Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

PHẦN MỘT:

MỞ ĐẦUI.1 Đặt vấn đề

Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) đã được biết đến và trồng từ rất lâu

đời Năm 1994 diện tích đậu tương trên thế giới khoảng 61571000 ha với năng suấtbình quân đạt 2078 kg/ha Sản lượng đạt trên 10 triệu tấn/năm Điều đó khẳng địnhcây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp.[2]

Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành là loại cây họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm củahạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giầu giá dinh dưỡng chính vì vậy là câythực phẩm có vai trò quan trọng cho con người và gia súc Từ hạt đậu tương có thể chếbiến được nhiều các sản phẩm khác nhau như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn,đậu phụ, tào phớ, sữa đậu nành,… là những sản phẩm công nghiệp được chế biến từđậu tương rất có lợi cho sức khoẻ con người, góp phần chống suy dinh dưỡngvà cácbệnh thần kinh, tim mạch.Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậutương có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể là 12-24% Bên cạnh đó, do có khả năng cốđịnh đạm tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương là câytrồng bảo vệ đất chống xói mòn Cuối cùng cây đậu tương còn góp phần giải quyếtcông ăn việc làm, tăng thu nhập cho người nông dân [2]

Nền nông nghiệp nước ta đã phát triển cùng với nền văn minh lúa nước, tấtnhiên không vì thế mà cây đậu tương mất đi chỗ đứng của nó Đậu tương nằm trongnhững cây trồng quan trọng và việc phát triển đậu tương cũng đã được chú trọng Tuynhiên, năng suất của cây đậu tương thường rất thấp bởi đang bị ảnh hưởng của hạn hán

và dịch bệnh Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và năng suất củacây đậu tương Bên cạnh đó còn có sự phá hoại của năm loại dịch bệnh phổ biến tấncông đậu tương, đó là bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử, tàn lụi vi khuẩn, đốm lá[1, 3] Các loại bệnh hại này và hạn hán đã gây tổn thất không nhỏ đối với năng suấtđậu tương Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học thì chi phí sản xuất cao và gây ảnhhưởng đến môi trường

Rõ ràng, đậu tương là cây thực phẩm thiết yếu, nhưng năng suất của các giốngđậu tương hiện nay lại đang bị ảnh hưởng bởi hạn hán và sâu bệnh hại Chính vì lẽ đó

cần có biện pháp cải tạo các giống hiện nay nhằm đem lại hiệu quả cao trong nôngnghiệp Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệsinh học thì có lẽ phương pháp chuyển gene là lựa chọn tối ưu và phù hợp với tìnhhình hiện nay Có nhiều phương pháp chuyển gene vào thực vật, trong đó phương

pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro

nhằm tạo cây trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ thành công cao nhất

Tuy nhiên, đậu tương (glycine max L) là cây rất khó tái sinh trong nuôi cấyinvitro, đặc biệt là việc tái sinh các callus có nguồn gốc từ chồi, lá mầm và phôi… Đã

có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh đậu tương thông qua các cơ quan như: lá mầm,mắt lá thật đầu tiên (Barwale và Cs 1986, Kim và Cs 1990), lá thật đầu tiên của câynon (Wright và Cs 1987), phôi soma (Lazzeri và Cs 1985, Rouch và Cs, 1985) [3]…

Để phục vụ cho công tác nhân invitro và bảo tồn nguồn gen đặc biệt là chọngiống thông qua chuyển gen, tạo ra giống mới có khả năng kháng sâu, kháng thuốc trừcỏ… Chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro

của một số giống đậu tương”

I.2 Mục đích, ý nghĩa, yêu cầu

I.2.1 Mục đích

Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống đậu tương bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro với 2 công đoạn chính: nuôi cấy, tái sinh cây để phục vụ các nghiên cứu vềchuyển gen, nhân giống, bảo tồn in vitro…

I.2.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu nhằm tìm ra các môi trường phù hợp để

tái sinh cây đậu tương in vitro nuôi cấy mô một số giống đậu tương Từ đó xây dựngđược quy trình nuôi cấy mô cây đậu tương từ đỉnh sinh trưởng của hai giống đậutương DT84 và DT2001

- Ý nghĩa thực tiễn: Tạo cây đậu tương nuôi cấy mô thành công sẽ ứng dụng

trong việc nhân giống đậu tương sạch bệnh và tạo cây đậu tương biến đổi gen, gópphần vào sự phát triển của nền Nông nghiệp bền vững

