Nghiên cứu quy trình chế biến trà từ lá dâu tằm

Nghiên cứu quy trình chế biến trà từ lá dâu tằm

Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh tiểu đường hiện đang là một thách thức lớn đối với vấn đề sức khỏe cộng đồng Mỗi năm có thêm hàng triệu người mắc bệnh tiểu đường Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường ở Châu Á 10 - 12%, ở các quốc đảo Thái Bình Dương là 30 - 40% Đây là căn bệnh có thể gây ra khủng hoảng y tế thế giới trong thế kỷ 21, và nó có thể giảm tuổi thọ của người dân trong vòng 200 năm tới Ước tính tới năm 2025 thế giới có 333 triệu người mắc bệnh chiếm 6% dân số Tỉ lệ tăng lên ở các nước phát triển là 40%, còn ở các nước đang phát triển là 70%[2] Ở nước ta có khoảng 2 - 2,5 triệu người mắc lệ mắc bệnh tiểu đường Trong đó ước đoán có tới 1,3 triệu người ở độ tuổi dưới

30 - đây là điều đáng lo ngại Theo số liệu điều tra mới nhất tại 4 thành phố lớn

Hà Nội, Huế, Hồ Chí Minh, Hải Phòng, tỉ lệ người mắc bệnh tiểu đường là 7-8% trong khi đó tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường ở lứa tuổi 30 - 64 là 4,2% [2]

Trước thực trạng trên có nhiều tổ chức và cá nhân tham gia nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị căn bệnh nguy hiểm này Đã có nhiều loại thuốc hóa dược được nghiên cứu thành công, và có hiệu quả điều trị cao, nhưng khi sử dụng lâu dài lại mang tới nhiều bất lợi với cơ thể, vì vậy việc nghiên cứu các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên có hệ số an toàn cao hơn khi điều trị lâu dài là xu hướng tất yếu Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản, Ấn Độ, Hàn Quốc trong lá dâu tằm có hợp chất alkaloit tên gọi là 1 – deoxynojimycin (DNJ) cấu tạo tương tự như D - Glucoza có khả năng ức chế các ezim trong hệ tiêu hóa như

α - amylaza làm thay đổi sự trao đổi glucoza cũng như tình trạng đường máu cao Cho đến nay, lá dâu tằm là nguồn thực vật duy nhất phát hiện có chứa DNJ

- hoạt chất có vai trò quan trọng trong việc hạ đường huyết Do đó việc nghiên cứu chế biến các sản phẩm giàu DNJ từ lá dâu để phục vụ cho việc phòng chống bệnh tiểu đường đang được quan tâm đặc biệt ở các quốc gia Châu Á nơi có diện tích trồng dâu tằm lớn

Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của DNJ trong

lá dâu tằm đối với bệnh tiểu đường Tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở bước thăm dò mà chưa đưa ra được quy trình có hệ thống để có thể áp dụng vào sản xuất Mặt khác có nhiều loại thực phẩm chức năng chuyên biệt có nguồn gốc từ thực vật như: Diabetna, tiểu đường nam dược, NADIA…dùng cho người

bị bệnh tiểu đường Tuy nhiên các sản phẩm này phần lớn được nhập khẩu nên

giá thành khá cao Trước những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu quy trình chế biến trà từ lá dâu tằm”

- Xác định nguyên liệu thích hợp cho chế biến trà

- Xác định được phương pháp tách chiết và thu nhận cao lá dâu phù hợp với điều kiện thiết bị nước ta

- Đưa ra được quy trình chế biến trà từ lá dâu có hàm lượng DNJ cao

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây dâu tằm

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm hình thái của cây dâu

2.1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

- Morus alba L (dâu trắng): Mọc chủ yếu ở châu Á, quả màu trắng hoặc

đỏ, lá được sử dụng để chăn nuôi tằm

- Morus rubra L (dâu đỏ): Mọc ở vùng Bắc Mỹ, quả có màu đỏ tía

- Morus nigra L (dâu đen): Mọc chủ yếu ở châu Âu, quả có màu đen

Cây dâu có tốc độ sinh trưởng nhanh vừa sống ở vùng ôn đới vừa sống ở vùng nhiệt đới Chúng có thể cao từ 10 – 15m, lá mọc so le hình bầu dục, hình tim hay chia thùy Đầu lá nhọn phần cuống lá bầu mép lá có hình răng cưa, quả

có thể ăn được

Theo FAO trên thế giới hiện có khoảng 30 nước trồng cây dâu tằm, chủ yếu là các nước thuộc Châu Á (chiếm 60%), trong đó Trung Quốc chiếm gần 60% lượng dâu được sản xuất, Hồ Bắc là một trong những vùng trồng dâu lớn ở Trung Quốc với trên 23.000 ha

Ở Việt Nam, hiện nay (tại thời điểm 5/2010) nước ta có 31 tỉnh tham gia sản xuất

dâu tằm với tổng diện tích dâu là 17.653ha, chiếm 0,17% diện tích đất nông nghiệp

2.1.1.2 Một số giống dâu chính được trồng ở Việt Nam

Nước ta có khoảng 165 giống dâu, bao gồm cả dâu địa phương, giống mới lai tạo trong nước và giống nhập nội, đang được trồng khắp nơi trên cả nước, nhưng qua lựa chọn hiện nay phổ biến trồng các giống dâu sau:

a) Giống dâu Hà Bắc

Thu thập được ở Hà Bắc, hiện nay được trồng nhiều ở Hưng Hà, Vũ Thư – Thái Bình, giống gốc được lưu giữ ở trung tâm giống dâu tằm Việt Hùng Thời gian sinh trưởng 280 - 290 ngày Lá có hình tim tròn, kích thước 15x11cm, màu xanh nhạt, ít cành tăm, cho năng xuất cao vào vụ xuân và vụ hè Năng suất trung bình 20 - 25 tấn/ha Có khả năng chống chịu tốt với bệnh gỉ sắt, vi khuẩn, vi rút Giống thường được trồng bằng hom ở những vùng nghèo dinh dưỡng

a) Giống dâu Quế

Chủ yếu trồng ở đất cát ven biển Nam Định, Thái Bình, lá có kích thước thuộc loại trung bình, lá dày nhẵn, màu xanh đậm Năng suất lá đạt 35-40 tấn/ha

d) Giống dâu ngái

Trồng phổ biến ở Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Tây cũ … Lá to, phẳng, nhẵn

không chia thùy, thường có màu xanh vàng Năng suất có thể từ 15 – 20 tấn/ha e) Giống dâu lai tam bội thể

