Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ r2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh vĩnh phúc

Đứng trước những khó khăn thách thức đó, năm 2012 tôi đã nghiên cứu và bảo vệ thành công đề tài luận văn thạc sĩ về “Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo ch

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VĨNH PHÚC TRƯỜNG THPT

NGUYỄN THỊ GIANG 

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN

Tên sáng kiến kinh nghiệm: “ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỌN LỌC THẾ HỆ R2 CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ

SẸO CHỊU LẠNH TẠI TỈNH VĨNH PHÚC”

Tác giả sáng kiến: Dương Thị Thu Huyền

Vĩnh Phúc, năm 2019

i

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ……….iii

DANH MỤC BIỂU BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

1 LỜI GIỚI THIỆU 1

2 TÊN SÁNG KIẾN 2

3 TÊN TÁC GIẢ: 2

4 CHỦ ĐẦU TƯ: 2

5 LĨNH VỰC ÁP DỤNG: 3

6 NGÀY ÁP DỤNG SÁNG KIẾN: 3

7 MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN 3

7 1 Mục tiêu nghiên cứu 3

7 2 Nội dung nghiên cứu 3

7.3 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu và xử lý kết quả , tính toán số liệu 3

7.3.1 Vật liệu nghiên cứu 3

7.3.2 Phương pháp nghiên cứu 5

7.3.3 Xử lý kết quả và tính toán số liệu 19

7.4 Kết quả và thảo luận 20

7.4.1 Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh 20

7.4.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R3 27

7.4.3 Đánh giá chất lượng hạt của một số dòng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH thông qua một số chỉ tiêu hóa sinh 34

7.4.4 Phân lập và tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả năng chịu lạnh ở lúa 36

8 NHỮNG THÔNG TIN CẦN BẢO MẬT (NẾU CÓ) 41

9 CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN 41

10 ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH CỦA VIỆC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN 42

11 DANH SÁCH NHỮNG TỔ CHỨC, CÁ NHÂN THAM GIA ÁP DỤNG THỬ HOẶC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN LẦN ĐẦU: 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4D –dichlorphenoxyacetic acid

ABA Abscisic acid

DNA Deoxyribo nucleic acid

BAP 6 – Benzyl amino purin

ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ

EDTA Ethylen diamin tetra axetic acid

FAO Food Agriculture Orgnization

KLK Khối lượng khô

mRNA ARN thông tin

PCR Phản ứng chuỗi polymerase

TAE Tris axetat EDTA

XCH Xuân Châu Hương

iii

2.3 Mồi nhân gen osDREB1F ở lúa

Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen

Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 4oC± 0,5oC 3.3

trong 32 giờ ở giai đoạn cây mạ 3 lá của các dòng chọn

lọc thế hệ R3

44910

11

24

36

29

iv

DANH MỤC HÌNH

3.1 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27 203.2 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH 213.3 Các dòng chọn lọc R3 ở giai đoạn mạ ở thời điểm 28

trước trước và sau khi xử lý bởi lạnh

3.4 Kết quả tách chiết DNA tổng số của 2 mẫu lúa 363.5 Kết quả nhân gen osDREB1F của 2 mẫu lúa 373.6 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 38

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN

1 LỜI GIỚI THIỆU

Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó cây lúa đang là thế mạnh đưaViệt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu gạo Năm

2017, Việt Nam tiếp tục là nước xuất khẩu gạo đứng thứ ba thế giới sau Ấn Độ vàThái Lan Chỉ tính riêng 9 tháng đầu năm 2018, Việt Nam đã xuất khẩu trên 4,89triệu tấn gạo với giá trị khoảng 2,46 tỷ USD, lần lượt tăng 6,7% về lượng và tăng21,3% về giá trị so với cùng kỳ năm trước Gạo Việt hiện đã có mặt ở gần 150quốc gia và vùng lãnh thổ với các sản phẩm khá đa dạng như: Gạo hạt dài, gạohạt ngắn, gạo thơm, gạo đồ, gạo hữu cơ… Đáng chú ý, gạo Việt bước đầu đãthâm nhập được vào những thị trường có yêu cầu cao như: Hàn Quốc, Nhật Bản,Hoa Kỳ, EU…

Tuy nhiên lúa thuộc nhóm cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh ở hầu hết cácgiai đoạn sinh trưởng và phát triển, nhất là đối với những giống có nguồn gốcnhiệt đới và cận nhiệt đới Những tổn thương do nhiệt độ lạnh gây ra có thể đượcquan sát ở nhiều giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cây lúa: hạt không nảymầm, cây mạ kém phát triển, hiện tượng cây lùn, cằn cỗi, hiện tượng biến đổimàu sắc, hiện tượng thoái hóa đỉnh bông lúa, gia tăng tỉ lệ hạt lép và hiện tượnghạt chín bất bình thường [3], [49], [52]