I.2.3 Yêu cầu

(1) Xác định quy trình khử trùng mẫu để tạo mẫu sạch và môi trường nuôi cấythích hợp

(2) Xác định nồng độ của BAP lên khả năng tạo thể protocorm ở mỗi giống làcao nhất

(3) Xác định nồng độ của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm củahai giống là lớn nhất

I.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

I.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu tương DT84, DT2001

I.3.2 Phạm vi nghiên cứu

* Địa điểm: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp (Km 2 ĐườngPhạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội)

- Thời gian chiếu sáng: 10giờ/ ngày

- Các dụng cụ, buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt

* Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy

- Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin B5, phytagel, MES, các chất điều hòasinh trưởng: BAP, Zeatin, GA3, Glutamin, Asparagin Nguồn cacbon: Đườngsaccaroza

PHẦN HAI:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

II.1 Lịch sử phát triển, cơ sở khoa học và kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

II.1.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trìnhnhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29)

II.1.2 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

II.1.2.1 Lịch sử phát triển nu ôi cấy mô tế bào thực vật.

Năm 1965, Robert Hooke quan sát trên kính hiển vi lát cát của miếng lạc thấy

phần mô thực vật được cấu tạo bởi nhiều tập hợp và đưa ra khái niệm “tế bào – cell”

Anten Vanleuwen Hock (1632 – 1723) thiết kế kính hiển vi khuếch đại được 270

lần, lần đầu đưa vào quan sát thấy vi khuẩn, tế bào dịch người hay động vật Năm

1965, phát hiện thấy tế bào động vật gồm nhiều tế bào động

Năm 1838 - 1839 Natthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học

thuyết cơ bản của sinh học gọi là học thuyết tế bào, khẳng định:

+ Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi 1 hoặc nhiều tế bào

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thứcnhỏ nhất của sự sống

+ Tế bào chỉ được cấu tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó (và mang đầy đủ thôngtin di truyền từ tế bào sinh ra nó)

Năm 1875 Oscar Hertw’g bằng quan sát trên kính hiển vi cho rằng sự thụ thai là

sự hợp nhất tinh trùng và trứng Sau đó Hermann P, Butschili và Schneider FA đã mô

tả chính xác quá trình phân chia tế bào

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thu.yết về tính toàn thế của

tế bào vào thực nghiệm Theo ông, tất cả tế bào thực vật có tính toàn năng, mỗi tế bàođều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và gặp điều kiện thuận lợithì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1922, Kotte người Mỹ học trò của Haberlandt và Robbins lặp lại thực

môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng mạnh, tạo nênmột hệ thống có rễ phụ Giai đoạn này làm cơ sở cho việc chọn mẫu cấy và nhữngnghiên cứu về thành phần môi trường ở các giai đoạn sau

Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công

trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi

White (Hoa Kỳ) nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum)

trong thời gian dài bằng muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau đó, nướcchiết nấm men được thay thế bằng 3 loại vitamin nhóm B: thiamin (B1), pyridoxine(B6) và nicotinic acid Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn được tiếnhành ở nhiều cây khác nhau

Cũng trong năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA (Indol

Acetic Acid), một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích

sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi

cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt vàthuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục

Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu vàtổng hợp thành công, như Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid(2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D giúp tạo mô sẹo,gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôicấy

Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của

kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mônuôi cấy

Năm 1957, Skoog và Miler công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nồng

độ các chất auxin/ cytokinin trong môi trường phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) của môsẹo ở thuốc lá Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin < 1 thì mô có xu hướnghình thành chồi Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin > 1 mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ

Tỷ lệ auxin/ cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoànchỉnh

Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển.

Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng

cách sử dụng máy lắc

Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật

nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu côngnghiệp vi nhân giống thực vật Cũng trong năm này, Bergman công bố có thể dùngphương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết tế bào đơn mà không dính cụm Cùngvới kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo câyhoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn

bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt

Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho

các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên quần thể tếbào trong môi trường lỏng

Năm 1972 Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các

loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nlangsdorfi

Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá

bằng dung hợp tế bào trần

Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào tế

bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium

Từ năm 1980 đến 1992, nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thựcvật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gen ngoại lai vào nhiều họ thực vật.Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong nhữngứng dụng của nuôi cấy mô thực vật Morel (1960) đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng củacác loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi chiacắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới Khi nuôi trong cácđiều kiện nhất định protocorm có thể phát triển thành cây lan con, tạo ra các dòng vôtính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoaitây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác

Năm 1993, Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh invitro tạo ra và nuôi cấy phôi hợp

tử ở ngô Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau đó đã được quan sát dướikính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từnggiai đoạn phát triển của phôi

Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống,chọn tạo giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận

di truyền thực vật bậc cao Nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trìnhchọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8]

II 1.2.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975 Phòngnuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam doTiến Sĩ Lê Thị Muội đứng đầu

Nhận thức được triển vọng to lớn của nuôi cấy mô trong chọn giống và nhângiống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tựnhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứuthuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiêncứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềmlực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu vào ngành này (Trần Văn Minh, 1999) [7].Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở ViệtNam đã đạt một số thành tựu như sau [8]:

- Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L ) tại Viện Công Nghệ Sinh học

- Nhân giống vô tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn VănUyển)

- Nhân giống chuối (Mus a spp)

- Nhân giống cây bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị ÁiThuyền

- Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An

- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống mía đường (Sacharum offciarum),nhân giống cây Vani (Vanilla sp) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên)

II.1.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấynguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhântạo trong điều kiện vô trùng [6]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo(callus)

- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

- Nuôi cấy prôtplast: nuôi cấy tế bào trần

Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính toànnăng của tế bào và dựa vào khả năng phân hoá – phản phân hoá của tế bào

II.1.3.1 Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Haberlandt đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cở thểsinhvật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mangtoàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ cả sinh vật đó Khi gặp điều kiệnthích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năngcủa tế bào [6]

Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã đượcbiệt hoá (trừ một số tế bào đã được biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năngthể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnhmới

II.1.3.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống bao gồm nhiều cơquan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuynhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá) Sau đó từ các tế bào phôi sinh nàychúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc biệt cho các mô, cơ quan cóchức năng khác nhau.

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào môchuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quanghợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chứcnăng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúngkhông hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ởđiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh

mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

Qúa trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được biểu diễn dưới sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bàoTrong đó:

+ Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu

+ Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt

+Tế bào chuyên hóa là các tế bào đã mang chức năng riêng biệt [15].

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chếcác gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số geneđược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số genekhác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này theo một chương trình đã được mã hoá trongcấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơthể thực vật luôn được hài hoà

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể bình thường bị ức chếbởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từngkhối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kếtquả của quá trình phân hoá và phản phân hoá Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho đếncùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấytách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phânhoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điềukhiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trườngnuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin.

* Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro

+Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị tạo cây mẹ sạch bệnh và nuôi cấy khởi động + Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh cây Khử

mô nuôi cấy sau khi đã xác định được mẫu cấy bằng (HgCl2, NaOCl, H2O2) Lựa chọnmôi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định hoặc phôi vô tính

+ Giai đoạn 3: Nhân nhanh

+ Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

+ Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm

II.1.4 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro

* Nuôi cấy phôi

Năm 1921 Dieterich đã đưa ra kết luận là phôi nuôi cấy invitro hoàn toàn có thể

nảy mầm không qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa trên cơ sở các nghiên cứu của mình

Nhưng môi trường dinh dưỡng cho sự tạo cây ở phôi trưởng thành và phôi non

là khác nhau, phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn

* Nuôi cấy mô trong cơ quan tách rời

Năm 1946 Wetmare đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy

khi gặp điều kiện thuận lợi

Với các bộ phận khác nhau trên cây thì nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy cũngrất khác nhau Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển mô của cơ quan nuôi cấy thì saumột khoảng thời gian nhất định ta phải cấy chuyển sang môi trường mới

Ứng dụng: Nghiên cứu các môi trường dinh dưỡng phù hợp với các bộ phận

khác nhau của cây, tạo mô sẹo nhân cây in vitro

* Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh

Thường sử dụng là các mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến1,0 mm Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồimới hình thành và các cành non

Khi sử dụng các mô phân sinh cần phải cân bằng giữa các chất điều hòa sinhtrưởng

Ứng dụng: Tạo cây sạch virus, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử

lý Conxixin [16]

