KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BÒ CẠP Heterometrus laoticus

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 - 2018 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỌ CẠP Heterometrus laoticus Nguyễn Hoàng Mỹ An Hướng dẫn khoa học: ThS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS Hoàng Thị Phương Liên

TP.HCM – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Đây là đề tài nghiên cứu của tôi

- Số liệu trong đề tài này là chính xác và trung thực

- Tôi xin chịu trách nhiệm về đề tài nghiên cứu của tôi

Chữ ký sinh viên

Nguyễn Hoàng Mỹ An

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Nguyễn Tất Thành, khoa Dược và bộ môn Dược lý đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn TSKH Hoàng Ngọc Anh đã đặt nền móng cho những nghiên cứu về

loài Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus), để từ đó em có cơ sở thực hiện

đề tài này

Em xin đặc biệt cảm ơn ThS.DS Hoàng Thị Phương Liên - bộ môn Dược lý đã truyền đạt những kiến thức cần thiết, những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

và đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn em thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên trong bộ môn Dược lý đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Hội đồng phản biện đã đưa ra các nhận xét và góp ý quý giá để báo cáo khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, mình cảm ơn các bạn trong nhóm monitor bộ môn Dược lý đã hỗ trợ, giúp

đỡ mình hoàn thành khóa luận

Sinh viên Nguyễn Hoàng Mỹ An

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP 2

1.1.1 Giới thiệu về bò cạp 2

1.1.2 Độc tính của nọc bọ cạp 4

1.1.3 Tác dụng dược lý của nọc bọ cạp 5

1.1.4 Cơ chế tác động của nọc bọ cạp 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus) 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU 12

1.3.1 Tiểu cầu 12

1.3.2 Cầm máu 15

1.3.3 Rối loạn đông máu 19

1.3.4 Những chất chống đông máu 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN LIỆU 23

2.1.1 Nọc Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 23

2.1.2 Động vật thử nghiệm 23

2.1.3 Dụng cụ 23

2.1.4 Hóa chất 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP 24

2.3 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 25

3.1 KẾT QUẢ 25

3.1.1 Tác động của chất khảo sát lên quá trình đông máu 25

3.1.2 Tác động của chất khảo sát lên quá trình chảy máu 26

3.2 BÀN LUẬN 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 31

4.1 KẾT LUẬN 31

4.2 ĐỀ NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

ADP Adenosine diphosphate

BKCa Big conductance potassium

channel

Kênh Kali được hoạt hóa bởi Calci

có độ dẫn lớn

BmK Buthus martensi Karsch

DIC Disseminated intravascular

Kênh Kali được hoạt hóa bởi Calci

Kv Voltage-gated potassium

channel

Kênh Kali cảm ứng điện thế

Nav Voltage-gated sodium channel Kênh Natri cảm ứng điện thế

PAF Platelet activator factor Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu

PPP Platelet poor plasma Huyết tương nghèo tiểu cầu

PRP Platelet rich plasma Huyết tương giàu tiểu cầu

rNav Human voltage-gated sodium

channel

Kênh Natri cảm ứng điện thế ở chuột

RyR Ryanodine receptor Thụ thể Ryanodin

SKCa Small conductance potassium

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bọ cạp hóa thạch 2

Hình 1.2 Cấu tạo cơ thể bò cạp Androctonus crassicauda 3

Hình 1.3 Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus) 10

Hình 1.4 Phần đuôi (metasoma) của Heterometrus laoticus 11

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình sinh tiểu cầu 13

Hình 1.6 Các tế bào máu 13

Hình 1.7 Hình dạng tiểu cầu 13

Hình 1.8 Cấu trúc của tiểu cầu 14

Hình 1.9 Quá trình đông máu 17

Hình 1.10 Các giai đoạn của quá trình đông máu 17

Hình 1.11 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu, tạo cục máu đông 18

Hình 1.12 Quá trình tan cục máu đông 19

Hình 3.1 Thời gian đông máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg 25

Hình 3.2 Thời gian chảy máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg 27

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu trong huyết tương 18Bảng 3.1 Thời gian đông máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%) 25Bảng 3.2 Thời gian chảy máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%) 27

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 - 2018 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐÔNG MÁU

CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN NỌC BỌ CẠP (Heterometrus laoticus)

Nguyễn Hoàng Mỹ An Hướng dẫn khoa học: ThS Hoàng Thị Phương Liên Đặt vấn đề

Phân đoạn 5 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus An Giang có tác động chống đông mạnh vượt trội ở thử nghiệm in vitro Từ phân đoạn 5, đã phân lập được 24 phân đoạn thứ cấp, trong

