ỨNG DỤNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới NGHIÊN cứu đặc điểm bộ GEN của một số CHỦNG ENTEROVIRUS 71 gây BỆNH CHÂN TAY MIỆNG ở VIỆT NAM năm 2011 – 2013

Trong những năm gần đây giải trình tự gen thế hệ mới NGS là mộtcông nghệ mới giúp giải mã nhanh chóng chính xác toàn bộ bộ gen của EV-A71.Mặc dù kỹ thuật NGS được phát triển từ năm 2005,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HOA

øNG DôNG Kü THUËT GI¶I TR×NH Tù GEN THÕ HÖ MíI

NGHI£N CøU §ÆC §IÓM Bé GEN CñA MéT Sè CHñNG ENTEROVIRUS 71 G¢Y BÖNH CH¢N TAY MIÖNG

ë VIÖT NAM N¡M 2011 – 2013

Chuyên ngành: Vi sinh

Mã số: NT 62726805

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ

Người hướng dẫn khoa học:

1.PGS.TS Nguyễn Vũ Trung 2.TS Lê Thị Hội

HÀ NỘI – 2017

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh Tay Chân Miệng 3

1.1.1 Sơ lược về bệnh TCM 3

1.1.2 Tác nhân gây bệnh TCM 5

1.1.3 Một số kĩ thuật phát hiện EV-A71 trong phòng xét nghiệm 5

1.1.4 Điều trị bệnh TCM 6

1.1.5 Phòng bệnh 7

1.2 Đặc điểm EV-A71 8

1.2.1 Phân loại 9

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của EV-A71 9

1.3 Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới 11

1.4 Các nghiên cứu ứng dụng NGS đối với EV-A71 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.1.2 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu 16

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ 16

2.2.2 Sinh phẩm hóa chất 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Quy trình kỹ thuật: theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit TruSeq Strand mARN LT sample Prep 18

2.3.2 Phân tích số liệu 26

2.4 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Trình tự bộ gen của các chủng EV – A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 28

3.1.2 Mức độ lâm sàng bệnh TCM do một số chủng EV-A71 đã giải trình

tự gây bệnh 28

3.1.3 Phân loại một số chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011-2013 29

3.1.4 Đặc điểm bộ gen của một số chủng EV – A71 gây bênh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 30

3.2 Sự biến đổi về đặc điểm di truyền của một số chủng EV – A71 33

3.2.1 Đặc điểm nucleotide vùng VP1 của một số chủng EV-A71 33

3.2.2 Đặc điểm vùng VP2 của một số chủng EV-A71 35

3.2.3 Đặc điểm nucleotide vùng VP3 của một số chủng EV-A71 37

3.2.4 Đặc điểm nucleotide vùng VP4 của một số chủng EV-A71 39

3.2.5 Đặc điểm nucleotide vùng 2A của một số chủng EV-A71 41

3.2.6 Đặc điểm nucleotide vùng 2B của một số chủng EV-A71 43

3.2.7 Đặc điểm nucleotide vùng 2C của một số chủng EV-A71 45

3.2.8 Đặc điểm nucleotide vùng 3A của một số chủng EV-A71 47

3.2.9 Đặc điểm nucleotide vùng 3B của một số chủng EV-A71 49

3.2.10 Đặc điểm nucleotide vùng 3C của một số chủng EV-A71 51

3.2.11 Đặc điểm nucleotide vùng 3D của một số chủng EV-A71 53

3.2.12 Đặc điểm nucleotide vùng 3’UTR của một số chủng EV-A71 55

3.2.13 Đặc điểm nucleotide vùng 5’UTR của một số chủng EV-A71 57

3.3 Cây phát sinh loài 59

3.3.1 Cây phân loài dựa vào toàn bộ bộ gen của các chủng EV – A71 59

3.2.2 Xây dựng cây phát sinh loài dựa vào vùng gen VP1 của các chủng nghiên cứu 61

Chương 4: BÀN LUẬN 63

4.1 Trình tự toàn bộ bộ gen của một số chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới 634.1.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân bị bệnh TCM 634.1.2 Đặc điểm bộ gen của các chủng EV – A71 được giải trình tự 644.1.3 Đặc điểm các vùng gen của các chủng EV – A71 được giải trình tự

654.2 Sự biến đổi về mặt di truyền của các chủng EV – A71 684.2.1 Sự biến đổi di truyền dựa vào trình tự toàn bộ bộ gen của các chủng

EV – A71 684.2.2 Sự biến đổi về mặt di truyền dựa trên trình tự các vùng gen của các

chủng EV – A71 70

KẾT LUẬN 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 3.1 Sự phân bố của các chủng EV-A71 28

