NGHIÊN cứu một số đặc điểm PHÂN tử GEN m của VIRUS HANTA TRÊN CHUỘT tại một số điểm ở hà nội từ 2015 2017

ĐẶT VẤN ĐỀVirus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae truyền bệnh sang người chủ yếu qua các loài động vật gặm nhấm, đặc biệt là chuột do bị cắn hoặctiếp xúc trực tiếp với các ch

 TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh, Phó Giám Đốc Trung tâm Kiểm soát

bệnh tật thành phố Hà Nội Cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học, đã trực tiếp hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu, đã chỉ bảo cho tôi ngày càng trưởng thành hơn về cách sống, về tư duy khoa học Và để có thể hoàn thành luận văn này, cô là người đã tạo rất nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi.

 TS BS Phạm Hồng Nhung, Phó chủ nhiệm bộ môn Vi Sinh trường

Đại học Y Hà Nội Cô đã truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức, tác phong khoa học

mà không phải ai cũng có được.

 Ths Nguyễn Vĩnh Đông - phòng thí nghiệm Dại và các lyssavirus, khoa

Vi rút, Ths Phan Hà Mỵ - phòng chẩn đoán Sinh Học Phân Tử Viện Vệ Sinh Dịch

Tễ Trung Ương đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Vi Sinh, trường

Đại học Y Hà Nội đặc biệt là TS Trần Minh Châu đã tận tình giảng dạy, dìu dắt

tôi ngay từ những ngày đầu tiên học tập tại bộ môn cũng như trong suốt thời gian học tập

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị tại khoa Xét nghiệm, Trung tâm kiểm soát bệnh tật thành phố Hà Nội đã giúp đỡ, ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng tri ân tới gia đình, những người đã luôn hỗ trợ

về mọi mặt, tạo điều kiện để tôi có thể yên tâm trên con đường học tập của mình.

Đặc biệt cảm ơn đến gia đình nhỏ của tôi vẫn đã, đang và sẽ luôn bên tôi động

viên, chia sẻ những khó khăn và hạnh phúc trong cuộc sống.

Hà Nội, tháng 09 năm 2018 Bùi Thị Huyền My

Tôi là Bùi Thị Huyền My, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Phạm Hồng Nhung

2 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được sự chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin cam đoan những điều trình bày ở trên là hoàn toàn trung thực và chính xác.

Hà Nội, ngày 16 tháng 9 năm 2018

Bùi Thị Huyền My

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về virus Hanta 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.2 Bệnh do virus Hanta 3

1.1.3 Tình hình dịch tễ thế giới và Việt Nam 6

1.1.4 Đặc điểm virus học 12

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán virus Hanta 17

1.2 Kĩ thuật Sequencing 18

1.3 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta 19

1.3.1 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta trên thế giới 19

1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền và phân loài virus Hanta tại Việt Nam 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Sinh phẩm hóa chất và trang thiết bị 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.5 Đạo đức nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Đặc điểm của mẫu nghiên cứu 34

3.2 Kết quả phân tích đặc điểm nucleotitde và acid amin của các chủng virus Hanta phân lập trên chuột tại Hà Nội từ 2015-2017 37

3.2.1 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của các chủng phân lập trên chuột tại Hà Nội với các chủng trong khu vực 37

3.3 Cây gia hệ của các virus Hanta lưu hành tại Việt Nam và một số nước trong khu vực châu Á và trên thế giới 48

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 50

4.1 Một số đặc điểm của mẫu 504.2 Đặc điểm phân tử đoạn gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội từ 2015-2017 524.3 Phân loài và phát sinh loài của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở

Hà Nội từ 2015-2017 dựa vào phân tích đoạn gen M 55

KẾT LUẬN 62 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viết tắt

Phiên ÂmTiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt

BCCV Black Creek Canal Virus VirusBlack Creek Canal

DNA Deoxyribose Nucleic Acid Deoxyribose Nucleic Acid

HFRS Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Sốt xuất huyết có hội chứng Thận HPS Hantavirus Pulmonary Syndrome Hội chứng Phổi do virus Hanta

ICTV International Committee on Taxonomy

of Viruses

Ủy ban phân loại virusQuốc tế

NCR Non Coding Region Vùng không mã hóa

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở

RNA Ribonucleic Acid Ribonucleic Acid

THAI

V

Bảng 1.1 Sự phân bố địa lý của các virus Hanta gây bệnh và các vật chủ 10

Bảng 1.2 Trình tự mồi của kĩ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta 17

Bảng 2.1 Trình tự mồi của kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta 25

Bảng 3.1 Phân bố mẫu theo địa điểm thu thập 34

Bảng 3.2 Phân bố chuột nhiễm virus Hanta theo loài và năm thu thập 36

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide và acid amin của các chủng Hanta phân lập trên chuột tại Hà Nội 2015-2017 so với các chủng trong nước và các chủng trong khu vực 38

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố chuột nhiễm virus Hanta theo thời gian trong năm 37

Hình 1.1 Phân bố của các hội chứng do virus Hanta 8Hình 1.2 Virus Hanta dưới kính hiển vi điện tử 13Hình 1.3 Cấu trúc virus và hệ gen của virus Hanta 14Hình 1.4 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào chủ của virus Hanta16Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100 19Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 28Hình 3.1 Bản đồ phân bố chuột nhiễm virus Hanta tại một số điểm ở Hà

Nội, năm 2015 - 2017 35Hình 3.2 Phân tích một số đột biến nucleotide của các chủng virus Hanta

phân lập trên chuột tại Hà Nội 2015-2017 43Hình 3.3 Phân tích một số đột biến nucleotide của các chủng virus Hanta

phân lập trên chuột tại Hà Nội 2015-2017 44Hình 3.4 Phân tích một số đột biến acid amin của các chủng virus Hanta

phân lập trên chuột tại Hà Nội 2015-2017 45Hình 3.5 Bản đồ phân bố các đột biến nổi trội của các chủng virus Hanta

thu được tại Hà Nội từ 2015-2017 47Hình 3.6 Cây gia hệ của các chủng virus Hanta kèm đột biến 48Hình 4.1 Cây gia hệ của các virus Hanta dựa trên trình tự nucleotide gen S 57Hình 4.2 Cây gia hệ của các virus Hanta gây ra các hội chứng khác nhau

