Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam

Xác định trình tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam

LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình, không chỉ là sự cốgắng hết mình của bản thân, tôi còn nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tìnhcủa các thầy cô cũng như sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè

Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Lê Thị Liên –Trưởng Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giangđồng kính gửi thầy PGS.TS Đinh Duy Kháng – Trưởng phòng Vi sinh vật họcphân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ ViệtNam, đã tận tình chỉ bảo, dìu dắt và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốtthời gian nghiên cứu và học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Bạch Như Quỳnh người đã trực tiếphướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình Tôi cũng xincảm ơn các cô chú, anh chị đang công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử –Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gianthực tập tại đó

Để có được những hiểu biết về kiến thức chuyên ngành, tôi xin chânthành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – trường Đạihọc Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện cho tôi được học tập trong môitrường giảng dạy tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đãluôn ở bên ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gianthực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khóa luận của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2011

Sinh viên

Đỗ Thị Hồng

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề:

Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thủy cầm,đặc biệt là ở gà do virus cúm type A thuộc họ Orthomysoviride gây nên.Trong các phân type cúm A thì phân type H5N1 là phân type có độc lựccao nhất và gây chết gia cầm hàng loạt, gây thiệt hại rất lớn cho con người

và kinh tế

Năm 1997 dịch cúm bùng phát tại Hồng Kông sau đó lan sang các nướcchâu Á, châu Âu, châu Phi Theo tổ chức y tế thế giới (OIE) có 55 quốc giatrên thế giới nhiễm dịch cúm A/H5N1 tính từ năm 2003 [12] Và ở việt Nam,dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện là vào tháng 2 năm 2003 và chỉ trongthời gian ngắn đã lây lan ra 57 tỉnh thành trên cả nước gây thiệt hại lớn chonghành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng tới nhiều mặt của đời sống kinh tế,

xã hội Theo Cục Thú y, trong năm 2010, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện tại

64 xã, phường của 38 huyện 23 tỉnh, thành trên cả nước Tổng số gia cầmmắc bệnh, chết và tiêu hủy là hơn 147 nghìn con, trong đó chủ yếu là vịt.Đáng lo ngại là tại khu vực Đồng bằng Bắc bộ, nơi chăn nuôi số lượng lớn giacầm đã tái phát dịch cúm tại tỉnh Nam Định, tỉnh Nghệ An cũng đã có loạidịch bệnh nguy hiểm này So với năm 2009, thì năm 2010, số địa phương xuấthiện dịch cao hơn, trong đó có đến 11 tỉnh xuất hiện dịch 2 năm liền [6] số ổdịch của năm 2010 thấp hơn nhưng số tỉnh có dịch cao hơn, cho thấy sự phân

bố về mặt không gian của các ổ dịch phân tán hơn Trong thời gian từ năm

2003 đến 2010, toàn quốc có 119 ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người, trong đó

có 59 ca tử vong Hiện nay, cả nước còn 3 tỉnh là Lạng Sơn, Nam Định vàKon Tum có dịch cúm gia cầm [1]

Do virus cúm gia cầm H5N1 có tốc độ tiến hóa nhanh, có độc lực cao

và rất dễ lây lan bùng phát thành dịch lớn Bên cạnh đó các biện pháp phòng,chống dịch đặc biệt là nhận thức của người chăn nuôi về tính chất nguy hiểncủa dịch cúm còn rất hạn chế, tỷ lệ tiêm vacine cúm gia cầm còn thấp…Chính vì vậy vấn đề nghiên cứu và sản xuất vacine phòng chống cúm gia cầm

là vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết

Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài “Xác định trình

tự và phân tích gen mã hóa kháng nguyên HA của virus cúm chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine cúm A/H5N1 tại Việt Nam” Đề

tài góp phần ứng dụng vào việc sản xuất vacine cúm A/H5N1, phòng bệnhtrên gia cầm tại Việt Nam

Ý nghĩ khoa học và ý nghĩa thực tiễn:

- Ý nghĩa khoa học: Xác định được trình tự gen mã hóa kháng nguyên

HA của chủng NIBRG-14 sử dụng trong sản xuất vacine

- Ý nghĩa thực tiễn: Sử dụng chủng NIBRG-14 này vào việc sản xuấtvacine

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Đối tượng nghiên cứu: Virus cúm chủng NIBRG-14

- Phạm vi nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên HA từ chủngNIBRG-14

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng vi sinh phân tử - Viện Công nghệ Sinhhọc – Viện Khoa học Và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ 23/02/2011 đến 22/05/2011

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về dịch cúm gia cầm.

Cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do siêu virus cúm gây racho các loài gia cầm và chim hoang dã Bệnh lây lan rất nhanh, tỉ lệ chết

là 100% nếu gà bị bệnh Đặc biệt có thể xâm nhiễm cho một số loài độngvật có vú

1.1.1 Lịch sử cúm gia cầm.

- Bệnh được ghi nhận từ hơn 400 năm nay

- Tiếng anh: Influenza xuất phát từ tiếng Ý (Influence of the start)

a Cúm gia cầm xuất hiện trên thế giới:

- Năm 1878 phát hiện bệnh ở Italia

- Năm 1901 phát hiện căn nguyên siêu nhỏ

- Năm 1955 phát hiện được virus gây bệnh

- Trận đại dịch đầu tiên: năm 1850 [12]

Một số đại dịch cúm đã xảy ra:

- Đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 - 1919

- Đại dịch cúm Châu Á năm 1957 - 1958

- Đại dịch cúm Hồng Kông năm 1968 – 1969 [12]

b Ở Việt Nam, dịch cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên vào 12/2003 Chia làm 3 đợt:

Bằng chứng sinh học và nguồn gốc phả hệ virus cúm A cho thấythủy cầm chính là nguồn tàng trữ virus cúm A và từ đó truyền lây sang cácvật chủ khác như: ngựa, lợn, gà, người… rồi gây bệnh và gây dịch ở cácloài này Gà bị nhiễm virus cúm thải virus qua đường mỏ hoặc qua phânsau đó người hoặc động vật ăn phải Đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễmnguồn nước và nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lây truyền virus trongcác quần thể động vật và người [12] Sự lây nhiễm virus cúm sang người cóthể xảy ra theo hình ảnh sau:

Hình 1.1: Con đường lây truyền virus cúm sang người [12].

Sự trộn kháng nguyên (Antigen shift) là những biễn đổi lớn, đột ngột vàvật liệu di truyền thường là do sự tái tổ hợp di truyền giữa hai chủng virus.Lệch kháng nguyên (Antigen drift) là những biến đổi nhỏ, từ từ, thường dođột biến xảy ra liên tục theo thời gian trong cùng một chủng virus Cả hai kiểu

biến đổi di truyền này đều tạo ra những chủng virus mới mà không được nhận

ra bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, kháng thể chống lại những virus cũkhông còn nhận ra và đáp ứng miễn dịch được và kết quả là gây ra các trậndịch lớn, nguy hiểm [11]

1.1.3 Triệu chứng lâm sàng.

a Triệu chứng.

- Thời gian ủ bệnh rất ngắn 1 - 3 ngày

- Gà nhiễm bệnh có những triệu chứng:

+ Viêm đường hô hấp cấp: Thở khó, khi thở phải há miệng, ho khẹc, chảy

dịch mắt, dịch mũi và rớt dãi liên tục Nhiệt độ cơ thể tăng đột ngột 40 - 450C

+ Viêm đường tiêu hóa cấp: Tiêu chảy rất nặng, phân xám vàng, xám

xanh, đôi khi có lẫn máu, mùi phân tanh

+ Nhiễm trùng huyết: Mào và tích sưng, tích nước, xuất huyết điểm đỏtừng đám Kết mạc mắt sưng chũng và xuất huyết, xuất huyết dưới da, đặcbiệt xuất huyết ở cả da chân [1,7]

- Triệu chứng bệnh cúm gà ở người:

Người nhiễm cúm gà có 3 hội chứng chính:

+ Hội chứng hô hấp: Hắt hơi, sổ mũi, mắt đỏ, chảy nước mắt, sợ ánh

sáng, cảm giác rát họng, khô họng Khó thở cấp tính, viêm thanh quản, khíquản, ho khan, khàn tiếng

+ Hội chứng nhiễm trùng: Sốt cao liên tục, mặt đỏ, viêm kết mạc mắt.Chán ăn, lưỡi trắng Mệt lả, đuối sức, chảy máu cam, hiếm nhưng quan trọng

+ Hội chứng đau: Nhức đầu nhiều vùng trán, đôi khi lan khắp đầu Đau bắp

cơ: Thường gặp ở thắt lưng, chi dưới Cảm giác nóng, đau vùng xương ức [1]

b Bệnh tích

Mổ khám gà bệnh thấy:

- Mũi viêm xuất huyết và tịt lại

- Mào và tích xưng chũng, đỏ sẫm, tích nước.

