Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hơp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Qua quá trình phát triển với việc áp dụng những công nghệ tiên tiến, ngày nay nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học đã trở thành cơ sở chính của sàng lọc hiệu năng cao High Th

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN XUÂN THÀNH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Xuân Thành

được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Hữu Nghị và

TS Nguyễn Xuân Vũ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán bộ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang

bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu 1

1.2 Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu 2

1.2.1 Tổng quan về ung thư 2

1.2.2 Ung thư cổ tử cung 7

1.2.3 Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 9

1.2.4 Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle) 11

1.2.5 Hoạt tính điều hòa yếu tố nhân kappa B (NF-B) 12

1.2.6 Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào và đích phân tử 15

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật huỳnh quang tế bào 22

2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín hiệu huỳnh quang đặc trưng 22

2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB 22

2.3 Vật liệu 22

2.3.1.Dòng tế bào 22

2.3.2.Mẫu thử nghiệm 22

2.3.3 Môi trường nuôi cấy tế bào 23

2.3.4 Hóa chất và thiết bị 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào 24

2.4.2 Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT 25

2.4.3 Kích hoạt yếu tố NF-κB 27

2.4.4 Cố định tế bào 27

2.4.5 Nhuộm huỳnh quang tế bào và đích phân tử 28

2.4.6 Thu nhận và phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trên hệ Olympus scanR 28

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư 30

3.2 Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào HeLa 32

3.2.1 Kích thích chuyển vị NF-κB 32

3.2.2 Thu nhận hình ảnh huỳnh quang 33

3.2.3 Thiết lập thông số phân tích hình ảnh 35

3.2.4 Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB 37

3.2.5 Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB trên tế bào HeLa 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

EMEM: Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM

GFP: Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh

HBV: Hepatitis B virus – Viêm gan B

HCTN: Hợp chất tự nhiên

HCV: Hepatitis C virus – Viêm gan C

Hela: Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-G2: Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan

HPV: Human papilloma virus – Virus u nhú ở người

IC50: Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể

KHCNVN: Khoa học và công nghệ Việt Nam

MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide

NF-κB: Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu

tố nhân kappa B OD: Optical density – Mật độ quang học

PBS: Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate

Tp: Thành phố

UTCTC: Ung thư cổ tử cung

UTG: Ung thư gan

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số

hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 23 Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên

dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư 3

Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới năm 2018 cả hai giới 5

Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư 6

Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm 13

Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang 21

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan 26

Hình 3.1: Biểu đồ khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các nồng độ khác nhau của các mẫu tinh sạch có biểu hiện hoạt tính 32

Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế bào HeLa Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) và TNF ( ▲ ) 33

Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z 34

Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE) Hình ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR 35

Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 36

Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích chính Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP) Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1 37

Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-110 ng/mL trong 30 phút 38

Hình 3.9: Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein p65 vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 39

Hình 3.10: Xác định hệ số Z' đối với nhóm đối chứng (control) và tế bào HeLa

kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên) Biểu đồ phân tán cường độ tín

hiệu vùng tế bào chất và trong nhân với đối chứng Control (-) và kích

hoạt với IL-1 (hình dưới) 41 Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB)

của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự

chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP) Nhân được xác định đồng thời với

nhuộm DAPI 42

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay Sự đa dạng sinh học và hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực này Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên này một cách có hiệu quả Qua quá trình phát triển với việc áp dụng những công nghệ tiên tiến, ngày nay nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học đã trở thành cơ sở chính của sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening -HTS) ở nhiều nước trên thế giới nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng Các phương pháp thử nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các hợp chất tiềm năng cho nhiều mục đích sinh học khác nhau Trong đó lĩnh vực mà các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc chống ung thư Điển hình như gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã

có nhiều thành công trong lĩnh vực này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư

Công nghệ ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được phát triển nhằm truy suất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước thực nghiệm Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình tế bào từ

đó đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân

tay sinh học” (fingerprint) Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong

quá trình sống và phân chia của tế bào Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu tế bào (yếu tố NF-κB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor ), sinh lý tế bào (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương

trình của TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh

(miễn dịch, tim mạch, các bệnh truyền nhiễm ) và đánh giá chức năng phân tử đích Sử dụng kỹ thuật này trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học, nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời

gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung

cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử Do vậy, kỹ thuật sàng lọc hiệu năng cao dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại

Nhằm tiếp cận và bước đầu ứng dụng kỹ thuật hiện đại trong sàng lọc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học"

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu đề tài luận văn là nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào trong sàng lọc các chất có hoạt tính chống ung

thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) ở điều kiện trong nước

3 Đối tượng nghiên cứu

* Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa

* Đánh giá hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích chuyển vị protein nội bào (yếu tố nhân NF-κB) sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi huỳnh quang tự động

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào xẩy ra nhanh và phức tạp Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA (electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot Một trong các yếu điểm của phương pháp này là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy Ví dụ, khi quan sát giảm 50 % độ mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50 % trong 100 %

quần thể đó Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào flow cytometry có thể cung cấp nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào

và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang Do vậy chúng tôi nghiên cứu kết hợp phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh nội hàm cao trên hệ thiết bị hiển vi tự dộng Olympus scanˆR với quy trình đơn giản hơn và chi phí thấp, phù hợp với điều kiện trong nước Hơn nữa, quy trình này đồng thời có thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy hóa, ung thư và quá trình viêm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu

Ung thư là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước có nền kinh tế phát triển và thứ hai ở các nước đang phát triển Gánh nặng ung thư ở các nước đang phát triển tăng lên do hậu quả của lối sống không lành mạnh như hút thuốc lá, uống rượu bia, ít vận động hay ô nhiễm thực phẩm và môi trường Chúng ta đã biết thực phẩm lành mạnh đóng vai trò quan trọng trong phòng và điều trị bệnh mãn tính không lây trong đó có ung thư Chính vì vậy, hiện nay các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật, góp phần tích cực hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Với nguồn thực vật phong phú không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có sẵn ở nước ta để hỗ trợ điều trị ung thư đã và đang được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay [1]

Trong khoa học đã khám phá và sử dụng được nhiều hợp chất thiên nhiên (HCTN) có hoạt tính sinh học quý từ động, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên, thế giới sinh vật rất phong phú và đa dạng, vẫn còn nhiều loài sinh vật chưa được nghiên cứu khai thác, đặc biệt là các sinh vật ở biển sâu [3] Do vậy, nguồn HCTN (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dược phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay Việc sàng lọc các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để xác định các chất tiềm năng là vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc Trong đó, lĩnh vực

mà các HCTN và bán tổng hợp vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc chống ung thư

Công nghệ ghi hình ảnh tế bào (TB) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được phát triển nhằm truy xuất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước thực nghiệm ngày nay đang được các nhà khoa học quan tâm và được nhiều phòng thí nghiệm trong điểm quốc gia đầu tư bài bản và hiện đại Bằng việc

sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình TB từ đó đưa ra các chẩn đoán

về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint)

Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong chu trình sống và phân chia của TB Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang TB có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu TB (yếu tố NF-KB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor,…), sinh lý TB (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương trình của TB - apoptosis),

đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh (miễn dịch, tim mạch, các

bệnh truyền nhiễm,…) và đánh giá chức năng giúp các nhà hóa học, các nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh

phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung cấp các

thông tin về tác dụng dược lý của chất thử Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN) – là đơn vị đầu tiên được trang bị

hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scan’R (Heidelberg, CHLB Đức) sử dụng cho mục đích sàng lọc, đánh giá các chất hoạt tính sinh học Do vậy, đề tài này xuất phát từ yêu cầu và tính cấp thiết của việc phát triển các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học đạt trình độ tiên tiến, có

độ chính xác cao, mặt khác nội dung thực hiện của đề tài này bao gồm sàng lọc, phân tích hoạt tính chống ung thư của một số mẫu hợp chất thiên nhiên ứng dụng kỹ thuật sàng lọc/phân tích hình ảnh huỳnh quang TB

1.2 Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về ung thư

Ung thư là một thuật ngữ được sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất thường phân chia không kiểm soát và các thể xâm nhập vào các mô khác Các TB ung thư

có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống máu và hạch bạch huyết Có hơn 100 loại ung thư khác nhau đã được biết đến trong y văn thế giới, hầu

hết chúng được đặt tên dựa vào mô hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh [11] Mỗi loại ung thư đều trải qua nhiều giai đoạn thứ tự thời gian: giai đoạn khởi phát, giai đoạn tăng trưởng và thúc đẩy, giai đoạn lan tràn, giai đoạn tiến triển – xâm lấn - di căn Từ một tế bào, qua quá trình khởi phát dẫn đến những biến đổi mà không thể khồi phục kết quả là hình thành ung thư Nếu không có sự sửa chữa hoặc có nhưng không kết quả thì cuối cùng ung thư sẽ có biểu hiện trên lâm sàng và dẫn đến tử vong

