ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH cầu TRONG TINH DỊCH và mối LIÊN QUAN GIỮA BẠCH cầu với một số CHỈ số TINH DỊCH đồ ở NAM GIỚI vô SINH

Nhận thấy sự cần thiết và tính khả thi củavấn đề trên, góp phần chẩn đoán chính xác hơn một số tình trạng viêm nhiễmđường sinh dục nam, hỗ trợ chức năng sinh sản nam giới, chúng tôi tiến

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TRONG TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ

Ở NAM GIỚI VÔ SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TRONG TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ

Ở NAM GIỚI VÔ SINH

Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền

Mã số : 60720102

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng

HÀ NỘI – 2019

Phượng, phó trưởng Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y HàNội đồng thời là phó giám đốc Trung tâm Tư vấn Di truyền, bệnh viện Đạihọc Y Hà Nội, người đã dành cho tôi sự quan tâm, trực tiếp chỉ bảo tận tình từnhững bước đầu trong quá trình nghiên cứu đến khi hoàn thiện khóa luận, cô

đã đặt những viên gạch đầu tiên làm nền móng cho con đường nghiên cứukhoa học của tôi

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS BS Lương Thị Lan Anh,phụ trách Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, PGS BS Trần Đức Phấn, TS.Nguyễn Thị Trang, TS Vũ Thị Huyền, PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan Bộ môn

Y Sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, TS Nguyễn Hoài Bắc Bộmôn Ngoại trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ hếtlòng trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn:

Toàn thể Thầy Cô, các anh chị kỹ thuật viên, các anh chị Bác sĩ nội trú

Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn gần gũi,động viên, giúp đỡ tôi và cho tôi những lời khuyên quý báu

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Phòng đào tạo sau đạihọc Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trìnhhọc tập, hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng kính yêu sâu sắc đến bố mẹ và những người thân tronggia đình, bạn bè, đã luôn ở bên hỗ trợ, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luậnvăn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2019

Bác sỹ nội trú

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Phan Văn Hưởng, học viên bác sĩ nội trú khóa 42, chuyên ngành

Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của TS Đoàn Thị Kim Phượng.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được sự xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2019

Tác giả

Phan Văn Hưởng

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình vô sinh và vô sinh nam 3

1.1.1 Khái niệm vô sinh nam 3

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới 4

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam 5

1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam 6

1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng 6

1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch .11 1.3 Sự hình thành và biệt hóa tinh trùng 12

1.3.1 Đại cương về quá trình hình thành tinh trùng ở người 12

1.3.2 Quá trình sinh tinh tại tinh hoàn 13

1.3.3 Sự thuần thục của tinh trùng tại mào tinh hoàn 16

1.4 Các loại tế bào trong tinh dịch 17

1.4.1 Tế bào sinh tinh 17

1.4.2 Tế bào không phải là tinh trùng (tế bào tròn - round cell – nonsperm cell) [45], [46] 19

1.5 Các phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch [56] 22

1.5.1 Phương pháp nhuộm esterase (leukhôngcyte esterase) 23

1.5.2 Phương pháp nhuộm elastase (Granulocyte elastate) [57] 23

1.5.3 Phương pháp nhuộm peroxidase (Myelo-peroxidase) 24

1.5.4 Phương pháp đo gốc tự do oxy hóa của BC tinh dịch bằng Chemiluminescence [62] 24

1.5.5 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch BC bằng kháng thể đơn dòng 25

1.6 Các nghiên cứu trong nước và thế giới về bạch cầu trong tinh dịch 25

1.6.1 Các nghiên cứu về xác định bạch cầu trong tinh dịch 26

1.6.2 Các nghiên cứu về mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ 27

2.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27

2.3.2 Tiến trình nghiên cứu 27

2.3.3 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 29

2.3.4 Các quy trình kỹ thuật 29

2.4 Phân tích xử lý số liệu 33

2.5 Sai số và cách khống chế 33

2.6 Đạo đức nghiên cứu 34

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 35

3.1.1 Phân loại theo thời gian vô sinh 35

3.1.2 Biểu hiện viêm nhiễm sinh dục tiết niệu 36

3.2 Kết quả phương pháp nhuộm peroxidase tìm bạch cầu trong tinh dịch 40

3.3 Mối liên quan giữa bạch cầu với số lượng, hình thái, độ di động tinh trùng 42

3.3.1 Mối liên quan giữa bạch cầu trong tinh dịch với độ pH 42

3.3.2 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với mật độ tinh trùng 43

3.3.3 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng 43

3.3.4 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng 44 Chương 4: BÀN LUẬN 45

4.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 45

4.2 Phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch bằng phương pháp nhuộm peroxidase 47

4.3 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với độ pH tinh dịch, hình thái, độ di động, số lượng tinh trùng 49

4.3.2 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với hình thái

tinh trùng 50

4.3.3 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với độ di động tinh trùng 52

4.3.4 Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với mật độ tinh trùng 53

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

RadioimmunoassayTinh dịch đồ

WHO World Health Organization

Bảng 1.1: TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010 4

Bảng 1.2: Các nghiên cứu trên thế giới về điều trị bạch cầu cao trong tinh dịch23

Bảng 3.1: Tỷ lệ viêm nhiễm sinh dục-tiết niệu trong nhóm có số lượng tế

bào khác cao và bạch cầu cao 38

Bảng 3.2: Các triệu chứng viêm nhiễm sinh dục tiết niệu trong nhóm có

bạch cầu cao và tế bào khác cao 38

Bảng 3.4: Mối liên quan giữa bạch cầu trong tinh dịch với độ pH 42

Bảng 3.5: Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với mật độ tinh trùng 43

Bảng 3.6: Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với hình thái tinh trùng .43

Bảng 3.7: Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với độ di động tinh trùng 44

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ vô sinh I, II 35

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ vô sinh theo thời gian 36

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ tế bào khác cao trong nam giới vô sinh 36

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ bạch cầu cao trong nam giới vô sinh 37

Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ bạch cầu cao trong số tế bào khác cao 37

Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ xuất hiện bạch cầu cao trong các nhóm tế bào khác cao 39

Hình 1.1: Quá trình hoàn thiện tinh trùng 16

Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành 18

Hình 1.3: Hình dạng các loại BC trưởng thành 21

Hình 2.1: Các vùng đếm bạch cầu trên buồng đếm Neubauer cải tiến 32

Hình 3.1: Hình ảnh bạch cầu sau khi nhuộm ở vật kính x10 40

Hình 3.2: Hình ảnh bạch cầu (bắt màu nâu) và tế bào khác không phải bạch cầu (không bắt màu) quan sát ở vật kính x40 (độ phóng đại 400 lần) 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, tỷ lệ vô sinh nói chung và tỷ lệ nam giới vô sinh nói riêngngày càng gia tăng Đặc biệt, vô sinh ở nam giới đang nhận được sự quan tâmnhiều hơn trong những năm gần đây Để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ởnam giới, thì tinh dịch đồ là một trong những xét nghiệm cơ bản nhất đánh giáchức năng sinh sản của nam giới trong độ tuổi sinh sản, là xét nghiệm đầu taychứa đựng nhiều chỉ số quan trọng trước khi người bác sĩ đưa ra một chỉ địnhtiếp theo đối với những trường hợp có bất thường trong kết quả tinh dịch đồ[1], [2] Trong tinh dịch người, ngoài tinh trùng trưởng thành còn có các loại

tế bào như tế bào bong, tinh trùng non, bạch cầu Các tế bào này được gọichung là các “tế bào khác”, hay “tế bào tròn” để phân biệt với các tinh trùngtrưởng thành Số lượng tế bào khác trong tinh dịch bình thường cho phép dưới