- Viêm hoại tử, xuất huyết tràn lan ở các phủ tạng: Phổi, tim, gan, lách,thận, buồng trứng…

- Xuất huyết đỏ sẫm từng mảng ở các tổ chức dưới da và cơ

- Tuyến tụy xưng to có các vạch vàng và đỏ xen kẽ

- Viêm xuất huyết toàn bộ niêm mạc dạ dày, ruột non, ruột già, manhtràng, hậu môn, túi frabrieius [7]

- Đại dịch cúm châu Á 1957: Sau đại dịch 1918, dịch cúm trở lại “hiền

lành” cho tới tận đầu những năm 1950 Năm 1957, thế giới bắt đầu tiến hànhtheo dõi hoạt động của căn bệnh cúm Dù các phương tiện phục vụ cho việcnày chưa được hiện đại như ngày nay, người ta sớm phát hiện thấy một dấuhiệu bùng dịch xuất hiện ở khu vực châu Á [12]

Virus được xác định đã bắt nguồn từ Quý Châu, Trung Quốc, lan sangSingapore vào tháng 2/1957, chạm tới Hồng Kông vào tháng 4 và Mỹ vàotháng 6 Có 69.800 người Mỹ thiệt mạng trong khi con số người chết toàn cầudao động từ 1 triệu – 4 triệu người Người ta đã chế tạo thành công một loạivaccine để kiềm chế căn bệnh này Dịch cúm châu Á lần đầu tiên cung cấp cơhội cho giới khoa học nghiên cứu hoạt động lây nhiễm tiền dịch bệnh chuyểnthành dịch ra sao Cúm châu Á biến mất sau 11 năm xuất hiện và biến đổithành cúm Hồng Kông vào năm 1968 [12].

- Đại dịch cúm Hồng Kong 1968: Dịch cúm Hồng Kông được xác nhận

là dịch cấp độ 2, gây ra bởi mẫu virus cúm A/H3N2, chính là hậu duệ củacúm châu Á H2N2 Thông tin đầu tiên về trận dịch là một vụ bùng dịch nhỏ ởHồng Kông xuất hiện vào ngày 13/7/1968, trong một khu vực có khoảng 500người sống rất gần nhau 2 tuần sau, dịch bệnh bùng nổ mạnh và kéo dàikhoảng 6 tuần Tháng 7/1968, dịch xuất hiện ở Việt Nam và Singapore Tớitháng 9/1968, nó đã lan tới Ấn Độ, Philippines, bắc Australia và châu Âu.Cùng tháng đó, virus đã vươn tới California từ những người lính trở về sauchiến tranh Việt Nam Virus vươn tới Nhật Bản, châu Phi và Nam Mỹ vàonăm 1969 Tổng cộng trong hai năm 1968 – 1969, trận dịch đã giết hạikhoảng 1 triệu người trên toàn cầu trước khi nó biến mất [12]

Hình 1.2 Bản đồ các quốc gia xảy ra dịch cúm A/H5N1 (WHO, tính đến

15/09/2008) [12]

Chú giải: Phần bôi đậm là vùng dịch cúm xảy ra trên gia cầm

Phần bôi nhạt là vùng dịch cúm chỉ xảy ra trên chim hoang dã

1.1.3 Tình hình dịch cúm ở Việt Nam.

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết cáctỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn Đây là lần đầu tiêndịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu giacầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân Tính đếntháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địaphương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau:

- Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch cúm xảy ra ở cáctỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trongvòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gà và

thủy cầm mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổngđàn gia cầm Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con.Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc thiêuhuỷ Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã

tử vong trong đợt dịch này [6]

- Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch bệnh tái phát tại 17tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kêtrong vụ dịch này là 84.078 con Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và19.950 con chim cút Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1,trong đó có 9 ca tử vong [6]

- Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: Dịch cúm gàxảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy được CụcThú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và551.000 chim cút) Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ratrong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trongtháng 12/2005 [6]