Tác động của lạnh lên cây lúa rất rõ rệt Ở nhiệt độ thấp dưới 100C, nếuthời gian rét kéo dài ở giai đoạn mạ hoặc sau khi cấy có thể gây chết hàng loạtvới những giống không chịu được lạnh Ở giai đoạn cây lúa trổ bông, nếu gặpnhiệt độ dưới 200C thì kết quả thụ phận sẽ giảm và tỷ lệ lép sẽ tăng lên đáng kể.Nếu lạnh hơn và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn Nhiệt độ dưới

150C ức chế tổng hợp chlorophyll phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém Nếu nhiệt

độ giảm xuống dưới 100C chức năng của rễ bị tổn thương, lá và cả thân bị khôhéo, cây chết, mạ mũi chông có thể ngừng sinh trưởng hoàn toàn [2]

Việt Nam hàng năm ở các tỉnh vùng núi phía Bắc, miền núi trung du đồngbằng sông hồng trong đó có tỉnh Vĩnh Phúc luôn có mùa đông lạnh giá Nhiệt độ

có năm xuống đến mức rét đậm, rét hại không đảm bảo cho cây lúa sinh trưởngtốt, làm ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng và sản lượng xuất khẩucuối năm

Đứng trước những khó khăn thách thức đó, năm 2012 tôi đã nghiên cứu và

bảo vệ thành công đề tài luận văn thạc sĩ về “Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc

thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh”, bước đầu chọn lọc được một số

dòng lúa thế hệ R2 cho thế hệ R3 đạt kết qủa tốt về khả năng chịu lạnh ở các tỉnhmiền núi phía Bắc Trong quá trình công tác tại tỉnh Vĩnh Phúc tôi nhận thấy vào

vụ đông xuân cây lúa cũng chịu ảnh hưởng không nhỏ bởi điều kiện lạnh giá như

ở các tỉnh miền núi phía bắc, những đợt rét đậm, rét hại làm ảnh hưởng nghiêmtrọng đến sản lượng lúa hàng năm của tỉnh

Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu đề

tài:“Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc”

2 TÊN SÁNG KIẾN

Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc.

3 TÊN TÁC GIẢ:

- Họ và tên: DƯƠNG THỊ THU HUYỀN

- Địa chỉ: Trường THPT Nguyễn Thị Giang – Đại Đồng – Vĩnh Tường – Vĩnh Phúc

- Số điện thoại: 0985123340 E_mail: duongthithuhuyen83@gmail.com

4 CHỦ ĐẦU TƯ:

Dương Thị Thu Huyền giáo viên giảng dạy môn Sinh học trường THPT Nguyễn Thị Giang

7 MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN

7 1 Mục tiêu nghiên cứu

- Chọn lọc được một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh để tiếp tục theo dõi bồi dưỡng thành dòng có triển vọng

7 2 Nội dung nghiên cứu

(1) Đánh giá đặc điểm nông học của một số dòng lúa thế hệ R2 có nguồn gốc từ

mô sẹo chịu lạnh

(2) Đánh giá khả năng chịu lạnh của một số dòng chọn lọc thế hệ R3

Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R3 ở giai đoạn

mạ ba lá thông qua đánh giá ảnh hưởng của lạnh đến tỉ lệ thiệt hại, hàm lượngdiệp lục a, b sau khi xử lý lạnh cây mạ ba lá

(3) Đánh giá chất lượng hạt của một số dòng chọn lọc thế hệ R3

(4) Nhân và tách dòng gen liên quan đến khả năng chịu lạnh của một số dòng chọn lọc triển vọng

7.3 Vật liệu, phương pháp nghiên cứu và xử lý kết quả , tính toán số liệu 7.3.1 Vật liệu nghiên cứu

7.3.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt R2 của một số dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh của giống U17,C27 và Xuân Châu Hương (XCH) được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

- Giống: U17 do Sở Nông nghiệp tỉnh Vĩnh Phúc cung cấp

- Các giống: C27, XCH, do Sở Nông nghiệp tỉnh Phú Thọ cung cấp

Bảng 2.1 Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu

Giống Thời gian sinh Chiều cao Số hạt chắc/bông Khối lượng

- Hoá chất: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Anh

Đức, Mĩ Trung Quốc gồm: EDTA, Tris-HCl , Acid acetic, X-gal, Kanamycin,Ampicilin, Agar; Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối, bộ kit dùng cho phản ứngPCR, kit tách dòng, bộ kit sử dụng tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp, các loạienzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI Tế bào E coli thuần chủng DH5α,photphat citrat, petroleum ether…

- Thiết bị: Cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ UvisCintra 40, máy li tâm lạnh Hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR system

9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode ArraySpectrophotometer, máy ổn định nhiệt, máy soi UV…có nguồn gốc từ Anh, Đức

7.3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Các thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành ở vụ mùa năm 2017 tại xã Đại Đồng, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh phúc

- Các thí nghiệm phân tích sinh lý tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào,phòng thí nghiệm Di truyền, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm HàNội 2.