1 triệu/mL [3] Khi các tế bào này tăng quá mức cho phép, dù là bạch cầu haytinh trùng non đều là một trong các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới Một

số nghiên cứu đã chỉ ra rằng bạch cầu trên 1 triệu/mL liên quan tới các bệnhđường sinh dục như: nhiễm trùng đường sinh dục tiết niệu, tắc ống dẫn tinh,giãn tĩnh mạch thừng tinh, giảm chức năng tuyến sinh dục phụ Bạch cầu tăngcao còn liên quan đến giảm số lượng và chất lượng của tinh trùng do bạch cầu

có thể sản xuất ra các sản phẩm chuyển hóa như ROS (reactive oxygenspecies) [4], khi số lượng bạch cầu trên 1 triệu/mL làm tăng nồng độ ROS lênđáng kể Các sản phẩm này làm tăng stress oxy hóa gây tổn thương tế bào tinhtrùng, đặc biệt là DNA và màng tế bào [5], [6], [7], [8]; tăng nguy cơ vô sinh,sảy thai, đẻ non và các bệnh lý di truyền [9], [10] Việc phân biệt các tế bàokhác nhiều quá mức trong tinh dịch là tế bào sinh tinh non hay bạch cầu cóvai trò quan trọng trong chẩn đoán và quyết định điều trị [11], [12] Tuynhiên, với các phương pháp nhuộm thông thường như Giemsa không phân

biệt được bạch cầu với tế bào non hay tế bào bong Hơn nữa, Việt Nam là mộtnước nhiệt đới, tỷ lệ viêm nhiễm nói chung và viêm nhiễm đường sinh dụctiết niệu nói riêng vẫn còn nhiều, đồng thời tỷ lệ vô sinh ngày càng gia tăng,đặc biệt là nhóm vô sinh nam chưa rõ nguyên nhân trong đó có nguyên nhân

từ tăng bạch cầu trong tinh dịch Nhận thấy sự cần thiết và tính khả thi củavấn đề trên, góp phần chẩn đoán chính xác hơn một số tình trạng viêm nhiễmđường sinh dục nam, hỗ trợ chức năng sinh sản nam giới, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu trong tinh dịch

và mối liên quan giữa bạch cầu với một số chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới

vô sinh”

Đề tài có 2 mục tiêu sau:

1 Phát hiện được bạch cầu trong tinh dịch bằng phương pháp nhuộm peroxidase.

2 Nhận xét mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với độ pH, số lượng,

độ di động và hình thái tinh trùng ở nam giới vô sinh.

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình vô sinh và vô sinh nam

1.1.1 Khái niệm vô sinh nam

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vô sinh (infertility) được định nghĩa

là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ, khi chung sống cùngnhau trên một năm, có quan hệ tình dục thường xuyên, không sử dụng bất kỳbiện pháp tránh thai nào, mà không thể có con [13]

Vô sinh được phân thành 2 loại:

 Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là trường hợp cặp vợ chồng chưa baogiờ có thai, mặc dù sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháptránh thai nào

 Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là trường hợp cặp vợ chồng đã từng có conhoặc đã có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại mặc dù đang sống vớinhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thai nào

Vô sinh nam (male infertility) là trường hợp vô sinh mà nguyên nhânđược xác định do người nam (chồng hoặc đối tác) Tại các cơ sở y tế, xétnghiệm TDĐ từ lâu đã trở thành một xét nghiệm cơ bản và đầu tay trong chẩnđoán vô sinh nam Từ năm 1978, WHO đã tiến hành biên soạn tài liệu hướngdẫn đánh giá TDĐ và các chỉ số liên quan đến tinh trùng Năm 1999, tài liệunày xuất bản phiên bản lần thứ IV [13] Mới đây, năm 2010, phiên bản V rađời đưa ra những chỉnh sửa về tiêu chuẩn đánh giá các chỉ số trong TDĐ [1].Theo tiêu chuẩn WHO 2010, số ngày kiêng quan hệ trước khi làm xét nghiệmTDĐ là từ 2 – 7 ngày Nếu kết quả phân tích tinh dịch bình thường thì chỉ cầnlàm 1 lần, trường hợp kết quả xét nghiệm bất thường thì cần làm ít nhất 2 lần

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010 –bảng 1.1.

Bảng 1.1: TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010 [1]

Chú thích: PR: Tiến tới (Progessive).

1.1.2 Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới

Vấn đề vô sinh và vô sinh nam đã được thế giới quan tâm và nghiên cứunhiều Theo WHO (1985), trong các trường hợp vô sinh có khoảng 80% xácđịnh được nguyên nhân và 20% không rõ nguyên nhân Đến năm 1991, WHOước tính trên thế giới có khoảng 12 – 15% cặp vợ chồng vô sinh [14]

Tại Mỹ, theo một nghiên cứu của Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ, có khoảng6,1 triệu người Mỹ bị vô sinh, một phần ba trong số này có nguyên nhân do

nữ giới, một phần ba có nguyên nhân từ nam giới và còn lại có nguyên nhân

từ cả hai phía hoặc không rõ nguyên nhân [15]

Tại châu Âu, thống kê năm 1988 – 1989 ở Pháp, tỉ lệ vô sinh nam chiếmđến 13,5%; trong đó nguyên nhân do nam chiếm khoảng 20% [16] TheoIrvine D S (2002) thì vô sinh là một vấn đề phổ biến trên thế giới, chiếm 14– 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó nguyên nhân do nam giới khó xác định[Error: Reference source not found] Còn Krauz và cộng sự lại cho rằng

nguyên nhân gây vô sinh nam lên đến 50%, trong số này lại có 40 – 50%trường hợp bất thường về cả số lượng và chất lượng tinh trùng [17].

Ở các nước châu Á, theo Aribarg A vô sinh tại Thái Lan chiếm 12% cáccặp vợ chồng vô sinh trong lứa tuổi sinh đẻ [18]

Nhằm mục đích nghiên cứu tỉ lệ vô sinh nguyên phát và thứ phát, năm

2000, Larsen và cộng sự tiến hành nghiên cứu tình hình vô sinh ở 10 trong số

28 quốc gia châu Phi, đã công bố có 3% các cặp vợ chồng vô sinh nguyênphát trong lứa tuổi sinh đẻ trong khi tỉ lệ vô sinh thứ phát còn cao hơn nhiều[19] Năm 2011, Lee J.Y khi nghiên cứu trên các cặp vợ chồng vô sinh đã chỉ

ra tỉ lệ vô sinh nguyên phát là 78% và vô sinh thứ phát là 22% [20]

Như vậy, tỷ lệ vô sinh trên thế giới thay đổi từ 10 – 20%, tỷ lệ này có xuhướng ngày càng tăng, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam và nữ có tỉ lệtương đương và tỷ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân còn nhiều

1.1.3 Tình hình vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam

Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỷ lệ vôsinh có xu hướng tăng Theo điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này chỉ ở mức7% – 10%, đến năm 1982, tỷ lệ vô sinh chung ở Việt Nam đã lên đến 13%,trong đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh không rõnguyên nhân chiếm 10% [21]

Theo Phan Văn Quyền (2000) tỷ lệ vô sinh là 10% – 15% [21] Cònnghiên cứu của Ngô Gia Hy (2000) cho rằng trong số các cặp vợ chồng bị vôsinh thì nguyên nhân do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cảhai vợ chồng là 10% [22]

Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002) đã công bố tỷ lệ vô sinhchiếm 5%, trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [23]