- Sau một năm (2006), do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãicho các đàn gia cầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịchquyết liệt, dịch cúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam Mặc dù vậy, đến06/12/2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lansang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ [6]

- Trong năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày17/02/2007 và được khống chế sau 1 tháng Tuy nhiên, đến ngày 01/05/2007dịch bệnh tiếp tục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh, thành phốtrong cả nước Theo Báo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển

Nông Thôn) đến ngày 10/06/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh, thành phố(Nghệ An, Quảng Ninh, Cần Thơ, Sơn La, Nam Định, Đồng Tháp, HảiPhòng, Bắc Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Quảng Nam,Hưng Yên, Thái Bình và Phú Thọ), và chỉ được khống chế hoàn toàn vào8/2007 [6].

- Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát ở một số tỉnh phía Bắc vào tháng3/2008 Cho đến tháng 6/2008, dịch cúm gia cầm A/H5N1 về cơ bản đã đượckhống chế trên toàn quốc [6]

- Cúm gà 2010 và đầu năm 2011(chủ yếu là bệnh cúm thuộc chủngH5N1)

Tại tỉnh Bắc Kạn từ ngày 19/3 đến ngày 6/4 năm 2010, dịch cúm giacầm đã xảy ra tại 16 hộ chăn nuôi tại huyện Lương Phú Tổng số gia cầm bịchết và tiêu hủy tại các hộ gia đình trên là 318 con [6]

Tại Quảng Ninh, ngày 29/3, dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại 4 hộ giađình thuộc xóm 4 xã Tiền Phong của huyện Yên Hưng Tính đến ngày 6/4tổng số gia cầm chết và tiêu huỷ của 4 hộ trên là 1.554 con (trong đó có 1.504vịt và 50 gà) Ở huyện Yên Hưng, Quảng Ninh, có hơn 3.000 con gà có biểuhiện mắc bệnh, số gia cầm bị chết là 1420 con [6]

Cả nước còn 6 tỉnh là Nghệ An, Khánh Hòa, Tuyên Quang, Bắc Ninh,Bến Tre và Quảng Ninh có dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày Số ca mắccúm A/H5N1 trong những tháng đầu năm 2010 có thể nói là “bất thường” sovới những năm trước đó chỉ trong 2 tháng đầu năm đã bằng tổng số ca mắc cảnăm 2009

Đầu năm 2011 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra ở một số tỉnh nhưng với sốlượng ít và hầu như chưa bùng phát thành dịch:

Ngày 17/2, chi cục thú y tỉnh Kon Tum đã xác địnht trên 2.000 conchim cút và trên 1.000 con gà bị chiễm cúm A Ngày 12/3, TS Lê Hữu Hải,

Trưởng phòng NN&PTNT huyện Cai Lậy (Tiền Giang), cho biết bảy đàn giacầm, thủy cầm hơn 4.700 con ở các xã Nhị Mỹ, Tân Phú, Nhị Quý, Hội Xuân

và Mỹ Phước Tây của huyện Cai Lậy đã phải tiêu hủy vì có các triệu chứngcủa bệnh cúm A/H5N1 [6]

Bảng 1.1 Tổng số trường hợp nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người báo

cáo cho WHO từ tháng 12/2003 đến 19/6/2008 [12].

1.2 Virus cúm A

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc.

* Đặc điểm hình thái:

Hình 1.3: (A): Hình thái virus cúm; (B): Cấu trúc virus cúm; (C): cấu

trúc RNA của virus cúm.

Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện,đường kính 80 – 120nm, đôi khi có dạng hình sợi Khối lượng phân tử khoảng

250 Da Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1%RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [10]

* Đặc điểm về cấu trúc:

Hạt virus: Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyềnRNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tếbào nhiễm, được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt cókhoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10

- 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus,

bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn

khác của virus Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ

lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quantrọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [2,17]

+ Gai H giúp virut gắn lên thể thụ cảm trên bề mặt tế bào.