- Phân tích sinh học phân tử được tiến hành tại phòng Sinh học hiện đại,khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 và Phòng Công nghệ Tế bào Thựcvật- Viện Công nghệ Sinh học

7.3.2 Phương pháp nghiên cứu

7.3.2.1 Phương pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng

Các dòng ở thế hệ R2 và giống đối chứng được trồng riêng và chăm sóctrong cùng một điều kiện Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc và giốngđối chứng qua các giai đoạn phát triển trong một vụ gieo trồng thông qua các chỉtiêu nông học: chiều cao cây, số bông/khóm, chiều dài bông, số hạt chắc/bông,kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng Các chỉ tiêu đượcđánh giá theo chuẩn IRRI [12]

7.3.2.2 Phương pháp phân tích hoá sinh

phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh

Chuẩn bị mẫu : Hạt của các mẫu thế hệ R3 được nghiền mịn và sấy khô

tuyệt đối

 Xác định hàm lượng lipit

Dựa vào tính chất hòa tan của lipit trong dung môi hữu cơ để chiết lipit,dung môi hữu cơ được sử dụng là Petroleum ether Hàm lượng lipit được xácđịnh theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [19]

Các bước tiến hành như sau:

(1) Cân 0,3g mẫu cho vào ống eppendort, cho 1,5ml Petroleum ether.(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 40C trong thời gian 30 phút

(3) Loại bỏ dịch trong, lặp lại quá trình 3 lần

(4) Sấy khô tuyệt đối và cân khối lượng mẫu còn lại sau khi triết lipit Hàm lượng lipit được tính theo công thức :

B: Khối lượng mẫu sau khi đem phân tích (mg).

 Xác định hàm lượng protein tan theo phương pháp Lowry được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [4]

Các bước tiến hành như sau:

(1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), chovào 1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH = 10), lắc đều trong 10 phút,

để ống nghiệm ở 4oC trong vòng 24 giờ

(2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút, rồi thu dịch để làm thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Dịch chiết được định mức lên 5 ml bằng dung dịch đệm phosphat citrat(pH=10) và đo hấp thụ trên máy UV vis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thửfoling

Hàm lượng protein tan được tính theo công thức:

X(%) = A.HSPL×100%

MTrong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)

A: Nồng độ đo được trên máy quang phổ (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng

M: Khối lượng mẫu đem phân tích (mg)

Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được mô tảtrong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [4]

Đường tan trong hạt nảy mầm được chiết bằng nước cất, để ở 40C trong 24giờ Sau đó li tâm ở 4oC với vận tốc 12000 vòng/phút trong thời gian 30 phút.Thu dịch để phân tích, tiến hành lặp lại 3 lần

Hàm lượng đường tan được tính theo công thức:

X = a × b × HSPL × 100 %

m

Trong đó: X: hàm lượng đường tan (%) b: số ml dịch chiết

HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg)

a: nồng độ đo được trên máy (mg/ml )

7.3.2.3 Phương pháp phân tích sinh lý

7.3.2.3.1 Đánh giá khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ 3 lá bằng phương pháp gây lạnh nhân tạo

+ Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R3 ngâm, ủ cho nảy mầm dài 1cm thì chuyển vào hộp trồng cây đựng cát vàng rửa sạch Mỗi hộp 45 -

50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chăm sóc

và điều kiện như nhau Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở đitưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh

ở nhiệt độ 40C ± 0,50C trong 32 giờ Chuyển cây ra ngoài sáng bình thường ởnhiệt độ 25 - 300C Sau hai, ba ngày xác định mức độ bị hại

+ Đánh giá mức độ bị hại do lạnh theo thang điểm từ 0 đến 5: 0:Không bị hại, 1: đầu lá bị khô chết, 2: 1/3 đầu lá bị khô chết, 3: 1/2 đầu lá bị khôchết, 4: 3/4 lá bị khô chết, 5: chết cả cây Tính giá trị trung bình của 50 cây mỗigiống nhắc lại 3 lần

+ Tỷ lệ thiệt hại do lạnh của cây mạ được xác định theo công thức:

a( % ) = ∑ ( n 0 × b ) × 100

n × cTrong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do lạnh gây ra (%)

b: Trị số bị hại của mỗi cấpc: Trị số bị hại của cấp cao nhất

n0: Số cây của mỗi cấp bị hạin: Tổng số cây xử lý

Xác định khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ theo phương pháp được

mô tả trong tài liệu của Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995) [1]

7.3.2.3.2 Ảnh hưởng của lạnh đến hàm lượng diệp lục a, b ở giai đoạn mạ 3 lá

- Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R3 ngâm, ủ cho nảy

mầm dài 1cm thì chuyển vào hộp trồng cây đựng cát vàng rửa sạch Mỗi hộp 45

- 50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chămsóc và điều kiện như nhau Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở

đi tưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lýlạnh ở nhiệt độ 12oC ± 0,5oC trong ngưỡng thời gian 3 và 5 ngày, thì thu hoạch

lá, tiến hành xác định hàm lượng diệp lục

- Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục được

mô tả trong sổ tay phân tích đất, nước, phân bón cây trồng (1998) [31]

Các bước tiến hành như sau:

+ Cân 0,1 g lá nghiền trong cồn ethanol 96%

+ Li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi

+ Dịch thu được đem pha loãng 10ml rồi đo quang phổ hấp thụ trên máy quang phổ UV Visible ở bước sóng 665 nm và 649 nm

+ Hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi) được tính theo công thức:

V: Thể tích sắc tố rút được (ml)

7.3.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

7.3.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa

Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá lúa dựa theo phương pháp của Foolad và cs (1995) có cải tiến [41]

- Tiến hành: Hạt lúa R3 của một số dòng từ thế hệ R2 được bóc vỏ và khử

trùng, cấy hạt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar,mật độ cấy 20 hạt/ bình Sau 10 ngày thu lá, bảo quản ở tủ lạnh sâu -850C DNAtách từ lá non của lúa được thực hiện theo các bước sau:

(1) Phá vỡ tế bào bằng cách nghiền nhanh 0,2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày cối sứ

(2) Cho 1,5 ml đệm chiết CTAB (CTAB 2,5%+100ml Tris - HCl pH=8 + 200 ml EDTA + NaCl 1,4mg), ủ trong 30 phút ở bể ổn nhiệt (650C)

(3) Bổ sung 1,0ml hỗn dịch chloroform: isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ trong 20 phút.(4) Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi trên

(5) Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1)

(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

(7) Rửa DNA 2 - 3 lần bằng ethanol 70%.

(8) Làm khô DNA

(9) Hoà tan DNA trong 300 µl TE

a) Đo quang phổ hấp thụ: Đo dung dịch DNA trên máy quang phổ có chương

trình xử lý trên máy vi tính Mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số

OD260/OD280 đạt 1,8 – 2,0 Mẫu được pha loãng 200 lần theo công thức: 995µlnước cất + 5 µl DNA mẫu Đo mẫu ở bước sóng λ = 260 nm và λ = 280 nm Tínhhàm lượng và độ sạch của DNA theo công thức:

+ Hàm lượng DNA (ng/µl) = 50 × HSPL × OD260+ Độ sạch của DNA = OD260/OD280

Trong đó: 50: Hằng số

HSPL: Hệ số pha loãng

OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm

OD280: Chỉ số đo được ở bước sóng 280nm

b) Điện di trên gel agarose xác định chất lượng của DNA tổng số

Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE 1X Tramẫu và chỉ thị phân tử (Marker) Chạy điện di ở 100V trong 30 phút Nhuộm geltrong dung dịch Ethidium bromide (2µg/ml; 15 µl/bản gel) trong 10 phút Rửa gelbằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Gel Logic 1500– Kodak –USA

7.3.2.3.2 Nhân và tách dòng gen osDREB1F

Nhân gen osDREB1F bằng PCR từ DNA hệ gen cây lúa

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi DREB1F/ DREB1R được thiết

kế dựa trên trình tự DNA trên GenBank với mã số AY78589 [60], cặp mồi đượctổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi ở bảng 2.2

Bảng 2.3 Mồi nhân gen osDREB1F ở lúa

DREB1F 5' - ATGGACACCGAGGACACGTCGTC - 3' 54OC

DREB1R 5' - TCAGTCCATCCATAGCTTGTAGTC - 3' 54OC

9

Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F ở lúađược trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F

Chu kỳ nhiệt: 94oC: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94oC- 1 phút, 56oC- 1 phút,

72oC- 1 phút 30 giây); 72oC- 10 phút; 4oC - ∞ Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển vềnhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC

Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrepPCR Purification Kít) theo qui trình như sau:

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm

- Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB: VIzopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tương ứng với 1mg mẫu) Ủ ở 60o trong 10 phút, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm

13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột

- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để 2 phút ở nhiệt độ phòng cho dung dịch

GB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút,loại bỏ dịch chảy qua cột

- Rửa màng lọc chứa DNA của PCR bằng cách cho 500 µl dung dịch WB(Washing buffer) lên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, rồi bỏdịch dưới Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB(Elution buffer) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột Thu mẫu DNA đã được tinh sạch Bảoquản ở -200C

Gắn gen vào vector tách dòng và biến nạp vector tái tổ hợp

- Sản phẩm PCR làm sạch từ thôi gen được gắn vào vector tách dòng pBT

sử dụng bộ kit pGEM – T System

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli

Vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào E coli chủng DH5α bằng một quá trình gọi là chuyển nạp (transformation) Đó là quá trình tạo cho plasmid đã

được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyênqua màng vào trong nguyên sinh chất Khi đã được chuyển nạp, plasmid (có thểtái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môitrường dinh dưỡng thích hợp.