Đây là giống dâu lai tạo, trong điều kiên thâm canh tốt có thể cho năng suất rất

cao (Đạt trên 40 tấn/ha Các giống dâu tam bội thể được trồng phổ biến hiện nay

- Giống dâu lai VH13: Lá to kích thước trung bình 18,5x15 cm, dầy bóng

và phẳng, màu xanh đậm VH13 hầu như không có quả nên rất thuận lợi cho thu

hái lá Năng suất cao, đạt trên 40 tấn/ha/năm

- Giống dâu VH15: Chiều cao cây trung bình 2,6m, thân màu xanh nhạt,

cành nhiều, tán gọn, lá màu dầy màu xanh đậm, thích nghi với vùng đồi núi trung du phía bắc. Năng suất lá ổn định đạt 25-30 tấn lá/ha

- Giống dâu VH1: Năng suất ổn định với trên 35 tấn lá/ha

f) Giống dâu VH9

Là giống mới lai tạo, lá to, dày, màu xanh đậm, giữ nước tốt, thích ứng được với nhiều loại đất trồng kể cả vùng đồi, trung du, Tây Nguyên và vùng bị nhiễm mặn Cho năng xuất lá khá cao đặc biệt là vụ thu, năng suất tối đa có thể tới 50 tấn/ha

g) Giống dâu Sa nhị luân

Là giống dâu mới nhập từ Trung Quốc, hiện nay được trồng nhiều tại Sơn

La, Lâm Đồng, Quảng Ngãi, Bình Định và Đông Nam Bộ Năng suất rất cao đạt trên 35 tấn/ha

2.1.2 Tình hình trồng trọt và sử dụng lá dâu ở một số tỉnh của Việt Nam hiện nay

Việt Nam là nước giàu truyền thống với nghề trồng dâu nuôi tằm, tuy cũng có nguy cơ thu nhỏ dần do người dân không không thể duy trì thu nhập ổn định từ nghề này nhưng với chiến lược phát triển của nhà nước những năm gần đây và những năm tới trong đó có định hướng thúc đẩy sự phát triển ngành dâu tằm tơ thì trong tương lai sản lượng lá dâu tằm của Vịêt Nam sẽ rất dồi dào Theo số liệu thống kê năm 2008 của Cục Trồng trọt - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thì có thể thấy là cây dâu tằm được trồng trên hầu khắp các miền của đất nước ta, từ miền Bắc, miền Trung đến miền Nam, trong đó sản lượng tập trung chủ yếu tại miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên với diện tích trên 16

nghìn ha

Bảng 2.1 Diện tích dâu tằm chia theo vùng sinh thái

Do vậy, ngoài việc sử dụng lá dâu cho nghề nuôi tằm thì việc phát triển các sản phẩm mới có lợi cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu lá dâu tằm sẽ là một động lực thúc đẩy sự phát triển của ngành trồng dâu, mang lại những giá trị kinh tế cao hơn cho người trồng dâu

2.1.3 Đặc điểm, thành phần hoá học của lá dâu

Trong thành phần của cây dâu nói chung và lá dâu nói riêng có chứa một lượng lớn các thành phần dinh dưỡng như saccarit và các axit amin, vitamin và các nguyên tố vi lượng và các chất có hoạt tính sinh học

2.1.3.1 Flavon và flavon glycozit

Lá dâu chứa các thành phần: rutin, quercetin, izoquercitin và triglucozit

quercetin-3-2.1.3.2 Steroit

Bao gồm -sitosterol, stigmasterol, campesterol, -sitosteryl, glucozit, mezoinositol và một số hoocmon metamorphic cụ thể là inokosteron và ecdysteron

-D-2.1.3.3 Các chất bay hơi

Axit axetic, axit propionic, axit butyric, axit izobutyric, axit valeric, axit izovaleric, axit caproic, axit izocaproic, methyl salicylate, guaiacol, phenol, o-cresol, m-cresol, eugenol Ngoài ra còn có axit oxalic, fumarat, axit tartaric, axit xitric, axit succinic, axit palmitic, ethyl palmitat, henthriacontan và

hydroxycoumarin

2.1.3.4 Saccarit và các axit amin

Bao gồm sacaroza, fructoza, glucoza và 17 loại axit amin như axit aspartic, axit glutamic Hàm lượng các axit amin chiếm 10,1 mg/100g lá dâu khô, axit

không 2.1.3.5 Vitamin và các nguyên tố vi lượng

Lá dâu chứa một số vitamin như A, B1 (0,59 mg/100g lá khô), B2 (1,35 mg/100g lá khô), C (31,6 mg/100 g lá khô), axit nicotinic, caroten (7,4 mg/100g

lá khô), chất xơ thực phẩm chiếm 52,9% trong đó xơ hòa tan là 7,9% Nó rất giàu canxi, kali, photpho, ngoài ra còn gồm các kim loại ở nồng độ vết như kẽm, đồng, boron, mangan, magie, sắt

2.1.3.6 Các chất có hoạt tính sinh học

Trong lá dâu còn chứa nhiều chất alkaloid, đặc biệt quan trọng trong số đó

là DNJ (1-deoxynojirimycin)

Bảng 2 2 Thành phần hóa học chính của lá dâu (% chất khô)

người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu

2.1.4.2 Tính chất của alkaloid

a)Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: khoảng từ 100 – 900

- Thể chất: Phần lớn alkaloid trong công thức cấu tạo có oxy thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm

chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy

ở nhiệt độ trước khi chảy

Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường bền vững, không bị phân hủy

ở nhiệt độ sôi nên được lấy ra khỏi dược liệu bằng bay hơi nước

- Mùi vị: Đa số các alkaloid không có mùi, có vị đắng và số ít có vị cay

- Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít có màu vàng

- Độ tan: Nói chung các alkaloid ở dạng bazơ gần như không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như eter, cloform, benzen, metanol…Một số alkaloid do có thêm nhóm phân cực như –OH, nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm ( Morphin, Cephalin)

Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn, hầu như không tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực

Có một số ngoại lệ như Ephedrin, Colchixin, Ecgovonin các base của chúng tan được trong nước, đồng thời cũng khá tan trong dung môi hữu cơ, còn các muối của chúng thì ngược lại

Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid dạng bazơ và dạng muối mà ngườu

ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết suất, phân lập và tinh chế alkaloid

b)Tính chất hóa học

* Alkaloid nói chung có tính kiềm yếu là do trong phân tử có nitơ Người ta

có thể tính được độ kiềm của các chất và chia thành:

+ Alkaloid có độ kiềm mạnh thì giá trị pKB<3

+ Alkaloid có độ kiềm trung bình thì giá trị pKB: 3 – 7 (alkaloid trong họ

Bên cạnh đó cũng có alkaloid không có tính kiềm như: Ricinin, colchicin, theobromin

