Tnguyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau- Đồng Hỷ- Thái Nguyên

Tnguyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau- Đồng Hỷ- Thái Nguyên

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhânloại Năm 1928, A Fleming phát hiện ra Penicillin - một chất kháng sinh(CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium Nhưng phải hơn 10 năm sau, vàonăm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công đượcPenicillin Kể từ đó, Penicillin mới chính thức được dùng để chữa bệnh chongười Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế

kỷ XX Sự ra đời của CKS có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực sản xuất

và đời sống Trong y học, CKS được sử dụng để phòng và chữa bệnh chongười Trong chăn nuôi, CKS được sử dụng để chữa bệnh và tăng trọng chovật nuôi Trong nông nghiệp, CKS được sử dụng để thay thế thuốc hóa học vàdùng làm chất kích thích sinh trưởng Ngoài ra, CKS còn được sử dụng đểbảo quản thực phẩm…[1]

Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiệnngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc khángsinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS

có cấu trúc tương tự nhau Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là cácCKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần được quan tâmnhiều hơn Hàng năm có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện và chođến nay, người ta đã phát hiện khoảng 17000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn

30000 CKS bán tổng hợp, nhưng trong số các CKS này chỉ có 1 - 2% là được

sử dụng trong y học [15, 21]

Trong số các VSV có khả năng sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai tròquan trọng hàng đầu, chiếm 80% các CKS được mô tả [18] XK là nhóm sinhvật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinhthái khác nhau trên thế giới Nhóm VSV này được biết đến với nhiều ứngdụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sửdụng cao như các enzym thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh vànhiều hợp chất y dược khác

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm, ngư nghiệpnên có khu hệ VSV khá phong phú Đồng thời, Thái Nguyên cũng nằm trongvùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung Các hoạtđộng khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất

và qua đó chắc chắn sẽ có ảnh hưởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này

mà hiện vẫn chưa được nghiên cứu

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, từ xu hướng nghiên cứu trênthế giới hiện nay và cũng như để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng

phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và

nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất

bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính khángsinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế

- Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzymngoại bào

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất

- Kiểm tra HTKS của các chủng XK đã phân lập được với các VSVKĐ

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

1.1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm

vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [32]

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ

Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó

có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại

được xếp vào nhóm XK hiếm [11, 36]

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầuhết các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà

cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được XK phân bố nhiều nhất ởtrong đất, và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chấttrong tự nhiên Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giảikhác trong đất [36] Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 -2.400.000 mầm XK, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [34] Sự phân bố của XKphụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Sựphân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiềutrong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 XK có rất íttrong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng

XK trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của XK là khả năng hìnhthành chất kháng sinh, 60 - 70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinhCKS [15] Ngoài ra, XK tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiềuhợp chất trong đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,amylaza, cellulaza… một số axit amin và axit hữu cơ Một số XK có thể gâybệnh cho người, động vật [8]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G(+), toàn bộ cơthể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinhchất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạkhuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng củakhuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng

60 ÷ 120A0, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớpglucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetylmuramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit Thành tế bào XK không chứacellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổichất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào XK được chia thành 4nhóm chính [5, 9] Bao gồm:

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic

(L - ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6

diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin Thuộc nhóm này gồm các giống:

Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6

-diaminopimelic Thuộc nhóm này có các giống: Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia…

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6

-diaminopimelic, arabinose và galactose Thuộc nhóm này gồm các giống:

Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[10].

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấutạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặcbiệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tửcủa XK

Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩnnhập gồm các hạt poliphotphat và polixacarit Nhân của tế bào XK không cócấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng Khi còn non,toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải ráctrong toàn bộ hệ khuẩn ty [25].

* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn

Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có váchngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi XK có đường kính thayđổi trong khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài

cm [11] XK phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm mộtnhánh Độ dài khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm [35]

Khuẩn ty XK bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hìnhthành nha bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy,dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bógọi là khuẩn ty thể (mycelium) Kích thước và khối lượng khuẩn ty thườngkhông ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy [31] Hệ sợi của

XK có màu sắc rất đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Cáckhuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn các khuẩn ty già

và khuẩn ty không mang bào tử Các loài XK khác nhau đều có cùng một kiểucấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sónghoặc rất ít phân nhánh, có loài lại có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳnghoặc xoắn

Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại.Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất -substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triểntrên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) vớichức năng chủ yếu là sinh sản [28] Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ cósợi cơ chất, làm cho bề mặt XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền Loại chỉ

có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường[25]

Hệ sợi của XK phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc Hình tháicủa khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thểthay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như: thành phần môitrường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm,nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa.Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt như của vi khuẩn hay nấmmen mà thường có dạng thô ráp, không trong suốt, xù xì, có dạng vôi, dạngnhung tơ hay màng dẻo… với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng,trắng, xanh… [8], có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch.Khuẩn lạc thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớptrong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Các sản phẩm trong quátrình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong sinhkhối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men Hệ sợi cơ chất có thể tiếtvào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… cósắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [38].

* Bào tử của xạ khuẩn

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khísinh (gọi là cuống sinh bào tử) Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK.Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới

200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử Sự hìnhthành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmenlation) hoặc do sựcắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử

Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan,hình cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm.Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậmchí ngay trên cùng một chuỗi bào tử Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm -Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose)hay dạng tóc Ha - Hair like [10]

Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu proteinvới độ dày khoảng 300 ÷ 400A0 gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử

tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm,pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thayđổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [14].

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axithữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon,muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiênkhả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủngkhác nhau

Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độthích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 300C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinhtổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 280C Độ ẩm thích hợp đốivới XK dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5

XK không có giới tính [28] XK có khả năng hình thành enzym và các CKSnên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống

1.2 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hìnhthành CKS Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là cónguồn gốc từ XK [5]

Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nóichung và từ XK nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác dụngvới một nhóm VSV nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc XK đều có phổkháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quantrọng để phân loại XK

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS, nhưng cóhai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:

- Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợicho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được

sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục

bộ đó

- Việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năngsống sót cao của chủng sinh ra CKS trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử[2].

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đadạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhấtđịnh

- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất nhưchloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleoside

- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhaunhư lincomycin, novobiocin

- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổibậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiềuCKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổnghợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu tráchnhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiềnchất, enzym và cofactor [15]

1.3 Phương pháp phân loại xạ khuẩn

1.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống

Cũng như đối với vi khuẩn, việc phân loại xạ khuẩn hiện nay chủ yếudựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA Bên cạnh đó các đặcđiểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường đượckết hợp để định danh xạ khuẩn một cách chính xác đến tên loài

Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bàođược coi là đặc điểm quan trọng nhất Các đặc điểm hóa phân loại khác nhưthành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GCtrong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quantrọng trong phân loại xạ khuẩn

Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trongphân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu

các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệthống enzym Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt

độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ vớichất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng vànhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chấtđặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời [10]

1.3.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại

Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng vềtrình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV Tất cả cácloài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ cácriboxom Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mãhoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng rRNA

là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì:

- Phân tử này có mặt trong mọi tế bào VSV

- Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên riboxom, bộ máytổng hợp protein của tế bào

- Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ

- Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiếnhóa

Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách kháccác gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá Mặc

dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hoá cho rRNA cũng chứa những vùng

có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khácnhau Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhàkhoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiềudài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa cácvùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi[26]

Hiện nay phân loại XK cũng như vi khuẩn nói chung được tiến hànhdựa trên so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với các

đặc điểm khác theo phân loại cổ truyền Các nhà phân loại học thường lấyngưỡng 98% trong độ tương đồng về trình tự 16S rRNA để phân biệt hai loàikhác nhau Bên cạnh đó, phép lai ADN genom cũng thường được tiến hànhnhư một thí nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại tới mức độ loài.Hai chủng XK (hay vi khuẩn nói chung) được coi là hai loài riêng biệt nếuchúng có độ tương đồng về ADN genom thấp hơn 70% Dựa trên mức độtương đồng về trình tự 16S rRNA người ta có thể dựng cây phát sinh chủngloại (cây phả hệ) thể hiện mối tương quan của các loài đang nghiên cứu vớicác loài có họ hàng gần và tổ tiên của chúng Trong đa số trường hợp, cácphân tích về hóa phân loại và sinh lý, sinh hóa có sự tương đồng cao so vớiphân loại theo trình tự 16S rRNA [27].