được xây dựng dựa trên trình tự gen S 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae truyền bệnh sang

người chủ yếu qua các loài động vật gặm nhấm, đặc biệt là chuột do bị cắn hoặctiếp xúc trực tiếp với các chất tiết (phân, nước tiểu) của các động vật này [1].Thể nặng của bệnh có biểu hiện dưới 2 Hội chứng là Hội chứng Thận (HFRS)với tỷ lệ tử vong là 15% và phổi (HPS) có tỷ lệ tử vong lên tới 50% [2]

Bệnh do virus Hanta đã được ghi nhận ở tất cả các châu lục Mỗi loàivirus truyền bệnh cho người thông qua một vật chủ xác định và phân bố theovùng địa lý khác nhau, chính vì vậy sự phân bố của HFRS và HPS cũng bịgiới hạn theo sự phân bố địa lý của các loài động vật gặm nhấm TheoMohammed Mir, phần lớn virus trong các phân họ Neotominae vàSigmodontinae gây ra HPS nặng với tỷ lệ tử vong cao (40-50%), những virusnày được phân bố khắp Bắc và Nam Mỹ trong các loài gặm nhấm khác nhau[2] Châu Á là châu lục có lịch sử lâu đời nhất về nhiễm virus Hanta VirusHTNV và Seoul (SEOV) là những tác nhân chính gây ra HFRS ở châu Á vớikhoảng 300-500 ca tử vong do HFRS được báo cáo hàng năm, trong đó 1-4%

ở Hàn Quốc [3], [4] Tại Việt Nam và Singapore, tỷ lệ chuột có kháng thểdương tính với virus từ 14-34% [5] Ở nước ta cũng đã có những báo cáo vềHội chứng Thận do virus Hanta Hà Nội là trung tâm kinh tế, văn hóa, chínhtrị của cả nước,sự giao thương rất lớn do đó, các quần thể chuột cũng có thể

dễ dàng xâm nhập và mang theo mầm bệnh khác nhau trong đó có virus Hanta

Vì vậy việc chủ động giám sát bệnh trên chuột trong đó có virus Hanta và làquan trọng để có những biện pháp phòng bệnh chủ động hiệu quả Đồng thời,việc nghiên cứu sâu hơn về phân loài của virus từ đó có thể xác định nguồn gốccủa virus là nội địa hay xâm nhập là vô cùng quan trọng giúp cho công tácphòng chống, đồng thời cũng cung cấp cơ sở dữ liệu gen của virus Hanta trongngân hàng gen thế giới để các nhà khoa học nghiên cứu và tham khảo

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm

phân tử gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội từ

2015 – 2017” với các mục tiêu sau:

1: Mô tả một số đặc điểm phân tử (nucleotide và acid amin) gen M của virus Hanta trên chuột tại một số điểm ở Hà Nội 2015-2017 2: Phân tích loài, phát sinh chủng loài của virus Hanta phân lập được tại Hà Nội, năm 2015 - 2017 dựa trên phân tích đoạn gen M

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về virus Hanta

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Virus Hanta thuộc giống Hantavirus, họ Bunyaviridae Có một số ý kiến

cho rằng một loại bệnh với các triệu chứng tương tự hội chứng HFRS đượcghi chép trong y văn của người Trung Quốc từ những năm 960 [31] Vào thế

kỉ 15 ở Anh, người ta cũng ghi nhận một chứng bệnh bí ẩn và được cho là phùhợp với triệu chứng do virus Hanta gây nên Người bệnh xuất hiện tình trạngmệt mỏi và đổ rất nhiều mồ hôi, dịch bệnh bùng phát với 5 đợt lớn vào cácnăm 1485, 1508, 1517, 1528 và 1551 [6] Thực tế, HFRS lần đầu tiên đượcphát hiện và ghi nhận trong cuộc chiến tranh Triều tiên (1951 – 1954), bệnh

đã khiến hơn 3000 binh lính Liên Hợp Quốc phải nhập viện Tuy nhiên, tácnhân gây bệnh vẫn chưa được tìm ra mãi cho đến 25 năm sau đó Vào năm

1978, nguyên nhân gây ra HFRS được xác định là virus Hanta, phân lập từ

loài chuột Apodemus agrarius bên bờ sông Hantaan thuộc Nam Triều Tiên,

chính vì vậy tác nhân được đặt theo tên con sông là Hantaan virus

Năm 1993, sự bùng phát các trường hợp suy hô hấp bất thường, sau này gọi

là HPS ở vùng Bắc Mỹ khiến nhiều người tử vong Sau đó, chỉ trong khoảng

thời gian ngắn, virus gây ra HPS được phân lập từ loài Peromyscus maniculatus

và sau đó đặt tên là virus SNV [7]

1.1.2 Bệnh do virus Hanta

a Nguồn lây và phương thức truyền bệnh

Nguồn lây truyền

Virus Hanta lây truyền bệnh cho người qua vật chủ chứa thường là cácđộng vật gặm nhấm với các loài tiêu biểu có mặt hầu hết ở các nơi trên thếgiới Ngoại trừ virus Puumala được phát hiện ở chuột đồng lông đỏ-nâu thì

hầu hết các virus Hanta gây bệnh cho người đều liên quan tới chuột nhắt vàchuột cống [8] Virus Hanta gây ảnh hưởng rất ít đến vật chủ chứa của chúng,các báo cáo thử nghiệm cho thấy virus Hanta hầu như không gây nên triệuchứng bệnh nào trên chuột Mặc dù vậy virus có thể được phát hiện trên rấtnhiều loại mô của cơ thể vật chủ chứa như phổi, lá lách, gan, tụy, tuyến nướcbọt, thận, não [9] Chính vì vậy ổ chứa virus là yếu tố quan trọng trong côngtác kiểm soát dịch bệnh do virus Hanta gây nên

Biểu hiện lâm sàng bệnh do virus Hanta

Tùy thuộc vào thể bệnh nặng hay nhẹ mà bệnh nhân có những biểu hiệnlâm sàng khác nhau Nếu ở dạng thể nhẹ, bệnh nhân có các triệu chứng nhưcảm cúm bao gồm sốt, nhức đầu, đau cơ bắp, thường ở đùi, lưng và hông Ởthể nặng, bệnh nhân có biểu hiện giảm tiểu cầu, xuất huyết, khó thở, suy hôhấp và suy thận, nếu không được điều trị kịp thời, người nhiễm bệnh có thể tửvong Thể nặng thường biểu hiện dưới hai hội chứng đó là sốt xuất huyết hộichứng thận (HFRS) và hội chứng phổi do virus Hanta (HPS), các thể này có

tỷ lệ tử vong cao, từ 35 - 50% [2], [11], [13], [14]