- Tác dụng với acid thường tạo muối tan trong nước và kết tinh

Khi ở dạng muối, các alkaloid bền vững hơn và không bị phân huỷ hoặc chuyển màu trong quá trình bảo quản Người ta sử dụng tính chất tạo muối của các alkaloid để chiết suất, tinh chế alkaloid Các muối alkaloid được bào chế thành các dạng viên nén, viên nang, thuốc tiêm để làm thuốc và bảo quản lâu hơn

- Các alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pb…) tạo ra các nuối phức

- Các alkaloid có phản ứng tương tự nhau như đối với một số thuốc thử, gọi tên chung là các thuốc thử alkaloid Những phản ứng này được chia làm 2 loại: + Phản ứng tạo màu

+ Phản ứng tạo tủa

2.1.4.3 Các alkaloid có trong lá dâu tằm

Trong thành phần hoá học của lá dâu tằm có chứa một lượng lớn các chất alkaloid, chiếm hàm lượng khoảng 0,52% Trong đó bao gồm rất nhiều các hợp chất alkaloid khác nhau như:

Bảng 2.3 Thành phần các chất alkaloid có trong lá dâu tằm

STT Hợp chất alkaloid HL trong lá dâu (%) Tỷ trọng so với alkaloid

2.1.5 Hợp chất DNJ trong lá dâu tằm

2.1.5.1 Bản chất và cấu trúc hoá học

DNJ có bản chất là Polyhydroxylat alkaloid, phổ biến với các tên gọi như iminosugar hay azasugar là một loại hoạt chất đang gây sự chú ý mạnh mẽ đối với khoa học như một tiền chất tiềm năng có thể ứng dụng rộng rãi trong y học, công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trong vài năm gần đây Thành phần

cơ bản của chất này là chuỗi D- glucoza, trong đó vòng pyranoza có phân tử oxy liên kết với nitro Polyhydroxylat alkaloid có cấu trúc tương tự như monosacarit

và có khả năng ức chế cạnh tranh đối với enzym β- glucosidaza và α- amylaza,

do vậy có tác dụng điều trị sự mất cân đối của quá trình trao đổi chất có liên quan đến cacbohydrat, cũng như là một hoạt chất tiềm năng trong việc điều trị nhiều loại bệnh hiểm nghèo như ung thư, tiểu đường, bệnh liên quan đến virus (HIV, HBV )

Hiện nay một lượng đáng kể các polyhydroxylat piperidin đã được biết đến, cả các chất có nguồn gốc tự nhiên và các chất được tổng hợp Trong số các hợp chất “giả đường” đó thì DNJ là một alkaloid tồn tại trong tự nhiên điển hình với hoạt tính sinh học hứa hẹn như ức chế các enzym β- glucosidaza và α- amylaza tiêu hóa Hợp chất này có cấu tạo tương tự như phân tử D- glucoza với một nhóm NH thay thế cho nhân oxy của vòng pyranoza

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất DNJ

Hợp chất DNJ tự nhiên lần đầu tiên được phân lập từ lá dâu vào năm 1976 Chất DNJ có nguồn gốc tự nhiên này đã thúc đẩy ý tưởng rằng chế độ ăn có DNJ của lá dâu có thể có tác dụng làm giảm sự cao bất thường của đường máu

và do đó ngăn ngừa bệnh này

2.1.5.2 Tác dụng và cơ chế làm giảm đường huyết của DNJ

Hoạt chất 1- deoxynojirimycin (DNJ) trong thành phần lá dâu tằm là một chất ức chế mạnh hoạt động của enzym α- glucosamindaza, ngăn ngừa phản ứng xúc tác của α- glucosehydrolaza, do vậy ngăn cản hoạt động và ức chế sự phân giải tinh bột trong thực phẩm thành đường đơn là glucoza và fructoza Do đó,

nó ngăn cản quá trình tạo glucose tại thành ruột và gan, từ đó làm giảm lượng

glucose đi vào máu, ức chế sự tăng lên nhanh của đường máu ngay sau khi ăn

Glucosaminidaza tham gia nhiều quá trình sinh học khác nhau, cụ thể là phản ứng phân giải cacbohydrat và sinh tổng hợp glycoprotein DNJ có tác dụng

vô hoạt enzym -glucosehydrolaza trong tất cả các động vật có vú Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng DNJ có khả năng năng làm giảm đường trong máu bằng cách làm giảm khả năng tiêu hóa cacbonhydrat và hấp thụ glucoza DNJ cũng liên kết với α- glycosidaza của maltaza, sucaraza và lactaza trong ruột non, do đó ngăn chặn quá trình chuyển hóa cơ chất thành đường đơn giản và sự

hấp thụ đường vào máu, do vậy hạn chế sự tăng đường máu đột ngột

Cho đến nay, lá dâu tằm là một trong những nguồn thực vật được phát hiện

có chứa DNJ khá cao Bên cạnh đó, trong thành phần cao dâu tằm còn chứa nhiều polyphenol mà điển hình là resveratrol Hoạt chất này giúp làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể insulin với hormon, do đó làm tăng phân huỷ glucose dư thừa Như vậy, chiết xuất dâu tằm vừa ức chế tổng hợp mới, vừa làm tăng phân hủy glucose và làm hạ lượng đường trong máu Thêm nữa, các polyphenol còn

có tác dụng chống oxy hoá sinh học mạnh, giúp chống lại quá trình peroxit hóa lipid, từ đó giúp ngăn ngừa các rối loạn chuyển hóa lipid – nguy cơ gây biến

chứng thành mạch phổ biến ở bệnh nhân ĐTĐ

Do đặc tính ưu việt của DNJ đối với bệnh tiểu đường, cũng như sự sẵn có của nó trong các loại thực vật như cây dâu, nên việc nghiên cứu chế biến thực phẩm chức năng từ lá dâu, một loại cây rất nhiều và phổ biến ở mọi nơi trên đất nước ta là rất khả thi, dễ thực hiện

2.1.6 Một số công dụng của lá dâu

Tất cả các bộ phận của cây dâu, từ lá, rễ đến quả đều được dùng làm thuốc với những tác dụng chữa bệnh rất khác nhau Ngay cả những loại cây hoặc con có liên quan đến cây dâu tằm như cây ký sinh trên cây dâu (tang ký sinh), tổ

bọ ngựa trên cây dâu (tang phiêu tiêu) cũng được dùng làm thuốc

Trong Y học cổ truyền (YHCT), lá dâu được gọi là tang diệp, cành dâu gọi là tang chi, vỏ trắng rễ dâu gọi là tang bạch bì, quả dâu gọi là tang thầm tử