* Nuôi cấy bao phấn

Đã có rất nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển

thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo

phôi trực tiếp và gián tiếp trung gian qua mô sẹo và tạo cơ quan

Ứng dụng: Tạo các dòng thuần, biểu hiện các gen lặn, cây đơn bội thu được từnuôi cấy bao phấn và hạt phấn là nguồn nguyên liệu cho chọn dòng đột biến

* Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Năm 1960 Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào và đã tạo ra một số lượng

lớn tế bào trần Khi tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào chúng được nuôi riêng rẽ

Ứng dụng: Là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ởthực vật bằng phương pháp dung hợp 2 loại tế bào trần để tạo các cây lai soma

* Nuôi cấy mô sẹo

Các mô đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt hóa tạothành mô sẹo

Có thể sử dụng bất kỳ bộ phận dinh dưỡng nào của cây: Mảnh lá, thân, rễ làmvật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo hoặc có thể sử dụng hạt gieo trên môi trường thích hợpđến khi phát triển thân mầm, tiếp tục cắt thân thành những đọan nhỏ và đưa vào môitrường tạo mô sẹo (cà chua)

Nên sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất bởi vì

tế bào mô sau khi cấy chuyển nhiều lần dễ phát sinh đột biến

* Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dung dịch lỏng (suspension culture).

Từ những năm 1959 Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô

thực vật ở qui mô lớn (134 l) bằng nuôi cấy chìm

Các nhà khoa học đã nuôi tế bào ở qui mô công nghiệp phục vụ sản xuấtsikonin chọn tạo các dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp stukonin caohơn

Công nghệ nuôi cấy tế bào trong các bioreactor dung tích lớn sản xuất sinhdược, thương mại hóa

* Công nghệ tế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng

Đưa những gen cần chuyển vào thực vật tạo cây mang những đặc tính mongmuốn có thể chưa từng xuất hiện ở loài cây đó, thậm chí trong toàn bộ dòng họ Những

gen chuyển vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy tái sinh tế bào

thành cây invitro sau chuyển gen.

Tạo những biến đổi sâu sắc có định hướng trong các tính trạng của cây thôngqua biến đổi các protein chủ chốt của tế bào, điều khó đạt được trong phương pháp cổđiển

- Gen cần chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau

- Gen cần chuyển phải được thể hiện đúng lúc đúng chỗ

1.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy phải cung cấp các nguyên tố quan trọng và các chất dinh

dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cây invitro Sự lựa chọn hay phát triển môi

trường nuôi cấy là một bước quan trọng trong bất cứ đề tài nuôi cấy mô tế bào nào

Thành phần môi trường sử dụng bao gồm các yếu tố sau:

+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Vitamin

+ Nguồn cacbon

+ Chất hữu cơ

+ Các chất điều hòa sinh trưởng (nhóm Auxin, Cytokinin)

+ Tác nhân làm đông (nếu môi trường nuôi cấy ở thể rắn)

* Nguồn Cacbon

Khi được nuôi cấy invitro thường thì các tế bào thực vật không có khả năng

quang hợp Do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn Cacbon cho các hoạt động dinh dưỡngcủa tế bào

Nguồn Cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là sucrose, một sốtrường hợp sử dụng Glucose và fuctozose thay thế cho Sucrose nhưng chúng thườngnghèo hydrat cacbon đối với cây

Khi khử trùng chú ý không nên để quá lâu để tránh hiện tượng caramen hóa xảy

ra làm cho môi trường chuyển sang màu vàng ức chế sự phát triển của tế bào

* Các muối khoáng đa và vi lượng.

Với cây trồng thì các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng

Nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, Mg, S và Ca Các nguyên tố đa lượng nàythường tồn tại ở dạng muối và tồn tại trong dung dịch Đây là nguyên liệu để những tếbào hình thành nên cấu trúc của mình

Nguyên tố vi lượng điển hình thường sử dụng như các nguyên tố Fe, Cu, Zn,

Mn, Bo, I, Co Nhờ các nguyên tố vi lượng này mà cây mới sinh trưởng và phát triểnbình thường Ngoài ra, chúng còn tham gia vào thành phần của enzym xúc tác chophản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào

* Các vitamin

Ảnh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy invitro ở các

loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơbản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng tốt nhất phải bổsung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và aminoacid Trong các loạivitamin, B1 được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3)

và pyridoxune (B6) cũng có thể được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy tăngcường sức sinh trưởng của mô