Bảng 1.1 Các giai đoạn điển hình, triệu chứng và biến chứng của HFRS [14], [15], [31]

Các đặc điểm chủ

Lượng nước tiểu giảm

Lượng nước tiểu tăng

- Rò rỉ mao mạch

- Có các triệu chứng liên quan đến đau phổi

- Lượng nước tiểu dưới 100ml/ ngày

HPS được nhắc đến như bệnh cấp tính nguy hiểm bởi sự khởi phátnhanh chóng của suy hô hấp và sốc tim với tỉ lệ tử vong khoảng 40% [2],[13] HPS mang một số đặc điểm tương đồng với HFRS bao gồm các triệuchứng về sốt, giảm tiểu cầu và bạch cầu, trừ đích tác động là phổi gây ra rò rỉmao mạch thay vì thận như HFRS mặc dù cũng có một số vấn đề liên quan tớithận nhận thấy ở một số ca mắc HPS Về cơ bản, các giai đoạn mắc HPS đượcchia thành ba giai đoạn, bao gồm: (1) giai đoạn sốt, (2) giai đoạn liên quanđến giảm chức năng phổi, tim và cuối cùng là (3) giai đoạn hồi phục Tại mỗigiai đoạn, biểu hiện bệnh sẽ xuất hiện khác nhau tùy thuộc vào loại virusmắcphải Giai đoạn sốt thường kéo dài từ 3 đến 5 ngày với một số triệu chứng liênquan đến đường hô hấp tuy nhiên không bao gồm ho và viêm mũi Sau đó,bệnh nhân thường phát triển đến giai đoạn có những triệu chứng liên quan đếnđường tiêu hóa như đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn và nôn [8], [9] Các dấuhiệu đánh dấu sự bắt đầu của giai đoạn liên quan đến phổi bao gồm sự xuấthiện của các cơn ho, thở nhanh, nhịp tim tăng Ở giai đoạn này, có thể thấygiảm số lượng tiểu cầu, giảm mức protein, tăng dung tích hồng cầu và pháthiện sự hoạt động của các tế bào lympho Diễn biến của HPS thường rất nguycấp, từ 1 đến 3 ngày sau khi xuất hiện những triệu chứng liên quan đến đường

hô hấp, bệnh sẽ phát triển những hội chứng rò rỉ trong mao mạch phổi, từ đódẫn đến suy hô hấp kéo theo sốc tim Thông thường các bệnh nhân HPS nhậpviện khi đã có triệu chứng khó thở, mất bù cấp hô hấp và xuất hiện phù phổi, giaiđoạn này thường kéo dài khoảng 3 – 4 ngày nhưng cũng có một số bệnh nhân tửvong ngay sau khi nhập viện vài giờ Tuy nhiên, đối với các bệnh nhân ở thể HPSsau khi hồi phục, thường không gây ra các di chứng lớn [14], [15]

1.1.3 Tình hình dịch tễ thế giới và Việt Nam

Tình hình dịch tễ bệnh do virus Hanta trên thế giới và Việt Nam

Virus Hanta có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau, điển hình cho thể

nặng của bệnh là hai hội chứng chính HPS và HFRS HFRS được mô tả lầnđầu vào cuối thế kỉ 20 ở châu Á và châu Âu trong khi HPS được công nhận làmột hội chứng lâm sàng thực thể từ năm 1993 khi xuất hiện dịch ở Tây báncầu Trên toàn thế giới, mỗi năm có khoảng 150.000 đến 200.000 ca nhậpviện, hầu hết xảy ra ở các nước đang phát triển [11] Tỷ lệ tử vong do HFRS

từ 1-12% tùy virus HPS là một vấn đề sức khoẻ cộng đồng, đặc biệt là ở Nam

Mỹ, nơi có sự gia tăng số ca bệnh HPS được báo cáo mỗi năm Từ khi HPSlần đầu tiên được công nhận do virus Hanta ở vùng Bốn góc của Mỹ vào năm

1993, các trường hợp lâm sàng cũng đã được xác nhận ở châu Mỹ tạiArgentina, Bolivia, Brazil, Canada, Chilê, Panama, Paraguay, Mỹ và Uruguayvới hơn 2.000 các trường hợp HPS được ghi nhận ở khu vực châu Mỹ [12],[13] Mặc dù HPS có tỷ lệ mắc nhỏ hơn nhiều với khoảng 200 trường hợpmỗi năm tại Mỹ nhưng tỷ lệ tử vong tới 40-50% [11], [2] Tại châu Á, cáctrường hợp lâm sàng của hội chứng HFRS chủ yếu do virus HTNV và virusSeoul (SEOV) xảy ra chủ yếu tại Trung Quốc và Hàn Quốc và vùng ViễnĐông của Liên Bang Nga Tại Trung Quốc, mỗi năm có hơn 1.400.000 trườnghợp với khoảng 45.000 người tử vong trong giai đoạn 1950 – 2001 làm chonước này trở thành quốc gia đặc hữu của HFRS, chiếm 70 – 90% các caHFRS trên toàn thế giới [14], [15]

Hình 1.1 Phân bố của các hội chứng do virus Hanta

Ở Việt Nam, năm 1986 Rollin và cộng sự bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnhquang gián tiếp đã tìm thấy 4.5% (8/146) kháng thế kháng virus trên nhómbệnh nhân nghi ngờ nhiễm virus Arbo tại Hà Nội [16] Theo nghiên cứu củaHoàng Thủy Nguyên và cộng sự trong năm 1998- 1999 [17], bằng kĩ thuậtngưng kết hạt (Hantadia) đã thấy 4.03 % (5/124) mẫu huyết thanh người và3.07% (1/27) mẫu huyết thanh chuột có kháng thể kháng với virus Hanta.Theo báo cáo của viện Pasteur, đã có nhiều trường hợp xuất hiện hội chứngHFRS tại thành phố Hồ Chí Minh Virus Hantan cũng đã thấy ở loàichuột Rattus Norvegicus ở một số tỉnh miền Bắc Đã có 11 chủng của ViệtNam được đăng ký tại Ngân hàng gen Quốc tế trong đó 10 chủng có cấu trúcgen thuộc chủng vùng Seoul, đặc biệt năm 2007 đã phát hiện một virus mớitại tỉnh Cao Bằng và được đặt tên là virus CBVN Tại Hà Nội đến nay chưaphát hiện trường hợp nào nhiễm virus Hanta nhưng kết quả nghiên cứu củaviện Vệ Sinh dịch tễ Trung Ương phối hợp với Đại Học Hokaido Nhật Bảntrên quần thể chuột bắt tại chợ Trương Định và Bến xe Giáp Bát có tới 16.3%mẫu huyết thanh chuột có kháng thể kháng virus Hanta [28]