Bảng 3.2 Mức độ lâm sàng bệnh TCM do một số chúng EV-A71 gây ra .28

Bảng 3.3 Phân loại một số chủng EV-A71 29

Bảng 3.4 Kích thước bộ gen của một số chủng EV-A71 30

Bảng 3.5 Tỷ lệ nucleotid của một số chủng EV-A71 31

Bảng 3.6 Kích thước vùng gen trung bình các vùng của một số chủng EV-A71 32

Bảng 3.7 Tỷ lệ nucleotid vùng VP1 một số chủng EV-A71 33

Bảng 3.8 Tỷ lệ nucleotid vùng VP2 một số chủng EV-A71 35

Bảng 3.9 Tỷ lệ nucleotid vùng VP3 một số chủng EV-A71 37

Bảng 3.10 Tỷ lệ nucleotid vùng VP4 một số chủng EV-A71 39

Bảng 3.11 Tỷ lệ nucleotid vùng 2A một số chủng EV-A71 41

Bảng 3.12 Tỷ lệ nucleotid vùng 2B một số chủng EV-A71 43

Bảng 3.13 Tỷ lệ nucleotid vùng 2C một số chủng EV-A71 45

Bảng 3.14 Tỷ lệ nucleotid vùng 3A một số chủng EV-A71 47

Bảng 3.15 Tỷ lệ nucleotid vùng 3B một số chủng EV-A71 49

Bảng 3.16 Tỷ lệ nucleotid vùng 3C một số chủng EV-A71 51

Bảng 3.17 Tỷ lệ nucleotid vùng 3D một số chủng EV-A71 53

Bảng 3.18 Tỷ lệ nucleotid vùng 3’UTR một số chủng EV-A71 55

Bảng 3.19 Tỷ lệ nucleotid vùng 5’UTR một số chủng EV-A71 57

DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP1 34

Hình 3.2 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP2 36

Hình 3.3 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP3 38

Hình 3.4 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP4 40

Hình 3.5 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2A 42

Hình 3.6 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2B 44

Hình 3.7 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2C 46

Hình 3.8 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3A 48

Hình 3.9 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3B 50

Hình 3.10 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3C 52

Hình 3.11 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3D 54

Hình 3.12 Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3’UTR 56

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình kỹ thuật 19

Sơ đồ 3.1 Cây phát sinh loài dựa trên toàn bộ hệ gen của các chủng được

giải mã và các chủng tham chiếu 59

Sơ đồ 3.2 Cây phát sinh loài dựa trình tự vùng VP1 của các chủng được

giải mã và các chủng tham chiếu 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, bệnh Tay chân miệng (TCM) đã trở thànhvấn đề quan tâm hàng đầu của các nước trên thế giới, nhất là các nước đangphát triển, trong đó có Việt Nam Do sự gia tăng của bệnh, số người nhập việnngày càng nhiều dẫn đến tình trạng quá tải ở nhiều bệnh viện Trong khi đó,nhận thức và thực hành các biện pháp phòng bệnh của người dân còn hạn chế

và tập quán ăn uống và sinh hoạt của người dân chưa đảm bảo vệ sinh Đếnnay, chúng ta vẫn chưa tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòngmột cách hiệu quả Các vụ dịch TCM thường xảy ra hàng năm từ tháng 3 đếntháng 11 Enterovirus 71 (EV-A71) là một trong những căn nguyên quantrọng liên quan đến các vụ dịch TCM ở khắp nơi trong khu vực Châu Á TháiBình Dương nhất là ở Việt Nam [1].Vụ dịch năm 2011 và 2013 với số ca mắchàng năm trên 100 000 người, gây tử vong trên 200 trẻ, căn nguyên phân lậpđược chủ yếu là Enterovirus 71 (EV-A71) với trên 68%, các chủng lưu hành

có genotype là C4 hoặc C4A Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa hiểu

rõ đặc điểm di truyền các chủng EV-A71 gây bệnh TCM trong vụ này [2] Các vụ dịch TCM do EV-A71gây nên, đặc biệt các nhóm, dưới nhóm, đôikhi kèm theo sự tái tổ hợp di truyền của các chủng Do đó, hiểu biết những thayđổi trong bộ gen của EV-A71 là cần thiết, đóng vai trò trong việc nghiên cứudịch tễ học, chẩn đoán, điều trị và phát triển vắc-xin phòng bệnh Có nhiều kỹthuật xác định sự thay đổi di truyền của các chủng vi rút nói chung, trong đó cóEV-A71 Trong những năm gần đây giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là mộtcông nghệ mới giúp giải mã nhanh chóng chính xác toàn bộ bộ gen của EV-A71.Mặc dù kỹ thuật NGS được phát triển từ năm 2005, nhưng ở Việt Nam đây vẫncòn là kĩ thuật mới và có rất ít các nghiên cứu về ứng dụng kĩ thuật này vào

phân tích các đặc điểm di truyền của EV-A71

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật giải trình

tự gen thế hệ mới nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng

enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng ở việt nam năm 2011 – 2013”.

Với mục tiêu:

1 Xác định trình tự toàn bộ bộ gen của một số chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới.

2 So sánh sự biến đổi về mặt di truyền giữa các chủng EV-A71.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh Tay Chân Miệng

1.1.1 Sơ lược về bệnh TCM

Bệnh TCM có thời gian ủ bệnh trung bình từ 3 đến 6 ngày Đầu tiên, virút thường cư trú ở niêm mạc má hay niêm mạc hồi tràng và sau 24 giờ, vi rútlan đến các hạch bạch huyết Nhiễm vi rút huyết thường xảy ra nhanh chóngsau đó và vi rút di chuyển đến niêm mạc miệng và da Vào ngày thứ 7 sau khinhiễm bệnh, kháng thể trung hòa tăng cao và vi rút bị thải loại

Các dấu hiệu tiền triệu bao gồm sốt nhẹ, mệt mỏi, đau bụng và đau trongmiệng Trong giai đoạn toàn phát, bệnh nhân có biểu hiện sốt, đau đầu, nôn,mệt mỏi, đau họng, loét miệng, ăn không ngon, tiêu chảy Khám có thể thấycác vết loét, xung quanh có viền đỏ, thường ở niêm mạc miệng, có thể thấy ởlưỡi, vòm họng, lưỡi gà, a-mi-đan, lợi hoặc ở trên da lòng bàn tay, bàn chân

và ở kẽ ngón tay, ngón chân Ở trẻ em dưới 5 tuổi, các triệu chứng điển hìnhhơn ở người lớn Các tổn thương trên da ban đầu thường là dạng dát sau đónhanh chóng tiến triển thành các phỏng nước hình oval, đường kính từ 2-10mm, màu xám trên nền ban hồng Ở trẻ sơ sinh, các tổn thương này có thể

ở thân mình, đùi và mông Trong trường hợp không điển hình chỉ có rất ítphỏng nước xen kẽ với hồng ban, hoặc chỉ có hồng ban mà không có phỏngnước hoặc chỉ loét miệng đơn thuần