Theo Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh nguyên nhân do nữ giớithường chiếm khoảng 30% – 40% các trường hợp Vô sinh nam giới chiếm

khoảng 30% các trường hợp [24] Khoảng 20% các trường hợp tìm thấynguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng Bên cạnh đó, có khoảng 20% các cặp

vợ chồng không tìm thấy nguyên nhân gây vô sinh [25]

1.2 Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam

1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng

Azoospermia – không có tinh trùng (KCTT) là tình trạng không pháthiện được tinh trùng nào trên tiêu bản với kính hiển vi độ phóng đại cao cũngnhư sau ly tâm tinh dịch Theo WHO (2010), oligospermia – ít tinh trùng(ITT) là tình trạng tinh dịch có mật độ tinh trùng ít hơn 15 triệu tinh trùng/ml[16]

Tiêu chuẩn tinh dịch đồ WHO 2010: [1]

- Nhẹ: Mật độ 10 triệu – 20 triệu tinh trùng/ml

- Vừa: Mật độ 5 triệu – 10 triệu tinh trùng/ml

- Nặng: Mật độ < 5 triệu tinh trùng/ml [26]

Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Quý (2002) trên những bệnh nhân nam

vô sinh theo tiêu chuẩn WHO (1999) về tinh dịch đồ cho thấy tỉ lệ KCTT là10,10% [27]

Theo Lê Hoàng Anh (2012) khảo sát tinh dịch đồ theo tiêu chuẩnWHO 2010 cho thấy tỉ lệ những người bệnh nhân nam vô sinh KCTT là 6%[28] Có rất nhiều nguyên nhân gây ra KCTT hoặc ITT bao gồm các nguyênnhân di truyền và không do di truyền.

1.2.1.1 Các nguyên nhân không do di truyền

Các yếu tố gây rối loạn nội tiết hay ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh,cương dương, phóng tinh đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh

 Bệnh tật:

Các bệnh ảnh hưởng vùng dưới đồi, vùng tuyến yên như phẫu thuậtvùng tuyến yên, tia xạ, nhồi máu (hội chứng Sheehan, đột quỵ tuyến yên),bệnh tự miễn, chấn thương sọ não, dị dạng như hội chứng hố yên rỗng, thiểusản tuyến yên, và các nhiễm khuẩn hệ thần kinh: apxe, viêm màng não, viêmnão, lao

Giãn tĩnh mạch thừng tinh (Varicocele): Là hiện tượng dòng máu tĩnhmạch thừng tinh bị nghẽn tắc làm tăng nhiệt độ gây giảm số lượng và giảmchất lượng tinh trùng

Lỗ đái lệch thấp (Hypospadias) là một rối loạn trong đó niệu đạo sẽ mở

ra ở vị trí mặt dưới của dương vật hoặc ở gốc dương vật, tầng sinh môn chứkhông phải đầu dương vật, khiến tinh trùng xuất ra khó đi vào lỗ cổ tử cung

Nhiễm trùng: một số bệnh nhiễm trùng như quai bị có thể gây viêm teotinh hoàn, sốt trên 38,5oC có thể ức chế quá trình sinh tinh trong thời gian 6tháng (WHO, 1987) [29]

Viêm tuyến tiền liệt, viêm ống dẫn tinh, viêm niệu đạo, viêm bao quyđầu, viêm mào tinh hoàn, phẫu thuật, chấn thương có thể gây ra sẹo ngănchặn quá trình xuất tinh

Sử dụng một số thuốc điều trị bệnh nội khoa như: nội tiết tố (corticoid,androgens), cimetidin, sulphasalazine, spironolactone, nitrofurantoin,

niridazone, colchichine… đều trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến quátrình sinh tinh.

Các nguyên nhân khác: một số bệnh toàn thân ảnh hưởng đến nội tiếtnhư bệnh ác tính, tim mạch, đái tháo đường, suy gan, suy thận… tiếp xúc vớihoá chất hay bức xạ, hút thuốc lá, nghiện các chất như: ma tuý, rượu…,kháng thể kháng tinh trùng, chấn thương tinh hoàn, thoát vị bẹn, tinh hoàn lạcchỗ…

1.2.1.2 Các nguyên nhân do di truyền

 Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ tế bào

Một số bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riênggây suy giảm quá trình sinh tinh, hậu quả là làm suy giảm khả năng sinh sảncủa nam giới Theo các tài liệu công bố trên thế giới, ở các bệnh nhân nam vôsinh, tỉ lệ bất thường NST thường cao gấp 6 lần và bất thường NST giới tínhcao gấp 15 lần so với cộng đồng [30]

Bất thường NST giới tính thường gặp

Hội chứng Klinefelter: Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng các trường

hợp bất thường NST giới tính như hội chứng Klinefelter (47,XXY,48,XXXY) hay rối loạn cấu trúc NST giới tính có thể gây tình trạng KCTT[31] Theo Trần Quán Anh (2002), hội chứng Klinefelter (47,XXY) chiếm1% các thể vô sinh, 13 – 20% các trường hợp KCTT [32]

Hội chứng nam 47,XYY có tỉ lệ 1/1000 trẻ sơ sinh nam Ở nhữngngười mắc hội chứng này, cơ thể không có biểu hiện hình thái gì đặc biệt,thường cao lớn, nội tiết không thay đổi khác thường, nhiều trường hợp tínhtình hung hăng, thiếu tự chủ Tuy nhiên, những người nam 47,XYY có thểbiểu hiện sinh dục kém phát triển, tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp

Hội chứng nam 46,XX (male 46,XX): Hội chứng nam 46,XX thường

là kết quả của sự trao đổi chéo không cân giữa nhánh ngắn của NST X và

NST Y, dẫn đến sự chuyển vị vật liệu di truyền của NST Y sang NST X, trong

đó có chứa gen xác định giới tính nam (SRY) Do gen SRY vẫn tồn tại nênkiểu hình vẫn là nam, tuy nhiên không có sự hiện diện của toàn bộ vùng đặchiệu nam trên NST Y (MSY: Male specific region Y) Do đó, nam 46,XXchắc chắn không có sự sinh tinh nên một khi làm karyotyp xác định là nam46,XX thì việc phẫu thuật tìm tinh trùng trong tinh hoàn để hỗ trợ sinh sản là

vô ích [33]

Bất thường NST thường

Bên cạnh những bất thường về NST giới tính, những bất thường củaNST thường cũng có thể gây nên tình trạng vô sinh Bất thường NST thườngchiếm tỉ lệ 1 – 2% các trường hợp vô sinh nam Cơ chế do sự mất cân bằngtrong bộ NST gây trở ngại cho việc bắt cặp NST trong quá trình giảm phân,

do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh Thường gặp các dạng đột biến sốlượng NST như hội chứng Down và các loại đột biến cấu trúc NST như mấtđoạn, chuyển đoạn tương hỗ, đảo đoạn quanh tâm và ngoài tâm [34]

Hội chứng Prader Willi: là một rối loạn di truyền hiếm gặp do đột biếnmất đoạn nhánh dài gần tâm NST số 15 vùng băng q12 với biểu hiện béo phì,thiểu năng trí tuệ và suy sinh dục, những người này thường vô sinh

Các rối loạn di truyền khác gây thiếu GnRH hoặc gonadotropin:Những rối loạn nguyên phát của sự chế tiết và điều hòa của hai hormon sinhdục LH và FSH từ tuyến yên do đột biến các gen thụ thể LH nằm trên nhánhdài của NST số 9 (9q) và FSH nằm trên nhánh ngắn NST số 2 (2p21)

 Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ phân tử

Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật di truyền, một số tácgiả đã chỉ rõ được một số gen liên quan đến quá trình sinh sản, các gen nàynằm ở đoạn xa nhánh dài NST Y (Yq11.23), nhóm gen này được gọi là DAZ(delected in azoospermia) Khi phân tích DNA của những người nam vô sinh

thấy có 8% trường hợp có mất đoạn ở nơi có các gen DAZ, những người bìnhthường về tinh dịch không có các bất thường này [35].