1.4 Ứng dụng của chất kháng sinh

1.4.1 Ứng dụng trong y học

Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị nhiễmtrùng máu năm 1941 [21], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứngdụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác phòng vàđiều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người Nhờ có CKS

mà y học đã làm giảm bớt mối lo cho nhân loại về căn bệnh nhiễm trùng, điềutrị loại bỏ những mối nguy hiểm của một số bệnh thường gặp như thươnghàn, dịch hạch, dịch tả, thấp khớp, các bệnh về răng miệng, mắt, mũi

Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi trựctiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống Có nhiều loại thuốc được sửdụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin…

Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,trong đó có tới 1/3 các CKS là do XK hiếm sinh ra Trong y học, kháng sinh

có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệuquả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp haikháng sinh hãm khuẩn) [21]

Hiện nay các CKS còn được sử dụng trong điều trị ung thư Ngày nay yhọc đã biết sử dụng thuốc kháng sinh trong trường hợp bệnh đã chuyển sanggiai đoạn di căn để thay thế cho biện pháp xạ trị và phẫu thuật Cho đến nay

đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong điều trị ung thư như:daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin,sarcom lưới… mitomycin dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, tụy,streptozocin dùng trong điều trị ung thư tụy…

Đến năm 2010 thuốc kháng sinh có 17 nhóm với gần 500 tên thuốctrong đó có 4 nhóm chuyên biệt là chống nấm, chống lao, chống phong, trịung thư, còn lại 13 nhóm là thuốc trị các bệnh nhiễm khuẩn thông thường[37] Tuy nhiên vẫn chưa có một kháng sinh nào có tác dụng để điều trị virus.Các bệnh do virus gây ra thường sử dụng các vaccin và interferon để điều trị

1.4.2 Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y

Trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay, biện pháp phổ biến được sửdụng để chống lại sâu bệnh là sử dụng các thuốc hóa học Ngoài mặt tích cựcnhư: tiêu diệt được nhiều loài sâu bệnh, tác dụng nhanh, mạnh… thì nó cũng

có nhiều nhược điểm như: hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, mặt khác nólại gây ô nhiễm môi trường và nhiều chất độc tồn dư trong sản phẩm có thểgây độc cho con người

Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tìm ra một số biện pháp kỹthuật như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp này gâyxáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh màtrước đây ít gặp Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vàinăm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại

Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh

do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học CKS và dịch lên

men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [16].

Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biếnrộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ ỞTrung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng XK từ đất và nghiên cứu sảnxuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như polixin chốngbệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn Năm 2002, ở Ấn Độ đã phânlập được chủng Streptomyces sp 201 có khả năng sinh CKS mới là z -methylheptyl iso - nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại

nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium

semitectum, Fusarium moniliforme [16].

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệthực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng

XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium

oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [1] Năm 2002, Trung tâm công nghệ

sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn

Streptomyces sp LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi

khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas

solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4] Tuy nhiên việc sử dụng CKS

trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canhtác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

Ngoài công tác bảo vệ thực vật thì CKS còn được sử dụng trong chănnuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm… Các loạiCKS thường được sử dụng trong chăn nuôi như: biomycin, terranycin,tetracyclin, bacitrcin… để phòng chống, điều trị bệnh và tăng trọng cho giasúc, gia cầm Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế

và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêuhóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăngtrưởng tốt Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở

quy mô 12 tấn /năm Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng

15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7%[1] Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng CKS kết hợp với công nghệlàm lạnh có thể làm tăng thời gian bảo quản của thực phẩm mà không gây độchại cho con người Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảoquản thực phẩm như: clotetracyclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Cácchất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tácđộng lên cả vi khuẩn và nấm Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trongbảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phânhủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm chongười, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làmmất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị Vì vậy để khắc phục tồn tạitrên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuântheo đúng nguyên tắc