Một số trường hợp có biến chứng hệ thần kinh trung ương Biểu hiệnlâm sàng thường hay gặp nhất là viêm màng não, liệt mềm cấp, viêm não Cácbiến chứng ít gặp hơn bao gồm mất điều hòa tiểu não, hội chứng Guillain-

Barré, viêm tủy cắt ngang, tăng áp lực nội sọ lành tính, tỷ lệ tử vong trong sốcác trường hợp mắc từ 40-80% Các biến chứng khác là phù phổi cấp, xuấthuyết, suy tuần hoàn Nhiều biến chứng có thể cùng phối hợp xảy ra trên cùngmột bệnh nhân

Bệnh TCM thường xảy ra thành dịch từ nhỏ đến lớn đe dọa sức khỏe tínhmạng của trẻ em Y văn thế giới cũng đã ghi nhận những vụ dịch TCM xảy ra

ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore Tại Việt Nam, giai đoạn 2011-2013 số

ca mắc và tử vong do bệnh TCM tăng đột biến, trong khi đó, chúng ta vẫnchưa tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòng

- Phân độ lâm sàng [4], [5]:

 Độ 1: Chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da

 Độ 2: Biến chứng thần kinh hoặc tim mạch mức độ trung bình

 Rung giật cơ

 Đi loạng choạng

 Ngủ gà

 Yếu liệt chi

 Mạch nhanh >150 lần/phút (khi trẻ nằm yên và không sốt)

 Sốt cao ≥ 3905C (nhiệt độ hậu môn)

 Độ 3: Biến chứng nặng về thần kinh, hô hấp, tim mạch

 Co giật, hôn mê (Glasgow < 10 điểm)

 Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ)

 Mạch nhanh >170 lần/phút hoặc tăng huyết áp

Bệnh TCM do nhóm vi rút đường ruột (Enterovirus) gây nên.

Enterovirus gây bệnh cho người gồm các nhóm: Poliovirus (PV),

Coxsackievirus A (CVA), Coxsackievirus B (CVB), Echovirus (ECV) vàEnterovirus 68 đến 71 (EV68-71) Trong đó, tác nhân chủ yếu gây bệnh TCM

là EV-A71và CVA16 EV-A71 có thể gây ra các biến chứng thần kinh nặng

và dẫn đến tử vong, còn các vi rút đường ruột khác thường ở thể nhẹ

1.1.3 Một số kĩ thuật phát hiện EV-A71 trong phòng xét nghiệm

Các mẫu bệnh phẩm có thể dùng để xác định căn nguyên bao gồm phân,dịch ngoáy họng, ngoáy hậu môn, dịch nốt phỏng và dịch não tuỷ Mỗi loạibệnh phẩm có ưu nhược điểm riêng

- Nuôi cấy

Nuôi cấy vi rút là kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có trong mẫu bệnh phẩm)lên dòng tế bào nuôi thích hợp nhằm tăng sinh phát triển, từ đó có thể xácđịnh được vi rút Dòng tế bào thích hợp cho nuối cấy Enterovirus nói chúng là

tế bào L20B có nguồn gốc từ tế bào Lympho chuột và tế bào RD có nguồngốc từ sarcom mô liên kết ở người

- Phản ứng trung hòa

Phát hiện kháng thể IgM kháng EV-A71 đang được phát triển, nhưng cóthể cho kết quả dương tính giả và giá trị dự báo dương tính thấp

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: gián tiếp sử dụng kháng thể

đơn dòng kháng EV-A71 cho kết quả nhanh nhưng giá thành cao [8] [9]

- Kỹ thuật khuếch đại gen kỹ thuật RT – PCR (Reverse transcription –polymerase chain reaction)

Một số tác giả sử dụng cặp mồi cặp mồi MD91/MD90 khuyếch đại vùnggen ở đầu 5’UTR PCR primers và cặp mồi MAS01S/MAS02A khuếch đạivùng gen VP1 [10]

- Kỹ thuật giải trình tự gen

Kỹ thuật này giúp định danh nhanh chóng chính xác vì mỗi loại vi rút cómột trình tự rất riêng biệt, không trùng lẫn với những loài khác Các phươngpháp giải trình tự gen cổ điển chỉ

1.1.4 Điều trị bệnh TCM

- Nguyên tắc điều trị [4]:

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ điều trị hỗ trợ (khôngdùng kháng sinh khi không có bội nhiễm)

Theo dõi sát, phát hiện sớm và điều trị biến chứng

Bảo đảm dinh dưỡng đầy đủ, nâng cao thể trạng

- Điều trị cụ thể [4]:

 Độ 1:

 Điều trị ngoại trú và theo dõi tại y tế cơ sở

 Tái khám mỗi 1-2 ngày trong 5-10 ngày đầu của bệnh

 Dặn dò dấu hiệu nặng cần tái khám ngay: Sốt cao ≥ 390C; thởnhanh, khó thở; rung giật cơ, chới với, run chi, quấy khóc, bứt rứtkhó ngủ; Co giật, hôn mê; yếu liệt chi; da nổi vân tím

 Chỉ định nhập viện:

 Biến chứng thần kinh, tim mạch, hô hấp (từ độ 2)

 Sốt cao ≥ 390C

 Nôn nhiều

 Nhà xa: không có khả năng theo dõi, tái khám

- Độ 2: Điều trị nội trú tại bệnh viện huyện hoặc tỉnh

 Điều trị như độ 1

 Nằm đầu cao 30o, cổ thẳng

 Điều trị chống suy hô hấp, co giật

 Immunoglobµlin (nếu có)

 Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, mạchmỗi 4- 6 giờ

 Đo độ bão hòa oxy SPO2 và theo dõi mạch liên tục (nếu có máy)

- Độ 3: Điều trị nội trú tại bệnh viện tỉnh hoặc bệnh viện huyện nếu đủ điều kiện

 Chống suy hô hấp, chống phù não, chống co giật

 Điều trị hạ đường huyết, điều chỉnh rối loạn nước, điện giải, toan kiềm

 Dùng thuốc vận mạch Dobutamin khi suy tim mạch

 Chỉ định từ độ 2 và độ 3.