Các nhà khoa học đã phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa KCTT hoặcITT với sự mất đoạn nhỏ xảy ra trên nhánh dài NST Y (Yq) là vùng AZF(azoospermic factor) Bốn vùng AZF lần lượt là AZFa, AZFb, AZFd, AZFc[36]

Xơ nang (Cystic Fibrosis) là một bệnh do đột biến gen CFTR trên NST

số 7 Nam giới bị bệnh này thường không có ống dẫn tinh hoặc ống dẫn tinh

bị tắc dẫn đến KCTT trong tinh dịch mặc dù tinh hoàn vẫn sản xuất được tinhtrùng

Hội chứng Kallmann: gen LAL – 1 nằm trên nhánh ngắn NST X bị đột

biến dẫn đến sự thiếu hụt LH, FSH, gây giảm sản xuất tinh trùng, suy chứcnăng tuyến sinh dục, giảm sự sinh tinh tại tinh hoàn Những bệnh nhân nàybiểu hiện mất khứu giác và suy sinh dục do suy hạ đồi

Hội chứng kháng Androgen: gen AR (gen thụ thể của androgen) nằm

trên nhánh dài của NST X bị đột biến dẫn đến mất một phần hoặc hoàn toànthụ thể androgen Người đột biến kháng androgen hoàn toàn có kiểu hình nữ,

bộ NST 46,XY, tinh hoàn nằm trong ổ bụng hay trong ống bẹn sâu, không có

tử cung, buồng trứng, âm đạo, hoặc âm đạo cụt, vô sinh

1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch

Bên cạnh số lượng, chất lượng tinh trùng cũng như tinh dịch ảnhhưởng đáng kể đến khả năng sinh sản ở nam giới Một tỉ lệ không nhỏ namgiới có mật độ tinh trùng bình thường, vẫn gặp khó khăn trong việc có con

1.2.2.1 Nguyên nhân từ plasma tinh

Plasma tinh có thành phần rất phức tạp, gồm nhiều hợp chất hữu cơ và

vô cơ như: nước, muối, fructose, kẽm, acid citric và một số chất khác [37]

Sự mất cân bằng hay thiếu hụt các thành phần trong plasma tinh cũng ảnh

hưởng đến chất lượng tinh trùng và độ di động của tinh trùng mặc dù sốlượng tinh trùng vẫn bình thường.

1.2.2.2 Nguyên nhân từ tinh trùng

Hình thái tinh trùng: Nguyễn Xuân Bái (2002) tiến hành nghiên cứutinh dịch của 1000 cặp vợ chồng vô sinh tại bộ môn Mô Phôi, trường Đại học

Y Hà Nội Kết quả cho thấy tỉ lệ có tinh dịch đồ bất thường chiếm 60% Bấtthường về độ di động tinh trùng chiếm tỉ lệ cao nhất 28,7%, tiếp đến là mật

độ tinh trùng 25,4%, hình thái tinh trùng 19,6% [38]

Chức năng tinh trùng: đứt gãy DNA tinh trùng gây ra một tỉ lệ khôngnhỏ các trường hợp vô sinh Chỉ số để đánh giá mức độ đứt gãy của DNAtinh trùng - DNA Fragmentation Index (DFI) càng lớn thì mức độ đứt gãyDNA càng cao Nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bất thường có tỉ lệ đứt gãyDNA tinh trùng cao hơn nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bình thường Tỉ lệnam giới có tinh dịch đồ bình thường có DFI ở mức > 30% vẫn chiếm tỉ lệcao (41%) [39]

Stress oxy hóa là một trong những tác nhân quan trọng tác động lên sựhình thành và phát triển của tinh trùng, gây nên ảnh hưởng cả về hình thái lẫnchức năng của tinh trùng Giống như nhiều loại tế bào sống hiếu khí khác,tinh trùng liên tục tiếp xúc với môi trường cân bằng liên quan đến oxy Oxycần để tế bào tồn tại và gốc tự do có oxy ở nồng độ sinh lí là rất cần thiết đểduy trì chức năng bình thường của tế bào Ngược lại, nếu các sản phẩm phụcủa oxy như ROS tăng cao lại là nguy cơ gây ảnh hưởng đến chức năng và sựtồn tại của tế bào

1.3.Sự hình thành và biệt hóa tinh trùng

1.3.1 Đại cương về quá trình hình thành tinh trùng ở người

Tinh trùng là tế bào giao tử đực ở người mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội(n=23), là loại tế bào có mức độ biệt hóa cao để thực hiện chức năng sinh sản.Quá trình sinh tinh phụ thuộc đầu tiên vào sự phát triển của tinh hoànthời kì bào thai (bắt đầu vào khoảng tuần 4-6) Ở giai đoạn này, các tế bàomầm sinh dục nguyên thủy ở gờ sinh dục bắt đầu tăng sinh, một số sẽ bị thoáihóa, số còn lại sẽ biệt hóa thành tiền tinh nguyên bào và ngưng lại ở giai đoạnnày Đến khoảng từ lúc sinh đến 6 tháng tuổi, các tiền tinh nguyên bào bắt đầubiệt hóa thành tinh nguyên bào và tăng sinh Đến lúc dậy thì, các tinh nguyênbào bắt đầu giảm phân để tạo thành tinh bào

Tinh trùng được sinh ra tại các ống sinh tinh trong tinh hoàn sau đó dichuyển vào mào tinh để hoàn thành sự trưởng thành cuối cùng trước khi đượcxuất tinh Nếu không có hiện tượng phóng tinh thì các tinh trùng sẽ chết, thoáihóa và được hấp thụ bởi tế bào biểu mô của mào tinh hoàn Vào thời điểmphóng tinh thì các tinh trùng di chuyển dọc theo ống dẫn tinh, sau đó đượctrộn lẫn với dịch của tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến hành niệu đạo và cuối cùngđược tống xuất ra ngoài theo đường niệu đạo

Quá trình hình thành tinh trùng bắt đầu từ lúc dậy thì và tiếp diễn liên tụccho đến lúc chết Quá trình sinh tinh là một quá trình rất hiệu quả (mỗi ngày

có thể có 150 triệu tinh trùng được tạo ra ở mỗi tinh hoàn) trong khi đó quátrình thụ tinh là một quá trình không hiệu quả vì chỉ có một tinh trùng thụ tinhcho trứng để tạo hợp tử Do đó, nếu quá trình sinh tinh giảm sút hoặc có sựtác động của các yếu tố vật lý, hóa học, sinh học trong hay ngoài cơ thể thì sốlượng và chất lượng sẽ không đảm bảo làm cho quá trình thụ tinh bị ảnhhưởng dẫn tới thiểu năng sinh sản [20], [22], [16], [40], [41] Thậm chí, chấtlượng tinh trung kém còn làm tăng khả năng sinh con dị tật, tăng nguy cơ tửvong trẻ em ở những gia đình có bố có chất lượng tinh dịch kém [42]

1.3.2 Quá trình sinh tinh tại tinh hoàn

Quá trình hình thành tinh trùng tại tinh hoàn thực chất là quá trình pháttriển và phân bào của các tinh nguyên bào (2n) chưa biệt hóa và không có khảnăng thụ tinh thành các tinh trùng (1n) có độ biệt hóa cao và khả năng thụ tinhkhi gặp trứng Đây là quá trình diễn ra liên tục tại các ống sinh tinh trong tinhhoàn của nam giới từ lúc dậy thì cho đến lúc chết