1.5 Khả năng tổng hợp enzym ở vi sinh vật

1.5.1 Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzym

Enzym là chất xúc tác sinh học do tế bào tổng hợp nên và chúng có vaitrò rất quan trọng, quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào Việc sản xuất

và sử dụng enzym đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, chỉ saukhi con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzym ngoài tế bào thìviệc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzym mới thực sự phát triển mạnh

mẽ Ngày nay, nhiều loại enzym đã được sản xuất ra với sản lượng lớn vàđược sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau như: công nghiệpthực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người đã tiến hành sảnxuất chế phẩm enzym từ động, thực vật với khối lượng lớn (hàng vạntấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, dolượng enzym trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế VSV trái lại có thể tổnghợp được một lượng lớn các enzym khác nhau Do vậy VSV là đối tượngchính được sử dụng để sản xuất enzym trong vòng 30 năm trở lại đây [22]

Hệ enzym ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầuhết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N2, S, Fe,

CO2, CH4… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, cácpectin, cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệenzym tương ứng [3] Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm

và chọn lựa những phức hệ enzym cần thiết phục vụ cho các nhu cầu côngnghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzym không thể khai thác được từnguồn động vật và thực vật

Enzym VSV có hoạt tính cao hơn enzym từ các sinh vật khác do VSV

có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanhchóng, hàm lượng enzym trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuấtcông nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất đượclượng lớn chế phẩm enzym

Việc lên men sản xuất enzym có thể triển khai trên quy mô sản xuấtcông nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết,khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệuđơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm Trong thực tiễn sản xuất enzym hiện nay chúngthường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải củamột số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ Do đó việc sản xuất enzymnhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh

tế cao

VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điềuchỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hayđiều chỉnh hoạt lực của enzym) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môitrường nuôi Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinhdưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn cókhả năng điều chỉnh phổ các enzym sẽ được tổng hợp, làm tăng cường nănglực sinh tổng hợp enzym hay làm thay đổi hoạt tính của chúng

Ngoài ra, so với nguồn enzym động vật và thực vật, đối với nhómenzym ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử

dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thuenzym ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn.

1.5.2 Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên

VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh đểduy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi VSV có hệ enzym

đa dạng và phong phú Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năngsinh enzym như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùnghoạt tính sinh tổng hợp enzym [19] Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm,lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzym mongmuốn là cần thiết Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzym chịunhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSVsinh enzym chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựachọn chủng sinh amylaza thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủngsinh enzym chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọnchủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bịphân hủy Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụngtrong sản xuất đòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức.Tuy hiện nay có nhiều chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnhvực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ caonhất cho con người

1.5.3 Một số enzym vi sinh vật chủ yếu

Tuy đã biết hơn 1000 loại enzym khác nhau nhưng cũng chỉ các enzymthủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau,

đó là các enzym amylaza, enzym cellulaza và enzym proteaza Lượng cácenzym sản xuất hàng năm: Proteaza từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, proteaza từnấm mốc là 10 tấn/năm, pectinaza là 10 tấn/năm [22] Các enzym này có ứngdụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích làlàm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thứcăn… Enzym được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới

- Enzym amylaza: enzym này bao gồm nhiều nhóm men khác nhau, đó

là amylaza, glucoamylaza, glucozidaza, dextrinaza… Các enzym này có ýnghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ cáclàng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai, sắn

Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylaza có thể dùng để sản xuấtalcohol Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylaza và glucoamylaza, từcác phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biếnthức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học vàsinh học

- Enzym cellulaza: Trong thập kỷ qua, enzym thuỷ phân cellulose ngàycàng được quan tâm Sự quan tâm này là do các enzym này có khả năng thủyphân chất thải chứa celluloza, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocelluloza và celluloza trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩmđường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác Thídụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thểthu nguồn năng lượng ethanol [29]

- Enzym proteaza: Proteaza thuộc nhóm enzym thủy phân protein được

sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá

và thịt Proteaza có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuấtcác dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vậtnuôi Proteaza thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, banđầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thànhcác liên kết lỏng trên bề mặt Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ravới tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzym lên bề mặt cơ chất

và tạo ra những phần nhỏ Chính vì tính chất trên mà proteaza được sử dụng,một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải nàykhông còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phếthải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôikhông còn mùi hôi thối [30]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực TrạiCau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên Từ đó phân lập được 92 chủng xạ khuẩn

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Xạ khuẩn

92 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khuvực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên

2.2.2 Vi sinh vật kiểm định

7 chủng VSVKĐ nhận từ Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

và Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Đa khoa

- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose… của

hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl,FeSO4.7H2O… nhập từ Anh, Trung Quốc.