Hình 1.1 Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư

Ngày nay, ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng và đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới Nguyên nhân ung thư có thể gây ra theo một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường Người ta ước tính khoảng 95% các loại ung thư là do lối sống và

có thể mất khoảng 20 - 30 năm để phát triển thành ung thư Con người hiện tại đang phải đối mặt với tỷ lệ ung thư và tử vong do ung thư ngày càng tăng [20] Trong năm 2018, đã có khoảng 9,6 triệu người tử vong và hơn 18 triệu người bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các loại ung thư khác nhau trên quy mô thế giới theo số liệu GLOBOCAN toàn cầu gần đây nhất của cơ cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế [28] Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, gan, ruột kết, trực tràng và ung thư tuyến tiền liệt, trong khi phụ nữ thường bị ung thư vú, ruột già, trực tràng và ung thư dạ dày [6]

Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thư, bệnh tim mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa, cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khỏe con người mỗi ngày [7] Theo thống kê của một số bệnh viện ung bướu ở Hà Nội, Hồ Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000

người mắc phải các loại ung thư khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000 bệnh nhân) tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hướng tăng trong tương lai gần Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thư mới và 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam [31]

Những bệnh ung thư phổ biến nhất thế giới

Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới

năm 2018 cả hai giới

Ung thư là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thư phát sinh từ sự thay đổi (đột biến) trong ADN (deoxyribonucleic acid) của TB bình thường Ung thư bắt đầu gây tổn hại tới một hoặc nhiều gen trong một TB đơn lẻ Tổn thương này làm cho các

TB tăng sinh không kiểm soát được và tạo ra những TB bất thường Ở giai đoạn này, nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những TB bất thường này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành TB ung thư Các đặc tính của

TB ung thư là chúng phân chia nhanh hơn các TB bình thường và hình thành khối u ác tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe mạnh Quá trình của một TB bình thường trở thành khối ung thư thường mất nhiều năm để phát triển

Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư

Trong nghiên cứu in vitro cũng đã phân lập được hơn 200 dòng tế bào ung thư

ở người và ngày càng được các phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm ứng dụng cho việc sàng lọc để tìm kiếm các thuốc tiềm năng chống ung thư trong tương lai Trong đó có thể kể đến hai dòng ung thư phổ biến là dòng tế bào ung thư gan người (HepG2) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (HeLa) Ngày nay, việc nghiên cứu sàng lọc để tìm kiếm các hoạt chất chống lại ung thư đã và đang được quan tâm hàng đầu từ các nhà khoa học theo hướng ức chế biểu hiện hoạt tính của một enzyme tham gia vào quá trình phát triển và di căn khối u, hoặc ức chế sự hình thành mạch và sự xâm nhập của các khối u nguyên phát ở mức độ tế bào, do đó có thể được sử dụng để ức chế sự di căn của khối mô ung thư

1.2.2 Ung thư cổ tử cung

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là ung thư hình thành trong mô cổ tử cung (CTC) được gây ra bởi việc nhiễm virus sinh nhú ở người (HPV) Hầu hết các trường hợp UTCTC đều bắt đầu trong vùng chuyển tiếp giữa cổ trong và cổ ngoài, các TB vùng chuyển tiếp bị tổn thương, nhiễm HPV và biến đổi dẫn dần, phát triển thành các tổn thương tiền ung thư rồi UTCTC UTCTC là bệnh ung thư tiến triền chậm, giai đoạn đầu thường không có triệu chứng và có thể phát hiện thông qua các phương pháp sàng lọc UTCTC [2]

UTCTC gồm hai loại chính là ung thư TB biểu mô vảy và ung thư TB tuyến, khoảng 80% đến 90% UTCTC là ung thư TB biểu mô vảy phát triển trong TB vảy bao phủ bề mặt vùng cổ ngoài CTC, thường bắt đầu ở vùng chuyển tiếp Ung thư

TB tuyến CTC phát triển từ các TB trụ vùng cổ trong CTC Có tỷ lệ rất nhỏ UTCTC

có các tổn thương của cả hai loại ung thư biểu mô TB vảy và TB tuyến gọi là ung thư hỗn hợp [2]