 Liều: 1g/kg/ngày truyền tĩnh mạch trong 6- 8 giờ x 2 ngày liên tiếp

 Riêng độ 2 cần đánh giá lại lâm sàng trước chỉ định liều thứ 2 Khôngdùng liều 2 nếu lâm sàng cải thiện tốt

1.1.5 Phòng bệnh

Hiện chưa có vắc xin phòng bệnh đặc hiệu

Áp dụng các biện pháp phòng bệnh đối với bệnh lây qua đường tiêu hoáPhòng bệnh tại các cơ sở y tế:

Cách ly theo nhóm bệnh

Nhân viên y tế: Mang khẩu trang, rửa, sát khuẩn tay trước và sau khichăm sóc

Khử khuẩn bề mặt, giường bệnh, buồng bệnh bằng Chloramin B 2%

Xử lý chất thải theo quy trình phòng bệnh lây qua đường tiêu hoá

Phòng bệnh ở cộng đồng: Vệ sinh cá nhân, rửa tay bằng xà phòng (đặcbiệt sau khi thay quần áo, tã, sau khi tiếp xúc với phân, nước bọt)

1.2 Đặc điểm EV-A71 [1]

EV-A71 thuộc họ (family) Picornaviridae Do không có màng bao lipid

nên các Enterovirus đều bền vững trong môi trường vật chủ, kể cả khi tiếpxúc với dịch vị ở dạ dày và chúng có thể tồn tại trong nhiệt độ phòng vàingày Các vi rút này không bị hòa tan bởi các dung môi hữu cơ (như ether vàchloroform), cồn Tuy nhiên vi rút bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 56oC, khử trùngbằng chlo, formaldehyde và tia cực tím EV-A71 và các Enterovirus kháccũng đã được tìm thấy ở trên mặt nước, nước ngầm và trong suối nước nóng

Chu kỳ sống và sự nhân lên của vi rút: Chu kỳ sống của vi rút xảy rahoàn toàn trong tế bào chất Giống như các loài Enterovirus khác, chu kì saochép của EV-A71 tương tự như Polioviruses

- Hấp phụ và xâm nhập: Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ thích hợpnhờ các receptor đặc hiệu Vi rút xâm nhập theo cơ chế nhập bào thông quaclathrin (clathrin-mediated endocytosis)

- Dịch mã: Bộ gen ARN sợi (+) có trình tự nucleotide giống với trình tựcủa mARN nên có chức năng như mARN và được dịch mã thành polyprotein.Sau đó, nhờ protease phân cắt polyprotein thành các protein cấu trúc và cácprotein không cấu trúc (enzyme) để thực hiện các chức năng khác nhau

- Tổng hợp ARN của vi rút: ARN polymerase phụ thuộc ARN của vi rútdùng ARN sợi (+) để tạo ra ARN sợi (-) Sau đó, ARN polymerase phụ thuộcARN này lại dùng ARN sợi (-) làm khuôn để tạo ra nhiều bộ gen của vi rút làARN sợi (+)

- Lắp ráp và giải phóng: Các protein cấu trúc tham gia lắp ráp tạo capsid.

ARN của virion được đóng gói trong capsid và tạo thành hạt vi rút trưởng

thành Các hạt vi rút mới được tổng hợp sẽ được giải phóng bằng sự ly giảicủa tế bào vi rút được phóng thích tiếp tục lây nhiễm.

1.2.1 Phân loại

Sau khi được phân lập đầu tiên năm 1969, EV-A71 gây trên 28 dịchTCM vừa và nhỏ [11] Trong hơn 15 năm qua, các vụ dịch lớn ở khu vựcĐông Nam EV-A71 Dựa vào các kết quả giải tŕnh tự gen VP1 xác định có 4nhóm EV-A71 độc lập là A, B, C và D Các vi rút sẽ đươc xếp vào cùng mộtgenotype nếu có trình tự vùng gen VP1 giống nhau 92% trở lên Nhóm A códuy nhất chủng BrCr được phân lập ở Mỹ năm 1969 Trong vụ dịch nhỏ TCM

do EV-A71 tại Trung Quốc, có một chủng được xếp vào nhóm A, tuy nghiênnguồn gốc của vi rút này chưa rõ ràng [11]

Nhóm D có một chủng duy nhất được phân lập ở Ấn Độ năm 2002

Nhóm B được chia làm 6 dưới nhóm (subgenotype): B1–5 và B0 Giữa B1 vàB2 có 12% khác biệt về nucleotide Chủng B1 và B2 là các chủng lưu hànhmạnh vào những năm 1970 và 1980 [12] Chủng B3, B4, B5 được cho rằnglưu hành từ năm 1997[13] Chủng B5, lần đầu tiên được phân lập tại NhậtBản và Sarawak (Malaysia) vào năm 2003 Đây là căn nguyên tạo nên vụ dịch

ở B-ru-nây, Sarawak và Đài Loan năm 2006 Chủng B0 được mô tả, phân lập

ở Châu Âu từ 1963 đến 1967 [14]

Nhóm C cũng được chia thành 5 dưới nhóm (subgenotype): C1-5 C1được phân lập tại Châu Âu và Mỹ năm 1987 C2 mới nổi từ năm 1995 C3 –C5 liên quan đến những vụ dịch ở Nam Á từ năm 1997 [1] [15] Trong vụdịch TCM lớn nhất do EV-A71 gây ra ở Trung Quốc giữa năm 2008 có 201

chủng C4 được ghi nhận là lưu hành rộng rãi

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của EV-A71 [16]

