A3265-2 rất giống với hợp chất A3265-1
• Ngoại trừ, sự có mặt của một methoxyl carbon tại δ 54,9 dễ dàng trao đổi bằng dung môi -OCD3
3
• hợp chất A3265-2 là methyl guanidylfungin A
Trang 16 Cấu trúc hóa học của cả hai hợp chất trên đềiu được xác định nhờ 2D NMR
Trang 176 Hoạt động kháng nấm
Hợp chất A3265-1 thể hiện hoạt động kháng nấm mạnh với: F oxysporum và
R solani, với nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) là 5,0 -10 μg.
Hợp chất A3265-2 cho thấy hoạt động kháng nấm đáng kể đối với: F
oxysporum và A panax, với giá trị MICs là 2,5 μg.
Các hợp chất này cũng có hoạt tính khánh vi khuẩn Gram dương: Bacillus
subtilis, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus với MICs trong
khoảng 5 ~ 20 μg.
Chủng Streptomyces A3265 sản xuất hai kháng sinh phổ rộng vừa kháng nấm và kháng khuẩn.
Hợp chất A3265-2 có tính kháng nấm cao hoạt động hơn so với hợp chất A3265-1
Chủng Streptomyces A3265 sản xuất hai kháng sinh phổ rộng vừa kháng nấm và kháng khuẩn.
Hợp chất A3265-2 có tính kháng nấm cao hoạt động hơn so với hợp chất A3265-1
Trang 18◦ Chủng vi khuẩn Streptomyces sp.A3265 được phát hiện là có hoạt tính kháng nấm chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật như
Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides
khác nhau
guanidylfungin A và methyl guanidylfungin A Chúng vừa thể hiện hoạt tính kháng nấm vừa có hoạt tính kháng khuẩn cao
◦ Chủng vi khuẩn Streptomyces sp.A3265 được phát hiện là có hoạt tính kháng nấm chống lại nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật như Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea và Colletotrichum gloeosporioides
Nghiên cứu tiến hành nuôi giống Streptomyces sp.A3265 và thu nhận những hợp chất kháng nấm bằng các phương pháp sắc ký
khác nhau
Những hợp chất này sau khi được phân tích cấu trúc bằng các phương pháp quang phổ (MS và NMR) thì được xác định là
guanidylfungin A và methyl guanidylfungin A Chúng vừa thể hiện hoạt tính kháng nấm vừa có hoạt tính kháng khuẩn cao
7 Kết luận