+ Gai N có tác dụng thoái biến thể thụ cảm của tế bào và giúp virusphóng thích tế bào bị nhiễm

- Vỏ bọc ngoài (envelope)

- Lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand RNA sợi đơn âm (viếttắt là (-) ssRNA) là vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A,gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối vớinhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tươngứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2;phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóacho 2 protein là PB1 và PB1-F2 [2]

1.2.2 Cấu trúc hệ gen và chức năng

Hình 1.4 cấu trúc virus cúm A

Tất cả các virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae đều có hệ gen là RNAchứa 8 phân đoạn Trên bề mặt virus có protein ngây ngưng kết hồng cầu là

HA và một loại enzyme NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào vật chu

và giải phóng virus Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, hệgen virus cúm A có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotit [16]

Các gen mã hóa cho các protein và chức năng của chúng như sau:

- Phân đoạn 1: Là các gen mã hóa cho protein PB2 với kích thước2341bp có vai trò trong quá trình sao mã: gắn mũ

- Phân đoạn 2: Liên quan đến quá trình sao mã: kéo dài, kích thước2341bp, mã hóa cho protein PB1

- Phân đoạn 3: Mã hóa cho protein PA, kích thước 2233 bp, có vai tròtrong quá trình sao mã

- Phân đoạn 4: Liên kết với tế bào thụ thể trên tế bào chủ gây ngưng kếthồng cầu, kích thước đoạn gen là 1778 bp mã hóa cho protein HA(Hemagglutinin)

- Phân đoạn 5: Mã hóa cho protein NP, kích thước 1565 bp, nucleotitbám vào RNA, là thành phần trong phức hợp sao mã, vận chuyển ra vào nhâncủa vRNA

- Phân đoạn 6: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng củavirus, kích thước 1413 bp, mã hóa cho protein NA (Neuraminidase)

- Phân đoạn 7: Kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein M1 (Matrixprotein), là protein nền, thành phần chính của virion và liên quan đến nhiều sựkiện quan trọng của virus

- Phân đoạn 8: Kích thước 890 bp, mã hóa NS1 với chức năng làprotein không cấu trúc liên quan đến sự vận chuyển của RNA, ức chếinterferon Mã hóa prtein NS2 là protein không cấu trúc, chức năng chưađược biết rõ

Hình 1.5 Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 [3].

* Độc lực gây bệnh của virus cúm A:

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lựcthấp (LPAI - low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tạitrong tự nhiên

- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quannội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số giacầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm Loại này rất nguy hiểm gây lo ngạicho cộng đồng Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bàothận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin

- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnhcúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ.Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên củavirus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực caođồng nhiễm trên cùng một tế sức đề kháng của virus và trở thành loại virusHPAI nguy hiểm [4]

1.2.3 Đặc tính kháng nguyên của virus cúm A.

HA và NA là hai kháng nguyên bề mặt đặc biệt quan trọng nó quyếtđịnh độc lực cũng như khả năng nhân lên của virus Hai kháng nguyên nàycũng là mục tiêu tấn công đầu tiên của hệ thống miễn dịch vật chủ khi có sựxâm nhiễm của virus

* Kháng nguyên HA

HA là một glycoprotein có khối lượng khoảng 76.000 Dalton chứa 2 – 3

vị trí glycosyl hóa Trên phân tử HA có ít nhất 5 domain kháng nguyên(A,B,C,D, và E) phân bố ở phần đầu của phân tử này HA được cấu tạo bởi 2tiểu phần là HA1 và HA2 Hai tiểu phần này được nối với nhau bởi một trình

tự amino acid ngắn, đặc trưng cho từng bến thể H Trình tự của đoạn peptitnối trong phân tử HA cũng chính là trình tự nhận biết và phân cắt của enzymeprotease tế bào chủ đối với phân tử protein này Sự phân cắt phân tử HA làbước đầu tiên trong quá trình thâm nhập vào tế bào chủ của virus cúm Thôngthường sự phân cắt này có tính giới hạn đối với các mô với sự có mặt của cácprotease thích hợp Tuy nhiên đối với virus cúm độc lực cao (H5 và H7) đãtìm thấy sự có mặt của nhiều amino acid kiềm tính tại vị trí nhận biết củaprotease Đặc tính này cho phép HA được nhận biết và phân cắt bởi nhiều loạiprotease có mặt ở nhiều loại tế bào khác nhau, dẫn đến sự mở rộng giới hạncác mô có thể bị xâm nhiễm bởi virus [14,15]

* Kháng nguyên NA

Cùng với HA, NA cũng là một kháng nguyên bề mặt vô cùng quantrọng, có tính chất quyết định đến khả năng nhân lên của virus Chức năngchính của NA là phân cắt phân tử sialic acid (N-Acetyl neuramic acid), giảiphóng virus khỏi tế bào nhiễm [8,5]