Bộ gen của EV-A71 chứa một sợi dương ARN dài khoảng 7400nucleotid chưa tính phần PolyA Về mặt di truyền nó rất gần với CV-A16.Cấu trúc gen gồm vùng 5’-UTR, khung đọc mở (ORF) mã hóa mộtpolyprotein, 3’-UTR, phần PolyA

Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, tại đây có 6 cấu trúc mã hóa stem-looptrong đó stem-loop I là stem-loop hình lá tham gia vào quá trình tổng hợpARN của vi rút còn stem-loop II đến VI gồm các các trình tự tiếp nhậnribosome ở bên trong ((internal ribosome entry site – IRES) liên quan đếnquá trình dịch mã protein Vùng 5’-UTR của EV-A71 giống với polioviru và

có thể chia thành 3 vùng: vùng 5′ terminal cloverleaf vì nucleotide 1 đến 89hoặc 101 nucleotid, vùng IRES có kích thước từ nucleotide 123–126 đếnnucleotide 602–605, và vùng siêu biến đổi khoảng 120 nucleotid

Khung đọc mở mã hóa một polyprotein gồm protein cấu trúc P1 dài 2586nucleotid, protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt), tham gia vào

sự sao chép ARN của vi rút Polyprotein được chia thành 11 protein gồm 4protein capsid thuộc P1 là VP1, VP2, VP3, VP4 và 7 protein không cấu trúcgồm P2 có 2A, 2B, 2C và P3 có 3A, 3B, 3C, 3D [12] VP1, VP2, VP3 tạothành tiểu đơn vị pentamer, gồm 60 bản sao được kết nối để tạo thành capsid

có cấu trúc khối đa diện đều, các vùng này có nhiều các quyết định khángnguyên tuy nhiên các kháng thể trung hòa đã được xác định chủ yếu từ cáckháng nguyển của vùng VP1, trong khi đó VP4 gắn vào mặt trong của vỏcapsid Ở vùng 2A chứa gen mã hóa enzyme protease đóng vai trò trong sựphân cắt protein của tế bào vật chủ trong đó có dystrophin là thành phần chính

của tế bào cơ tim [17].

Vùng VP1 gồm 891 nucleotid, vùng này gây ảnh hưởng đáng kể đến sựbiến đổi về gen, về đặc điểm hình thái và thích hợp cho qua trình phát sinhloài của vi rút Vùng gen mã hóa protein VP1 được chứng minh là vùng genkháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của vi rút.Những đột biến trong vùng VP1dễ dẫn đến thay đổi thành phần acid amin vàđặc tính gây bệnh của vi rút, từ đó có thể hình thành biến chủng mới

Vùng không dịch mã 3’-UTRs (81nt) chứa 3 cấu trúc mã hóa stem-loop

X, Y, Z [18]

Phần PolyA gắn ở đầu 3’

Hình 1.1 Cấu trúc gen của EV-A71

Những đột biến chuỗi nucleotide trong 5’-UTR, VP3, và gen ARNpolymerase phụ thuộc ARN ở 3D đóng vai trò quan trọng trong cơ chế gâybệnh và gây độc thần kinh [19] Đột biến nucleotide từ vỏ capsid VP1, VP2

và một nucleotide trong stem-loop II của vùng 5’-UTR tăng khả năng nhiễmbệnh và tử vong [19]

1.3 Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) [20]

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được mã hóa trong phân tửADN (acid deoxynucleic), đây là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn đượctạo thành từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine)

và T (thymine) Các nucleotide này nối tiếp nhau theo một trình tự xác định,

và khác nhau ở từng loài, thậm chí ở từng các thể Giải trình tự ADN là kỹthuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C, G trên phân tửADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử

Hiện nay, giải trình tự gen đang là xu thế phát triển và được ứng dụng caotrong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như giải trình tự để định danh,định type vi khuẩn, vi rút, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác định đột biếngen, ứng dụng trong sản xuất vắc-xin, điều trị đích ung thư Các phươngpháp giải trình tự cổ điển luôn bị hạn chế bởi nhiều mặt như thời gian, sốlượng, quy mô, độ phân giải, cản trở các nhà khoa học có được những thông

tin quan trọng từ nghiên cứu của họ Để khắc phục những hạn chế đó, đòi hỏi

sự ra đời của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) Hệ thống NGS thương mạixuất hiện đầu tiên năm 2005 bởi 454 Life Sciences Với cách tiếp cận giảitrình tự hoàn toàn khác, giải trình tự gen thế hệ mới đã tạo ra một cuộc cáchmạng mang tính đột phá trong nghiên cứu về hệ gen

Nguyên lý của giải trình tự gen thế hệ mới tương tự với phương phápSanger đều dựa vào giải trình tự các đoạn ADN nhỏ, các đoạn này được pháthiện dựa vào tín hiệu phát ra từ các đoạn bổ sung được tổng hợp từ sợi ADNkhuôn Giải trình tự gen thế hệ mới có hơn 1 triệu các phản ứng diễn ra songsong tạo ra hàng trăm gigabase trong dữ liệu của một trình tự và cho phép giảitrình tự nhanh chóng một lượng lớn các cặp base của toàn bộ bộ gen Với khảnăng giải trình tự nhanh, giải trình tự gen thế hệ mới cho phép giải trình tựđầy đủ bộ gen trong vài giờ hoặc vài ngày

NGS gồm 3 bước

- Chuẩn bị thư viện: Trong bước này các đoạn ADN có độ dài phù hợp đượcchuẩn bị bằng cách cắt đứt các phân tử ADN dài hoặc tổng hợp các đoạnADN ngắn (bằng PCR hoặc lai)

- Gắn ADN và làm giàu: Các phân tử được gắn với mồi dùng để tách thànhcác đoạn ngắn đơn, được cố định vào một chất nền, mỗi phân tử dạng đơnđóng vai trò như một mẫu cho sự khuếch đại