Lá dâu vị ngọt đắng, tính mát, có tác dụng bổ âm, phát tán phong nhiệt, giải cảm, thanh nhiệt lương huyết, mát gan, mát phổi Chủ trị các chứng mắt đỏ, mắt mờ, đau nhức chảy nước mắt , có thể vừa uống, vừa nấu nước để rửa ngoài Lá dâu có tác dụng chữa bệnh đổ mồ hôi trộm ở trẻ em Lá dâu còn có tác dụng dưỡng âm Thường được dùng để chữa tăng huyết áp, mất ngủ, phát ban chẩn, đau mắt đỏ Liều dùng mỗi ngày từ 6 - 12g Trong Nam dược thần hiệu, Tuệ Tĩnh cũng rất chú trọng đến việc dùng lá dâu chữa bệnh [1]

Theo Dược điển Việt Nam: Lá dâu có các công dụng như sơ tán phong nhiệt, thanh phế nhuận táo, thanh can, minh mục Chủ trị: Cảm mạo thanh nhiệt, phế nhiệt ho ráo, chóng mặt, nhức đầu hoa mắt

Theo các nghiên cứu cổ xưa nhất của người Trung Quốc đã chỉ ra rằng lá dâu có tác dụng làm giảm mỡ máu, cân bằng huyết áp, làm giảm lượng đường máu và tăng cường quá trình trao đổi chất, ngăn ngừa quá trình lão hóa và tăng cường sinh lực

Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã công bố các công trình nghiên cứu về thành phần, chức năng và cơ chế hoạt động của các thành phần trong lá dâu Theo các kết quả đó, họ đã nhận thấy rằng lá dâu chứa một

lượng lớn các thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học, nhất là hoạt chất có khả năng làm giảm lượng đường máu, huyết áp, mỡ máu và duy trì lão hóa Đặc biệt trong số đó là hoạt chất DNJ – một alkaloid mà trong các loài thực vật và động vật khác không có, nó có chức năng chế ngự sự tăng đường máu và phòng ngừa bệnh tiểu đường

Bảng 2.4 Thành phần dược tính của lá dâu Các chất có dược tính Chất chính Tác dụng tốt cho sức khỏe

Giảm huyết áp

Nhóm izoflavon - Izoquercitrin

- quercitrin

Chống oxy hóa và lão hóa

2.2 Các phương pháp tách chiết các hợp chất alkakoid trong lá dâu

Như đã nêu ở phần trên, trong số các alkaloid của lá dâu tằm thì hợp chất DNJ là hợp chất chiếm khối lượng lớn nhất và có ý nghĩa quan trọng nhất trong việc phòng chống bệnh tiểu đường

2.2.1 Phương pháp và điều kiện chiết xuất lá dâu

Để chiết rút các loại chất từ lá dâu một cách hoàn toàn và nhanh nhất thì ngoài việc lựa chọn dung môi phải tạo điều kiện tối ưu cho quá trình khuếch tán

- Dựa vào trạng thái của nguyên liệu và đặc tính của dung môi trích ly, người ta chia trích ly thành 2 loại:

+ Trích ly tĩnh: Nguyên liệu được nghiền nhỏ tới kích thước thích hợp rồi ngâm trong dung môi ở nhiệt độ phòng, trong một thời gian nhất định (cả hai đều không chuyển động) trong suốt quá trình trích ly

+ Trích ly động: Dung môi hoặc nguyên liệu chuyển động hoặc cả hai cùng chuyển động nhờ cánh khuấy làm tăng khả năng tiếp xúc, tăng khu nhờ đó hiệu suất trích ly cao hơn

- Dựa vào phương pháp và số bậc trích ly có thể chia trích ly thành trích

ly gián đoạn một bậc, nhiều bậc và trích ly liên tục

+ Trích ly một bậc: Toàn bộ quá trình được thực hiện trong một thiết bị trích ly, nguyên liệu và dung môi chỉ tiếp xúc một lần, phương pháp trích ly này thường cho hiệu suất thấp

+ Trích ly nhiều bậc: Nếu hệ số phân bố không đủ lớn để trích một lần thì phải trích ly thêm nhiều lần Nghĩa là sau khi chiết một lần, trong dung dịch còn lại một lượng chất tan đáng kể thì thường người ta thêm một lượng dung môi chiết mới và chiết một hay nhiều lần nữa Hiệu suất cao hơn hiệu suất chiết đơn nhưng tốn dung môi, thời gian và công suất

Tuỳ thuộc vào chiều chuyển động của dung môi và nguyên liệu ta có thể trích ly nhiều bậc xuôi chiều và trích ly nhiều bậc ngược chiều

Ngoài ra tuỳ theo tính chất của nguyên liệu và dung môi có thể gia nhiệt trong quá trình trích ly Nếu nguyên liệu hay dung môi ít bị biến đổi hay biến đổi theo chiều hướng có lợi, thì khi gia nhiệt làm tăng độ hoà tan các cấu tử vào trong dung môi do đó rút ngắn thời gian trích ly

Một số phương pháp trích ly cụ thể:

Phương pháp ngâm trong dung môi: Nguyên liệu được nghiền nhỏ tới kích

thước thích hợp và dung môi vào một bình kín để ở nhiệt độ phòng Ngâm trong thời gian nhất định, Sau đó gạn, ép bã lấy dịch chiết Để lắng ở nơi mát để loại tạp chất lơ

lửng, rồi lọc lấy dịch trong Có thể ngâm đơn giản hoặc ngâm phân đoạn

- Ngâm đơn giản: Ngâm một lần với toàn bộ lượng dung môi

- Ngâm phân đoạn: Chia dung môi làm nhiều phần ngâm với nguyên liệu, sau đó tiến hành gạn ép như trên rồi tập hợp dịch chiết lại Ngâm phân đoạn hiệu xuất thu hồi cao hơn tuy nhiên tốn nhiều thời gian

Phương pháp ngấm kiệt: Đây là phương pháp chiết xuất bằng cách cho dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu đựng trong một dụng cụ đặc biệt gọi là bình ngấm kiệt Quá trình chiết xuất không có khuấy trộn Trong phương pháp này nguyên liệu cần khô và có độ mịn thích hợp Sau đó làm ẩm nguyên liệu bằng cách cho chúng hút ẩm từ dung môi để đuổi hết không khí trong nguyên liệu Nguyên liệu sau hút ẩm được cho vào bình dàn đều sau đó khoá bình rồi rót dung môi ngập nguyên liệu, để ngâm trong khoảng thời gian nhất định Mở khoá cho dịch chiết chảy từng giọt vào bình hứng Chú ý để dung môi ngập nguyên liệu 2 – 3 cm

2.2.2 Chọn dung môi chiết xuất lá dâu

Các alkaloid có thể được chiết suất từ nguyên liệu dưới dạng muối hoặc dạng bazơ Trong đó chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu dưới dạng muối sử dụng các dung dịch axit hoặc các dung môi phân cực đã axit hoá, còn chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu dưới dạng bazơ sử dụng các dung môi hữu cơ sau khi đã kiềm hoá nguyên liệu