* Các chất bổ sung

- Glutamin:

- Asparagin:

* Phytagel:

1.1.6 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin và Cytokinin, ngoài

ra còn có nhóm gibberlin và etylen là nhóm chất điều tiết kích thích sự sinh trưởngphát triển, phân hóa cơ quan

* Nhóm Auxin

Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm( IAA, NAA,2,4D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sửdụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến Auxin thường hòa tan trong etanolhoặc NaOH pha loãng [15]

Vai trò:

- Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào

- IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng chồiđỉnh

- IAA (3- irdole aceticacid) đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn(xylem và phloem) IAA, IBA, NAA thường được sử dụng cho phát sinh rễ

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành dâm và phát sinh chồi phụ có ảnh hưởng khácnhau với sự rụng lá, sự ra hoa đậu quả, sự phát triển và chín của quả.

- 2,4D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp

IAA là Auxin tổng hợp dễ bị phân hủy sau vài ngày khi để ngoài ánh sáng, do

đó nên pha dung dịch IAA sau mỗi tuần

* Nhóm Cytokinin

- Các Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi Trongmôi trường nuôi cấy tỷ lệ Auxin/ Cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóachồi từ mô sẹo, tạo phôi vô tính

- Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, 2iP

+ Kinetin (6 - fafurolaminoprrine) hình thành và phát triển trong điều kiệnnhiệt độ cao từ chế phẩm ADN có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi

+ Zeatin (6 – hydoxy - 3 - methylbut - 2 enl amino purin) thực chất là một dẫnxuất của adenin có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá quá đắt nên ít sử dụng

+ BAP (6 - benzyl amino purine) có hoạt tính cao hơn kenitin và bền với nhiệt

độ cao, hơn zeatin

+ 2ip (Isopentenil- adenine)

Chức năng chủ yếu của Cytokinin trong quá trình phân bào là kích thích sự

phân chia tế bào, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy, tăng diện tích phiến lá, tạo

chồi bất định (nồng độ cao) ức chế quá trình già hóa, kích thích tạo diệp lục, ức chế sựkéo dài chồi, ức chế sự hình thành rễ, có thể làm tăng sự phát triển mật độ khí khổng ở

một số loài [17] Cytokinin được pha bằng dung dịch HCl loãng.

* Gibberilin (GA3): là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong nhóm gibberilin cóhơn 20 chất

Thường ít thấy sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bởi nó ức chế sựphát triển mô sẹo và hình thành rễ bất định, do hoạt động của mô sẹo chúng được sửdụng trong nghiên cứu về sự tạo hình

GA3 tan được trong nước nhưng trong môi trường axit, nhiệt độ cao thì GA3

mất họat tính sinh học

Trong môi trường kiềm, GA3 chuyển thành dạng điện phân không hoạt động

* Axit absisic (ABA)

Tác dụng: Tạo phôi, kích thích sự chín phôi, kích thích sự phát chồi ở nhiềuloài thực vật

Phát huy khả năng chống chọi của tế bào với ngoại cảnh bất thuận ( gây rađóng khí khổng) sản sinh các yếu tố ức chế mất nước, nhiệt độ thấp

Dung dịch mẹ pha cao gấp 1000 lần (NaOH 1N), ABA khá ổn định với nhiệt độnhưng rất nhạy với ánh sáng, được pha loãng bằng dung môi nước

* Ethylen

Là chất ức chế sinh trưởng gây sự già hóa, rụng lá, quả, làm chín, kích thích nởhoa, sự lão hóa của hoa và lá

Với cây trồng thì các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng

II.2 Lịch sử nghiên cứu cây đậu tương

II.2.1 Nguồn gốc lịch sử và phân bố cây đậu tương

Cây đậu tương (đậu nành - Glycine max L) có nguồn

gốc xa xưa từ Trung Quốc và được sử dụng làm cây thực

phẩm phục vụ đời sống con người từ hơn 4000 năm trước

Vào thế kỷ thứ 11 trước công nguyên, người Trung Quốc

đã bắt đầu sử dụng đậu tương

Hàng trăm năm sau khi Trung Quốc phát hiện ra những ứng dụng của đậutương và thuần hóa chúng, các nước khác cũng đua nhau sử dụng đậu tương Sau đó,khoảng thế kỷ thứ VIII người Nhật Bản đen về trồng trên đất nước mặt trời mọc, rồitiếp tục được trồng ở một số nước châu Á như: Thái Lan, Malalysia, Hàn Quốc, ViệtNam, Indonesia, Philippines, Việt Nam, Malaysia, Miến Điện, Nepal và miền Bắc Ấn