Ổ chứa và nguồn truyền bệnh

Vật chủ tự nhiên của virus Hanta hầu hết là các loài động vật gặmnhấm Các loài vật chủ này có đặc điểm chung là bị nhiễm virus trong thờigian dài với các biểu hiện ở giai đoạn cấp tính lượng virus đạt đỉnh, virusđược đào thải với số lượng lớn ra ngoài cùng chất tiết như phân, nước tiểu,nước bọt và tiếp theo giai đoạn cấp là giai đoạn nhiễm dai dẳng Điều đặc biệt

là mỗi virus Hanta có động vật là ổ chứa nhất định [16] Vì đặc thù này nên sựphân bố địa lý và dịch tễ học của các bệnh do virus Hanta gây ra cho conngười gắn liền với sự phân bố của vật chủ chứa chúng

Theo Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV), mỗi Hanta virus có một

ổ chứa khác nhau theo từng loài hoặc dưới loài [16], chúng được chia thànhbốn nhóm riêng biệt dựa trên vật chủ của chúng Nhóm đầu tiên chứa các virusgây HFRS chẳng hạn như HTNV, Seoul (SEOV) và virus Dobrava-Belgrade(DOBV), được mang bởi chuột và các loài gặm nhấm trong Cựu Thế Giới (OldWorld rat) [17] Các virus của nhóm thứ hai được mang bởi chuột đồng vàlemmut, là nguyên nhân của NE (PUUV) hoặc tác nhân gây ra TULV, ProspectHill Virus (PHV) Nhóm thứ ba, được mang bởi các loài gặm nhấm thuộc TânThế Giới (New World rat) và chuột bao gồm SNV, Andes (ANDV), nguyênnhân của HPS khi truyền sang người [18] Nhóm thứ tư là sự bổ sung gần đâynhất, được mang bởi chuột chù không thuộc nhóm các loài gặm nhấm mà lànhóm ăn côn trùng, mặc dù loài đầu tiên của nhóm này được phân lập từ năm

1964 có tên là Thottapalayam

Bảng 1.1: Sự phân bố địa lý của các virus Hanta gây bệnh và các vật chủ

Nhóm và

phân họ

Virus phân lập hoặc chủng

Tên viết tắt

Phân bố địa lý Vật chủ chứa

Bệnh liên quan Virus Hanta trong Cựu Thế Giới (Old World)

Murinae

Virus Hantaan HTNV

Trung Quốc, Nam Triều Tiên, Nga

Apodemus

Virus Belgrade DOBV Balkan

Dobrava-Apodemus flavicollis HFRS

Virus Dobrava/

Belgrade (Kurkino)

DOBV Trung Âu và

DOBV

Khu vực phíaNam châu Âuthuộc lãnh thổ Nga

Clethrionomys glareolus HFRS/NE

Virus Hanta trong Tân Thế Giới (New World)

Sigmodontina

e

Virus Sin Nombre

SNV Bắc Mỹ Peromyscus

maniculatus

HPS

Nhóm và

phân họ

Virus phân lập hoặc chủng

Tên viết tắt

Phân bố địa lý Vật chủ chứa

Bệnh liên quan

Virus Monongahela MGLV Bắc Mỹ

Peromyscus maniculatus nubiterrae

HPS

Virus New York NYV Bắc Mỹ Peromyscus

Virus Black Creek Canal BCCV Bắc Mỹ

Virus Bermejo BMJV Argentina Oligoryzomys

Virus Lechiguana LECV Argentina

Calomys

Virus Araraquara - Brazil

a Phân loại

Hantaviruses thuộc họ Bunyavirus, một họ gồm 5 chi: Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus, Phlebovirus và Tospovirus Mỗi loại đều được

tạo thành từ những virus đơn chuỗi RNA Tất cả các chi này bao gồm virus

gây bệnh truyền qua động vật chân khớp, ngoại trừ chi Hantavirus, là loài gây

bệnh truyền qua động vật gặm nhấm Theo Ủy ban Quốc tế về Phân LoạiVirus (ICTV), hiện tại có khoảng 24 loài virus Hanta đã được phát hiện [16]

Bộ gen của virus được chia thành các phân đoạn S (nhỏ, từ 1.6 – 2.1 kb),

M (trung bình, 3.7 – 3.8 kb) và L (lớn, 6.5 – 6.6 kb), đây cũng là đặc trưng

của các thành viên trong họ Bunyaviridae [19] Đoạn nhỏ (S) mã hóa cho

nucleocapsid protein (N), N protein tồn tại với mật độ cao trong tế bào chấtcủa tế bào nhiễm virus Biểu hiện của chúng có thể phát hiện được khoảng 6tiếng sau khi tế bào bị nhiễm Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các đáp ứngmiễn dịch sớm phần lớn tác động đích đến N protein Đoạn trung bình (M) mãhóa cho 2 glycoprotein bề mặt G1 và G2, chúng tạo điều kiện cho virus có thểgắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ Đoạn lớn (L) mã hóa choRNA phụ thuộc RNA polymerase của virus (Rdrp) [20], [21] RdRp thực hiệnkhá nhiều vai trò: dịch mã, nhân bản, endonuclease, tháo xoắn helix ARN.Trong quá trình dịch mã RdRp tổng hợp mARN từ khuôn là sợi đơn âm ARNvirus và nhân bản vật chất di truyền của virus qua cARN trung gian

Hình 1.3 Cấu trúc virus và hệ gen của virus Hanta

Cấu trúc đoạn gen M

Đoạn gen M của virus Hanta gồm 3 vùng bao gồm vùng 5’ không mãhóa (5’ NCR), một khung đọc mở (ORF) và 3’ không mã hóa (NCR) Vùng5’NCR và 3’NCR có chiều dài lần lượt khoảng 47 nucleotid và 203nucleotide Đoạn M chứa một khung đọc mở đơn (48 – 3448 nucleotide) mãhóa cho tiền chất của 1133 acid amin quy định các glycoprotein G1 và G2