Có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau đây để chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu và loại bớt những tạp chất:

* Chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm

Gồm có hai bước:

Bước 1 – Chiết xuất: Trước khi chiết xuất tiến hành kiềm hoá nguyên liệu bằng dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid dạng muối sang dạng bazơ (các alkaloid tồn tại trong thực vật dưới dạng bazơ và dạng muối) Sau khi kiềm hoá, tiến hành chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữư cơ (thường dùng chloroform, dietylether, cồn) Thu hồi dung môi, thu được alkaloid toàn phần

Bước 2 – Tinh chế: Chuyển các alkaloid ở dạng bazơ sang dạng muối bằng cách hoà tan alkaloid toàn phần bằng các dung dịch axit loãng như axit sunfuric, axit hydrochloric 5-10% Lọc lấy dung dịch axit Kiềm háo dung dịch axit để chuyển các alkaloid từ dạng muối sang dạng bazơ Để lắng, lọc, thu được kết tủa alkaloid toàn phần thô

Phương pháp này thường được áp dụng trong nghiên cứu cơ bản để chiết tách và xác định cấu trúc hoá học, định danh các alkaloid chưa biết Sử dụng độ kiềm khác nhau của các alkaloid để tách chúng trong quá trình kiềm hoá dịch chiết Nếu muốn thu được alkaloid tinh sạch hơn có thể chiết alkaloid từ dung dịch axit đã kiềm hoá bằng dung môi ít phân cực như chloroform hoặc hỗn hợp chloroform + dietylether

Do phương pháp này sử dụng nhiều dung môi hữu cơ để chiết xuất alkaloid trực tiếp từ nguyên liệu, vì vậy ít được sử dụng trong sản xuất

* Chiết xuất alkaloid bằng dung dịch axit loãng hoặc cồn đã axit hoá

Bước 1 – Chiết xuất: Tiến hành chiết xuất alkaloid bằng dung dịch axit loãng như axit sunfuric, axit hydrochloric (hoặc cồn đã axit hoá) Thu hồi dung môi, thu được alkaloid toàn phần

Bước 2 – Tinh chế: Kiềm hoá để chuyển các alkaloid từ dạng muối sang dạng bazơ Tiến hành chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ (thường dùng chloroform, dietylether) Thu hồi dung môi, thu được alkaloid thô Tiếp tục tinh chế bằng phương pháp kết tinh, thu được hỗn hợp alkaloid tinh chế, hoặc kết tinh phân đoạn có thể thu được alkaloid chính dưới dạng tinh thể

Phương pháp này được áp dụng nhiều trong sản xuất vì dung môi là các dung dịch axit loãng hoặc cồn đã axit hoá có giá thành rẻ và an toàn

* Chiết xuất alkaloid bằng cồn trung tính

Bước 1 – Chiết xuất: Tiến hành chiết xuất alkaloid bằng cồn Thu hồi dung môi, được cao cồn toàn phần

Bước 2 – tinh chế: Chiết alkaloid từ cồn toàn phần bằng dung dịch axit loãngit loãng, lọc bỏ tủa, kiềm hoá dịch chiết axit Để lắng tủa alkaloid, lọc, thu được alkaloid toàn phần Tiếp tục tinh chế bằng phương pháp kết tinh

Phương pháp này cũng được áp dụng trong sản xuất (tuỳ theo loại nguyên liệu) nhưng ít hơn phương pháp trên vì dung cồn trung tính thường kéo theo nhiều tạp chất, khó khăn cho việc tinh chế sau này

2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các loại thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường trên thế giới và Việt Nam hiện nay

2.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các loại thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường trên thế giới

Bệnh tiểu đường là một bệnh nguy hiểm, làm tăng nguy cơ mắc các chứng bệnh về tim, thận, thần kinh, mù lòa, vết thương chậm lành, dễ nhiễm bệnh Số người mắc bệnh tiểu đường trên toàn cầu đang ngày càng gia tăng Hiện nay, thuốc điều trị bệnh tiểu đường tăng nhanh về số lượng, chủng loại và nhằm mục tiêu khống chế sự tăng nồng độ glucose máu; phòng ngừa và điều chỉnh các rối loạn lipid, hoạt động của gốc tự do, từ đó có thể kiểm soát tốt mức glucose máu và ngăn ngừa, hạn chế các biến chứng có thể xuất hiện ở bệnh lý tăng glucose máu Trên thị trường hiện có rất nhiều loại thực phẩm chức năng phòng ngừa bệnh tiểu đường và đã sàng lọc được nhiều loài dược liệu có tác dụng rất tốt với căn bệnh này, nhất là tiểu đường Týp II như cây tri mẫu, nhàu, móng châu, mướp đắng, bằng lăng nước…

Trên thị trường thế giới hiện nay, đã có một số sản phẩm chức năng được làm từ lá dâu tằm dùng cho người bị bệnh tiểu đường Tại Trung Quốc, Nhật Bản, các công ty như Mori, Nangtong Sihai Plant Extract Co.Ltd đã đưa ra thị trường một số sản phẩm chức năng được làm từ lá dâu tằm như trà dâu, mỳ lá dâu, bánh ngọt lá dâu có tác dụng phòng và chữa bệnh tiểu đường Các sản phẩm này đang được người dân ưa chuộng

2.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ các loại thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường ở Việt Nam

Tỉ lệ biến chứng của bệnh tiểu đường ngày càng tăng, do không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời Ước tính khoảng 44% người bị bệnh tiểu đường ở nước

ta bị biến chứng thần kinh, 71% biến chứng về thận, 8% biến chứng về mắt…

Hiện nay trên thị trường nước ta có rất nhiều các sản phẩm thực phẩm chức năng chuyên biệt cho người bị bệnh tiểu đường, trong đó có một số loại phổ biến như:

2.3.2.1 Diabetna (Công ty dược phẩm Ích Nhân)

Đây là thuốc được bào chế từ dây thìa canh, dược liệu quý hiếm mới được tìm thấy tại Việt Nam Thuốc có tác dụng hạ đường huyết, ổn định và kiểm soát đường huyết, giảm cholesterol máu, giúp cho bệnh nhân đái tháo đường kiểm soát đường huyết ở mức an toàn, giúp phòng ngừa biến chứng tiểu đường, giảm tác dụng phụ của thuốc điều trị tây y

2.3.2.2 Nadia (Công ty cổ phần dược phẩm Hoàng Giang)

Thành phần của thuốc bao gồm có: Chiết xuất từ khổ qua, cà rốt, hoài sơn,

nấm Linh chi, giúp làm giảm đường máu cao và hạn chế một số biến chứng của bệnh tiểu đường