1.2.2.1 Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên Thế giới

UTCTC là loại ung thư hay gặp ở nữ giới Bệnh tiến triển qua nhiều năm, ước tính trên thế giới có khoảng 1,4 triệu phụ nữ mắc UTCTC và nhiều hơn gấp 2 - 5 lần (khoảng 7 triệu) phụ nữ có triệu chứng tiền lâm sàng cần được phát hiện và điều trị Theo kết quả của các ghi nhận ung thư trên thế giới, UTCTC đứng hàng thứ ba trong các loại ung thư chung, đứng thứ hai trong các ung thư ở nữ giới sau ung thư

vú và đứng thứ tư trong số các nguyên nhân gây tử vong ở phụ nữ trên toàn thế giới

Tỷ lệ mắc UTCTC có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây, đặc biệt tại các nước nghèo và nếu không có biện pháp can thiệp thì tỷ lệ tử vong do UTCTC sẽ tăng 25% trong vòng vài năm tới Theo báo cáo của IARC (Hiệp hội nghiên cứu ung thư Quốc tế), năm 2008 thế giới có khoảng 529.828 trường hợp mắc trong đó trên 85% các trường hợp ung thư và tử vong xảy ra ở các nước đang phát triển [2] Cũng như các nước trong khu vực Đông Nam Á, tại Việt Nam UTCTC là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở nữ giới và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư đối với phụ nữ Theo thống kê, năm 2008 Việt Nam có khoảng 5.174 trường hợp mới mắc với tỷ suất là 11,7/100.000, chiếm 11,65% số trường hợp mới mắc của các nước Đông Nam Á (44.404 trường hợp) Ước tính đến năm 2025

tỷ lệ tử vong do UTCTC tăng lên từ 62% (ở nhóm dưới 65 tuổi) hoặc 75% (ở nhóm trên 65 tuổi) so với năm 2008 [2]

1.2.2.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung

UTCTC là kết quả từ sự phát triển và phân chia bất thường TB vùng ranh giới CTC, nguyên nhân chính là do nhiễm HPV - vi rút lây truyền chủ yếu qua đường tình dục khi người phụ nữ còn trẻ Thông thường, các lớp trên cùng của biểu mô CTC chết đi và bong ra, và các TB mới lại tiếp tục được sản sinh nên hầu hết viêm nhiễm đều tự biến mất mà không hề có triệu chứng Tuy nhiên, trong trường hợp viêm nhiễm HPV kéo dài (chiếm khoảng 5 - 10% các trường hợp nhiễm HPV), người phụ nữ nhiễm HPV và phối hợp với các yếu tố nguy cơ khác, tiến trình này bị ngắt quãng, các TB có xu hướng tiếp tục sản sinh, trước tiên sẽ trở thành bất thường (tiền ung thư) và sau đó sẽ xâm lấn tới các biếu mô phía dưới (ung thư xâm lấn) Sự tiến triển từ nhiễm HPV đến ung thư xâm lấn rất chậm, thường từ 10 đến 15 năm,

có thể kéo dài đến 30 năm, do đó thường gặp UTCTC ở phụ nữ tuổi 40 - 50 [2] Quá trình tiến triển từ tổn thương tiền ung thư đến UTCTC phụ thuộc rất nhiều vào độ tuổi có tổn thương tiền ung thư, mức độ tổn thương tiền ung thư, mức

độ tổn thương và kết quả điều trị UTCTC [2]

Thời gian tiến triển từ loạn sản đến ung thư biểu mô tại chỗ khác nhau tùy vào từng giai đoạn: đối với loạn sản nhẹ là 85 tháng, đối với loạn sản nhẹ và vừa là 58

tháng, 38 tháng đối với loạn sản vừa và 12 tháng đối với loạn sản nặng Tuổi trung bình của các bệnh nhân loạn sản trẻ hơn 5 – 10 năm so với bệnh nhân ung thư biểu

mô tại chỗ và trẻ hơn 10 – 15 năm so với bệnh nhân UTCTC xâm nhập [2]

1.2.2.3 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây ung thư cổ tử cung