đó có 3 phân đoạn sạch là 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 Đề tài này được thực hiện nhằm khảo sát tác động của phân đoạn 5 và các phân đoạn thứ cấp trên lên thời gian đông – chảy máu

Đối tượng – phương pháp

Nọc bọ cạp: phân đoạn 5, các phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 được cung cấp bởi

TSKH Hoàng Ngọc Anh (Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện hàn lâm khoa học và công

nghệ Việt Nam, Thành phố Hồ Chí Minh)

Động vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss albino do Viện Vắc xin và

sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp

Phương pháp: Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột dung dịch NaCl 0,9% (lô chứng) và các phân đoạn

khảo sát pha trong NaCl 0,9% với liều 2,48 mg/kg (lô thử), thể tích tiêm là 0,1 ml/10g thể trọng chuột

Thời gian chảy máu: Cắt 1 đoạn đuôi chuột (dài 5 mm, đường kính 1,5 mm) từ đầu mút ngoài

Nhúng phần đuôi còn lại vào dung dịch NaCl 0.9% ở 37oC Tính thời gian chảy máu tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm

Thời gian đông máu: Lấy 1 giọt máu (đường kính 6-7 mm) từ vết cắt đuôi chuột lên lam kính

Tính thời gian đông máu tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau tiêm

Kết quả

Phân đoạn 5 và các phân đoạn thứ cấp được khảo sát cho thấy tác dụng kéo dài thời gian đông – chảy máu so với nhóm chứng Trong đó, phân đoạn thứ cấp 5.5.1, 5.22.3 có tác động mạnh hơn và phân đoạn thứ cấp 5.21.1 có tác động yếu nhất

Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2013 – 2018

ANTICOAGULANT ACTIVITY OF FRACTIONS FROM Heterometrus laoticus

SCORPION VENOM Nguyen Hoang My An Supervisor: Hoang Thi Phuong Lien Introduction

The fraction 5 of Heterometrus laoticus venom (from An Giang province, Viet Nam) shows anticoagulant activity in vitro This fraction was separated into 24 sub-fractions and 3 of them

(5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3) are clean Therefore, this study was conducted to investigate the

anticoagulant activity of fractions 5, 5.5.1, 5.21.1 and 5.22.3 in vivo

Materials – Methods

Scorpion venom: fraction 5, sub-fractions 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (provided by D.Sc Anh Ngoc

Hoang, Institute in Applied Materials Science, Vietnam Academy of Science and Technology,

Ho Chi Minh City)

Mice: Swiss albino mice were provided by Institute of Vaccines and Biological Medical- IVAC Method: Solution of the fractions in 0,9% NaCl were injected into the lateral vein of the mouse

tail at a dose of 2,48 mg/kg (injection volume 0,1 ml/10g of body mouse weight) The mice of the control group received only 0,9% NaCl solution

Determination of Bleeding Time: Amputate the mouse tail (about 5 mm long from the outside

end, diameter of about 1,5 mm), soak the remaining tail into the 0,9% NaCl solution at 37oC Calculate the bleeding time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection

Determination of Blood Coagulation Time: Take a drop of blood from the amputated tail on the

glass (diameter of about 6-7 mm) Calculate the clotting time at 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after injection

The results

Fraction 5 and 3 sub-fractions have bleeding time and blood coagulation time longer than control Specifically, sub-fraction 5.5.1, 5.22.3 have stronger effect and sub-fraction 5.21.1 has weaker effect

38, 41, 54-56] Ngoài ra, chúng đã mở ra tiềm năng phát triển các thuốc điều trị rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50] và điều trị ung thư [24]

Heterometrus laoticus còn được gọi là bò cạp đen hoặc bò cạp rừng là một trong

những loại bò cạp phổ biến ở miền Nam Việt Nam Những năm qua đã có những nghiên cứu về nọc độc của loài bò cạp này và đã chứng minh được chúng có tác dụng

kháng khuẩn [51], giảm đau – kháng viêm [6-10, 33] Từ nọc bò cạp Heterometrus

laoticus An Giang, đã tách được 5 phân đoạn (PĐ) TSKH Hoàng Ngọc Anh cùng

các đồng sự đã chứng minh được các PĐ 2, 4 và 5 có tác dụng chống đông máu trong

thử nghiệm in vitro [2] Cũng từ PĐ 5, đã có 24 phân đoạn thứ cấp (PĐTC) được

phân lập, trong đó có 3 PĐTC sạch là 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3

Đề tài “KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG ĐÔNG MÁU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN

NỌC BÒ CẠP Heterometrus laoticus” được thực hiện nhằm khảo sát hoạt tính chống

đông máu của 3 PĐTC Từ đó, đóng góp thêm một phần nguyên liệu nhằm phát triển các thuốc chống đông máu, hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối – nguyên nhân chủ yếu dẫn đến đột quỵ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP

Hình 1.1 Bọ cạp hóa thạch

(a) Allopaleopholus caledonicus (b) Protobuthus elegans (c) Gallioscorpio voltzi

(d) Protoischnurus axelrodorum (e) Archaeobuthus estephani

(f) Palaeolychas balticus [27]

Bò cạp được tìm thấy ở khắp nơi trên Thế giới, trừ Bắc Cực, nhưng phân bố chủ yếu

ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, sa mạc và bán sa mạc Chúng là động vật ăn đêm

và nhút nhát, thường chỉ sống dưới các tảng đá, các khe nứt, lớp vỏ cây và gốc tối của những ngôi nhà [27]

 Đặc điểm hình thái của bò cạp

Cơ thể bò cạp được chia thành 2 phần: phần đầu-ngực (prosoma) và phần bụng (opisthosoma) Toàn thân bò cạp được bao phủ bởi một lớp vỏ gồm chitin, protein và chúng lớn lên bằng cách lột xác [27]

Phần prosoma được bảo vệ bởi một “cái mai” có hình thang hoặc hình chữ nhật Bộ phận này mang 1 cặp mắt trung tâm, 2-5 cặp mắt bên và có cánh thìa Chúng có 1 cặp chi phụ trước miệng (chân kìm), 1 cặp càng, 4 cặp chân đi và không có râu [27] Phần opisthosoma lại được chia thành 2 phần nhỏ hơn là phần bụng trước (mesosoma)

và phần đuôi (metasoma) Mesosoma có 7 đốt, chứa phổi và bộ phận sinh dục Metasoma có 5 đốt hẹp và có thể chuyển động linh hoạt Opisthosoma kết thúc ở bộ phận telson (túi chức nọc độc) và ngòi đốt [27]

Hình 1.2 Cấu tạo cơ thể bò cạp Androctonus crassicauda

Chân kìm Càng Mắt Chân 1 Chân 2

Chân 3 Đốt bụng trước Chân 4

Đốt đuôi Telson Ngòi đốt

1.1.2 Độc tính của nọc bọ cạp

Bò cạp là loài động vật có độc và có thể gây chết người, có 2100 loài thuộc 190 chi

và 16-19 họ Trong đó, Buthidae và Hemiscorpiidae là 2 họ bọ cạp rất nguy hiểm cho con người [27]

Nọc độc của bò cạp có khả năng làm tê liệt các bộ phận của cơ thể con người và súc vật Bò cạp châu Phi là loài độc nhất, giết chết người nhanh hơn cả rắn độc Vết đốt của nó gây ra đau đớn dữ dội, làm nạn nhân vã mồ hôi, tim đập nhanh, co giật mạnh, các cơ bị tê liệt dẫn đến tử vong Bò cạp Việt Nam đốt chỉ gây sưng đau, nhức nhối

và phù nề, nhưng không gây chết người [3]

Độc tính nọc bò cạp ảnh hưởng chủ yếu lên hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa,… [36]

- Hệ thần kinh thực vật: nọc độc bò cạp gây kích thích hệ thần kinh thực vật, bao gồm cả hệ giao cảm và hệ phó giao cảm

 Hệ phó giao cảm (hệ cholinergic): tăng tiết nước bọt, chảy nước mắt, co đồng

tử, tăng tiết phế quản, tiêu chảy, nôn mửa, nhịp tim chậm, hạ huyết áp, cương dương,…

 Hệ giao cảm (hệ adrenergic): nhịp tim nhanh, tăng huyết áp, giãn đồng tử, thân nhiệt cao, tăng đường huyết, lo âu, bồn chồn,…

Trong hầu hết các trường hợp, phản ứng phó giao cảm thường xảy ra sớm hơn

- Hệ thần kinh cơ: sự kích thích hệ thần kinh ngoại biên của nọc độc dẫn đến hoạt động thần kinh cơ bất thường như rối loạn thị giác, co cơ và động kinh,…

- Hệ tim mạch: loạn nhịp tim, ngoại tâm thu thất, đảo ngược sóng T, block nhánh (bundle-branch block), suy tim, hôn mê, suy đa tạng…là những tình trạng có thể gặp phải khi bị bò cạp đốt