Quy trình biến nạp như sau:

Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH 5α

và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 – 4oC) trong 30 phút, cho plasmid xuyên quamàng chuyển nạp vào tế bào Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42oC trong 1phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút Bổ sung 400µl môitrường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôilắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37oC để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vàichu kỳ sinh trưởng và phát triển Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịchkhuẩn lên đĩa môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứakháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM) Ủ đĩa ở 37oCtrong 16 - 20 giờ

Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc trênmôi trường thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal (4mg/l), IPTG (100μM), ủđĩa ở 370C trong 16 - 20 giờ sẽ thu được các khuẩn lạc xanh trắng

Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặpmồi pUC18(có trình tự bắt cặp mồi trên vector và cách nhau khoảng 0,2kb).Thành phần phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ kháccặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmit như mong muốn.Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sungampicillin 100mg/l nhằm mục đích tách plasmit

Tách DNA plasmid tái tổ hợp

- Tách plasmit được sử dụng đệm chiết TELT: Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; EDTA 0,5M ,pH=8,0; LiCl 1M ; Trion X-100

- Thành phần dung dịch lysozym: lysozym; Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; EDTA 0,5M, pH=8,0 Quy trình:

- Chọn các khuẩn lạc trắng riêng rẽ, nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l ampicillin qua đêm ở 37oC

- Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000v/p trong 7 phút, loại dịch

- Bổ sung 200μl TELT, 10μl lysozym, khuấy tan để khuẩn tan hết

- Để nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 95oC trong 3 phút, ủ 4oC trong 5 phút, ly tâm 13000v/p trong 15 phút

- Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lượng tương đươngisopropanol, ly tâm 13000v/p trong 15 phút

- Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 70%

- Làm khô plasmit bằng máy Speed Vac

- Hoà tan Plasmit trong 40 ml nước cất khử ion khử trùng

- Bổ sung 0,1μl RNase, ủ ở 37oC trong 2 giờ

- Tinh sạch plasmit để đọc trình tự

Quy trình tinh sạch plasmit

- Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu : VPB = 1 : 5, mix nhẹ

- Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, li tâm 13000v/p trong 1 phút

- Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch đệm rửa Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml

- Bổ sung 30μl nước khử ion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2phút, ly tâm 13000v/p trong 1 phút

7.3.2.4 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong việc đánh giá và nâng cao

khả năng chống chịu ở cây trồng

7.3.2.4.1 Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy in vitro

Cơ sở khoa học đầu tiên là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi một tếbào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thànhmột cá thể hoàn chỉnh Điều này đã được các nhà khoa học chứng minh qua nhiềuthí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật [6], [24], [27]

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượnglớn các tế bào không đồng nhất Vì thế, quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem nhưquần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình vàtuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi đó ở mức độ

cơ thể Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưngtrong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi thành một cơ thểhoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng của các yếu tốmôi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hoà sinh trưởng Tế bào nuôi cấy invitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn vì thế có thể chọn được các cá thể đột biếnnhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn giống thông thườngkhác áp dụng trên cây nguyên vẹn Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào còn cho phéplàm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được những tính trạng mong muốn[6], [24], [27]

Những hệ thống nuôi cấy đã được sử dụng trong chọn dòng tế bào soma:

+ Nuôi cấy mô sẹo+ Nuôi cấy tế bào huyền phù+ Nuôi cấy tế bào trần

Các phương pháp chọn dòng tế bào

+ Chọn dòng trực tiếp+ Chọn dòng tổng thể+ Chọn dòng tổng thểCác tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lýđột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lạichính là yếu tố gây đột biến Tuy nhiên cũng cần kiểm tra cả mức độ di truyền vàmức độ phân tử qua các thế hệ Những thay đổi tính trạng do đột biến là nhữngtính trạng di truyền cho thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính Đột biến DNA

nhân sẽ phân li theo định luật Mendel sau khi lai, còn đột biến DNA cơ quan tửnhư lục lạp và ti thể là di truyền theo dòng mẹ [27], [30].

7.3.2.4.2.Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống

chịu ở cây trồng

Để nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng, các tác giả đã ứng dụng kỹthuật nuôi cấy in vitro để chọn các dòng có khả năng chống chịu tốt và duy trìdòng chống chịu đó để làm giống, cải thiện những giống gốc không có khả năngchống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như chịu nhiệt độ thấp [16], [24],[37], [38], chịu nóng [23], chịu mặn [13], [15], [29], [37], [39], chịu hạn [20],[21], [25], [26]

Một hướng nghiên cứu mới cũng được quan tâm nghiên cứu và thu đượcnhiều thành công đáng kể là chuyển gen liên quan đến tính chống chịu vào câytrồng, sau đó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chốngchịu cho cây [48]