Mối liên hệ giữ HPV và UTCTC đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu tại các nước khác nhau trên thế giới Bên cạnh UTCTC, HPV còn có mối liên quan với các ung thư đường sinh dục khác như ung thư âm đạo (hơn 64% ung thư âm đạo có HPV dương tính), ung thư trực tràng (hơn 88% có HPV dương tính) và ung thư dương vật (hơn 80% có HPV dương tính) Bênh ngoài cơ quan sinh dục, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng HPV cũng có thể là yếu tố nguy cơ của một số loại ung thư khác như ung thư da, ung thư tổ chức liên kết, ung thư vòm họng Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy sự hiện diện của HPV trong 93 - 100% các trường hợp ung thư

TB biểu mô vảy ở CTC, khảo sát vi thể cho thấy các hình ảnh đặc trưng của TB nhiễm HPV là lớp TB bề mặt có hình ảnh loạn sừng, á sừng và những TB rỗng có nhân to, đa nhân, tăng sắc [2]

Mặc dù nguyên nhân gây tổn thương tiền ung thư và UTCTC là vi rút HPV đã được thừa nhận nhưng có nhiều yếu tố nguy cơ có liên quan chặt chẽ đến sự suất hiện bệnh như các yếu tố liên quan đến hành vi tình dục không an toàn, yếu tố liên quan đến sinh đẻ (có thai lần đầu sớm, khoảng cách mang thai giữa hai lần ngắn, sẩy thai,…), sử dụng thuốc tránh thai đường uống trong thời gian dài, tiền sử gia đình mắc UTCTC, hệ thống miễn dịch yếu, chế độ dinh dưỡng, tuổi, chủng tộc và hút thuốc lá cũng được biết đến là yếu tố nguy cơ gây UTCTC [2]

1.2.3 Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Trong khi các lĩnh vực y học chẩn đoán, xác định căn nguyên gây các bệnh lý khác nhau đã phát triển theo thời gian cùng với những hiểu biết ngày càng sâu và rộng hơn của con người về các nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh, chẳng hạn việc xác định nguồn gốc của nhiều bệnh truyền nhiễm gắn liền với sự phát minh và phát triển của kính hiển vi Nền công nghiệp hóa dược là một lĩnh vực quan trọng nhưng ra đời sau này và phát triển chủ yếu trong vòng 100 năm gần đây Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loại cây cỏ (ban đầu

phần lớn là các loại alkaloid) được chiết xuất thành công vào đầu thế kỷ 20 là điểm khởi đầu cho công nghiệp hóa dược, trong đó có thể xem morphin và papaverine

chiết xuất từ cây Anh túc (Papaver somniferum) như những ví dụ điển hình Nửa

cuối thế kỷ thứ 19 được đánh dấu bằng các nghiên cứu dược lý đầu tiên nhằm làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của các thuốc đã biết trên các mô hình động vật thí nghiệm Theo những mô hình này, các dịch chiết hay các hợp chất từ dược liệu đã được thử

nghiệm trên các mô hình cơ quan động vật (ex vivo) và mô hình động vật in vivo

Phương pháp nghiên cứu dược lý mà ngày nay đã trở thành “kinh điển” này thực tế

đã trở thành một phương pháp hiệu quả để phát hiện ra nhiều dược phẩm mới trong suốt thế kỷ 20 vừa qua [24] Nhờ những phát minh mới của các nhà khoa học, ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã cung cấp cho con người nhiều loại thuốc quý có tác dụng phòng và điều trị nhiều loại bệnh nguy hiểm như các chất kháng sinh điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm, các corticosteroid chống viêm, chống dị ứng, các thuốc điều trị ung thư như vincaleucoblastin, vincaleucocristin từ

lá dừa cạn, taxol từ thông đỏ Các HCTN có hoạt tính sinh học không những được

sử dụng rộng rãi trong y học mà còn được sử dụng trong sản xuất các loại thực phẩm chức năng là các sản phẩm nâng cao sinh lực, sức khỏe, tăng cường miễn dịch cho con người, chống oxy hóa, chống lão hóa, phòng và hỗ trợ điều trị bệnh như các Carotenoid, các flavonoid, các vitamin, các acid amin và các enzyme [3] Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh HCTN có tác dụng rất cao trong việc hỗ trợ và điều trị bệnh nhưng lại rất an toàn đối với sức khỏe con người Do vậy việc tận dụng HCTN sẵn có và tiêu chuẩn hóa các sản phẩm dược có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp bách trong quá trình hiện đại hóa, công nghiệp hóa dược kết hợp giữa đông – tây y ở nước ta Muốn vậy, các nghiên cứu nhằm xác định các cơ chế tác dụng, phát hiện các mục tiêu phân tử, xác định các thành phần có hoạt tính sinh học và độc tính của dược liệu cần được triển khai một cách toàn diện và hệ thống Các phương pháp sàng lọc nhanh hiện nay không những cho phép đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất mới mà còn cho biết các số liệu về dược động học và chuyển hóa của các dược chất có tiềm năng mới [25], [27] Việc tự động hóa quá trình sàng lọc, hiện nay cho phép sàng lọc hàng nghìn chất một ngày trên một đích phân tử riêng biệt [4], [16], [29] Mặc dù vậy, sự phát hiện và phát triển các thuốc