Mỗi tinh nguyên bào đều phải trải qua 3 giai đoạn để trở thành tinh trùng: ♦ Giai đoạn tinh nguyên bào: đây là giai đoạn các tinh nguyên bào phânbào nguyên nhiễm để tạo thành các loại tinh nguyên bào và tinh bào I để cungcấp cho quá trình sinh tinh

♦ Giai đoạn tinh bào: đây là giai đoạn các tinh bào phân chia giảmnhiễm 2 lần để tạo 4 tinh tử đơn bội

♦ Giai đoạn tinh tử: đây là giai đoạn các tinh tử biến đổi các bộ phậnnhư đuôi, nhân, bộ Golgi, ti thể để biệt hóa thành tinh trùng trưởng thành

có chức năng

Các giai đoạn này diễn ra đồng thời và liên tục trong các ống sinh tinhcủa tinh hoàn, bắt đầu từ khi các tế bào mầm nguyên thủy biệt hóa thành cáctinh nguyên bào nhưng quá trình này ngừng lại cho đến tuổi dậy thì mới tiếptục Ở tuổi dậy thì, mỗi ngày mỗi tinh hoàn có thể sản xuất từ 50-150 triệutinh trùng [43], [44] Quá trình này diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời củangười nam giới nhưng cũng bắt đầu giảm từ tuổi 40

♦ Giai đoạn tinh nguyên bào

Ở giai đoạn này, các tinh nguyên bào nằm ở phần đáy của biểu mô sinh tinhphân bào liên tục để tạo ra nhiều thế hệ tế bào để cung cấp cho quá trình sinhtinh Tuy nhiên, cũng có một số tinh nguyên bào có chu kỳ rất dài, rất ít phânchia, đóng vai trò dự trữ, cung cấp cho quá trình sinh tinh khi có sự thiếu hụt

Ở người có 3 loại tinh nguyên bào dựa vào hình dạng:

 Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, phân chia để tạo tinh nguyênbào loại A nhạt màu khi có sự thiếu hụt.

 Loại A nhạt màu: phân bào liên tục để tạo thành tinh nguyên bào loại B

 Loại B: phân chia để tạo thành tinh bào I

Sự phân bào liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo cho quá trình sinhtinh ở nam giới được diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời

♦ Giai đoạn tinh bào

Ở giai đoạn này, các tinh bào I thực hiện quá trình giảm phân để tạo racác tinh tử Giảm phân là quá trình đảm bảo cho sự chuyển tiếp từ tế bàolưỡng bội (2n) thành đơn bội (n) trong quá trình sinh tinh Trong quá trìnhgiảm phân có 2 hiện tượng quan trọng liên quan đến chất liệu di truyền, đó là

số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa và sự tái tổ hợp vật liệu di truyềngiữa các chromatid

Phân bào giảm nhiễm được chia làm 2 giai đoạn:

 Giảm phân lần 1: từ tinh bào I sẽ tạo ra 2 tinh bào II, giai đoạn nàykéo dài vài ngày

 Giảm phân lần 2: từ tinh bào II sẽ tạo ra 2 tinh tử, giai đoạn nàythường bắt đầu một thời gian ngắn sau khi giảm phân I kết thúc vàdiễn ra rất nhanh trong vòng vài giờ Do vậy, đời sống tinh bào IIthường ngắn hơn tinh bào I [11], [43]

Như vậy sau quá trình phân bào giảm nhiễm từ một tinh bào I sẽ tạo ra 4tinh tử tương đương với số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa

♦ Giai đoạn tinh tử

Sự biệt hóa tinh tử để tạo thành tinh trùng diễn ra ngay sau khi quá trìnhgiảm phân kết thúc và cũng là giai đoạn cuối của quá trình sinh tinh Sự biệthóa này gồm:

 Bất hoạt toàn bộ bộ gen để đảm bảo sự hoạt động hoàn toàn sau khi thụtinh với trứng

 Nhiễm sắc thể được nén gọn để thu nhỏ kích thước của nhân, từ đó thunhỏ kích thước đầu tinh trùng tạo điều kiện cho quá trình di chuyển: trong quátrình này, protein histon trong chromatid sẽ được thay thế bằng proteinprotamin, protein này giúp sắp xếp lại các chuỗi DNA làm cho kích thước củanhân sẽ được thu nhỏ và nằm ngay dưới màng tinh trùng Sau khi thụ tinh,protamin sẽ được thay thế bằng histon ở trong tế bào trứng.

 Hình thành các cấu trúc giúp cho sự vận động của tinh trùng như đuôi

và sự loại bớt bào tương Hiện tượng loại bớt bào tương diễn ra ở tinh trùngtrưởng thành, các túi bào tương sẽ được loại ra ngoài từ phần cổ của tinhtrùng Khi tinh trùng được phóng thích vào ống sinh tinh thì các túi bào tươngvẫn còn tồn tại, tại mào tinh các túi bào tương sẽ trượt dần từ cổ xuống đuôi

Hình 1.1: Quá trình hoàn thiện tinh trùng 1.3.3 Sự thuần thục của tinh trùng tại mào tinh hoàn

Trong quá trình di chuyển tại mào tinh hoàn thì tinh trùng hoàn thànhquá trình chuyển hóa cuối cùng về hình thái, sinh hóa, chuyển hóa và sinh lý:

♦ Hình thái: mất đi các túi bào tương thừa, hình thái và kích thước củacực đầu ổn định

♦ Sinh hóa: cấu trúc glycoprotein ở màng tinh trùng thay đổi để dễ dàngnhận diện trứng và thực hiện các phản ứng với trứng khi gặp trứng

♦ Chuyển hóa: tinh trùng tăng chuyển hóa và tăng vận động Ở đầu màotinh hoàn tinh trùng di động yếu, không đồng bộ và không định hướng nhưng

ở cuối mào tinh, tinh trùng đã có khả năng di động nhanh và định hướng tốt

để đến được với trứng

♦ Sinh lý: tinh trùng ở cuối mào tinh có khả năng thụ tinh cao hơn ở đầumào tinh

Như vậy tinh trùng phải mất khoảng 10-12 tuần để hoàn thành quá trình từtinh nguyên bào ở ống sinh tinh đến giai đoạn trưởng thành hoàn toàn vàchuẩn bị xuất tinh ở mào tinh.

1.4 Các loại tế bào trong tinh dịch

1.4.1 Tế bào sinh tinh

 Tinh trùng trưởng thành (chiếm >90% trong tinh dịch đồ bình thường[1], [11])

♦ Nguồn gốc: tinh trùng được tạo ra từ các tế bào sinh tinh, nằm trong cácống sinh tinh thuộc hai tinh hoàn

♦ Đặc điểm: một tinh trùng được coi là bình thường về hình thái khi đầu,

cổ, đoạn trung gian và đuôi tinh trùng phải nằm trong giới hạn bình thường(WHO 1999) [13]

 Đầu: hình bầu dục hoặc hơi dẹt (khi nhìn mặt bên); dài 4-5 µm, rộng

2 µm Khu vực chứa nhân nằm ở đoạn sau phình to, bắt màu đậm trên tiêubản nhuộm màu Phía trước đầu là túi cực đầu bắt màu nhạt, chiếm 40-70%diện tích vùng đầu Đầu tinh trùng có thể có không bào tuy nhiên chỉ coi tinhtrùng bình thường khi không bào ≤ 20% vùng đầu

 Cổ: là đoạn ngắn, hẹp, gắn thẳng với trục đầu

 Đoạn trung gian: tiếp nối với đoạn cổ, khoảng 1 µm, có bao ti thể Cổ

và đoạn trung gian được định ranh giới với đuôi bởi vòng Zensen, đây là nơimàng bào tương dày lên Chiều dài cổ và đoạn trung gian gấp 1,5 lần chiềudài đầu

 Đuôi: gồm 2 đoạn là đoạn chính và đoạn cuối Đoạn chính dài khoảng

45 µm, thẳng, thon, nhỏ hơn phần cổ, không cuộn Đuôi có một dây trục nằm ởtrung tâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào Ở đoạncuối, đuôi vuốt nhỏ lại chỉ còn dây trục ở giữa và bọc ngoài bởi màng tế bào

Tinh trùng có thể có bào tương, thường nằm ở phần cổ và đoạn trunggian, cũng có khi ở phần đuôi Diện tích không bào thường < 1/3 diện tíchđầu Tinh trùng bình thường có chiều dài từ 50-60 µm.

Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành

♦ Tinh bào 2: có kích thước nhỏ, gồm 2 loại: một loại mang nhiễm sắcthể X và một loại mang nhiễm sắc thể Y Trên tiêu bản mô học của tinh hoànhầu như không tìm thấy tinh bào 2 bởi tinh bào 2 ngay sau hình thành đã bướcvào lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân để tạo tiền tinh trùng

♦ Tiền tinh trùng (tinh tử): nằm gần lòng ống sinh tinh, có hình hơi dài,nhân sáng, bào tương có các bào quan: bộ Golgi, ti thể Tiền tinh trùng quamột quá trình biệt hóa phức tạp để tạo thành tinh trùng (quá trình này gồm 4giai đoạn, xảy ra khi các tiền tinh trùng đang được vùi trong các khoảng trống

ở mặt tự do phía lòng ống sinh tinh của các tế bào Sertoli)

Các tế bào dòng tinh này hiếm khi xuất hiện trong tinh dịch đã xuất tinhtrừ một số trường hợp bất thường

1.4.2 Tế bào không phải là tinh trùng (tế bào tròn - round cell – nonsperm cell) [45], [46]

 BC đa nhân trung tính (Neutrophil): kích thước 10-14µm, nhân chianhiều múi nối với nhau bằng sợi mảnh, bắt màu trung tính Nó tăng trongnhiễm trùng cấp tính, giai đoạn bình phục trong mất máu nhiều; giảm khinhiễm virus và nhiễm độc kim loại Pb, As,…

 BC đa nhân ưa acid (Eosinophil): 12-15 µm nhân chia nhiều múi nốivơi nhau rất rõ (hình mắt kính) bắt màu acid, các hạt to bắt màu da cam Nótăng trong các bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột, hen suyễn; giảm khidùng nhiều ACTH, Cortisol

 BC đa nhân ưa kiềm (Basophil): 8-10 µm nhân chia thành nhiều múinối với nhau bằng các mảnh nhỏ, hạt rất nhỏ, khó thấy, bắt màu kiềm cho màu

xanh nhạt Nó tăng lên trong các bệnh viêm mãn tính, các bệnh BC dòng tủy,đái đường, nhược năng tuyến giáp.

 BC mono (monocytes): 8-22 µm, nhân to hình hạt đậu, bào tươngmàu xanh nhạt Nó có khả năng xuyên mạch đi vào mô liên kết, tập trungnhiều ở các ổ viêm Nó có chức năng đại thực bào, chuyển hóa protein,glucid, lipid

 BC lympho (lymphocytes): gồm lympho cầu bé (8-12 µm) vàlympho cầu lớn (15-18 µm), nhân hình gần tròn chiếm hầu hết tế bào, nguyênsinh chất màu xanh nhạt

Hình 1.3: Hình dạng các loại BC trưởng thành (nguồn internet)

 Tế bào mầm chưa trưởng thành (immature germ cells)[50], [51], [52]

♦ Nguồn gốc

Tế bào mầm sinh dục được sinh ra từ các tế bào biểu mô sinh tinh củaống sinh tinh Đa phần là các tinh tử tròn và tinh bào, hiếm khi là tinh nguyênbào Chúng phải trải qua các giai đoạn phát triển khác nhau trước khi đi đến màotinh hoàn thiện chuẩn bị đầy đủ nhất về cấu tạo và chức năng tìm và thụ tinh vớitrứng Vì một nguyên nhân nào đó, các tế bào mầm chưa trưởng thành đượcphóng thích sớm trước khi nó có đủ khả năng thụ tinh với trứng, sẽ xuất hiệntrong mẫu tinh dịch, có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử.

♦ Đặc điểm: tinh tử và tinh bào có thể phân biệt được với bạch cầu trongphiến đồ phết nhuộm tinh dịch bằng kỹ thuật Papanicolaou [12] Việc xác định

có thể dựa trên màu thuốc nhuộm, kích thước nhân và hình dạng, sự thiếuperoxidase nội bào và không có kháng nguyên bạch cầu đặc hiệu Tinh tử nhiềunhân có thể nhầm lẫn về mặt hình dạng với bạch cầu hạt nhưng bắt màu hồngnhạt, trái với màu hơi xanh của bạch cầu hạt [12] Tinh tử tròn có thể được xácđịnh bằng các thuốc nhuộm chuyên biệt cho vùng cực đầu đang phát triển [53]lectin hay các kháng thể đặc hiệu [54], [55] Kích thước nhân cũng có thể giúpcho việc xác định: tinh nguyên bào (rất hiếm khi thấy trong tinh dịch) có nhânxấp xỉ 8µm, tinh bào có nhân xấp xỉ 10µm, và tinh tử có nhân xấp xỉ 5µm.Những kích thước này chỉ là tương đối vì sự thoái hóa và giai đoạn phân chia cóthể ảnh hưởng lên kích thước của nhân

 Tế bào biểu mô

Tế bào biểu mô từ các túi tinh chứa sắc tố màu vàng trong tế bào chấtcủa chúng, cũng được thấy sau khi nhuộm bằng kỹ thuật Papanicolaou, có thểđược tìm thấy với số lượng lớn tong viêm túi tinh mạc, đôi khi kết hợp vớicác hạt sắc tố trong huyết tương tinh dịch.

1.5 Các phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch [56]

Có 2 phương pháp giúp phát hiện các tế bào khác (tế bào không phải tinhtrùng - non sperm cells) đang được sử dụng là phương pháp nhuộm tế bào học

và phương pháp xét nghiệm miễn dịch

Trong đó phương pháp nhuộm tế bào phát hiện hoạt tính enzym từ cácquần thể bạch cầu được khuyến cáo cho việc phát hiện bạch cầu trong tinh dịch[56], [48]

1.5.1 Phương pháp nhuộm esterase (leukhôngcyte esterase)

♦ Nguyên lý: phát hiện hoạt động của enzym ngoại bào của bạchcầu dựa trên sự phân cắt của nhóm indoxyl ester bởi enzym esterase của bạch cầu tạo ra màu xanh chàm (Cytur test, Boehringer Mannheium, Germany)

♦ Ưu điểm: dễ thực hiện, nhanh và không quá tốn kém

♦ Nhược điểm: kết quả không tương thích với các phương pháp nhuộm

BC trong tinh dịch khác như phương pháp nhuộm peroxidase Ngày naykhông được khuyến cáo dùng để phát hiện BC trong tinh dịch

1.5.2 Phương pháp nhuộm elastase (Granulocyte elastate) [57]

♦ Nguyên lý:

 Với phương pháp ELISA: elastase được tiết ra từ các BC hạt lưu hànhtrong các dịch cơ thể, thường bị ràng buộc với chất ức chế alpha1-antitryosin.Ống polystyren phủ kháng thể với elastase của BC hạt được ủ tiếp với mẫuhuyết tương tinh dịch và kháng thể thỏ có chứa phosphotase kiềm với chất ứcchế alpha1-antitrypsin

Hoạt tính phosphatase kiềm liên kết sau đó được xác định bằng quangphổ quang học bằng cách sử dụng p-nitrophenylphosphatase làm chất nền.