Độ đã bắt đầu sử dụng đậu tương Đậu nành được sử dụng làm đậu phụ, tào phớ, éplấy dầu Trong khi đó, các nước châu Âu khác vẫn chưa biết đến việc sử dụng đậunành

Cuối cùng, mãi đến thế kỷ thứ XVII, XVIII , đậu nành mới được trồng ở cácnước châu Âu và Bắc Mỹ Và lâu hơn nữa thì hạt đậu tương mới chạm được đến đất

Mỹ Ngày nay, quốc gia đứng đầu về đậu tương với 50% sản lượng toàn thế giới làHoa Kỳ [4]

II.2.2 Vị trí trong phân loại thực vật [9]

Giới (Kingdom) : Plantae

Nghành (Phylum) : Magnoliophyta

Lớp (Classis) : Magnoliopsida

Phân họ (Subfamilia) : Paboideae

Loài (Species) : G max

II.2.3 Vai trò của cây đậu đậu tương

Cùng với thời gian, ngày nay cây đậu tương (Glycine Max (L) Merrill) còn gọi

là đậu nành càng thể hiện được vai trò vô cùng quan trọng trên nhiều lĩnh vực Khó cóthể tìm thấy một loại cây trông nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương Là câytrồng đã biết đến từ rất lâu, sản phẩm của nó làm thức ăn cho con người, thức ăn chogia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt Bởi vậy

nó được ví là loại "cây kỳ lạ", "vàng mọc từ đất", "cây thần diệu", "cây đỗ thần", "câythay thịt" hay còn được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu"… [5]

Quả là đúng khi đánh giá về tầm quan trọng của đậu tương như vậy Bởi nhữnggiá trị toàn diện mà cây đậu tương mang lại Mà những giá trị kinh tế đó chủ yếu đượcquyết định bởi các thành phần chứa trong hạt Hạt đậu tương gồm có protein, lipit,hydrat cacbon, các chất khoáng Trong đó protein và lipit là hai thành phần quantrọng nhất chiếm khoảng 60% trọng lượng hạt

Theo giáo trình Cây công nghiệp thì trong hạt đậu tương hàm lượng proteinchiếm khoảng 40-50% và lipit biến động từ 12-24% tuỳ theo giống và điều kiện khíhậu Điều này thực sự cho thấy đây là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánhgiá đồng thời cả protein và lipit mà phải nói rằng so với một số thực phẩm, thịt haymột số loại hạt đậu đỗ khác thì hàm lượng protein rõ ràng là cao hơn hẳn.Bên cạnh hàm lượng lớn về protein và lipit, hạt đậu tương còn giàu nguồn sinh tố vàmuối khoáng và chứa nhiều loại axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế như:Arginin, Histidin, Lysin, Triptophan Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnhnhư Methionin, Sistein, Sixtin trong đỗ tương rất gần với hàm lượng của các chất này

ở trứng Hàm lượng của Cazein, đặc biệt là của Lysin rất cao, gấp rưỡi của trứng Điềunày cho thấy đây là loại hạt mà có đầy đủ và cần đến của các loại axit amin cần thiết

Hơn nữa protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có Colesteron Ngày nay,qua các thí nghiệm mới người ta còn biết thêm nó chứa chất Lexithin có tác dụng làmcho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm trí nhớ và tái sinh các mô, làm cứng xương

và tăng sức đề kháng của cơ thể

Trong thời đại ngày nay khi chúng ta đang tìm nguồn dầu thực vật để thaythế việc phải dùng mỡ động vật thì có thể thấy rằng với hàm lượng lipit như đã nói

ở trên có thể đủ cung cấp một lượng dầu thực vật khá lớn Cho nên so với các loạiđậu đỗ khác cây đậu tương được coi là cây lấy dầu thực vật quan trọng Lipit củađậu tương chứa một tỷ lệ các axit béo chưa no có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơmngon như: axit oleic (30-35%), axit lioleic (45-55%) và linonic (5-10%) Dùng dầuđậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch và có tác dụng tốtđối với sức khoẻ con người