- Hệ tiêu hóa: nọc độc có thể làm nạn nhân nôn mửa, tiêu chảy, viêm tụy cấp… Nọc độc tác động trực tiếp lên các tế bào biểu mô ống thận, gián tiếp lên hệ thần kinh thực vật và gây ra phản ứng viêm, nên thận (đặc biệt là ống thận) là một trong những

cơ quan chịu ảnh hưởng nặng nề của nọc bò cạp [46]

Ngoài ra, nọc độc loài này còn ảnh hưởng đến sự phát triển của thai nhi và trẻ nhỏ khi được sử dụng cho phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu sâu hơn nhằm xác định các cơ quan và mức độ ảnh hưởng của nọc độc lên sự phát triển của trẻ [25]

1.1.3 Tác dụng dược lý của nọc bọ cạp

Trong y học cổ truyền, bò cạp được sử dụng cả con (toàn yết) hoặc chỉ sử dụng đuôi (yết vĩ) Nọc bò cạp cũng được sử dụng rộng rãi Bò cạp có vị mặn, hơi ngọt, cay, tính bình, có độc, vào kinh can, có tác dụng trấn kinh, khu phong Vị thuốc được dùng

để chữa kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn ván, tràng nhạc [3] Trong nền y học hiện tại, nọc bò cạp là một đối tượng nghiên cứu tiềm năng do có các tác dụng dược lý quan trọng

Các peptide trong nọc độc bò cạp đã được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn

(trên cả các chủng gram dương và gram âm), kháng nấm (Candida albicans,

Fusarium culmorum và Fusarium oxysporum), kháng virus (virus viêm gan C (HCV),

herpes simplex virus type 1 (HSV-1), virus sởi, SARS-CoV, virus cúm H5N1,

H1N1,…), và kháng kí sinh trùng (Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum)

[53]

Loài Buthus martensi Karsch (bò cạp vàng Trung Quốc) có khả năng giảm đau do

chứa các toxin BmK IT-AP, BmK dIT-AP3 (hoặc BmK IT2), BmK AngP1, BmK AS

và BmK AS1 [17, 29-30, 38, 54] BmK AS thể hiện tác động giảm đau cả ngoại biên lẫn trung ương và phản ứng đau giảm rõ rệt theo các liều thử nghiệm [38] Hơn nữa, BmK IT2 và BmK AS còn cho thấy tác động kháng viêm [17, 29], chống co giật [55-56] Từ đó, chúng tạo tiềm năng phát triển các thuốc chống động kinh Cơ chế được đưa ra cho các tác dụng này là sự tác động lên kênh Na+ trên các tế bào thần kinh của các toxin trong nọc bò cạp [18, 55-56]

Các peptide trong nọc của loài động vật này cho thấy tác động thúc đẩy hội chứng priapism – hội chứng cương dương kéo dài dai dẳng, không liên quan đến kích thích

tình dục Các nghiên cứu đã chứng minh rằng nọc của các loài bò cạp Androctonus

australis, Buthotus judaicus, toxin Ts3 trong nọc của Tityus serrulatus (bò cạp vàng

Brazil) có tác động kích thích giải phóng nitric oxide (NO) khỏi các dây thần kinh nonadrenergic và noncholinergic (NANC), gây giãn cơ trơn thể hang trong cấu trúc dương vật, thúc đẩy hình thành priapism Điều này có ý nghĩa trong việc phát triển các tác nhân dược lý mới nhằm điều trị các rối loạn cương dương [12-13, 42, 48-50] Nọc bò cạp còn mở ra tiềm năng phát triển các thuốc điều trị ung thư Chlorotoxin

(một peptide nhỏ được tinh chế từ nọc loài bò cạp Leiurus quinquestriatus) là một

chất độc thần kinh, đóng vai trò như chất chẹn kênh Cl- Toxin có tác động ưu tiên trên một loạt các khối u ác tính ở người, điển hình là các u thần kinh đệm (glioma) nhưng lại ít hoặc không liên kết với các mô bình thường [40, 43, 47] Trong các nghiên cứu khác, những peptide tương tự chlorotoxin đã được tinh chế, tái tổ hợp từ

bò cạp Buthus martensi là rBmK Cta, Bm-12 và Bm-12b cũng cho thấy tác động lên

kênh Cl-, đặt biệt là rBmK Cta gây ức chế sự tăng trưởng của các tế bào u thần kinh theo liều nhưng không có tác động lên các tế bào hình sao [26, 29] Ngoài ra, loài bò

cạp Rhopalurus junceus ở Cuba cũng đã được chứng minh là có tác động chọn lọc

trên các tế bào ung thư biểu mô [24]