NA phân giải thụ thể tế bào màng nhày đường hô hấp bằng cách cắt đứtcác liên kết glucosid giải phóng ra Neuramininic acid Quá trình này cho phépvirus đi qua màng nhày và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu của cơthể vật chủ NA cũng phá hủy các thụ thể dành cho HA trên bề mặt của tế bàohồng cầu, mặc dù các tế bào không phải là đối tượng gây nhiễm Cùng vớiprotease của tế bào chủ, NA tham gia tích cực vào quá trình phân cắt phân tử

HA và phân cắt mối liên kết giữa thụ thể tế bào với HA Nếu không có NA thìvirus sẽ bị bất hoạt do gắn chặt vào thụ thể sialic acid của tế bào chủ, khôngđược giải phóng ra khỏi tế bào và dẫn tới mất khả năng gây nhiễm tế bào.Vùng hoạt động của phân tử NA hoạt động ở đầu 5’ của phân tử này Đối vớicác chủng H5N1 độc lực cao, NA đã biến đổi rất nhiều qua quá trình tiến hóa.Các đột biến đó đã giúp cho virus trở nên thích nghi và gây bệnh cho nhiềuloại vất chủ khác nhau [9] Ở dạng NA-N1 của các chủng độc lực cao, trênphân tử protein này có đoạn nhỏ gọi là vùng “đảo ngược” tạo ra một lỗ hổng(hollow pocket), cấu trúc này không có ở N2 và N9 Các nghiên cứu đã chỉ rarằng chính cấu trúc này đóng vai trò như một nhân tố ức chế tác dụng của một

HA mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Các vaccine phòngbệnh hiện nay dựa trên cơ sở 2 loại chính là vaccine truyền thống và vaccinethế hệ mới [1].

- Vaccine truyền thống bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dịchủng Vaccine vô hoạt đồng chủng (homonogus) là loại vaccine được sảnxuất chứa cùng những virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa.Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous) là vaccine sử dụng virus có khángnguyên NA dị chủng [1]

- Vaccine thế hệ mới: Vaccine được sản xuất có sử dụng kỹ thuật ditruyền bao gồm:

+ Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên HA, NA tái tổ hợp vàtách chiết làm vaccine

+ Vaccine tái tổ hợp có chứa vecto đậu gia cầm dẫn truyền: Sử dụngvirus đậu gia cầm làm vecto tái tổ hơp mang gen H5 và N1 chống virus typeH5N1 và H7N1

+ Vaccine tái tổ hợp có vecto adenovirus dẫn truyền: Sử dụng plasmitadenovirus dẫn truyền, lắp ghép virus adeno có chứa gen kháng nguyên H5 từ

đó làm vecto tái tổ hợp H5 phòng chống virus type H5N1

+ Vaccine từ sản phẩm plasmit tái tổ hợp có chứa gen HA, NA, NP,M2 đơn lẻ hoặc đa gen

+ Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: Được sản xuất bằng kỹ thuật

di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gentrong đó gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuất

di truyền

1.3.2 Phòng bệnh bằng sử dụng hoá dược liệu.

Một số dạng hóa dược đang được dùng trong các thuốc ức chế virus

không đặc hiệu tác dụng ngăn cản quá trình giải phóng virus ra khỏi tế bàonhiễm (ức chế NA), hoặc ức chế quá trình thoát vỏ (cởi áo) và bao gói củavirus do ức chế vận chuyển protein NP vào nhân tế bào trong quá trình nhânlên của virus trong tế bào nhiễm [7]

Các chế phẩm chủ yếu là Rimantadine, Amantadine A/H5N1 đã xuấthiện sự kháng thuốc với hai thuốc này và Oseltamivir (Tamiflu) hoặc phác

đồ hỗn hợp cả hai loại Trong đó, Oseltamivir ức chế NA của mọi typevirus cúm, được sử dụng uống dự phòng trong vòng 48 h sau tiếp xúc vớimầm bệnh, và được sử dụng là thuốc dự trữ chiến lược phòng dịch cúm A/H5N1, tuy nhiên thuốc cũng có một vài tác dụng phụ trên người được ghinhận như gây rối loạn tâm thần và có thể gây độc sau điều trị liều cao, cầnchú ý khi sử dụng [1,7]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu.