Glycoprotein bề mặt tiền thân (GPC) của virus Hanta được tổng hợp ởribosome liên kết với màng lưới nội chất (ER) Sau đó trong quá trình chuyểntới ER, GPC được protease nội bào phân chia thành glycoprotein trưởngthành G1 và G2 Các glycoprotein G1 và G2 tạo điều kiện cho virus có thểgắn lên các thụ thể màng trên bề mặt tế bào vật chủ Cũng có nghiên cứu chorằng sự biểu hiện của G1 làm giảm sản xuất IFN-β – yếu tố quan trọng trongquá trình đáp ứng miễn dịch chống lại sự xâm nhập của virus [1], [27]

Các glycoprotein G1/G2 có thể tương tác với các protein đặc biệt trên bềmặt tế bào β3-integrins, tạo điều kiện xâm nhập tế bào của hantavirus gây raHPS [22]

c Đặc điểm nhân lên và đáp ứng miễn dịch

Quá trình nhân lên của virus Hanta

Giống như nhiều virus khác, virus Hanta xâm nhập vào các tế bào chủbằng sự tương tác giữa các glycoprotein của virus và các thụ thể đặc hiệu trên

bề mặt tế bào (Hình 3) Các virus Hanta gây bệnh và không gây bệnh sử dụngcác thụ thể tích hợp khác nhau để xâm nhập vào tế bào chủ của chúng Cácintergrin của người như αIIaβ3 trên bề mặt tiểu cầu và αvβ3 ở các tế bào nội

mô làm trung gian cho sự xâm nhập tế bào của các virus Hanta gây bệnh, từ

đó gây ra HFRS và HCP [22] Ngược lại, virus Hanta không gây bệnh, chẳnghạn như, PHV và TULV sử dụng thụ thể α5β1 cho việc xâm nhập vào tế bào

Sau khi bám dính vào bề mặt tế bào chủ, virus Hanta xâm nhập vào các

tế bào bằng quá trình nhập bào phụ thuộc Clathrin Sau khi xâm nhập, virusHanta cởi bỏ lớp áo của mình, ba nucleocapsids được giải phóng vào bàotương tế bào cùng với RdRp của virus Sau đó, RdRp bắt đầu được phiên mã

và các mRNA của virus mã hóa cho ba protein virus được tổng hợp Các

mRNA virus có khoảng 100 nucleotide ngắn hơn RNA của virus ban đầu vàthiếu đuôi poly A RdRp của virus sử dụng cơ chế "nắp đậy" để bắt đầu phiên

mã [23], [24] Các mRNA của virus được dịch mã trong tế bào chất nhờ bộmáy dịch mã của tế bào chủ RdRp virus cũng sao chép bộ gen thông qua tổnghợp cRNA bổ sung Các cRNA bổ sung là sự bổ sung chính xác của RNA vi-rút (vRNA), và trở thành như các khuôn mẫu để tổng hợp các bộ gen âm củavirus Virus lắp ráp và trưởng thành trên bề mặt tế bào hoặc trên Golgi Cácvirion trưởng thành trên Golgi được vận chuyển đến bề mặt tế bào thông quacác con đường túi tiết Cuối cùng, virion mới nảy chồi ra khỏi các tế bào chủ

từ màng tế bào

Hình 1.4 Quá trình xâm nhập và nhân lên trong tế bào chủ của virus Hanta

 Đáp ứng của hệ thống miễn dịch khi bị nhiễm virus Hanta

Sự nhiễm virus Hanta gây ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong tế bàochủ, tuy vậy các virus gây bệnh dường như có thể trốn tránh các phản ứngnày ở một mức độ nhất định Các dạng interferon khác nhau được biểu hiện

và gen kích thích sản xuất IFN được kích hoạt Sự biểu hiện của

IFN-inducing MxA protein bị trì hoãn trong các tế bào bị nhiễm các virus Hantagây bệnh Tương tự, mức độ các phân tử kháng nguyên trình bày như HLAlớp I được nâng cao Tuy nhiên, việc điều hòa tăng chậm hơn sau khi nhiễmvirus Hanta gây bệnh so với các virus Hanta không gây bệnh Các cơ chếchống virus bẩm sinh khác được gây ra trong suốt quá trình nhiễm virusHanta bao gồm kích hoạt hệ thống bổ thể theo con đường cổ điển và thay thế,

ví dụ sự tăng phức hợp SC5b-9 và tỷ lệ C4d/C4 cao hơn trong suốt NE doPUUV [25] Các tế bào giết tự nhiên, được gọi là effector và các tế bào tiếttrong hệ thống miễn dịch miễn dịch sản xuất các phân tử gây độc tế bào vàtiết cytokine và chemokine di chuyển vào các mô bị nhiễm virus [25], [26]

Cơ thể nhiễm virus, sau khi bệnh khởi phát vài ngày bắt đầu xuất hiệnkháng thể IgM, đạt đỉnh sau 2-3 tuần IgG cũng xuất hiện sớm nhưng có thể tồntại hàng năm

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán virus Hanta

a Phương pháp trực tiếp

Soi trên kính hiển vi điện tử

Đây là một phương pháp hữu hiệu, nhạy và nhanh trong việc quan sátvirus Virus Hantan hơi khác virus khác ở chỗ sự nhân lên của virus Hantanchậm và vắng mặt hình thái tế bào gây nhiễm Tuy nhiên, phương pháp nàyđòi hỏi phải nồng độ virus cao: tốt nhất là từ 106 tới 109/ml

Phân lập virus Hanta

Phải thực hiện trong phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp 3 (BSL3)

- Thu thập mẫu xét nghiệm từ bệnh nhân và ổ chứa virus: ví dụ từ phổi

và lách của chuột nhiễm virus Hanta

- Tiến hành phân lập trên động vật

- Phân lập trên tế bào nuôi (tế bào VERO E6)

RT PCR xác định sự có mặt của virus

Có rất nhiều phương pháp sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu khác nhau đểphát hiện virus Hanta Trong nghiên cứu của chúng tôi, sử dụng kĩ thuật RTPCR sử dụng cặp mồi khuếch đại gen M mã hóa cho G2 protein của virusHanta, SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353 được Hua Wang và cộng sự công bốnăm 2000 có trình tự nucleotide như sau:

Bảng 1.2 Trình tự mồi của kĩ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta [48]

Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) T m

SEO-MF 1936 GTGGACTCTTCTTCTCATTATT 49.2oCSEO-MR 2353 TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG 60.6oC

b Phương pháp gián tiếp bằng các xét nghiệm huyết thanh học

Kĩ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu

Đây là kỹ thuật tương đối nhạy cảm và đòi hỏi ít trang bị đắt tiền như:kính hiển vi huỳnh quang, các kháng thể Kỹ thuật này gồm các bước tiếnhành như sau:

- Chuẩn bị kháng nguyên ngăn ngưng kết hồng cầu,

- Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên (HA)

- Tiến hành kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).

