TV Mycoplasma Chlamydophia pneumoniae Real TM-50 test- Full version

1023 Hóa chất dùng cho xét nghiệm sinh học phân tử, sử dụng cho máy real-time PCR Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumniae Real-TM Bộ thuốc thử Real-time PCR phát hi

1023

Hóa chất dùng cho xét nghiệm sinh học phân tử, sử dụng cho máy real-time PCR

Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumniae Real-TM

Bộ thuốc thử Real-time PCR phát hiện

Mycoplasma pneumoniae và Chlamydophila pneumoniae

Sử dụng trong chẩn đoán in vitro

B42-4-50FRT

50

TÊN

Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM

GIỚI THIỆU

Mycoplasma pneumoniae lây lan qua đường hô hấp Sau khi gắn với niêm mạc của vật chủ, M

pneumoniae hút các chất dinh dưỡng, phát triển và sinh sản Các vị trí cho vi khuẩn bám vào bao gồm

đường hô hấp trên và dưới, gây viêm họng, viêm phế quản và viêm phổi Nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra được gọi là viêm phổi không điển hình vì giai đoạn kéo dài, không có đờm và nhiều triệu chứng

ngoài phổi Chlamydophila (trước đây là Chlamydia) pneumoniae gây ra viêm phổi hoặc viêm phế

quản nhẹ ở thanh thiếu niên Những người lớn tuổi có thể bị bệnh nặng hơn và nhiễm trùng lặp đi lặp lại Khoảng 50% thanh thiếu niên và 75% người cao tuổi có huyết thanh học nhiễm trùng rõ ràng Mầm

bệnh được ước tính gây ra 10-20% trường hợp viêm phổi ở người lớn Số ca bệnh ước tính của C pneumoniae là 300.000 ca / năm

MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG

Bộ thuốc thử Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM là một xét nghiệm

khuếch đại Real-time PCR dùng để phát hiện Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae trong

các mẫu sinh học (máu toàn phần, mô, mẫu phết, )

NGUYÊN TẮC XÉT NGHIỆM

Bộ thuốc thử Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM dựa trên 2 quy

trình chính: DNA được tách chiết từ mẫu và khuếch đại bằng phản ứng Real time với probe gắn huỳnh

quang đặc hiệu cho Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và IC Xét nghiệm phát hiện IC

nội sinh của đoạn DNA bộ gen người được tách chiết từ mẫu và IC xem như là chứng khuếch đại cho từng mẫu riêng biệt được xử lý và để xác định khả năng ức chế phản ứng IC được phát hiện trên một

kênh khác với M pneumoniae hoặc C pneumonia

VẬT LIỆU ĐƯỢC CUNG CẤP

Đóng gói 1: Bộ thuốc thử Real-time PCR ( B42-4-50 FRT)

Khuếch đại real time “Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM”

 PCR-mix-1, 55 ống

 PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml

 Positive Control Mycoplasma pneumoniae C+, 0.1 ml

 Positive Control Chlamydia pneumoniae C+¸0.1 ml

 Negative Control C-*, 1.2 ml

 Internal Control IC (human DNA), 0,2 ml

 DNA-buffer, 0,5 ml

Thuốc thử đủ 55 test

* Phải được sử dụng trong quá trình tách chiết như chứng âm tách chiết

VẬT LIỆU CẦN THIẾT NHƯNG KHÔNG ĐƯỢC CUNG CẤP

Khu vực chuẩn bị mẫu:

 Bộ thuốc thử tách chiết DNA

 Tủ an toàn sinh học

 Máy ly tâm

 Máy ủ nhiệt khô 60o

C ± 2oC

 Máy vortex

 Đầu tip có lọc

 Ống polypropylene vô trùng 1.5 ml (Sarstedt, QSP, Eppendorf)

 Thùng chứa chất thải sinh học

 Tủ mát, tủ âm

Khu vực khuếch đại:

 Thiết bị real time

 Ống phản ứng

 Tủ pha mix

 Pipet điều chỉnh được thể tích

 Đầu tip có lọc vô trùng

 Máy ly tâm cho ống 1.5/2.0 ml

 Máy vortex

 Tủ âm, tủ lạnh

HƯỚNG DẪN BẢO QUẢN

Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM phải được bảo quản ở 2-8oC

ĐỘ ỔN ĐỊNH

Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM ổn định trong thời gian sử

dụng Sản phẩm duy trì hoạt tính trong thời hạn kiểm định ghi trên nhãn Tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm cao

KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG

Đạt chứng nhận ISO 13485-Certified Quality Management System của Sacace, mỗi lô được kiểm tra với các yêu cầu kỹ thuật đã xác định trước để đảm bảo sự nhất quán của chất lượng sản phẩm

CẢNH BÁO VÀ PHÒNG NGỪA

Người sử dụng luôn lưu ý những điều sau:

 Sử dụng đầu tip vô trùng có lọc và thay mới đầu tip cho mỗi quy trình

 Bảo quản mẫu dương đã tách chiết (mẫu, chứng và các amplicon) tránh tất cả các thuốc thử khác

và thêm vào hỗn hợp phản ứng ở một khu vực riêng biệt

 Rã đông tất cả thành phần ở nhiệt độ phòng trước khi bắt đầu xét nghiệm

 Khi đã rã đông, trộn các thành phần và ly tâm nhanh

 Mang găng tay, mặc áo khoác phòng thí nghiệm và đeo kính bảo hộ khi xử lý mẫu và thuốc thử Rửa tay ngay sau đó

 Không ăn, uống, hút thuốc, sử dụng mỹ phẩm, hoặc tiếp xúc với kính các khu vực làm việc trong phòng thí nghiệm

 Không sử dụng thuốc thử đã hết hạn

 Tất cả mẫu và thuốc thử không phù hợp với quy định phải loại bỏ

 Mẫu bệnh có khả năng lây nhiễm và được xử lý trong tủ an toàn sinh học theo an toàn sinh học

 Lau và khử trùng tất cả các mẫu và thuốc thử bị tràn bằng chất khử trùng như sodium hypochlorite 0.5% hoặc thuốc khử trùng khác

 Tránh tiếp xúc các mẫu và thuốc thử với da, mắt và màng nhầy Nếu tiếp xúc, rửa sạch ngay bằng nước và tìm bác sĩ tư vấn ngay lập tức

 Bảng chỉ dẫn về an toàn vật liệu (Material Safety Data Sheets - MSDS) có sẵn theo yêu cầu

 Chỉ nhân viên được đào tạo kỹ thuật mới sử dụng sản phẩm này

Thuốc thử trong chẩn đoán in vitro

Chỉ sử dụng trong chẩn đoán In Vitro

 Quy trình làm việc trong phòng thí nghiệm phải tiến hành một hướng, bắt đầu tại khu vực tách chiết và di chuyển đến khu vực khuếch đại và phát hiện Không trả lại mẫu, trang thiết bị và thuốc thử trong khu vực nơi thực hiện bước trước

Một vài hóa chất trong bộ thuốc thử có chứa sodium azide – như chất bảo quản, do đó không dùng ống kim loại để trữ và vận chuyển

GIỚI HẠN SỬ DỤNG SẢN PHẨM

Việc sử dụng sản phẩm này chỉ nên giới hạn ở những người được đào tạo về kỹ thuật khuếch đại DNA (UNI EN ISO 18113-2:2012) Cần tuân thủ chặt chẽ hướng dẫn sử dụng để có kết quả PCR tối ưu Cần chú ý đến ngày hết hạn in trên nhãn của tất cả các thành phần Không sử dụng thuốc thử sau ngày hết hạn

THU NHẬN, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU

Bộ thuốc thử Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM có thể phân tích

DNA được tách chiết từ:

 Máu toàn phần được thu trong ống ACD hoặc EDTA

 Mẫu mô: đồng nhất khoảng 1.0 gr mẫu với máy dập mô cơ học hoặc dao, đũa thủy tinh, chày và hòa trong 1 ml nước muối sinh lý hoặc PBS tiệt trùng Vortex mạnh và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển dịch nổi vào ống 1.5 ml mới

 Dịch rửa khí quản: ly tâm 10 ml ở 3.000 g/ phút trong 10-15 phút Loại bỏ dịch nổi Nếu chưa thấy cặn thêm 10 ml dung dịch ly tâm lại và loại bỏ dịch nổi Tái huyền phù cặn trong 100 ml nước muối sinh lý

 Mẫu phết: đặt que phết vào ống 1.5 ml và thêm 0.2 ml môi trường vận chuyển Khuấy mạnh que phết trong môi trường vận chuyển khoảng 15-20 giây

Mẫu phải được bảo quản ở 2-8oC trong vòng 12 giờ hoặc trữ đông -20C đến -80o

C

TÁCH CHIẾT DNA

Khuyến cáo sử dụng các bộ thuốc thử sau:

 DNA-Sorb-B (Sacace, REF K-1-1/B)

 SaMag Bacterial DNA Extraction Kit (Sacace, REF SM00)

Thực hiện tách chiết DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH (thể tích phản ứng 2l)

1 Chuẩn bị số ống PCR-mix-1 đủ cho số mẫu và chứng

2 Thêm 7 µl PCR-mix-2 Flu vào mỗi ống

3 Thêm 10 l DNA đã tách chiết vào ống tương ứng

4 Chuẩn bị các chứng:

 Thêm 10 µl DNA-buffer vào ống dán nhãn Amplification Negative Control – chứng âm khuếch đại

 Thêm 10 µl Mycoplasma pneumoniae C+ vào ống dán nhãn Myc.Pneum C+

 Thêm 10 µl Chlamydia pneumoniae C+ vào ống dán nhãn Chl.Pneum C+

 Thêm 10 µl Internal control vào ống dán nhãn IC

Khuếch đại

1 Thiết lập chu trình nhiệt theo bảng sau:

Thiết bị dạng rotor 1 Thiết bị dạng đĩa hoặc modular 2

Giai đoạn Nhiệt độ, o

C Thời gian Chu kì Nhiệt độ, o

C Thời gian Chu kì

2

10

10

3

3

3

60

30 giây (phát hiện tín hiệu huỳnh quang)

60

4 giây (phát hiện

tín hiệu huỳnh quang)

1

Rotor-Gene™ 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen)

2

SaCycler-96™ (Sacace), CFX96TM/iQ5™ (BioRad);

Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện trong bước 2 của chu kỳ 2 (0C) trên kênh Fam (Green), Rox (Orange) và Joe (Yellow)

Mycoplasma pneumoniae được phát hiện trên kênh FAM (Green), Chlamydophila pneumoniae trên

kênh ROX (Orange) và IC DNA trên kênh JOE(Yellow)/HEX/Cy3

CÀI ĐẶT THIẾT BỊ

Đối với thiết bị dạng Rotor

Kênh Calibrate/Gain

Optimisation… Threshold

Outlier Removal More Settings/ Slope Correct

Đối với thiết bị dạng đĩa

Đường ngưỡng phải chỉ cắt các đường cong của mẫu dương và không cắt đường nền Nếu không, đường ngưỡng cần được nâng lên Cài đặt ngưỡng ở mức đường cong huỳnh quang tuyến tính và không cắt các đường tín hiệu của mẫu âm