Chủng virus cúm NIBRG-14 do viện Công Nghệ Sinh Học tiếp nhận từViện Quốc Gia về tiêu chuẩn và kiểm định sinh học (NIBSC, vương quốcAnh) là chủng được tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược

2.1.2 Các hoá chất dùng trong nghiên cứu.

Agarose, agar, EDTA, ethanol 70%, ethanol 100%, NaCl, cao nấm men,trypton, Amp, X-gal, MgCl2, SDS10%, chlorofrom, trizol, acetat natri, TAE,Sol I, Sol II, Sol III

2.1.3 Các trang thiết bị:

Bộ nguồn điện di, bộ điện di DNA, máy khuấy trộn Vortex, máy soichụp ảnh gel, máy lắc ổn nhiệt 370C, máy khuấy từ, máy li tâm lạnh, tủ lạnhsâu - 250C, - 750C,máy li tâm, lò vi sóng, máy hút chân không, cân phân tích

10-4g, cân điện 10-2g, phòng thí nghiệm cấp độ 3, box cấy an toàn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Đưa dịch đã li tâm vào ống eppendorf mới

- Bổ sung 0,5 isopropanol,đảo đều trong nhiệt độ phòng trong vòng 15phút

- Ly tâm 12.000 v/p trong vòng 30 phút ở 40C để thu tủa RNA

- Rửa tủa bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12.000 v/p trong vòng 15 phút

ở 40C

- Làm khô RNA trong box, hòa lại trong 20µl nước vô trùng đã loạiRNase

2.2.2 Kiểm tra RNA trên quang phổ kế

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại ởbước sóng 260nm của các bazơ purin và pirimidin Nồng độ RNA sợi đơn(µg/ml) sẽ được tính theo công thức: CRNA = A260 x 40 x d, với d là độ phaloãng mẫu cần đo Cách tiến hành như sau:

- Pha loãng dung dịch RNA pha loãng 20 lần trong nước vô trùng (5µldung dịch RNA trong 95µl nước)

- Dùng pipet chuyển dung dịch RNA đã pha loãng sang ống thạch anhcủa máy quang phổ Shimadzu và đo ở bước sóng 260nm

- Nồng độ RNA của mẫu đo sẽ được tính theo công thức trên với độpha loãng là 20 lần

2.2.3 Phương pháp tạo cDNA

Tổng hợp sợi cDNA từ RNA của virus giai đoạn này cần có enzymeReverse Transcriptase và mồi ngẫu nhiên

Phương pháp thực hiện như sau:

Chuẩn bị hỗn hợp RNA và mồi trong ống 0,5ml vô trùng với các thànhphần:

Chuẩn bị xong hỗn hợp ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá khoảng 1phút Tiếp tục chuẩn bị các thành phần khác bổ sung cho phản ứng:

- Bổ sung 9 µl hỗn hợp thành phần trên vào mỗi ống chứa RNA và mồi

đã sử lý ở 650C trong 5 phút, đảo nhẹ sau đó ly tâm 3000 v/p trong 30 giây

- Bổ sung 1 µl Rnase H vào mỗi ống và ủ ở 370C trong 20 phút để loại

bỏ toàn bộ RNA Mẫu chứa các sợi cDNA có kích thước khác nhau và cDNA

sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn DNA đặc hiệu bằngphương pháp PCR

2.2.4 Nhân bản gen mã hoá kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 chủng NIBRG-14 bằng phương pháp PCR

Phản ứng giai đoạn này cần có đoạn mồi đặc hiệu cho gen mã hoákháng nguyên HA của virus cúm và sự có mặt của Taq polymerase

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR.

Bước 6: 720C/8 phútBước 7: 40C/ vô cùng

2.2.5 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di

- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch đệmTAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuốngkhoảng 500C rồi đổ dung dịch vào khay agarose điện di có cài sẵn răng lược.Sau khoảng 30 phút khi gel đã đông, gỡ lược ra đổ gel vào bể điện di Đổ đệmTAE 1X vào để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm

- Tra mẫu: Lấy khoảng 5 µl sản phẩm trộn với 3 µl màu loadingdye10X tra vào các giếng nhỏ trong gel Chỉ thị phân tử là DNA đã được cắt phốibằng Hind III và EcoR I cũng được tra vào gel làm marker

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, 400 mA, trong khoảng 2 – 30phút DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Quan sát sự di chuyển củamàu bromophenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di