Năm 1974, nọc thô của loài Leiurus quinquestriatus đã được chứng minh có tác dụng

chống đông máu ở động vật có vú và các yếu tố chống đông trong các PĐ tinh khiết

của nọc loài Palamneus gravimanus có tác động ngăn cản hoạt động của thrombin [31] Trong nọc loài Tityus discrepans cũng chứa các thành phần có hoạt tính ức chế yếu tố X hoạt hóa [14] Nọc độc từ bò cạp Mexico Anuroctonus phaiodactylus đã

được báo cáo là gây ra tác động làm chậm thời gian đông máu của PRP và PPP ở người [41]

1.1.4 Cơ chế tác động của nọc bọ cạp

Nọc bò cạp là một hỗn hợp phức tạp của các peptide, nucleotide, lipid, mucoprotein, amin sinh học, vài enzyme hiếm và các chất chưa được biết đến khác [27] Trong đó, các polypeptide neurotoxic tác động lên các kênh ion của hệ thần kinh, đóng vai trò quan trọng giúp nọc bò cạp có độc tính cũng như thể hiện các tác dụng dược lý [16,

29] Các kênh ion mà các toxin trong nọc bò cạp tác động đến bao gồm: kênh Natri cảm ứng điện thế (Nav), kênh Kali cảm ứng điện thế (Kv), kênh Kali được hoạt hóa bởi Calci (KCa), kênh Calci và kênh Chloride

Trong bài tổng hợp “Scorpion toxin peptide action at the ion channel subunit level”

được đăng trên tờ Neuropharmacology năm 2017 của David M Housley và các đồng

Maurotoxin (Scorpio maurus palmatus) ức chế chọn lọc mạnh nhất lên IKCa và

Tamapin (Mesobuthus tamulus) có tác động mạnh nhất lên SKCa

- Có 16 peptide ảnh hưởng lên kênh Ca2+ và có 2 peptide tác động lênh kênh Cl-

 Toxin tác động lên kênh Natri cảm ứng điện thế (Na v )

Peptid trong nọc bò cạp tác động lên Nav gồm 2 loại toxin: α-toxin và β-toxin Các peptide được gọi là α-toxin hay β-toxin là do vị trí gắn kết của chúng trên kênh Na+ α-toxin liên kết với receptor site 3, trong khi β-toxin liên kết với receptor site 4 của kênh Na+ [27]

α-toxin có ái lực phụ thuộc điện thế màng, có tác dụng chính là làm chậm hoặc ức chế quá trình bất hoạt của kênh Na+ trong các tế bào thần kinh, cơ và tim [20, 29] Chúng là các polypeptide gồm các chuỗi có 61-76 amino acid nối với nhau bằng 4 cầu nối disulfide, được chia thành 3 nhóm chính [28]:

(1) Các α-toxin cổ điển, hoạt động mạnh trên não động vật có vú và có ái lực cao với

synaptosome trong não chuột Các toxin như Aah1, Aah2, Aah3 (Androctonus

australis hector), Lqq5 (Leiurus quinquestriatus quinquestriatus) và Bot3

(Buthus occitanus tunetanus) là những toxin lần đầu tiên được xác định thuộc

nhóm này vì có độc tính cao với con người [28, 44];

(2) Các α-toxin hoạt động mạnh trên côn trùng như LqhαIT (Leiurus quinquestriatus

hebraeus), Lqq3 (Leiurus quinquestriatus quinquestriatus), BotIT1 (Buthus occitanus tunetanus) và BjαIT (Hotentota Judaica) có ái lực cao với tế bào thần

kinh côn trùng [28];

(3) Các toxin tương tự α-toxin có hoạt tính trên cả động vật có vú và côn trùng như

Lqh3 và Lqh6 (Leiurus quinquestriatus hebraeus), Bom3 và Bom4 (Buthus

occitanus mardochei) và BmK M1 (Mesobuthus martensii Karsch.) [28]

β-toxin gắn với một vị trí thụ thể cụ thể có trong các synaptosome độc lập với điện thế màng có trong não chuột [15], làm thay đổi quá trình hoạt động của các kênh Na+[29] Các β-toxin là các polypeptie có 61 amino acid với 8 cystein nối với nhau qua

4 cầu nối disulfide [29], được chia làm 4 nhóm dược lý [27]:

- β-toxin tác động trên động vật có vú như Css4 (Centruroides suffusus suffusus), Cn2 (Centruroides noxious) gắn kết ái lực cao với synaptosomes não chuột;

- β-toxin kích thích chọn lọc với côn trùng như AahIT (Androctonus australis), xtrIT (Hottentotta judaicus) gây liệt co cứng do tác động lặp đi lặp lại của dây thần