Thành phần khá quan trọng trong hạt đậu tương nữa là các Vitamin Hạt đậutương chứa khá nhiều các loại Vitamin mà đặc biệt phải kể đến hàm lượng của cácVitamin B1, B2, ngoài ra là các loại Vitamin PP, A, E, K, D, C và các loại muốikhoáng khác

Theo tác giả Nguyễn Danh Đông, trong 100g hạt đậu tương có hàm lượngVitamin B1 có thể cung cấp cho một nửa nhu cầu B1 của cơ thể trong một ngày Đặcbiệt hạt đậu tương ngâm hàm lượng Vitamin C tăng từ 8,7-354mg trong 100g hạt đậutương Nhân dân một số vùng như Cao Bằng, Bắc Kạn… đã dùng hạt đậu tương nảymầm làm rau giá, đó là món ăn tốt và giàu Vitamin, protein Ngoài ra đậu tương cònchữa được nhiều bệnh như đái đường, thần kinh suy nhược, suy dinh dưỡng.Bởi những thành phần như vậy mà từ lâu con người đã biết sử dụng hạt đậu tương vàoviệc chế biến thành thức ăn, thành các dạng thực phẩm khác nhau Cho đến nay, người

ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ănbằng các phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lênmen như giá đỗ, bột đậu tương, tương đậu phụ, đậu hũ, chao, tào phớ, sữa đậu nành,

xì dầu đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, socola đậu tương, bánh

kẹo, pate, thịt, nhân tạo được mệnh danh là “người đầu bếp của thế kỷ” Đối với

nhân dân ta có lẽ không ai biết rõ từ khi nào đậu tương đã được sử dụng làm thức ăncung cấp một phần nhu cầu chất đạm cho con người và gia súc dưới dạng các món ăn

cổ truyền [10 ]

Đối với con người, đậu tương còn là một vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt làđậu tương hạt đen có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đặc biệt đốivới người mắc bệnh đái đường, thấp khớp, mới ốm dậy, lao động quá sức thì quả làloại thức ăn tốt.

Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng hạt đậu tương chín để làm thức ăn thì conngười lại có xu hướng sử dụng đậu tương như một loại rau Thực ra điều này cũng đãđược con người chú ý đến Ở nước ta các vùng nông thôn vẫn hay thu hoạch đậu tươngsớm và luộc ăn nhưng chưa được xem như là một loại rau như những năm gần đây.Hạt đậu tương không những là thức ăn cho người mà nó còn góp phần cung cấp thức

ăn cho chăn nuôi gia súc, gia cầm Trong khi nhà nước ta đang có những biện pháp đểtăng sự phát triển của ngành chăn nuôi thì đối với việc dùng đậu tương làm thức ăncho gia súc đã giải quyết được một khâu quan trọng trong vấn đề tìm nguồn thức ăn

Để sử dụng đậu tương làm thức ăn cho gia súc có thể sử dụng trực tiếp hạt hay bã đậutức là bột đậu tương sau khi ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinhhỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp Thân lá cây đậutương có thể dùng làm thức ăn gia súc, gia cầm rất tốt

Trong công nghiệp, dầu đậu tương còn được sử dụng làm xi, sơn, mực in, xàphòng, chất dẻo, cao su nhân tạo, len nhân tạo, thuốc trừ sâu

Thực sự trong giai đoạn hiện nay phát triển nền nông nghiệp bền vững là điều

mà mỗi một quốc gia đều mong muốn Chính vì vậy mà với chủ trương phát triển nềnnông nghiệp bền vững thì vai trò của cây đậu tương trong hệ thống nông nghiệp là vôcùng quan trọng

Một điều khá đặc biệt đối với những cây thuộc họ đậu là chúng có khả năngtích luỹ đạm tự do trong không khí để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vào sự cộng

sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium Japonicum ở bộ rễ và trong điều kiện thuận lợi

các vi khuẩn nốt sần này có thể tích lũy được một lượng đạm tương đương với 25kg ure/ha Rễ ăn sâu phân nhánh nhiều làm đất tơi xốp, thân lá được dùng làm phânxanh rất hiệu quả Bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn ít phân đạm mà cònlàm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo và bồi dưỡng đất Mặt khác, đậu tương là cây trồng ngắn ngày, các giống đậu tương ngắn ngày thì thờigian sinh trưởng chỉ có 70-75 ngày và với khả năng thích nghi trên nhiều loại đất khác