Khả năng chống chịu với nhiệt độ cũng như khả năng chống chịu với cáctác động bất lợi của ngoại cảnh khác liên quan đến sự có mặt của các chất có khảnăng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như prolin, protein tan,glicinebetain, đường tan… Alia và cs (1998) đã chuyển gen CodA mã hóa

enzyme cholin oxidase vào arabidopsis, sau đó tiến hành nuôi cấy in vitro thu

được cây chuyển gen có sự tích lũy hàm lượng cao glycinebetain trong hạt, nângcao đáng kể khả năng chịu nóng trong suốt giai đoạn hút nước và nảy mầm củahạt cũng như trong giai đoạn sinh trưởng của cây non [34] Honghong Hu và cs(2004) đã biểu hiện thành công gen NAM, ATAF và CUC (viết tắt là NAC) giúplàm tăng tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa Zhonghan số 5 [42] Benze Xiao và

cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen LEA 3-1 vào giống lúa Zhonghua 11 Kếtquả nghiên cứu cho thấy, các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu mặn cao hơn

so với đối chứng [36] Qiuyun Wang và cs (2008) đã chuyển gen OsDREB1F vào

arabidopsis và lúa sau đó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã tạo ra được các

dòng cây chuyển gen có khả năng chịu lạnh cao hơn so với đối chứng [48]

Bằng kỹ thuật tách dòng và giải trình tự gen của các dòng chọn lọc tác giả

Lê Xuân Đắc (2007) đã so sánh có sự sai khác về trình tự nucleotit của dòng chọnlọc từ nuôi cấy mô kết hợp gây đột biến so với giống gốc[5]

Ở Việt Nam, những năm gần đây cũng có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹthuật nuôi cấy in vitro và chuyển gen để tạo các dòng cây có khả năng chống chịucao với các stress của môi trường như: chuyển gen kháng virus đốm thuốc lá,kháng thuốc trừ cỏ [9], chuyển gen nâng cao khả năng chịu mặn và chịu hạn

ở lúa [22], đậu tương [11], Lê Tấn Đức và cs (2007) đã thành công khi chuyểngen kháng sâu cryIA(b) và cryIA(c) vào cây cải ngọt và cây hồng Mẫu lá khichuyển gen được chuyển lên môi trường nuôi cấy in vitro và đã thu được 5 dòngcây Hồng và 2 dòng cây Cải ngọt chuyển gen được tái sinh [8] Cao Lệ Quyên và

cs (2009) đã nghiên cứu phân lập và chuyển gen MtOs DREB2A điều khiển tính

chịu hạn vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium [22].

7.3.2.4.2 Một số nghiên cứu về nhân tố phiên mã DREB và osDREB1F liên quan đến khả năng chịu lạnh ở thực vật

Nhân tố phiên mã là các gen điều khiển phiên mã có khả năng hoạt hóahoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA

điều khiển (cis acting element) trên vùng khởi động gen (promoter) và tương tác

với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các genchức năng Ngoài ra nhân tố phiên mã đóng vai trò quan trọng trong việc điềukhiển toàn bộ quá trình sinh học trong cơ thể sống Ngày nay có nhiều phươngpháp nghiên cứu nhân tố phiên mã: nghiên cứu chức năng gen, nghiên cứu tươngtác giữa DNA và nhân tố phiên mã [48]

Theo nghiên cứu về nhân tố phiên mã của một số tác giả đã được công bốtrên Ngân hàng gen quốc tế, có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tínhchống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như: AP2/EREBP, MYB, MyC,AREB, DREB, NAC, ZFH Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều

khiển tính chống chịu có trật tự cis acting element riêng biệt Promoter trên mỗi gen chức năng chứa một hoặc nhiều cis acting element của một hoặc nhiều nhóm

nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chống chịu điều kiện

ngoại cảnh bất lợi Trong số các yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chốngchịu ở thực vật thì có một số yếu tố tham gia vào quá trình phiên mã điều khiểntính chịu lạnh như: AP2/EREBP, DREB, MYB…[43], [48], [50].

Nhân tố phiên mã DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiềutrong tế bào sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh.Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng, DREB

là nhân tố tham gia tích cực vào quá trình phiên mã bằng cách kích hoạt nhanhchóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợicủa môi trường như hạn hán, mặn và lạnh, nhưng nhân tố phiên mã DREB hoạtđộng không cần thông qua sự tác động của ABA, [35], [44], [50]

Nghiên cứu cấu trúc các protein họ DREB đã chỉ ra rằng chúng có chứa vùng bảothủ duy nhất để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ ERF, cho phép chúng tương tácvới một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA Các miền AP2/ERFkhá bảo thủ và các yếu tố phiên mã có chứa nó được tìm thấy ở nhiều loài thực vật Vùng bảo thủ AP2/ERF của protein DREB có khoảng 60 amino acid Thông qua đặcđiểm cấu trúc của các yếu tố phiên mã DREB, có thể chia chúng thành 6 nhóm nhỏ từ