- Giải trình tự ADN: Sự trùng hợp ADN kết hợp với đọc trình tự

NGS ngày càng phát triển và ứng dụng nhiều vào các lĩnh vực đặc biệt là

nghiên cứu bộ gen của vi sinh vật giúp con người ngày càng hiểu rõ hơn về sự

đa dạng sinh thái, tiến hóa, hoạt động của vi sinh vật từ đó chúng ta có thểkiểm soát được sự bùng phát của các tác nhân gây bệnh NGS có tính ứngdụng rất to lớn trong lĩnh vực vi rút học Những tiến bộ trong công nghệ NGS

có thể cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin bao gồm định danh chính xác virút, xác định chính xác đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen và đường lây truyềncủa chúng trong bệnh viện, trong cộng đồng cũng như độc lực của các loại virút này Do đó, công nghệ NGS sẽ giúp tăng cường điều tra dịch tễ học của vụdịch, từ đó áp dụng các biện pháp kiểm soát để can thiệp kịp thời tại bệnhviện và tại cộng đồng Ngoài ra, thông tin từ các kết quả nghiên cứu giúp chocác nhà lâm sàng quản lý, chăm sóc một cách tốt nhất bệnh nhân NGS có thểđược sử dụng để phát hiện và giám sát kháng thuốc, kể cả trong việc đánh giá

và sử dụng các thuốc kháng vi rút mới, giúp cho các nhà hoạch định chínhsách xây dựng và phát triển các chiến lược quốc gia về giám sát tình trạngkháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng

Kỹ thuật NGS giúp định danh rất chính xác các vi rút mới nổi trongnhững mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân, động vật như phát hiện một Arena virusmới có liên quan đến nhóm các bệnh nhân ghép tạng, Bundibugyo Ebolavirus,xác định căn nguyên vi rút gây bùng phát các dịch bệnh NGS còn ứng dụngtrong nghiên cứu đặc điểm bộ gen, phân biệt những kiểu gen khác nhau dựatrên sự khác nhau ở một số nucleotide trong cùng một gen Xác định kiểu gengiúp nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền nhiễm.Một trong những ứng dụng phổ biến của NGS tái thiết lập bộ gen của vi rútnhư các vi rút cúm gây đại dịch, vi rút HIV, vi rút Herpes Bên cạnh đó, NGScòn giúp nghiên cứu giúp phát hiện các đột biến nucleotide tồn tại trong quầnthể [21], mà không một kỹ thuật nào có thể xác định được Nghiên cứu về bộ

gen của HCV cho thấy có thể tồn tại 2 đến 3 đột biến trên một gen, đây là mộttrong những nguyên nhân giúp vi rút thoát được sự đáp ứng miễn dịch và liệupháp điều trị Một trong những ứng dụng điển hình của NGS là phát hiện cácđôt biến kháng thuốc của vi rút như đột biến kháng thuốc xảy ra trên gen Ncủa vi rút cúm, đột biến kháng thuốc do đột biến vùng ADN Polymerase của

vi rút viêm gan B, nghiên cứu đột biến kháng thuốc, tính đa hình quần thể của

vi rút HIV [22], sự thoát đáp ứng miễn dịch của vi rút [23] [24], xác định cácchủng lưu hành của một số vi rút gây dịch, đóng vai trò quan trọng trong việcsản xuất các vắc xin phòng bệnh

1.4 Các nghiên cứu ứng dụng NGS đối với EV-A71

EV-A71 vẫn là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe trẻ sơ sinh và trẻnhỏ Do đó sự hiểu biết về bộ gen của EV-A71 là rất cần thiết Từ khi ra đời,

kỹ thuật NGS được ứng dụng nghiên cứu bộ gen của EV-A71, Le Van Tan vàcộng sự đã giải trình tự toàn bộ bộ gen của 22 mẫu bệnh phẩm dương tính vớiEV71 tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có 107 vị trí có những biến đổinhỏ (10 – 15 biến đổi/ mẫu) [25] Năm 2014 Long Chen và cộng sự đã tiếnhành giải trình tự toàn bộ bộ gen của 7 chủng EV-A71 gây tử vong ở ThâmQuyến, Trung Quốc năm 2014 và cho thấy bộ gen của các chủng này chiềudài 7,405 nucleotides (nt), chưa tính chiều dài của đuôi poly(A), vùng 5’UTR

742 nt, tiếp theo là khung đọc mở mã hóa cho protein cấu trúc P1(2,586 nt),protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt) và 3-UTR (81nt) Tỷ lệcác nucleotide A, C, G, and U của 7 bộ gen của EV-A71 lần lượt là 27,05 –27,27%, 23,97 – 24,19%, 23,70 – 23,92%, và 24,83 – 25,02%, tỷ lệ G+C là47,67 – 48,11%, các chủng này có mối quan hệ rất gần với các chủng EV-A71 địa phương Các chủng này thuộc chủng C4a [16] Chia-Pei Lin và cộng

sự đã giải trình tự toàn bộ một chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Đài Loan và

cho thấy: bộ gen của chủng này có 7,262 nt bao gồm cả phần poly(A), vùng5’UTR có 665 nt, tiếp đó là khung đọc mở, P1 (2,586 nt), P2 (1,734 nt), P3(2,259 nt), 3’UTR (18 nt) Tỷ lệ A, U, G, và C lần lượt là 27,2%, 24,9%,23,8%, và 24,2%, với G+C là 48,0% [26] Nghiên cứu của Wen HL và cộng