2.3.2.3 Metabosol

Là một thực phẩm chức năng gồm 8 loại thảo dược quý nhằm kích thích các cơ chế tự nhiên đưa đến sự cân bằng đường trong cơ thể Thảo dược trong thuốc có khả năng phục hồi kênh vận chuyển glucose trên màng tế bào, làm tăng

sự nhạy cảm của tế bào với insulin do đó có tác dụng tăng vận chuyển glucose vào tế bào để sử dụng

2.3.2.4 Hộ tạng đường

Thành phần chính của thuốc là axit α- lipoic, câu kỷ, mạch môn, hoài sơn,

nhàu Tác dụng của thuốc dựa trên sự kết hợp giữa acid α –lipoic với các chất dược thảo có tác dụng điều hòa đường huyết, bồi bổ các cơ quan

2.3.2.5 Tiểu đường nam dược (Công ty cổ phần Nam Dược)

Thành phần của thuốc bao gồm cam thảo, cát căn, mạch môn, ngũ vị tử, sinh địa, thiên hoa phấn và các phụ liệu vừa đủ Thuốc có tác dụng tăng cường bồi bổ, phục hồi chức năng các cơ quan gan, thận, tuyến tụy do đó có tác dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường

2.3.2.6 Ayubes (Công ty Phú Hải)

Thành phần bao gồm các loại dược thảo sau: cao lá dây thìa canh, cao vỏ quả mướp đắng, cao cây xuyên tâm liên, cao lá trái mấm, cao hạt vối rừng, cao

lá cây sầu đâu, cao củ hương phụ (củ gấu)

Hình 2.3 Một số sản phẩm cho người bệnh tiểu đường

2.4 Tình hình nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của chất chiết lá dâu đối với

sự giảm đường huyết

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Từ xa xưa người Trung Quốc đã sử dụng lá cây dâu tằm trong các bài thuốc chữa trị và ngăn ngừa bệnh tiểu đường, tuy nhiên chưa có sự đề cập nào tới các thành phần có tác dụng mà hoàn toàn dựa theo kinh nghiệm.[17]

Trong những năm gần đây, từ các công trình chuyên sâu, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ công bố về thành phần, dược tính và cơ chế hoạt động của các thành phần chức năng có trong lá dâu tằm Các kết quả nghiên cứu

đã cho thấy trong lá dâu chứa một lượng lớn các thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học, nhất là các hoạt chất có khả năng làm giảm lượng đường máu, huyết áp, mỡ máu và trì hoãn quá trình lão hóa Đặc biệt là hợp chất DNJ - đây là chất có chức năng chế ngự sự tăng đường máu và phòng ngừa bệnh tiểu đường

Năm 1976, lần đầu tiên DNJ được tách từ rễ và lá của cây dâu bởi Yagi và cộng sự Điều này làm cơ sở cho việc sử dụng cây dâu làm thực phẩm chức năng

có tác dụng làm giảm nồng độ đường máu và ngăn ngừa bệnh tiểu đường nhờ vào sự có mặt của hoạt chất DNJ trong thành phần của cây dâu tằm

Năm 2003, Jin-Won Kim đã dùng sắc ký lỏng cao áp để định lượng thành phần hoạt chất DNJ trong lá dâu với độ tin cậy và chính xác cao [11]

Năm 2007, Nitra và cộng sự đã thực hiện các thí nghiệm so sánh thành phần DNJ trong lá dâu tằm ở các độ già khác nhau và nhận thấy hàm lượng DNJ

có trong chồi lá cao hơn lá bánh tẻ[16]

Cũng theo nghiên cứu của Lin-Ling Wang và Ze- Yang Zhou vào năm

2008, cho thấy dịch chiết từ lá dâu tằm có khả năng kìm hãm enzym α- glycosidaza, giúp làm giảm hàm lượng đường trong máu có tác dụng rõ rệt đến việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [14] Từ các kết quả nghiên cứu này, Kimura và cộng sự [13] đã nghiên cứu tạo ra bột chiết lá dâu tằm có nồng độ DNJ 1,5% và tiến hành thử nghiệm bột chiết này trên 24 người mạnh khỏe bằng cách cho sử dụng các lượng bột chiết khác nhau và sau đó uống 50g đường sacaroza, hàm lượng đường máu được xác định sau 30, 60, 90, 120, 150 và 180 phút thì kết quả cho thấy liều lượng có hiệu quả đến việc hạn chế sự tăng đường máu là 0,8-1,2 g bột chiết có nồng độ DNJ là 1,5% tương ứng với 12-18 mg DNJ Tuy nhiên một câu hỏi được đặt ra là việc sử dụng bột chiết giàu DNJ có thể gây tác dụng phụ cho người sử dụng hay không Để kiểm tra điều này tác giả nghiên cứu đã thử nghiệm trên 12 người mạnh khỏe tự nguyện mỗi lần sử dụng 1,2 g bột chiết lá dâu nồng độ 1,5% trước mỗi bữa ăn (tức là khoảng 3,6 g/ngày) trong

38 ngày thì thấy rằng hàm lượng đường máu của họ luôn ổn định ở giới hạn bình thường, như vậy có thể thấy là bột chiết lá dâu sử dụng thường xuyên không gây hiện tượng hạ đường huyết Kết quả này cho thấy người mạnh khỏe nếu dùng thường xuyên bột chiết lá dâu sẽ có dụng phòng bệnh mà không có tác dụng phụ nào, do vậy có thể coi bột chiết lá dâu như một loại thực phẩm chức năng an toàn

Một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sản phẩm trà lá dâu bổ dưỡng Mori chiết xuất từ lá dâu do công ty sản xuất phối hợp với trung tâm nghiên cứu ứng dụng thực vật thiên nhiên, trường đại học Y Phương Nam (tên cũ Đại học Y khoa Quân đội số 1- Trung Quốc) đã đánh giá tác dụng của sản phẩm trên người Kết quả là với liều lượng 20ml/người/ngày, dùng đều đặn trong 3 tháng, còn 3 tháng sau đó thì tùy theo biểu đồ máu của người dùng thì cho thấy hiệu quả rõ rệt, mức

độ đường máu của bệnh nhân trở về mức bình thường là 50,88%

Các nghiên cứu trên người này đã cho thấy rằng loại bột chiết giàu DNJ tách chiết được từ lá dâu có tác dụng làm hạ thấp lượng đường máu, do đó loại sản phẩm này có thể sử dụng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường hệ không phụ thuộc insulin (tiểu đường tuýp 2)

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam chưa có các nghiên cứu một cách hệ thống về vấn đề tách chiết hợp chất DNJ từ lá dâu tằm và dùng để sản xuất các thực phẩm chức năng Năm 2007, Viện Công nghiệp thực phẩm (chủ trì là TS.Đặng Hồng Ánh) đã

thực hiện đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giầu 1- deoxynojirimycin” [6], do thời gian thực hiện ngắn (01 năm) và kinh phí có hạn nên kết quả mới dừng lại ở quy mô thí nghiệm thăm dò