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck(Đức)

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl MethylCellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

- KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)

- KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật)

- Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton

- Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp

- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam…

2.3.3 Môi trường nghiên cứu

* Môi trường gause 1 (g/l) (môi trường phân lập xạ khuẩn)

- Tinh bột tan - 20 - FeSO4 - 0.01

* Môi trường xác định hoạt tính enzym ngoại bào

- Môi trường tinh bột tan (g/l)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Dùng dao lấy khoảng 10 - 15 g đất ở bề mặt từ 5 - 20 cm ở các vị tríkhác nhau (4 - 5 vị trí) trong 1 vùng 50 m2 Trộn đều các mẫu đất và đựng vàotúi nilông đã khử trùng Ngoài túi ghi rõ loại đất, ngày và nơi lấy mẫu [11]

Đất lấy về được phân lập ngay hoặc có thể bảo quản trong tủ lạnh ởnhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ

2.4.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

2.4.2.1 Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trênmáy lắc 30 phút Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dịch đất sang ống nghiệm cóchứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3… 10-6 Từ mỗinồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1ml dịch sang đĩa Petrichứa môi trường Gause 1 Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ởnhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn đượccấy ria 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause 1 để làm sạch Sau đónuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền

sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause 1, tiếp tục nuôi ởđiều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]

Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng XK được chia thành

8 nhóm màu: White (W) nhóm màu trắng, Grey (Gy) nhóm màu xám, Red(R) nhóm màu đỏ, Yellow (Y) nhóm màu vàng, Green (Gn) nhóm màu xanh,Blue (B) nhóm xanh màu da trời, Violet (V) nhóm màu tím, và nhóm màukhông xác định (X) [16, 17, 30]

2.4.2.2 Phương pháp phân lập bằng que cấy vòng

Pha đất với nước cất tạo thành dịch huyền phù Dùng que cấy lấy mộtvòng dịch huyền phù đất Đặt que cấy vào một góc đĩa, ria thành đường zíchzắc thứ 1 Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội sau đó đặtque cấy bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 1, ria thành đường zíchzắc thứ 2 có chiều khác với đường ria thứ 1

Thanh trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, để nguội Đặt đầu que cấybắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ 2,ria đường zích zắc thứ 3 cóchiều khác với đường ria 1 và 2 trên phần thạch còn lại

Phương pháp phân lập này thuận tiện cho sự phân lập lại để thuầnchủng các giống bị nhiễm trong khi cấy giữ giống hoặc nghi ngờ giống chưathuần chủng

2.4.2.3 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch

Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lượng khuẩnlạc mọc trong mỗi đĩa petri, để từ đó tính số lượng tế bào trong 1 g đất

* Cách đếm:

Đếm số khuẩn lạc bằng cách úp sấp đĩa petri, trên mặt đáy phía ngoàicủa đĩa, dùng bút viết kính đánh dấu các khuẩn lạc đã được đếm Nếu sốlượng khuẩn lạc nhiều, dùng bút chia mặt đáy thành các phần và đếm sốkhuẩn lạc trong từng phần sau đó cộng lại

Không đếm các đĩa khuẩn lạc mọc quá dày không thể đếm được hoặccác đĩa bị nhiễm ảnh hưởng đến sự phát triển của XK

* Cách tính kết quả:

Theo lý thuyết: 1 khuẩn lạc được hình thành từ 1 tế bào Tuy nhiên trênthực tế khó có thể xác định được chính xác là một khuẩn lạc có thể được hìnhthành từ 1 hay nhiều tế bào Vì vậy để tính tổng số tế bào có trong 1 đơn vịthể tích, người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1đơn vị thể tích” (CFU - Colony Forming Unit)

Như vậy từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có thể suy ra số lượng tế bào(CFU) có trong 1 g đất theo công thức sau:

CFU/g = A x 1/K x 1/V

Trong đó:

A: Số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ phaloãng

V: Thể tích dịch đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch

K: Độ pha loãng của dịch đất được cấy trên thạch

Số CFU/1 đĩa petri được coi là tốt để tính tổng số CFU/1g đất nếu khicấy 0,1 ml dịch đất pha loãng trên môi trường đếm được từ 30 - 300/1 đĩa