sự trên 6 chủng ở Trung quốc cho thấy có 298 vị trí biến đổi, trong đó có 3 vịtrí (Val(P814)/Ile(P814) ở VP1, Val(P1148)/Ile(P1148) ở 3A và Ala(P1728)/Cys)/Val(P1728) ở 3C) được bảo tồn ở các chủng gây độc thần kinh và có sựbiến đổi xảy ra ở cấu trúc thứ cấp của 5’-UTR John và cộng sự đã giải trình

tự 14 chủng EV-A71 gây dịch TCM ở Thái Lan năm 2012 – 2014 và đánh giá

sự đa dạng của các chủng lưu hành Sự đa dạng về các nucleotide lớn nhất làgiữa chủng phân lập từ bệnh nhân tử vong và các chủng khác và phát hiện có

sự tái tổ hợp di truyền [27] Năm 2014 Long Chen và cộng sự đã tiến hànhgiải trình tự toàn bộ bộ gen của 7 chủng EV-A71 gây tử vong ở Thâm Quyến,Trung Quốc năm 2014 và cho thấy các chủng này có mối quan hệ rất gần vớicác chủng EV-A71 địa phương, các chủng này thuộc týp C4a [16]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Xét nghiệm – bệnh viện Bệnh Nhiệtđới Trung ương từ 3/2016 đến 12/2016

2.1.2 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

- Tiêu chuẩn chọn mẫu:

 20 chủng EV-A71 phân lập từ bệnh nhân TCM do EV-A71 từ vụ dịchnăm 2011 đến 2013, được lưu giữ tại Khoa Xét Nghiệm – Bệnh việnBệnh Nhiệt đới Trung ương

 Các chủng này được phân lập từ bệnh nhân được chẩn đoán bệnh TCM

có phân độ lâm sàng từ 2b trở lên

Đây là các chủng được phân lập trong Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứuĐặc điểm lâm sàng, Dịch tễ học, Phương pháp chẩn đoán, Điều trị, Dự phòngBệnh Tay Chân Miệng tại Việt Nam và Đề xuất chủng vi rút để sản xuất vắcxin” năm 2011 - 2013 của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ

- Máy chạy PCR, Biorad, Mỹ

- Máy đo nồng độ ADN Cubit, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Mỹ

- Máy giải trình tự gen thế hệ mới Miseq, Illumina, Mỹ

- Giá từ

- Block nhiệt

- Ống Eppendoft 1,5ml free-ARN

- Plate 96 giếng 0,3ml, miếng dán Microseal B

- Đầu côn, Pippet các cỡ 10µl, 100µl, 1000µ

- Găng tay, khẩu trang

2.2.2 Sinh phẩm hóa chất

2.2.2.1 Hóa chất tách ARN: QIAamp viral ARN extraction kit (QIAGEN) 2.2.2.2 Hóa chất đánh giá ADN bằng máy Qubit: Qubit Working Solution

gồm 1µl QuBit reagent và 199 µl QuBit Buffer

2.2.2.3 Bộ kit chuẩn bị thư viện

Bộ TruSeq Strand mARN LT sample Prep (ILMN) Gồm các hóa chấtHóa chất tinh sạch, cắt ARN

 Bead Binding Buffer (BBB)

 Bead Washing Buffer (BWB)

 Elution Buffer (ELB)

 Fragment, Prime, Finish Mix (FPF)

 Resuspension Buffer (RSB)

 ARN Purification Beads (RPB)

- Hóa chất tổng hợp chuỗi cDNA thứ nhất (st cDNA)

 First Strand Synthesis Act D Mix (FSA)

 Episcrip reverse transcriptase enzyme (Epicenter)

- Hóa chất để tổng hợp chuỗi cDNA thứ 2 (ds cDNA)

 Resuspension Buffer (RSB)

 Second Strand Marking Master Mix (SMM)

 AMPure XP Beads 90µl/ mẫu

 Ethanol (EtOH) 80%

- Hóa chất gắn đuôi PolyA ở đầu 3’: A-Tailing Mix (ATL)

- Hóa chất gắn adapter

 Resuspension Buffer (RSB)

 TruSeq Stranded mARN LT Sample Prep Kit contents:

 ARN Adapter Indices (AR001–AR016, AR018– AR023, AR025, AR027

 Ligation Mix (LIG)

 Resuspension Buffer (RSB)

 Stop Ligation Buffer (STL)

- Hóa chất làm giàu cDNA

Tween 20

2.2.2.4 Hóa chất chạy máy Miseq

Bộ MiSeq Reagent kit 300 cycle V2 gồm các hóa chất: ReagentCartridge, HT1, lọ dung dịch PR2, MiSeq Flow Cell

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Mô tả, phân tích dữ liệu phòng xét nghiệm

2.3.1 Quy trình kỹ thuật: theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit TruSeq Strand

mARN LT sample Prep (ILMN)

Chủng được

lưu giữ bảo

ở -800C

Tách ARN

Chuẩn bị thư viện

Trộn các mẫu lại với nhau

Tổng hợp cDNA thứ 2

Đưa mẫu vào máy Miseq

Gắn đuôi Poly A vào đầu 3’

Gắn index-adapter

Làm giàu các đoạn ADN

Định lượng thư viện

Sơ đồ 2.1 Quy trình kỹ thuật.