Ngoài ra, còn có một số công trình khác nghiên cứu về tách chiết lá dâu tằm của tác giả Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn, Đại học Y Hà Nội khi thực

hiện đề tài “Chiết suất, xác định hàm lượng polyphenol và đánh giá tác dụng chống Oxy hóa của các mẫu bột chiết lá dâu”[4] vào năm 2005 và

TS.BS.Nguyễn Quang Trung, bệnh viện Uông Bí – Quảng Ninh khi thực hiện đề

tài “Đánh giá tác dụng bột chiết lá dâu trên các chỉ số lipid và trạng thái chống oxy hóa trong máu ở chuột nhắt trắng gây rối loạn lipid máu và đái tháo đường thực nghiệm” vào năm 2006 [5], tuy nhiên đây chỉ là những nghiên cứu về dược

tính của một thành phần khác trong lá dâu

Trước những tác dụng của lá dâu nói chung và hợp chất DNJ nói riêng, cần phải ứng dụng được sản phẩm bột lá dâu tằm giàu DNJ này để tạo ra một số sản phẩm chức năng mang tính hàng hóa với mục đích phòng chống, hỗ trợ điều trị cho người bệnh tiểu đường với tiêu chí dễ sử dụng, giá thành hạ nhằm đa dạng hóa các sản phẩm chức năng cho người bệnh tiểu đường ở trên thị trường Việt Nam, đây đang là vấn quan tâm của các cơ quan chức năng

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và nguyên vật liệu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá dâu tằm thu hái tại các địa phương có diện tích và sản lượng lớn là Thái Bình, Hà Nội, Sơn La, Lâm Đồng tập trung chủ yếu vào 4 giống là Hà Bắc, Quế, VH13 và Sa nhị luân

3.1.2 Hoá chất

Các hoá chất xuất xứ từ Nhật, Trung Quốc, Đức bao gồm: axit formic, axetonitril, ammonium axetat, axit sulfuric, chloroform, diethylether, NH4OH đậm đặc, Na2SO4 khan, HC, axit axetic, Ethanol, Đường asprtame, maltodetrin, enzyme Ultra SPL,…

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ: ống đong, phễu thuỷ tinh, phễu chiết, bình định mức…

- Thiết bị:

 Máy HPLC- FL, Shimadzu, cột ODS-3

 Cân điện tử Presisa 62A, Thụy Điển

 Thiết bị lọc chân không

 Bình hút ẩm

 Máy đo hàm ẩm

 Micropipet cầm tay – Đức

 Máy hút chân không - TQ

 Máy đo màu MINOTA- CHROMAMETER CR200/231

 Cân phân tích - SHIMADZU & MONO BLOC - Nhật Bản

3.2 Nội dung

- Nghiên cứu xác định giống, độ già và phương pháp bảo quản thích hợp

- Nghiên cứu quy trình sản xuất bột lá dâu có hàm lượng DNJ cao

- Nghiên cứu tỉ lệ phối chế bột triết lá dâu với bột lá dâu khô và với chất

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1.Phương pháp chung

Về mặt tổng thể đề tài sử dụng phương pháp thực nghiệm, có sự hỗ trợ của các lý thuyết toán học để xác định các điều kiện tối ưu trên mối quan hệ

giữa các yếu tố ảnh hưởng đồng thời và kiểm chứng các cơ sở giả thuyết

Phương pháp toán học các thực nghiệm trong nghiên cứu tìm tối ưu

Tối ưu hoá một số quá trình, đặc biệt là quá trình trích ly đối với lá dâu mà

cụ thể là xác định các giá trị tối ưu của các biến số nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Bằng ngôn ngữ, tối ưu hoá quá trình là tìm giá trị của các yếu tố X i để tại đó quá trình trích ly đạt hiệu suất cao nhất (tức là hàm lượng DNJ được chiết tách lớn nhất), nghĩa là các hàm mục tiêu Yi đạt cực trị

Để đạt được mục đích nghiên cứu chúng tôi chọn ma trận DOEHLERT Ma trận này cho phép tìm được vùng tối ưu trong khoảng giới hạn đã chọn Ma trận cho phép phân chia rất cân đối các điểm thí nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ hướng nào Dựa vào ma trận, ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất đi tính đúng đắn của ma trận

Trong ma trận này, số lần thí nghiệm N và các biến số K được xác định như sau: N= K2+ K+1

Trong trường hợp K= 3 thì số điểm thí nghiệm cần thực hiện là N=13

Với 3 yếu tố ảnh hưởng, ma trận được xác định như hình sau:

Tất cả các điểm đã chọn được xác định theo phương trình hồi quy có dạng sau: Y= b0+ b1X1+ b2X2+ b3X3 + b11X12+ b22X22+ b33X32+ b12X1X2+ b13X1X3 + b23X2X3 Trong đó : Y- Hàm mục tiêu ( hay các đại lượng cần xác định)

b- Các hệ số hồi quy

X- Các biến số

Quá trình tính toán và kết quả được xử lý bằng máy tính theo chương trình NEMROD- New Efficient Methodology For Research Using Optimal Design

3.3.2 Phương pháp thiết kế thí nghiệm và xử lý số liệu

- Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp yếu tố ngẫu nhiên hoàn toàn

- Kiểm tra giả thiết thống kê theo ANOVA

3.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý

- Xác định màu sắc của nguyên liệu và sản phẩm trong quá trình nghiên cứu bằng máy đo màu MINOTA

- Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng refactometer (chiết quang kế) theo TCVN 5610-1991

- Xác định độ ẩm theo TCVN 5613-1991

- Xác định hàm lượng alcaloit toàn phần bằng sắc ký lỏng cao áp

- Xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp: Xác định hàm lượng DNJ bằng phương pháp tạo dẫn xuất với 9-fluorenylmethyl chloroformat trên hệ thống HPLC pha ngược

- Xác định số lượng nấm men, nấm mốc theo TCVN 4886-89

3.3.4 Phương pháp đánh giá cảm quan

Sử dụng phép thử thị hiếu để đánh giá mức độ ưa thích đối với sản phẩm (theo thang điểm hedonic 1-9)

3.3.5 Phương pháp cụ thể

Các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần

Nội dung 1: Nghiên cứu giống, độ già lá dâu và phương pháp bảo quản thích hợp

Trên cơ sở khảo sát, ta lựa chọn 4 giống có năng suất và diện tích trồng lớn, phân tích xác định giống có hàm lượng DNJ cao

Về độ già: Tiến hành xác định ở các độ già khác nhau từ lá non (lá 1 – 4 từ nõn trở xuống) thuần thục (từ lá thứ 5 – tới lá thứ 9) lá già (từ lá thứ 9 xuống gốc)