A1 đến A6 Các protein DREB của các nhóm khác nhau giữ nhiều vai trò ở thực vật[48], [51]

Khi so sánh trình tự amino acid của các protein DREB từ nhiều loài khác nhaucho thấy trình tự giống nhau cao trong vùng AP2/ERF Tuy nhiên, trình tự giống nhau íthơn ở vùng đầu N và đầu C của các protein DREB Các nhóm protein DREB, ngoại trừcác thành viên nhóm A4 và A5, đều có một mô hình bảo thủ cao ở vùng cuối của cáctrình tự protein, lần lượt là LWSY (A1), GDDGFSLFxY (A2), GSIWDxxDPFF (A3) vàKYPSxEIDW (A6) Vùng giữa các yếu tố phiên mã DREB có vùng bảo thủ giàu Ser/thrgần kề vùng AP2/ERF, gắn với DNA chịu trách nhiệm phosphoryl hóa protein DREBdưới các điều kiện khử nước [47]

Các yếu tố phiên mã DREB có thể xác định và gắn nhân tố hoạt động cis

CRT/DRE (A/GCCGAC) trong các promoter và điều tiết sự biểu hiện của các gen liênquan đến stress môi trường ở thực vật bậc cao Bảy vị trí quan trọng liên quan tới sựtương tác đặc trưng cao với nhân tố CRT/DRE trong vùng AP2/EREBP lần lượt là 4 Arg(R), 2 Trp (W) và 1 Val (V) Hai nhân tố quan trọng YRG và RAYD định vị trong

vùng AP2/EREBP có thể gắn với trình tự promoter hoặc các protein tương tác khác.Nhân tố YRG là vùng có thể hút nước trong khu đầu N của vùng AP2/EREBP, chứađựng 19 đến 22 amino acid [47], [48].

Nhóm DREB có trật tự lõi cis acting element: DRY, A/GCCGAC Hai

nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã DREB1 và DREB2 bám đặc hiệu vào DRY.Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh trong khi nhóm DREB2điều khiển tính chịu hạn [48]

DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từnhững năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như cây hoa cúc,lạc, hướng dương…và đã thu được những thành quả nhất định cho khoa họctrong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật trước điều kiện môi trườngkhắc nghiệt và biến đổi khí hậu như hiện nay Các nhà khoa học Trung Quốc,Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải trình tự gen DREB trên loài cúc vàhướng dương, lúa; đã so sánh trình tự gen của các loài cây trồng và cây hoang dạithấy rằng có sự sai khác giữa chúng từ đó họ đã đề xuất phương án cải thiện khảnăng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế chống chịuđiều kiện bất lợi của môi trường sống đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chốngchịu tốt vào loài chống chịu kém [36], [48], [52]

Theo Yang và đtg (2007) ông đã phân lập được phân họ DREB trên đốitượng hoa cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa và DmDREBb, những gen này

mã hóa cho hai phân tử protein gồm 191 axit amin có khối lượng phân tử là 21,66

và 20,99 kDa, các protein của 2 gen này được biểu hiện khi cây hoa cúc bị hạnlạnh [52]

Ở cây Arabidopsis trên cơ sở tương tự và đặc tính cấu trúc của chuỗi axit

amin, 10 DREBs được phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4,

và DREB5; nhóm thứ hai gồm W50, DREB6, DREB7 và DREB1; nhóm thứ bagồm DREB2 và DREB8; nhóm thứ tư gồm có DREB9 và DREB10, nhóm thứnăm gồm DREB11, ERF1 và ERF2 [53]

Năm 2003, Dubouzet et al đã phân lập được 5 nhóm DREB ở lúa là:OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D, và OsDREB2A Sự biểuhiện của OsDREB1A và OsDREB1B được gây ra bởi lạnh và OsDREB2A bởi

hạn hán và mặn OsDREB1A biểu hiện kích hoạt gen COR và kết quả là tăngcường khả năng chịu hạn, mặn, và lạnh [40].

Trong số các phân nhóm DREB thì nhóm DREB1 có chức năng điều khiểntính chịu hạn mặn và lạnh ở thực vật, trong đó có osDREB1F do Qiuyun Wang và

cs (2008) phân lập từ DNA của lúa, có mã số trên GenBank là AY785897 vớichiều dài 660 bp, mã hóa cho phân tử protein gồm 219 axit amin (kể cả axit amin

mở đầu) với dự đoán khối lượng phân tử 23,8 kDa [48]

Các phân tích về biểu hiện của nhân tố phiên mã này cho thấy chúng đượccảm ứng bởi một số yếu tố bất lợi như mặn, hạn, lạnh và ABA, nhưng không bịcảm ứng bởi các tác nhân gây bệnh, thương tổn và oxy hóa Nhân tố phiên mãnày hoạt động chủ yếu ở trong nhân và các phân tích trên nấm men cho thấy nó

mã hóa cho một tác nhân kích hoạt phiên mã và chỉ liên kết đặc hiệu với yếu tốdre/crt Phân tích cây chuyển gen mang nhân tố phiên mã này cho thấy tính chốngchịu các điều kiện bất lợi như hạn, mặn và lạnh được tăng cường cả ở lúa cũng

như cây arabidopsis [48].