mới dường như ngày càng trở nên khó khăn hơn Có nhiều nguyên nhân giải thích cho hiện tượng này, nhưng một nguyên nhân bắt nguồn từ thực tế hiện nay là y học

đã có thuốc tương đối tốt cho nhiều bệnh phổ biến, việc đầu tư phát hiện và phát triển một thuốc mới có tác động cùng đích và hiệu quả hơn thuốc đã biết sẽ ngày càng hiếm hơn

Dễ nhận thấy rằng việc sàng lọc hoạt tính để xác định các chất tiềm năng là vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc Nhiều hoạt tính sinh học được sàng lọc, giúp rút ngắn thời gian và chi phí cho quá trình phát triển thuốc và số lượng lớn các thuốc mới đã được chuyển giao từ các chất tiềm năng này Các phương pháp thử nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các hợp chất tiềm năng cho nhiều mục đích sinh học khác nhau Trong đó các HCTN vẫn giữ vai trò quan trọng trong việc khai thác thuốc ứng dụng để phòng và hỗ trợ điều trị ung thư Điển hình như gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã có nhiều thành công trong lĩnh vực này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư Để có thành công đó, việc ứng dụng kỹ thuật phân tích tế bào và đích phân tử trong sàng lọc hoạt tính của nó đóng vai trò quan trọng

1.2.4 Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle)

Mật độ và kích thước nhân là các đặc điểm đặc trưng cho các giai đoạn của chu kỳ TB Điểm kiểm soát chu kỳ TB được sử dụng nhằm giám sát và điều tiết diễn biến chu trình TB Điểm kiểm soát có vai trò ngăn chặn chu kỳ TB tại một số điểm nhất định, nhờ đó TB có thể kiểm định lại một số diễn biến và quá trình cần thiết cũng như sửa chữa những chỗ sai hỏng của ADN TB không thể thực hiện pha

kế tiếp của chu kỳ cho đến khi nó thỏa mãn các yêu cầu mà điểm kiểm soát đặt ra Một số điểm kiểm soát được thiết kế để đảm bảo các ADN bị sai hỏng hay thiếu sót

sẽ không được truyền cho các TB con cháu Hai điểm kiểm soát nhưu vậy tồn tại là điềm kiểm soát G1/S và điểm kiểm soát G2/M Trong các khối u tỷ lệ TB trong trạng thái sẵn sàng phân bào so với các TB ở trạng thái pha G0 cao hơn nhiều so với các

TB bình thường; trong khi đó các TB bị chết rụng hay già lão vẫn không thay đổi

Do vậy tính tổng cộng thì số TB khối u sẽ từ từ tăng dần lên Những TB đang trải qua chu kỳ một cách tích cực là mục tiêu trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư vì các ADN của chúng bộc lộ tương đối rõ rệt trong quá trình phân bào và vì vậy trong việc điều trị ung thư (phương pháp debulking), lúc này một số lớn các TB khối u bị loại bỏ và khiến một số lớn TB khối u còn trong pha G0 bị chuyển sang G1 Các TB này nhanh chóng bị tiêu diệt bởi thuốc ngay khi mới chớm thực thi chu kỳ TB [21]