 Với phương pháp RIA: (Radioimmunoassay, phương pháp miễn dịchđánh dấu phóng xạ): mẫu tinh tương tinh dịch được ủ với một số lượng nhấtđịnh elastase và kháng thể kháng elastase Tỷ lệ giữa phóng xạ tự do và phóng

xạ gắn thể hiện nồng độ elastase trong tinh tương tinh dịch

♦ Ưu điểm: đánh giá khách quan hoạt động chức năng của bạch cầu[58], [59]

♦ Nhược điểm: chỉ đánh giá được những BC tiết elastase, khó thựchiện và đắt

1.5.3 Phương pháp nhuộm peroxidase (Myelo-peroxidase)

Nguyên lý: trong bạch cầu hạt có hệ thống enzym peroxidase nội bào,với sự hiện diện của H2O2, chất nền là benzidine hoặc o-toluidine sẽ tạo thànhphức hợp màu nâu đậm có thể quan sát được dưới kính hiển vi

♦ Ưu điểm: nhanh chóng, dễ thực hiện và giá thành rẻ[60] Nhuộm đượccác tế bào BC hạt đa nhân, là loại BC chủ yếu trong tinh dịch [61].Phương pháp này đủ ý nghĩa trong thực hành lâm sàng

♦ Nhược điểm:

 Chỉ những bạch cầu có chứa peroxidase mới được phát hiện

 Không phân biệt được BC lympho và mono

 Chất khí được tạo thành bởi peroxidase và nhiệt của đèn kính hiển vitạo thành các bọt nước cản trở việc đọc kết quả

• Benzidine có thể gây ung thư (vì vậy, người ta thường dùng toluidine làm chất nền)

o-1.5.4 Phương pháp đo gốc tự do oxy hóa của BC tinh dịch bằng

Chemiluminescence [62]

Định lượng nồng độ ROS trong tinh dịch là một phương pháp quantrọng nhằm tìm hiểu nguyên nhân và cơ chế gây hiếm muộn ở nam giới.Phương pháp này bắt đầu được nghiên cứu nhiều trên thế giới trong vòngkhoảng 10 năm gần đây, nhưng tại Việt Nam, phương pháp này trước đâychưa từng được nghiên cứu

Bạch cầu trong tinh dịch cũng là tác nhân tạo ROS quan trọng Sự xuấthiện của bạch cầu trong tinh dịch, mặc dù rất ít, cũng có thể làm suy giảmchức năng tinh trùng Có nhiều kỹ thuật định lượng ROS trong tinh dịch đãđược nghiên cứu [63] Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay làphương pháp phát quang hóa học (Chemiluminescence), sử dụng đầu dòluminol Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp nên thườngđược dùng trong nghiên cứu hơn là thực tiễn lâm sàng

1.5.5 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch BC bằng kháng thể đơn dòng

Đây là phương pháp nhuộm đặc hiệu nhất, có thể phân biệt được BC hạt,lympho và đại thực bào

Nguyên tắc của phương pháp này là tất cả các loại BC người đều cómột loại kháng thể đặc hiệu (CD45), có thể được phát hiện bởi kháng thể đơndòng phù hợp Bằng cách thay đổi bản chất của kháng thể nguyên thủy, kỹthuật này có thể phát hiện nhiều loại BC khác nhau như đại thực bào, đơn bào,bạch cầu trung tính, tế bào B hay tế bào T Đây được xem là tiêu chuẩn vàngphát hiện các loại BC trong tinh dịch, tuy nhiên, nhuộm hóa miễn dịch tế bàođắt tiền hơn và tốn nhiều thời gian hơn so với phương pháp đánh giá hoạtđộng enzym peroxidase của các BC hạt

1.6 Các nghiên cứu trong nước và thế giới về bạch cầu trong tinh dịch

Trên thế giới từ lâu đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp pháthiện bạch cầu trong tinh dịch, tác động của bạch cầu trong tinh dịch đến cácchỉ số tinh dịch đồ, ảnh hưởng của bạch cầu đến khả năng sinh sản nam giới

và phương pháp điều trị khi số lượng bạch cầu tăng cao Tuy nhiên, ở ViệtNam vẫn chưa có báo cáo nào về vấn đề này

1.6.1 Các nghiên cứu về xác định bạch cầu trong tinh dịch

Bạch cầu, chủ yếu là BC hạt, thường có mặt trong hầu hết các mẫuxuất tinh ở người [11], [64] Theo một nghiên cứu của Johanisson và cộng sựnăm 2000 chỉ ra rằng: có thể phân biệt được BC với các tinh tử và tinh bàotrong phiến đồ phết được nhuộm theo kỹ thuật Papanicolaou Sự khác biệtdựa trên những sự khác nhau về màu nhuộm, kích thước và hình dạng nhân[12] Các BC hạt dễ nhầm về mặt hình thái học với các tinh tử nhiều nhânnhưng lại bắt màu xanh nhạt, ngược lại với màu hơi hồng của tinh tử [12].Kích thước nhân cũng có thể giúp nhận biết: nhân BC đơn nhân cho thấy có sựkhác biệt lớn về kích thước, từ khoảng 7µm đối với các tế bào bạch huyết đếnhơn 15 µm đối với các đại thực bào Tuy nhiên, các kích thước này chỉ để thamkhảo vì sự thoái hóa và phân chia ảnh hưởng đến kích thước nhân Nghiên cứunày của Johanisson đã góp phần phân biệt được bạch cầu với các tinh tử, tuynhiên quá trình nhuộm gồm rất nhiều bước đòi hỏi sự tỷ mỉ và độ chính xác caomới có thể phân biệt rõ bạch cầu với tinh bào và tinh tử Vì vậy, kết quả thườngkhông đánh giá một cách chính xác, khách quan như mong đợi

Theo Wolff năm 1995, Johanisson và cộng sự năm 2000: do bạch cầu hạt

có chứa peroxid là dạng BC chiếm ưu thế trong tinh dịch, xét nghiệm thườngquy hoạt tính của enzym peroxidase có thể thực hiện như một kỹ thuật tầmsoát bước đầu [12], [48] Với nghiên cứu này, chúng ta có thể phân biệt rõbạch cầu hạt với các “tế bào tròn” khác trong tinh dịch, hóa chất thông dụng,

dễ tìm, không quá tốn kém và dễ thực hiện Phương pháp nhuộm peroxidase

này có ý nghĩa cao trong thực hành lâm sàng Nguyên lý: trong bạch cầu hạt

có hệ thống enzym peroxidase nội bào, với sự hiện diện của H2O2, chất nền làbenzidine hoặc o-toluidine sẽ tạo thành phức hợp màu nâu đậm có thểquan sát được dưới kính hiển vi Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, rẻ,

dễ thực hiện, có thể nhuộm được bạch cầu hạt là loại bạch cầu chiếm ưu thếtrong tinh dịch [65] Phương pháp có đủ ý nghĩa trong thực hành lâm sàng.Tuy nhiên cũng có một số nhược điểm như: chỉ những BC có chứa peroxidasemới được phát hiện, không phân biệt được BC lympho và mono