Bj-kinh vận động, làm tăng dòng điện và làm chậm lại quá trình khử hoạt của Nav;

- β-toxin ức chế côn trùng như LqhIT2 và Lqh-dprIT3 (Leiurus quinquestriatus

hebraeus), BotIT2 (Buthus occitanus tunetanus) có ái lực cao với Nav của côn trùng và không gây hại trên chuột, toxin gây liệt mềm, trái ngược với chứng liệt cứng ở toxin kích thích;

- β-toxin có ái lực cao với cả động vật có vú và côn trùng như Ts1 (Tityus serrulatus)

và Lqhβ1 (Leiurus quinquestriatus hebraeus) Hầu hết β-toxin có tác động thay

đổi sự hoạt hóa của rNav1.2 não chuột và rNav1.4 cơ xương cùng cơ chế, nhưng không ảnh hưởng hNav1.5 trên tim

 Toxin tác động lên kênh Kali (KTx)

Các peptide ức chế kênh K+ đầu tiên được phân lập là từ nọc độc của loài bò cạp

Centruroides noxius [29]

Nhóm KTx bao gồm các peptide chuỗi ngắn với 23-43 dư lượng amino acid và chuỗi dài với 42-84 dư lượng và cấu trúc được ổn định bởi 3-4 cầu nối disulfide Các toxin này được chia thành 4 nhóm: α, β, γ và κ dựa vào cấu trúc giống nhau và đặc trưng cho từng kênh K+ riêng biệt [27]

- α-KTx được phát hiện sớm nhất, đến nay đã có 133 chất là các chuỗi peptide ngắn (23-43 acid amin), ổn định bằng 3-4 cầu disulfide, có tác động chẹn kênh KCa;

- β-KTx dài hơn α-KTx (47-84 acid amin và 3 cầu disulfide), có nguồn gốc từ họ Buthidae, Caraboctonidae và Scorpionidae Toxin này chứa 2 miền: N-terminal có hoạt tính phân giải độc tố và C-terminal chẹn kênh K+;

- γ-KTx có 36-47 amino acid và phần lớn có 4 cầu disulfide Hiện nay đã có 29 toxin thuốc nhóm này;

- κ-KTx là nhóm mới nhất của KTx gồm các peptide có 22-28 acid amin và 2 cầu disulfide Chúng có nguồn gốc từ họ Scorpionaidae và Liochelidae Hiện nay đã

có 18 κ-KTx được liệt kê trong danh sách của UniProt;

 Toxin tác động lên kênh Calci

Các peptide đầu tiên được biết là có hoạt tính trên receptor ryanodine (RyR) – receptor của kênh Calci nhóm ligand-activated channel, được tìm thấy trong nọc loài

bò cạp Buthotus hottentota Ryanotoxin (peptide 11KD của Buthotus judaicus) làm

tăng phóng thích Ca2+ từ mạng nội cơ tương và cũng gây ra giảm độ dẫn của các RyR

2 peptid khác của Buthotus judaicus là BjtX-1 và BjtX-2 cũng ảnh hưởng kênh Ca2+

ở màng nội cơ tương của cơ vân nhưng không ảnh hưởng đến gan và tim Toxin

BmK-AS và BmK-AS1 (từ loài BmK) kích thích sự gắn kết với ryanodine với RyR trong cơ vân thỏ IpTxi và Iptxa (Pandinus imperator) là 2 peptide đầu tiên được báo

cáo là có ái lực cao với RyR IpTxi ức chế gián tiếp RyR xương và tim, IpTxa (Imperatoxin A) làm tăng gắn kết ryanodine với RyR xương nhưng không có tác dụng

ở tim [45]

Ngoài ra, kurtoxin (toxin của Parabuthus transvaalicus) có ái lực cao với α1G T-type

của kênh Ca2+ Toxin này có sự phân biệt giữa các kênh Calci T-type α1G và các kênh khác gồm α1A, α1B, α1C và α1E [19]

 Toxin tác động lên kênh Chloride

Nọc độc loài Leiurus quinquestriatus đã được chứng minh là có khả năng chẹn kênh

Cl- có độ dẫn điện nhỏ [23] Đó là 1 peptid cơ bản nhỏ có 4070 Da [22]