Kết quả các mẫu chứng

Mẫu chứng Giai đoạn Ct kênh

Fam/Green

Ct kênh Joe/Yellow

Ct kênh Rox/Orange

Giải thích

Chl

pneum C+ Khuếch đại Âm tính Âm tính Dương tính (<33) Hợp lệ Myc

pneum C+ Khuếch đại Dương tính (<33) Âm tính Âm tính Hợp lệ

IC DNA Khuếch đại Âm tính Dương tính (<33) Âm tính Hợp lệ

ĐẶC ĐIỂM SẢN PHẨM

Độ đặc hiệu phân tích

Độ đặc hiệu phân tích của mồi và đầu dò được xác nhận với mẫu âm tính Không có bất kỳ tín hiệu

nào với cặp mồi và probe đặc hiệu của Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae Độ đặc

hiệu của bộ Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM là 100% Khả năng

phản ứng chéo của bộ thuốc thử được kiểm tra đối với nhóm chứng Không ghi nhận được bất kỳ phản ứng chéo nào với các tác nhân khác

Độ nhạy phân tích

Bộ thuốc thử Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae Real-TM cho phép xác định

DNA Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae trong 100% xét nghiệm với độ nhạy là 00

copies/ml Độ nhạy được xác định bằng bộ đối chứng chuẩn và các nồng độ của nó được pha loãng bằng mẫu âm tính

Vùng gen mục tiêu: Mycoplasma: putative lipoprotein; Chlamydophila- ompA

XỬ LÝ SỰ CỐ

1 Tín hiệu IC yếu hoặc không xuất hiện

 Phản ứng PCR bị ức chế

 Hãy chắc chắn sử dụng phương pháp tách chiết DNA được khuyến cáo và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất

 Ly tâm lại tất cả các ống trước khi hút DNA đã tách chiết khoảng 2 phút ở tốc độ tối đa (12.000-16.000 g) và cẩn thận hút dịch nổi Không làm nhiễu cặn, sorbent ức chế phản ứng

 Điều kiện bảo quản thuốc thử không đúng theo hướng dẫn

 Kiểm tra lại điều kiện bảo quản

 Các điều kiện PCR không thực hiện theo hướng dẫn

 Kiểm tra các điều kiện PCR và chọn kênh huỳnh quang phát hiện IC trong quy trình

2 Tín hiệu chứng dương yếu hoặc không xuất hiện

 Điều kiện PCR không đúng theo hướng dẫn kiểm tra lại quy trình khuếch đại và lựa chọn kênh màu theo hướng dẫn

3 Chứng âm tách chiết xuất hiện tín hiệu trên kênh FAM (Green) hoặc Rox (Orange)

 Nhiễm trong quá trình tách chiết Kết quả tất cả các mẫu đều không hợp lệ

 Làm sạch tất cả các bề mặt và dụng cụ bằng sodium hypochlorite và ethanol

 Sử dụng tip có lọc trong quá trình tách chiết Thay tip giữa các ống

 Lặp lại bước tách chiết DNA với thuốc thử mới

4 Chứng âm khuếch đại (DNA –buffer) có bất kỳ tín hiệu nào:

 Nhiễm trong quá trình khuếch đại Kết quả tất cả các mẫu đều không hợp lệ

 Làm sạch các bề mặt và dụng cụ bằng sodium hypochlorite và ethanol hoặc thuốc khử DNA

 Hút chứng dương sau cùng

 Lặp lại quá trình PCR với thuốc thử mới

KÝ HIỆU SỬ DỤNG

Số danh mục Cảnh báo

Số lô Thành phần đủ <n>tests

Nhiệt độ bảo quản Phiên bản

Nhà sản xuất

NCA Chứng âm PCR

Hướng dẫn tham khảo

NCE Chứng âm tách chiết

Ngày hết hạn

C+ Chứng dương PCR

Sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

IC Chứng nội

Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, 44 – 22100 –

Como – Italy Tel +390314892927 Fax +390314892926

mail: info@sacace.com web: www.sacace.com

*SaCycler™ is a registered trademark of Sacace Biotechnologies

*CFX™ and iQ5™ are registered trademarks of Bio-Rad Laboratories

*Rotor-Gene™ is a registered trademark of Qiagen

*MX 3000P/3005P® is a registered trademark of Agilent Technologies