Ngoài ra còn một số kĩ thuật như kĩ thuật Western Blot, kĩ thuật trunghòa giảm đám hoại tử, Kĩ thuật ngưng kết hạt (HantaDia)

1.2 Kĩ thuật Sequencing

Nguyên lí: DNA là cơ sở hóa học của gen Phân tử DNA là một chuỗixoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờcác base của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T(thymine) Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xácđịnh Giải trình tự gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loạinucleotide này trên phân tử DNA

Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen đã được phátminh như: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (AlanMaxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzymehay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger)

Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử pháttriển của sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự độngđều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger

Hình 1.5 Hệ thống giải trình tự gen ABI 3100

1.3 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta

1.3.1 Các nghiên cứu di truyền và phân loài virus Hanta trên thế giới

Virus Hanta là một trong những tác nhân nguy hiểm bởi hậu quả nặng

nề do chúng gây ra và cũng bởi vật chủ mang chúng là những loài vô cùnggần gũi với con người Chính vì vậy, kể từ khi virus Hanta được phân lập từcác loài gặm nhấm Murinae ở Bắc Á và châu Âu và một số vật chủ đặc biệtcủa virus Hanta ở những vùng khác nhau trên trên thế giới, đặc biệt ở ĐôngNam Á, nơi mà có tới hơn 35 loài Murinae sinh sống, hàng vạn câu hỏi đãđược đặt ra Một số virus Hanta đã được ghi nhận từ Đông Nam Á, đặc biệtlà: THAIV được phát hiện năm 1994 ở Thái Lan từ một con chuột túi lớn,Bandicota indica, một số virus Hanta được phân lập tại Campuchia từ Rattusrattus và R Norvegicus [32], [33] Ngoài ra, các cuộc điều tra huyết thanh họccũng cho thấy các mẫu dương tính với virus Hanta ở Thái Lan và Campuchia[34], [35], [36], [37] Từ những kết quả này, các nhà khoa học bắt đầu đặt racâu hỏi về sự đa dạng di truyền ở các virus Hanta ở Đông Nam Á như thế nào,

có mối liên hệ gì giữa virus Hanta ở Đông Nam Á, Nam Á với các khu vựckhác Năm 2006, Pierre Hugot và cộng sự đã sử dụng kết quả giải trình tự cácphân đoạn gen S và M để xây dựng cây phát sinh loài, kết quả cho thấy cácchủng THAIV có mối quan hệ gần gũi với SEOV, với SEOV, đồng thời cũngphản ánh mối quan hệ gần gũi giữa vật chủ là Bandicota và Rattus [37] Đã córất nhiều các công trình công bố về sự đa dạng di truyền các virus trên thếgiới, thông qua kết quả nghiên cứu về di truyền phân tử, bằng việc dựng cáccây phát sinh loài các nhà khoa học đã sơ bộ khái quát được các virus Hantalưu hành trên thế giới cũng như vật chủ của chúng [43] Năm 2014,Yoshimatsu tiến hành phân tích cây gia hệ được xây dựng trên trình tự axitamin protein N của các chủng virus Hanta trên thế giới đã cho thấy các virusHanta được phân tách rõ theo phân bố địa lý và được chia ra làm 2 khu vực

đó là các virusthuộc cựu thế giới bao gồm các vi rút: HTNV, SEOV, DOBV

và PUUV (Old World hantavirus) và các virusthuộc tân thế giới (New Worldhantavirus) Các virus thuộc tân thế giới lại được chia tách thành ít nhất 5nhóm và các dưới nhóm Đồng thời phân tích cây gia hệ được xây dựng trêntrình tự gen S của các virus Hanta cho thấy sự phân bố rõ của các hội chứngHPS và HFRS theo các nhóm virus [47]

1.3.2 Các nghiên cứu đặc điểm di truyền và phân loài virus Hanta tại Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 2005, Trương Thừa Thắng và cộng sự bằng kĩ thuật

RT PCR sử dụng cặp mồi SEOMF1936 và SEOMR2353 bước đầu phát hiệnvirus Seoul trên địa bàn Hà Nội, kết quả cho thấy có 2/160 mẫu chuột dươngtính với virus Hanta [29]

Năm 2011, Trần Đức nghiên cứu trên quần thể chuột tại cảng Hải Phòngthu được 14/165 (8,48%) mẫu chuột cho kết quả dương tính với kĩ thuật

Western Blot và trong số 14 mẫu đó có 4/14 mẫu phổi chuột cho kết quảdương tính với phương pháp RT PCR Tác giả cũng sử dụng trình tự đoạn gen

M để phân tích và xây dựng cây phả hệ của chủng virus phát hiện được Kếtquả cho thấy virus SEOV tại cảng Hải Phòng có cùng nguồn gốc với virusSEOV tại Nhật Bản và Indonesia [30]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- 14 mẫu phổi chuột được chẩn đoán xác định dương tính với virusHanta bằng kỹ thuật RT – PCR Các mẫu bệnh phẩm này được lấy từ chuộtthu thập được tại các điểm giám sát thường quy trên địa bàn Hà Nội gồm: bến

xe vận tải, ga Giáp Bát, chợ Thành Công, chợ Thái Hà, bệnh viện Hà Đông,bệnh viện Đống Đa, nhà máy bia Hà Nội, chợ Đồng Tâm, bệnh viện GiaoThông Vận Tải (GTVT) từ 2015 – 2017

- Trình tự gen M của các chủng so sánh là các chủng đại diện cho một

số khu vực trên thế giới đã được công bố tại ngân hàng gien thế giới(GenBank) tại địa chỉ website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ với các mã đăng

ký và tên chủng như sau:

2000 Hải Nam HN71-L AB027084

1998 Hải Nam HB55 AF035832

2000 Nội Mông NM39 AB027080

1998 Giang Tây L99 AF035833

2000 Bắc Kinh Beijing-Rn AB027087

Nhật Bản

1994 - KI-83-262 D17592

Indonesia 2012 Jakarta KS90 AB697618

2004 Jakarta Jakarta AJ620583

Việt Nam

2013 Hải Phòng HaiPhong3-11 AB674759

2013 Hải Phòng HaiPhong17-11 AB674760

2013 Hải Phòng HaiPhong24-11 AB674761

2007 Hải Phòng Haiphong #28 AB355731

2007 Hải Phòng Haiphong #7 AB355728

2007 Hai Bà Trưng Hanoi #9 AB355732

2007 Hai Bà Trưng Hanoi #25 AB355733

2012 Sài Gòn 11CSG AB618131

2012 Sài Gòn 5CSG AB618130

Chú thích: (-): không có thông tin

2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: các địa điểm giám sát thường quy được chọn lựa

bao gồm các chợ, bến xe vận tải, nhà ga, một số bệnh viện trên địa bàn

Hà Nội

Có 9 địa điểm được lựa chọn thuộc 05 quận:

Quận Hoàng Mai: bến xe vận tải Nam Hà Nội, ga Giáp Bát

Quận Đống Đa: chợ Thái Hà, bệnh viện Đống Đa, bệnh viện GiaoThông Vận Tải

Quận Ba Đình: chợ Thành Công, nhà máy Bia Hà Nội

Quận Hà Đông: bệnh viện Hà Đông

Quận Hai Bà Trưng: Chợ Đồng Tâm

- Địa điểm thực hiện phân loại chuột và lấy mẫu phổi chuột: Khoa Sốt rét

kí sinh trùng và Côn trùng – Trung tâm Kiểm soát bệnh tật thành phố Hà Nội

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm RT-PCR: Khoa xét nghiệm - Trung tâm

kiểm soát bệnh tật thành phố Hà Nội

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm giải trình tự gen: Khoa Virus- Viện Vệ

sinh Dịch tễ Trung ương

2.3 Sinh phẩm hóa chất và trang thiết bị

Sinh phẩm hóa chất

- Bộ sinh phẩm tách chiết ARN từ mẫu mô động vật (RNeasy Lipid

Tissue Mini Kit - QIAGENE, Đức);

Bộ sinh phẩm khuếch đại ARN (QIAGEN OneStep RTPCR Kit

-QIAGENE, Đức);

- Dung dịch TRIzol (Gibco, Mỹ);

- Dung dịch Chloroform (Merck, Đức);

- Dung dịch Ethanol (70%) (Merck, Đức);

- Thang chuẩnADN (GelPilot MidRange 100bp Ladder – QIAGENE, Đức);

- Loading dye 5X (QIAGENE, Đức);

- Thạch agarose LE (Roche, Pháp);

- Dung dịch TAE 50X (Mỹ);

- Ethidium Bromide (Mỹ);

- Cặp mồi khuếch đại gen M mã hóa cho protein G2 của virus Hanta,

SEO-MF (mồi xuôi) và SEO-MR (mồi ngược) đã được tác giả Hua Wang vàcộng sự sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của virus Hanta tạiTrung Quốc năm 2000, có trình tự nucleotide và sơ đồ mồi như sau:

Bảng 2.1 Trình tự mồi của kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus Hanta

Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) T m

Vị trí gắn trên genome

Kích thước sản phẩm đích

-418bpSEO-MR

-Hình 2.1 Sơ đồ cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353

trên đoạn trình tự gen M

Các sinh phẩm, hóa chất và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật PCR và Sequencing

RT-Trang thiết bị, dụng cụ

- Tủ an toàn sinh học cấp II;

- Tủ -80oC;

- Máy nghiền Mini-Beadbeater (Mỹ);

- Hạt nghiền thủy tinh, đường kính 0,1 mm;

- Máy PCR;

- Máy điện di;

- Máy ly tâm lạnh cho tuýp 2mL;

- Máy chụp kết quả điện di Gel.doc;

- Máy lắc Vortex;

- Cân điện tử;

- Lò vi sóng;

- Máy định lượng ADN (Nano Drop, Mỹ);

- Máy giải trình tự gen ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (AppliedBiosystems; Mỹ) với gel POP-6;

- Các trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật PCR

và sequencing

- Tuýp eppendorf vô trùng: 2 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml;

- Đầu côn các loại: 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 1000 l;

- Pippet bán tự động các loại: 1-10 l, 2-20 l, 20-200 l, 200 -1000 l;

- Găng tay vô trùng;

- Giá tích lạnh;

- Khuôn đổ thạch agarose

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Chuột sau khi thu thập được vận chuyển về phòng thí nghiệm tiến hànhđịnh loại theo phương pháp hình thái học [38] dựa vào khóa xác định loài sau:

- Kích thước cơ thể;

- Màu lông của thân, đuôi, bụng, chi;

- Đặc điểm của lông: Độ mềm, có gai hay không có gai, độ dài của lông;

- Chiều dài: chiều dài thân, chiều dài đuôi, chiều dài của đuôi so với thân;

- Kích thước sọ: Chiều dài chung, chiều dài xương mũi, chiều dài bầu nhĩ, chiều dài dãy răng hàm, đặc điểm cung gò má;

- Hình dạng của tai, mõm, lỗ khẩu cái;

- Hình thái, chiều dài răng cửa, đặc điểm răng cửa, các núm mặt nhai củarăng…

Chuột sau khi xác định loại cụ thể được gây mê bằng ether và phẫuthuật, mở lồng ngực lấy mẫu phổi Mẫu phổi được bảo quản trong tủ -80oCcho tới khi sử dụng

-Các mẫu phổi chuột được chẩn đoán dương tính với virus Hanta bằng

kỹ thuật RT – PCR được tiến hành chọn lọc, tách chiết ARN từ mẫu phổi bằng

bộ sinh phầm sinh phẩm tách chiết ARN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit –QIAGEN Tiếp đó khuếch đại đoạn gen M mã hóa cho protein G2 của virusHanta bằng sử dụng cặp mồi SEO-MF (mồi xuôi) và SEO-MR (mồi ngược)

đã được tác giả Hua Wang và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu đa dạng ditruyền của virus Hanta tại Trung Quốc năm 2000, sử dụng bộ sinh phẩm Onestep RT-PCR- QIAGEN với nhiệt độ bắt cặp 52oC, 35 chu kỳ, thời gian kéodài là 1 phút Sản phầm PCR sau đó được tinh sạch trực tiếp bằng bộ sinhphẩm Kit PCR Purification QiaGen – Cat No 28104 Giải trình tự gen trựctiếp từ sản phẩm PCR, phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện với bộ sinhphẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) trong