Các phân tích sâu hơn cho thấy, bên cạnh khả năng kích hoạt gen cor (genquy định tính trạng chịu lạnh) ở vùng điều khiển, osDREB1F còn kích hoạt cácgen rd29b và rab18 Điều này cho thấy osDREB1F có thể giữ chức năng trongquá trình thích ứng các điều kiện bất lợi từ môi trường có phụ thuộc vào ABA[48]

Trong osDREB1F các axit amin 48-107 có một phạm vi miền AP2 đặctrưng, từ 31 đến 43 chứa một tín hiệu định khu hạt nhân và các axit amin giữa

107 và 211 có chứa một thể hoạt hóa tên miền, những tính năng này có thể chorằng yếu tố phiên mã OsDREB1F mã hoá một AP2/EREBP và điều khiển genbiểu hiện khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, lạnh [48]

7.3.3 Xử lý kết quả và tính toán số liệu

Phân tích các tính trạng số lượng theo phương pháp thống kê sinh học.Mỗi công thức thí nghiệm và đối chứng lấy ngẫu nhiên 30 cây Các giá trị thống

kê như: trị số trung bình mẫu ( X ), phương sai (σ2), độ lệch (σ), sai số trung bìnhmẫu ( m X ), hệ số biến động (Cv%), hệ số tương quan (r)…Các trị số thống

kê được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình excel, ở mức ý nghĩa α =

0,05[17], [18], [28]

7.4 Kết quả và thảo luận

7.4.1 Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ

mô sẹo chịu lạnh

Các dòng chọn lọc và giống gốc sau khi gieo trên khay được cây mạ đưa

ra trồng ngoài ruộng đều có khả năng sinh trưởng phát triển bình thường (hình3.1; 3.2) Sau thời gian tiến hành theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu nông học trong

vụ mùa 2017, kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Hình 3.1 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, có sự sai khác đáng kể về đặc điểm nông họcgiữa các giống khác nhau, tuy nhiên trong cùng một giống thì giữa các dòng chọnlọc lại không biến động nhiều Các chỉ tiêu có sự biến động lớn là chiều caocây,số nhánh hữu hiệu/ khóm, số hạt chắc trên bông, chiều dài bông Chiều dàihạt, chiều rộng hạt, khối lượng 1000 hạt là các chỉ tiêu nông học ít biến động Hệ

số biến động ở các dòng chọn lọc có xu hướng thấp hơn so với đối chứng làgiống gốc, chứng tỏ các đặc điểm nông học theo dõi đã ổn định dần

- Chiều cao cây

Chiều cao cây được đo từ mặt ruộng đến đầu bông Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy mức độ biến động về tính trạng chiều cao cây của các dòng chọn lọc đang

dần ổn định, trong đó thấp nhất là dòng R2.04( 2,86%) cao nhất là dòngR2.18( 5,78%) Trong số 14 dòng nghiên cứu thì có 8/14 dòng (chiếm 42,8%) có

hệ số biến động nhỏ hơn giống gốc

Tính trạng chiều cao cây giữa các dòng chọn lọc trong từng giống nghiêncứu có sự khác nhau, cụ thể: giống XCH có chiều cao thân chính dao động78,56cm đến 87,12cm; từ 85,02 đến 91,09 cm (các dòng có nguồn gốc từ giốngC27), từ 90,12 đến 116,52 cm (các dòng có nguồn gốc từ giống U17) Có 2/5dòng chọn lọc có nguồn gốc từ giống XCH có chiều cao thân chính của cây thấphơn giống gốc (cao hơn 81,93cm); có 3/4 dòng của giống C27 và 4/5 dòng củagiống U17 thấp hơn giống gốc, còn lại các dòng đều cao hơn giống gốc Như vậychiều cao thân chính của các đa số các dòng chọn lọc đã có xu hướng thấp hơngiống gốc, mức độ ổn định của nhiều dòng lại cao hơn so với giống gốc

Hình 3.2 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH

Sự sai khác về chiều cao cây của các dòng chọn lọc so với giống gốc đượckiểm tra bằng hàm t– Test Two sample For Mean trong chương trình Exel (α =0,05) ( Bảng 3.2) Kết quả cho thấy, sự sai khác về chiều cao cây của 80% sốdòng của giống XCH,75% số dòng của giống C27, 80% số dòng của giống U17

là có ý nghĩa (Ttn> Tα) còn sự giảm về chiều cao cây của các dòng còn lại so vớigiống gốc là không có ý nghĩa (Ttn< Tα)

- Chiều dài bông