2.3.1.1 Bảo quản chủng vi rút EV-A71

Các chủng đươc lưu giữ dưới dạng huyền dịch trong ống cryotube 2mltrong môi trường bảo quản thích hợp

Tổng hợp cDNA thứ 2

Gắn đuôi Poly A vào đầu 3’

Gắn index-adapter

Làm giàu các đoạn ADN

Định lượng thư viện

- Cho 140 µl dịch vi rút nuôi cấy vào ống đã có chứa hỗn hợp AVL vàcarrier ARN, trộn đều.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

- Thêm 560 μl of Ethanol (96–100%) vào hỗn hợp trên, trộn đều

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp lên cột lọc, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút,chuyển cột lọc sang ống hứng mới

- Cho 500 AW1 vào cột lọc, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, chuyển cộtlọc sang ống hứng mới

- Cho 500 AW2 vào cột lọc, ly tâm 14000 rpm trong 3 phút, chuyển cộtlọc sang ống hứng mới

- Ly tâm khan với tốc độ 15000 rpm trong 1 phút

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml, cho 60 µl dung dịch AVE vào, ủ ởnhiệt độ phòng trong 1 phút

- Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, vứt bỏ cột lọc, cất ARN trong tủ -200C

2.3.1.3 Chuẩn bị thư viện

 Tinh sạch, cắt ARN thành các đoạn ngắn

Quy trình

- Tạo plate RBP

 Rã đông hóa chất ở nhiệt độ phòng, tạo Plate dán nhãn RBP

 Cho 50µl ARN mỗi mẫu vào mỗi giếng

 Cho 50 µl dung dịch RPB vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều

 Dán plate bằng miếng Microseal B

 Ủ plate RBP ở 650C trong 5 phút, giữ ở 40C, ngay sau khi plate đạt

40C, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi

- Rửa RBP

 Bỏ miếng dán, đặt plate lên giá từ

 Cho 200 µl dung dịch BWB vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều, để

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, nhấc plate khỏi giá từ, hút bỏ dịch nổi

 Thêm 50µl dung dịch EB vào mỗi giếng, trộn đều

 Ủ plate ở 80oC trog 2 phút, giữ ở 25oC

- Tạo RFB

 Thêm 50µl dung dịch BBB vào mỗi giếng của plate RBP, dùng

pippet trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

 Đặt plate RBP lên giá từ trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi

 Thêm 200 µl BWB vào mỗi giếng của plate RBP, dùng pippet trộn đều

 Đặt plate ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, nhấc platekhỏi giá từ

 Thêm 19,5 µl dung dịch FPF vào mỗi giếng của plate RBP, dùngpippet trộn đều

 Dán plate bằng miếng Microseal B

- Ủ RFP: ủ plate RBP ở 940C trong 8 phútgiữ ở 40C Ngay khi plate đạt

40C thì nhấc plate RBP ra

 Tổng hợp chuỗi cDNA thứ nhất (st DNA)

- Tạo CDP

 Rã đông và vortex hóa chất First Strand Synthesis Act D Mix (FSA)

ở nhiệt độ phòng, tạo plate dán nhãn CDP

 Bỏ miếng dán ở plate RBP, đặt plate lên giá từ, giữ ở nhiệt độ phòngtrong 5 phút

 Chuyển 17 µl dịch nổi từ plate RBP sang plate CDP

 Thêm 50µl EpiScript™ Reverse Transcriptase vào ống chứa FirstStrand Synthesis Act D Mix, sau đó thêm 8µl hỗn hợp này vào mỗigiếng của plate CDP, dùng pippet trộn đều

- Tạo quy trình nhiệt để tổng hợp chuỗi st cADN

Giữ ở 40C

 Tổng hợp chuỗi cDNA thứ 2 (ds cDNA)

- Rã đông hóa chất ở nhiệt độ phòng Tạo một plate có dán nhãn CCP

- Tinh sạch CDP

 Cho 90 µl hỗn hợp AMPure XP beads vào mỗi giếng của plate CCP

 Chuyển toàn bộ hỗn hợp của plate CDP sang các giếng của CCP

 Dán đĩa CCP, lắc ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó ly tâm 280g

x 1 phút, bỏ miếng dán

 Đặt plate CCP lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Hút bỏ 135 µl dịch nổi từ mỗi giếng của plate CCP

 Thêm 200 µl dung dịch Ethanol 80% vào mỗi giếng, để 30s ở nhiệt

độ phòng, hút bỏ dịch nổi Thực hiện bước này 2 lần

 Để plate CCP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, cho khô

 Thêm 17,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng, dán plate CCP, lắc1800rpm trong 2 phút, sau đó ly tâm 280g x 1 phút, để ở nhiệt độphòng trong 2 phút, gỡ bỏ miếng dán

 Đặt plate CCP lên giá từ trong 5 phút, tạo một plate dán nhãn ALP

 Chuyển 15 µl dịch nổi (ds cADN) từ mỗi giếng của plate CCP sangplate ALP mới

 Gắn đuôi Poly A ở đầu 3’

- Rã đông và vortex hóa chất ở nhiệt độ phòng: A-Tailing Control(CTA), A-Tailing Mix (ATL)

- Thêm 2,5µl dung dịch RSB vào mỗi giếng của plate ALP, 12,5 µl dungdịch ATL, dùng pippet trộn đều, dán plate ALP

- Ủ plate ALP: cài đặt quy trình nhiệt

- Ly tâm plate ALP ở 280g x 1 phút

- Ủ plate ALP ở 300C trong 10 phút, bỏ miếng dán.

- Thêm 5µl dung dịch STL vào mỗi giếng, dùng pippet trộn đều

- Tinh sạch plate ALP

 Cho 42 µl dung dịchAMPure XP Beads vào mỗi giếng của PlateALP, dùng pippet trộn đều

 Để plate ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó đặt plate lên giá từtrong 5 phút

 Hút bỏ 79,5 µl dịch nổi

 Đặt plate lên giá từ, thêm 200µl Ethanol 80% vào mỗi giếng, để ởnhiệt độ phòng 30 giây, hút bỏ dịch nổi Thực hiện bước này 2 lần

 Để plate ALP ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, nhấc plate ra khỏi giá từ

 Thêm 52,5 µl dung dịch RSB vào mỗi giếng ALP, dùng pippet trộnđều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút

 Đặt plate lên giá từ, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Chuẩn bị một plate mới ghi nhãn CAP, chuyển 50 l dịch từ plateALP sang các giếng của plate CAP

 Thêm 50 µl dung dịch AMPure XP Beads vào các giếng của plate