2 phản ứng với lần lượt 2 mồi SEO-MF và SEO-MR nhằm thu được đoạntrình tự có độ dài mong muốn Sản phẩm PCR giải trình tự gen được tinh sạchbằng bộ kít Dye Ex 2.0 Spin để loại bỏ các thành phần thừa Thực hiện giảitrình tự và phân tích kết quả trên máy giải trình tự ABI 3100-AvantTM GeneticAnalyser Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm các

chương trình Larsergene DNA Star – Seqman; Larsergene DNA Star MeAlign và Mega 7.0 để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide,acid amin của chủng thu được và so sánh trình tự nucleotide, acid amin vớichủng chuẩn Kiểm tra chất lượng trình tự thu được bằng phần mềm DNASequencing Analysis v5.3.1 hoặc phần mềm Sequence Scanner 1.0 Phầnmềm được cung cấp kèm theo máy giải trình tự gen ABI PRISM™ 3100.

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

a Quy trình giải trình tự nucleotide của ADN của virus Hanta

Bước 1 Tinh sạch DNA từ sản phẩm PCR dương tính

Bước 2 Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide

Bước 3 Tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide

Bước 4 Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

 Bước 1 Sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu

- Sử dụng kit làm tinh sạch của hãng Qiagen

- Purification kit Qiaquick 250 Cat No 28104

Hanta.

Tinh sạch sản phẩm RT PCR Giải trình tự các sản phẩm DNA thu được

Đọc kết quả bằng phần mềm DNASTAR, MEGA4, BioEdit

Phân tích kết quả, chỉ ra các đặc điểm nucleotide,

aa, đột biến, xây dựng cây phát sinh loài dựa trên phân tích gen M.

Tuýp 2ml 50 chiếc

Chú ý: Thêm cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trước khi sử dụng

Các bước tiến hành:

- Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có (vd: 500 µlđệm PB và 100 µl sản phẩm PCR)

- Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2ml

- Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm 13.000vòng/30-60giây

- Loại bỏ nước ở tuýp thu, đặt lại cột Qiaquick vào tuýp

- Dùng pipet cho 750ul đệm PE vào cột Qiaquick để rửa DNA, ly tâm13.000 vòng/30-60giây

- Loại bỏ nước ở tuýp thu, đặt lại cột Qiaquick vào tuýp, ly tâm 13.000vòng/60giây

- Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml

- Cho 30ul đệm EB hoặc nước tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cộtQiaquick để tách lấy DNA, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm13.000 vòng/60giây DNA tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC

 Bước 2 Chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide – PCR sequencing

- Dùng bộ kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Mã catalog:

- Sinh phẩm được trộn trong từng tube 0.2ul riêng biệt, vortex đều sau đó

ly tâm nhẹ trước khi cho vào máy

Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, tránh

nhiễu trong quá trình giải trình tự

- Sử dụng bộ kít Dye Ex 2.0 Spin Qiagen Mã catalog: 63206

- Thành phần bộ kít bao gồm

Cột DyeEx 2.0 Spin 50 chiếc

- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1.5ml sạch

- Dùng pipet hút toàn bộ sản phẩm nhỏ vào chính giữa cột gel

- Ly tâm 2800 vòng / 2-3 phút

- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin

- Thu hồi mẫu Trong trường hợp không đưa vào máy ngay, có thể giữmẫu ở -80oC không quá 24h

 Bước 4 Giải trình tự gen bằng điện di mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

- Dùng POP 6 Mã catalog 4316357

- HiDi Formamide ABI 25ml Mã catalog 4311320

- Nhỏ mẫu trực tiếp lên đĩa 96 giếng (dành riêng cho ABI 3130-Avant)

- Đưa đĩa 96 giếng vào máy giải trình tự ABI

- Hiệu chỉnh các thông số để chạy

- Phân tích kết quả thu được

b Cài đặt chương trình chạy, tạo tệp dữ liệu, lưu giữ và phân tích kết quả

Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm cácchương trình Larsergene DNA Star – Seqman; Larsergene DNA Star -MeAlign và Mega 7.0 để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide,

acid amin của chủng thu được và so sánh trình tự nucleotide, acid amin vớichủng chuẩn.

Kiểm tra chất lượng trình tự thu được bằng phần mềm DNA SequencingAnalysis v5.3.1 hoặc phần mềm Sequence Scanner 1.0 Phần mềm được cungcấp kèm theo máy giải trình tự gen ABI PRISM™ 3100

Ghép các trình tự xác định bởi các mồi khác nhau thành một trình tự hợpnhất và đọc trình tự bằng phần mềm Larsergene DNA Star – Seqman Phầnmềm Seqman được cung cấp bởi công ty DNA Star sử dụng trong ghép nối,phân tích các dữ liệu giải trình tự Sanger

Xác định týp của 14 chủng virus Hanta phân lập trong nghiên cứu bằngphần mềm MEGA 7.0 MEGA (Molecular Evolutionary Gentics Analysis) sosánh và sắp xếp đa trình tự nucleotide đoạn gen M 418 nucleotide của các chủngvirus Hanta phân lập trong nghiên cứu với các chủng lưu hành trong nước vàmột số nước lân cận Cây gia hệ giữa các chủng của Việt Nam và thế giới bằngphương pháp Neighbour -Joining với giá trị tính phần trăm sự lặp lại (giá trị tincậy) có độ tin cậy tại mỗi nhánh phát sinh là 1000 lần (giá trị bootstrap)

Phân tích đặc điểm phân tử nucleoprotein dựa trên đoạn gen M gồm 418nucleotide để phân tích sự đồng nhất nucleotide và acid amin của các chủngvirus Hanta phân lập trong nghiên cứu với các chủng lưu hành trong nước vàmột số nước lân cận như Singapore, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc,Indonesia Số liệu được làm sạch bằng phần mềm MEGA, sau đó được dùngphương pháp ClustalW để sắp xếp đa trình tự Các chuỗi nucleotide hay acidamin được sắp xếp và tính toán mức độ đồng nhất (identity) và tương đồng(homology) bằng chương trình Lasergene (Germany)

2.5 Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu được phê duyệt bởi hội đồng khoa học và cải tiến kỹ thuật