1.2 TỔNG QUAN VỀ BÒ CẠP ĐEN AN GIANG (Heterometrus laoticus)

Heterometrus thuộc phân họ Scorpioninae, họ Scorpionnidae – 1 trong 24 họ bò cạp còn tồn tại đến ngày nay Các loài Heterometrus phân bố ở Ấn Độ, Sri Lanka, Burma, Borneo, Philipine và châu Phi Có khoảng 33 loài Heterometrus được tìm thấy chủ

yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á [27] Loài Heterometrus laoticus

phân bố chủ yếu ở Lào, Campuchia, miền Nam Thái Lan và miền Nam Việt Nam [21]

 Đặc trưng về hình thái của Heterometrus laoticus

Heterometrus laoticus trưởng thành dài từ 90-125 mm và có màu đen, riêng manus

(phần thịt của chela trước các ngón (finger)) và telson có thể có màu nâu đỏ Ở cả hai giới đực và cái, các răng số 15-19 xếp thành dạng lược [37]

Hình 1.3 Bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)

Chela của loài này có tỷ lệ dài và rộng là 2 – 2,3 và có manus nhẵn Lớp giáp và phần mesosoma nhẵn và không có các hạt nhỏ Telson có nhiều lông, thuôn dài và có bọng dài hơn phần ngòi đốt [37]

manus

chela telson

finger patella

Hình 1.4 Phần đuôi (metasoma) của Heterometrus laoticus

 Nọc bò cạp đen An Giang (Heterometrus laoticus)

Các dấu hiệu lâm sàng gặp phải khi bị các loại bò cạp trong loài Heterometrus đốt là: sưng – đau cục bộ, tấy đỏ hoặc đổi màu, hạ huyết áp, bồn chồn, suy hô hấp, buồn nôn, nôn, đau bụng, khát nước, đau đầu, sốt, run và sốc [27]

Ở Việt Nam, nọc bò cạp Heterometrus laoticus của 2 tỉnh An Giang và Tây Ninh đã được tiến hành nghiên cứu Nọc Heterometrus laoticus 2 vùng này tương đối giống

nhau, đều tách được 10 PĐ (bằng phương pháp sắc ký cột Bio-gel P 10 và phương pháp điện di) Trong đó, 2 PĐ độc 6 và 7 chứa các neurotoxin – các protein nằm trong vùng 3-8 kDa Tuy nhiên, trong nọc bò cạp An Giang, PĐ 6 độc hơn 7, trong khi nọc

bò cạp Tây Ninh thì phân đọc 7 độc hơn Như vậy, nọc của bò cạp tại 2 tỉnh này không giống nhau hoàn toàn [1]

Qua mô hình thử độc tính cấp, nọc độc bò cạp Heterometrus laoticus An Giang có

LD50 được xác định là 190,0 ± 1,7 mg/kg cân nặng chuột qua đường tiêm dưới da và 12,0 ± 0,6 mg/kg qua đường tiêm tĩnh mạch Còn trong mô hình độc tính bán trường diễn, nọc bò cạp tiêm hàng ngày dưới da với liều 0,1 mg/ 10g thể trọng/ ngày trong

30 ngày gây hoại tử da nhưng chưa biểu hiện độc tính trên gan, thận và huyết học trong một tháng thử nghiệm Nọc loài bò cạp này thể hiện được tác dụng giảm đau –

kháng viêm trên chuột [6-7, 10, 33] Tác dụng này cũng có đối với Heterometrus

laoticus Tây Ninh (LD50 = 170 ± 0,95 mg/kg qua đường tiêm dưới da) [8-9]

Đã có vài polypeptide được phân lập ra từ nọc Heterometrus laoticus là

Heteroscorpine 1 (HS-1), HelaTx1, Hetlaxin và Heteromtoxin (HmTx) HS-1 là toxin đầu tiên được phân lập, có khối lượng phân tử là 8293 Da và có tác động chẹn kênh

K+ HS-1 có tác động trên các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Klebsiella

pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa mạnh gấp 300 lần so với nọc thô [51]

HelaTx1 là thành viên đầu tiên của phân họ κ-KTx5 [52] Toxin này tác động trên các kênh K+ khác nhau và hoạt động mạnh nhất trên Kv1.1 [33] Hetlaxin (thuộc

nhóm α-toxin) là toxin đầu tiên được phân lập từ nọc Heterometrus laoticus có ái lực

cao với Kv1.3 [32-33] Heteromtoxin (HmTx) có nucleotide chứa 649 bp (base pair) với cấu trúc protein trưởng thành gồm 131 amino acid dư lượng (tiểu đơn vị lớn gồm

104 amino acid, tiểu đơn vị nhỏ gồm 27 amino acid) [35]

Cũng như một vài loài bò cạp khác, Heterometrus laoticus cũng thể hiện hoạt tính chống đông máu Từ nọc Heterometrus laoticus An Giang, đã tách ra được 5 PĐ