Theo nghiên cứu của Homyk và cộng sự năm 1990, Eggert-Kruse vàcộng sự năm 1992: các BC hạt còn có thể được phân biệt với BC thôngthường và các kháng thể kháng tinh trùng bằng các xét nghiệm hóa miễn dịch

tế bào [54], [55] Các BC hạt đã phóng thích hạt và những loại BC khác nhưlympho bào, đại thực bào không chứa enzym peroxidase nội bào nên khôngthể phát hiện được nhờ vào xét nghiệm o-toluidine, nhưng có thể phát hiệnbởi các phương pháp hóa miễn dịch Stế bào Nguyên tắc của phương phápnày là tất cả các loại BC người đều có một loại kháng thể đặc hiệu (CD45), cóthể được phát hiện bởi kháng thể đơn dòng phù hợp Bằng cách thay đổi bảnchất của kháng thể nguyên thủy, kỹ thuật này có thể phát hiện nhiều loại BCkhác nhau như đại thực bào, đơn bào, bạch cầu trung tính, tế bào B hay tế bào

T Đây được xem là tiêu chuẩn vàng phát hiện các loại BC trong tinh dịch, tuynhiên, nhuộm hóa miễn dịch tế bào đắt tiền hơn và tốn nhiều thời gian hơn sovới phương pháp đánh giá hoạt động enzym peroxidase của các BC hạt

1.6.2 Các nghiên cứu về mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ

Nghiên cứu của Jakhôngb E Lackner và cộng sự năm 2010 về mối liênquan giữa BC và chất lượng tinh trùng phụ thuộc vào nồng độ BC trong tinhdịch [66] Đây là một nghiên cứu lâm sàng hồi cứu tại trung tâm nam học của

một bệnh viện trường đại học Các mẫu tinh dịch từ nam giới vô sinh đượcphân tích hình thái tinh trùng và độ di động theo nồng độ bạch cầu trong tinhdịch (loại A: >0 đến <0,25 ×106 /mL; loại B: > 0,25 đến <0,5×106/mL, loại C:

>0,5 đến <0,75×106/mL, loại D: > 0,75 đến <1,0×106/mL, loại E:

>1,0×106/mL) Kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng với hình thái bình thườngtăng đáng kể từ loại A (14%) đến loại D (19%) nhưng giảm đáng kể xuốngmức 14% ở loại E tương tự như loại A Mức độ di động trong nhóm di độngtiến tới cũng tăng từ loại A (12%, 20%) đến loại D (18,0%, 28,5%) và giảmđáng kể ở loại E (11%, 20,5%) về mức tương tự như loại A Độ biến dạng tinhtrùng và độ di động tại chỗ hoặc không di động tăng dần trong tất cả các loại.Nghiên cứu đưa ra kết luận rằng tỷ lệ tinh trùng với hình thái bình thường vàtính di động tiến tới cao hơn ở các mẫu tinh dịch với nồng độ bạch cầu từ 0đến 1×106/mL so với các mẫu có nồng độ bạch cầu >1×106/mL Mặc dù mốiliên quan giữa các bạch cầu và các tham số tinh dịch phức tạp, và có thể liênquan đến nhiều yếu tố khác nhau, các kết quả này chỉ ra rằng bạch cầu có thể

có tác động tích cực trên một số tham số tinh dịch [48], có thể phụ thuộc nồng

độ và ngưỡng cho nồng độ bạch cầu có thể gây hại cho tinh trùng tương ứngvới mức độ hiện tại của WHO >1×106/mL [13]

Nghiên cứu của Alaa Moubasher và cộng sự năm 2018 về tác động củatăng bạch cầu lên các thông số vận động của tinh trùng, DNA và tính toàn vẹncủa nhiễm sắc thể [67] Các mẫu tinh dịch từ nam giới vô sinh được phân tíchmật độ và độ di động của tinh trùng, tính toàn vẹn DNA và nhiễm sắc thể theo

số lượng bạch cầu trong tinh dịch (bệnh nhân nam vô sinh có nồng độ bạchcầu trong tinh dịch ≥ 1 triệu/mL được đặt vào nhóm A-leukhôngcytospermia,những bệnh nhân khác có nồng độ bạch cầu trong tinh dịch dưới 1 triệu/mLđược đặt trong nhóm B-nonleukhôngcytospermia) Kết quả cho thấy không có

sự khác biệt đáng kể về thống kê giữa nhóm A và nhóm B đối với số lượng

tinh trùng và hình thái tinh trùng Số lượng tinh trùng nhóm A là (81,90

±87,26) triệu/lần xuất tinh so với nhóm B là (72,63 ±85,00) triệu/lần xuấttinh, hình thái tinh trùng bình thường nhóm A là (13,44 ±9,19) % so vớinhóm B là (15,00 ±6,99) %, p> 0,05) Tuy nhiên lại có sự khác biệt về tỷ lệtinh trùng di động tiến tới và tổng số tinh trùng di động Tỷ lệ tinh trùng diđộng tiến tới của nhóm A là (22,04 ±8,67)% thấp hơn đáng kể so với nhóm

B là (39,08 ±11,41) (p<0,001) và tổng số tinh trùng di động nhóm A là (26,80

±11,03)% cũng thấp hơn đáng kể so với nhóm B là (45,44 ±13,16)%(p<0,001)

Nhóm A có các thông số vận động tinh trùng được đánh giá trên máyCASA thấp hơn đáng kể bao gồm VCL, VSL, VAP, MAD, ALH và STR sovới nhóm B Trong đó, tốc độ di động trung bình VSL của nhóm A là (24,12

±5,28) µm/s thấp hơn đáng kể so với tốc độ di động trung bình VSL của nhóm

B là (38,08 ±5,74) µm/s (p<0,001) Mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ở nhóm

A là 43.60 ±13.43 cao hơn so với 30.20 ±5.10 ở nhóm B có ý nghĩa thống kê(p<0,001) Ngoài ra, các mối tương quan nghịch đáng kể đã được tìm thấygiữa số lượng bạch cầu dương tính vơi peroxidase và các thông số vận độngcủa tinh trùng được đánh giá bởi CASA, bao gồm mức độ di động tiến tới củatinh trùng (r = -0,580, p <0,001), VCL (r = -0,590, p <0,01), VSL (r = -0,526,

p <0,01), VAP (r = -0,424, p <0,05) Cũng có mối tương quan thuận đáng kểgiữa số lượng bạch cầu của tinh dịch và tỷ lệ DFI của tinh trùng (r = 0,767, p

<0,001) Nghiên cứu kết luận rằng có sự gia tăng đáng kể về tình trạng suygiảm chất lượng tinh dịch ở nhóm A so với nhóm B thông qua khảo sát cácthông số tinh dịch trên 2 nhóm có và không có số lượng bạch cầu cao trongtinh dịch, chủ yếu là do nhiễm trùng các tuyến sinh dục phụ, rối loạn chứcnăng tuyến sinh dục hoặc thậm chí là hệ miễn dịch

Theo Jae Hung Jung và cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ BC tăng caotrong tinh dịch do viêm nhiễm đường sinh dục – tiết niệu dẫn tới tỷ lệ vô sinhcao 15% [68], [69] Kết quả sau khi điều trị kháng sinh cho những trường hợpnày đã cải thiện các chỉ số tinh dịch đồ một cách hiệu quả ví dụ như: tăng mật

độ tinh trùng, tăng tốc độ di động và giảm bất thường hình thái Điều này chothấy tỷ lệ bạch cầu cao trong tinh dịch là một trong những yếu tố gây ảnhhưởng tới số lượng và chất lượng tinh trùng và là nguyên nhân gián tiếp tăng

tỷ lệ vô sinh ở nam giới [70], [71], [72] Việc xét nghiệm đánh giá số lượngbạch cầu trong tinh dịch trong việc hỗ trợ điều trị vô sinh nam giới đang ngàymột gia tăng hiện nay là vấn đề cấp bách và thiết thực [70], [73], [74]