Thí nghiệm1: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái nguyên liệu đến sự thay đổi hàm lượng DNJ

Tiến hành phân tích chất lượng của lá dâu sau khi thu hái ở hai trạng thái CT1: Lá dâu tươi

CT2: Lá dâu khô, độ ẩm ≤ 10%

Bảo quản lá dâu ở điều kiện thường trong khoảng thời gian từ 1-10 ngày Sau đó, xác định hàm lượng alkaloid TS trong lá dâu trong khoảng thời gian bảo quản, kiểm tra 2 ngày/lần

Thí nghiêm 2: Xác định phương pháp làm khô thích hợp

Tiến hành làm khô lá dâu sau thu hái bằng 3 phương pháp

CT1: Phơi nắng

CT2: Sấy đối lưu ở nhiệt độ 60-70oC

CT3: Sấy lạnh đến độ ẩm đến khi lá dâu có độ ẩm 10%

Sau đó lá dâu khô được đóng trong bao bì PE buộc kín và bảo quản trong điều kiện thường

Tiếp tục theo dõi sự thay đổi hàm lượng alkaloid TS trong lá dâu khô ở 3 phương pháp trong thời gian bảo quản 3 tháng, kiểm tra 1tuần/lần

Các chỉ tiêu kiểm tra hàm lượng alkaloid tổng số

Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm giàu DNJ

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định phương pháp trích ly thích hợp

Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ sau khi xử lý enzim ở các điều kiện thích hợp (có được từ thí nghiệm 1) tiếp tục được khảo sát hiệu suất trích ly bằng 3 phương pháp trích ly phổ biến áp dụng với việc chiết dược liệu, gồm 3 công thức TN

- Công thức 1: Phương pháp ngâm với dung môi

- Công thức 2: Phương pháp ngấm kiệt bằng dung môi

- Công thức 3: Phương pháp trích ly Soxhlet

* Các chỉ tiêu kiểm tra: Hàm lượng alkaloid và DNJ trong dịch chiết (hay hiệu suất trích ly)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn loại và nồng độ dung môi trích ly thích hợp

* Phương pháp: Lá dâu xay nhỏ được chia thành các mẫu có khối lượng như nhau rồi tiến hành trích ly trong cùng một khoảng thời gian, cùng nhiệt độ, cùng

tỷ lệ dung môi/nước chiết và cùng phương pháp trích ly với các loại dung môi

có các nồng độ sau:

Loại dung môi: Do sản phẩm cuối cùng của quá trình tách chiết được sử dụng làm thực phẩm chức năng nên để đảm bảo độ an toàn vệ sinh thực phẩm và đơn giản cho quá trình chiết tách dự kiến sử dụng 03 loại dung môi là nước, ethanol trung tính, ethanol đã axit hóa (đây là các dung môi thường được sử dụng trong quá trình chiết xuất các dược liệu)

Nồng độ dung môi (đối với dung môi ethanol trung tính và ethanol đã axit hóa): 30%V- 96%V

Trên cơ sở xác định hàm lượng DNJ có trong dịch chiết ở các mẫu mà xác định được loại dung môi cũng như nồng độ dịch chiết thích hợp nhất Tuy nhiên trong quá trình này cũng cần chú ý tới hiệu quả kinh tế, đây cũng được coi là một tiêu chuẩn để lựa chọn loại dung môi thích hợp

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xác định nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

và thời gian trích ly thích hợp

* Phương pháp: Tiến hành xác định miền ảnh hưởng của từng yếu tố trong quá trình trích ly (nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu, thời gian trích ly) bằng cách thực hiện các thí nghiệm thăm dò đơn yếu tố nhằm xác định vùng dừng của từng tham số công nghệ, cụ thể:

+ Nhiệt độ trích ly (X): Từ 300C- 1000C

+ Thời gian trích ly (Y): 4 – 24 giờ

+ Tỷ lệ lá dâu/dung môi (Z): 1/6, 1/8, 1/10, 1/12

Từ đó sử dụng phương pháp toán học (như đã nêu) để tìm miền tối ưu của các yếu tố trên

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu xác định số lần trích ly thích hợp

* Phương pháp: Tiến hành trích ly với các lần trích ly n =1 - 4 lần ở các điều kiện đã chọn (có được từ thí nghiệm 4)

Dựa vào hiệu suất trích ly (hay hàm lượng DNJ có trong dịch chiết) kết hợp với hiệu quả kinh tế để xác định số lần trích ly thích hợp

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu xác định chất mang và nồng độ chất mang thích hợp

Dịch chiết lá dâu được cô cạn tới 19.60bx Sau đó lấy mỗi mẫu dịch chiết

có thể tích là 100ml được bổ sung các chất mang: maltodextrin, đường isomalt, tinh bột biến tính ở ba nồng độ khảo sát lần lượt là: 4,5,6% được sấy phun ở cùng một chế độ sấy như nhau Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được chất mang và nồng độ chất mang thích hợp Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun:

- Lưu lượng nhập liệu: 432ml/h

- Áp suất khí nén: 8bar

- Nhiệt độ đầu vào: 125oC

Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ sấy phun thích hợp

Dịch lá dâu sau khi trích ly được cô cạn tới 19.6oBx, sau đó tiến hành lấy mỗi mẫu dịch chiết có thể tích là 100ml được bổ sung chất mang và nồng độ chất mang thích hợp từ thí nghiệm 1 rồi tiến hành sấy phun ở các khoảng nhiệt

độ khác nhau: 115,125,135,145,155

Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được nhiệt độ sấy thích hợp Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun:

- Lưu lượng nhập liệu: 432ml/h

Xác định Hàm lượng DNJ/g sản phẩm, độ ẩm, màu sắc, mùi vị, độ bám dính, khả năng hút ẩm của sản phẩm, khả năng hòa tan trong nước từ đó xác định được lưu lượng nhập liệu thích hợp Các thí nghiệm đều được tiến hành trong điều kiện sấy phun:

- Nhiệt độ đầu vào: nhiệt độ thích hợp được tìm từ thí nghiệm 2

Thí nghiêm 1: Nghiên cứu tỷ lệ phối chế bột lá dâu và lá dâu khô

Từ hàm lượng DNJ có trong lá dâu khô và trong bột chiết lá dâu ta phối chế để được hàm lượng DNJ theo yêu cầu rồi đem đánh giá cảm quan

CT Tỷ lệ bột lá dâu

khô(%)

Tỷ lệ bột chiết (%)

Hàm lượng DNJ (mg/túi 3g)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tỉ lệ phối chế các chất điều vị

Sử dụng trà được phối chế thu được ở thí nghiệm trên Ta bổ xung chất điều vị

là đường Isomailt theo các tỷ lệ 4 - 10% theo các công thức dưới đây rồi đánh giá cảm quan