Trong đó, PĐ 2, 4 và 5 thể hiện được tác động chống đông máu trong các thử nghiệm

in vitro Ở nồng độ 5 mg/ml, PĐ 2 có thời gian đông máu gấp đôi so với mẫu đối

chứng trong xét nghiệm Prothrombin; PĐ 4 và 5 gây ra quá trình chậm đông máu trong xét nghiệm APTT (thời gian đông máu cục bộ) do tăng thời gian đông máu cục

bộ và PĐ 5 có tăng thời gian đông máu hơn 10 lần so với mẫu đối chứng [2]

1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH CẦM MÁU

1.3.1 Tiểu cầu

 Nguồn gốc

Tiểu cầu là những mảnh tế bào được tách ra từ một tế bào rất lớn, được gọi là mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) – có nguồn gốc từ tế bào gốc sinh máu vạn năng trong tủy xương Một mẫu tiểu cầu có thể sinh ra 6000 tiểu cầu [11]

Phần lớn mẫu tiểu cầu nằm lại trong tủy xương và giải phóng tiểu cầu vào máu Tuy nhiên, có một số mẫu tiểu cầu theo máu đến các cơ quan khác, đặc biệt là phổi và chúng sản sinh tiểu cầu tại đây Lách cũng là một cơ quan dự trữ tiểu cầu Số lượng tiểu cầu ở nam là 263 ± 61 G/l, ở nữ là 274 ± 63 G/l [11]

Hình 1.5 Các giai đoạn của quá trình sinh tiểu cầu

 Cấu trúc

Tiểu cầu là những mảnh hình đa giác, hình đĩa rất nhỏ (nhỏ nhất trong số các tế bào máu), đường kính từ 2-4 μm và không có nhân

Hình 1.6 Các tế bào máu Hình 1.7 Hình dạng tiểu cầu

Màng tiểu cầu tích điện âm mạnh, có nhiều chỗ lõm vào trong bào tương làm tiểu cầu

có tính xốp và tăng diện tích bề mặt lên rất nhiều Trên màng tiểu cầu có các receptor với collagen, yếu tố von-Willebrand thành mạch và fibrinogen Bào tương tiểu cầu

có actin, myosin và thrombosthenin Các protein này giúp tiểu cầu co lại và giải phóng các chất chứa trong các hạt đó như:

- Hạt alpha chứa nhiều enzyme và một protein có tác dụng sửa chữa thành mạch sau tổn thương (yếu tố tăng trưởng)

- Thể đông đặc rất giàu Ca2+, serotonin, adenosinediphosphat (ADP)

Hồng cầu

Bạch cầu

Tiểu cầu

Ngoài ra, tiểu cầu còn chứa yếu tố von-Willebrand, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (platelet activator factor – PAF) và yếu tố ổn định fibrin (XIII) [11]

Hình 1.8 Cấu trúc của tiểu cầu

 Đặc tính chính

Khả năng hấp phụ và vận chuyển các chất: trong quá trình tiếp xúc, tiểu cầu có khả

năng hấp phụ các chất trong huyết tương và các tế bào của tổ chức khác để tạo thành lớp khí quyển quanh tiểu cầu Nhờ đó mà các chất thiết yếu cho quá trình cầm máu

và đông màu được lưu hành tới nơi cần thực hiện nhiệm vụ [11]

Khả năng kết dính của tiểu cầu: tiểu cầu có khả năng dàn ra vào bám dính vào các tổ

chức dưới nội mạc, collagen,… do lực hút tĩnh điện giữa tiểu cầu và cơ chất, cùng với sự tham gia của một số yếu tố: Ca2+, các yếu tố huyết tương, yếu tố von-Willebrand,… [11]

Khả năng ngưng tập của tiểu cầu: tiểu cầu có khả năng kết dính lẫn nhau tạo thành

các kết tập tiểu cầu gọi là hiện tượng ngưng tập tiểu cầu Nhờ đó mà tiểu cầu có thể thực hiện chức năng của mình [11]

Khả năng thay đổi hình dạng và giải phóng của tiểu cầu: sau ngưng tập là quá trình

thay đổi hình dạng và giải phóng của tiểu cầu: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại,… Sau đó, tiểu cầu co rút, giải phóng một loạt các yếu tố (serotonin, adrenalin, histamine, yếu tố 3 tiểu cầu,…) Quá

Vi ống Glycogen

Ty thể

Hạt lysosoma Hạt α

Hạt đặc

Chất chuyển hóa

Hệ thống kênh mở bề mặt Màng tế bào