2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

* Phương pháp thỏi thạch

Đây là phương pháp nhằm sơ tuyển XK có HTKS

XK được nuôi cấy trên môi trường Gause 1, Gause 2, hoặc ISP4 tronghộp petri sau 5 - 7 ngày Nuôi cấy VSVKĐ trên các môi trường thích hợptrong các đĩa petri (vi khuẩn nuôi trên môi trường MPA, nấm mốc nuôi trên

môi trường PDA) Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có XK được

nuôi cấy từ 5 - 7 ngày, sinh trưởng tốt, không bị nhiễm Đặt các thỏi thạch lên

bề mặt môi trường thạch đĩa đã cấy VSVKĐ Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh

40C trong vòng 4 - 5 giờ để CKS khuếch tán rồi nuôi ở 28 - 300C Đọc kết quảsau 24 giờ đối với vi khuẩn kiểm định, 48 - 72 giờ đối với nấm kiểm định

HTKS của mỗi chủng XK được xác định theo kích thước vòng vôkhuẩn: D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kínhcủa thỏi thạch

* Phương pháp đục lỗ

Đây là phương pháp xác định HTKS của XK trong dịch lên men

Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc

220 vòng/phút sau 5 ÷ 7 ngày thì thu dịch kháng sinh thô từ môi trường nuôicấy bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Dùng khoan nút chaikhoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy VSVKĐ trong các đĩa petri Nhỏ vào môitrường 0,1 ml dịch kháng sinh cần thử Các bước tiếp theo tiến hành nhưphương pháp thỏi thạch [7, 9, 14]

2.4.4 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh

Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy truyền sang bình nóndung tích 250 ml có chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi trên máy lắc 220vòng/phút ở 28 - 300C, trong khoảng thời gian từ 5 - 7 ngày Sau đó thu dịchlên men và xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ HTKS của các chủng

XK được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn [15]

2.4.5 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống

Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyềnphù nên ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuần lạc thường mọc táchrời nhau và có khả năng được hình thành từ một tế bào riêng rẽ

Dùng que cấy đã vô trùng lấy một ít tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽtrên đĩa cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trường Gause 1, để vào tủ

ấm 28 - 300C trong thời gian từ 4 - 7 ngày, sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuầnchủng của các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm Giữ các ống giống nàytrong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 40C Để bảo quản giống cho các nghiên cứu tiếptheo, chúng tôi tiến hành cấy chuyển giống định kỳ 3 tháng một lần trên môitrường thạch nghiêng Gause 1, trước khi sử dụng cần cấy chuyển giống sangống thạch mới [9]

2.4.6 Phương pháp lên men xạ khuẩn

Từ ống thạch nghiêng, giống đã được hoạt hóa được cấy sang các bìnhnón có dung tích 250 ml chứa 25 ml môi trường Gause 1 và nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ 28 - 300C trong thời gian 5 - 7 ngày Sau đó thu dịch lên

men, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu riêng sinh khối

và phần dịch Tùy theo mục đích nghiên cứu mà sử dụng phần dịch hayphần sinh khối: Xác định HTKS trong dịch lên men hay trong sinh khối tếbào [9]

2.4.7 Xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

* Chiết dịch enzym

Nuôi cấy XK trên môi trường Gause 1 dịch thể (bỏ thạch) trên máy lắc

220 vòng/phút sau 5 ngày thì thu dịch enzym từ môi trường nuôi cấy bằngcách ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, chiết dịch trong thì thu được dịchenzym thô

* Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếchtán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau:

- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza)

- Casein (xác định hoạt tính proteaza)

- CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza)

Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 18g thạch, 2 g cơ chất,nước cất vừa đủ 1 lít Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút Đổ môi tr ườngvào các đĩa petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm Dùng khoan nútchai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm Nhỏ 0,2 ml dungdịch enzym cần thử, để ở tủ lạnh 40C khoảng 4 - 5 giờ cho enzym khuếchtán vào trong thạch, sau đó đặt vào tủ ấm 300C trong 24 giờ để enzym hoạtđộng phân giải cơ chất [14]

Nhuộm màu đĩa thạch bằng dung dịch lugol để kiểm tra khả năngphân giải cơ chất của enzym trong dịch lên men Vòng cơ chất không bắtmàu ở xung quanh lỗ thạch

Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó D làđường kính vòng thuỷ phân cơ chất, d là đường kính lỗ thạch