Được phát hiện đầu tiên bởi Sen & Baltimore vào năm 1986, NF-κB (Nuclear factor-kappa B) lúc đầu được xem như là yếu tố nhân (yếu tố phiên mã) của riêng tế

bào B (tế bào lympho B có chức năng sản xuất kháng thể liên kết tác nhân gây bệnh), sau này chúng không chỉ được tìm thấy trong tế bào B mà còn trong rất nhiều loại tế bào khác nhau Hiện nay đã có 5 thành viên của họ NF-κB được xác định:

p105/p50 (nfkb1), p100/p52 (nfkb2), p65 (RelA), RelB và c-Rel Một đặc trưng

quan trọng của NF-κB là tất cả các thành viên của họ này đều bảo tồn được một vùng (domain) Rel giống nhau Domain này chứa khoảng 300 amino acid chịu trách nhiệm chính cho quá trình gắn với DNA, nhị phân hóa và tương tác với IκB - chất

ức chế nội bào của NF-κB [15]

Vai trò của yếu tố nhân NF-κB bao gồm:

(i) Điều hòa quá trình sao mã của rất nhiều loại tế bào khác nhau trong đáp ứng với các kích thích như viêm và miễn dịch;

(ii) Hoạt hóa NF-κB cũng đóng vai trò quan trọng trọng quá trình chống virus của tế bào thông qua điều hòa hoạt động của gene mã hóa cho interferon;

(iii) Trong hầu hết các loại tế bào thì NF-κB điều hòa các tín hiệu sống sót của

tế bào Tuy nhiên trong một số trường hợp, yếu tố này lại gây nên chết tế bào theo chương trình apoptosis;

(iv) Quá trình điều hòa bất hợp lý của NF-κB là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh lý khác nhau như ung thư, thoái hóa thần kinh, viêm khớp, hen phế quản…

(v) NF-κB cũng đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình phát triển bình thường của phôi thai Rối loạn điều hòa NF-κB là nguyên nhân của nhiều dị tật bẩm sinh [15]

Yếu tố nhân kappa B, NF-κB, là một yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh viêm và ung thư Khi tế bào ở trạng thái nghỉ, NF-κB tồn tại trong bào tương ở dạng tương tác không đồng hóa trị với các protein IκB (IκB-, IκB-, IκB-𝛾, IκB-ε, Bcl-3, p100 và p105) Tất cả các IκB này đều chứa các đoạn lặp lại là ankyrin Các ankyrin này điều hòa quá trình gắn kết giữa IκB - NF-κB và tương tác với một vùng trên RHD của NF-kB do đó che mất phần NLS (nuclear localization sequence) nên phân tử NF-

κB không thể di chuyển từ bào tương vào nhân được Những tác nhân hoạt hóa NF-κB gây nên quá trình phosphoryl hóa các IκB Kết quả là IκB bị giáng hóa bởi quá trình thủy phân protein hoặc bị phân hủy do các proteasome hay các protease khác Khi đó các NF-κB sẽ được giải phóng, đi vào nhân tế bào và kích hoạt quá trình sao mã tại đây [23] Sự kích hoạt sai lệch tín hiệu NF-κB có liên quan đến các bệnh viêm như viêm khớp dạng thấp và hen suyễn và một số bệnh chuyển hóa

Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm

Tín hiệu NF-κB được biết là có liên quan đến nhiều bệnh viêm khác nhau; do vậy, có nhiều phương thức điều trị đối với các bệnh viêm hướng đích là blocking hoạt động của NF-κB Ví dụ như ức chế hoạt động kinase IKK: Các loại thuốc như aspirin và salicylate có khả năng ức chế đặc hiệu IKK, do đó ngăn ngừa sự phosphoryl hóa của IκBα Thứ hai, ức chế hoạt động protease: Các loại thuốc như PS-341 và lactacystin ức chế phức hợp proteasome 26S, do đó ức chế thủy phân IκBα Thứ ba, ức chế chuyển vị nhân tế bào: Các loại thuốc như tacrolimus ngăn chặn các tiểu đơn vị NF-κB p65 (RelA), p50, c-Rel và các thành viên khác của nhóm này di chuyển vào trong nhân Cuối cùng, ức chế sự gắn kết DNA: Các loại thuốc như glucocorticoid và chất chủ vận PPAR có khả năng ngăn chặn các tiểu đơn vị NF-κB gắn các gen mục tiêu và do đó ức chế sự phiên mã

Mặt khác, khi viêm không lành dễ chuyển sang giai đoạn viêm mạn tính và nhiều nghiên cứu đã chứng minh có mối liên hệ giữa viêm mạn tính và nguy cơ ung thư cao thông qua yếu tố NF-κB Liên quan tới bệnh ung thư, NF-κB có vai trò là yếu tố điều hòa biểu hiện của những gen kiểm soát sự tăng sinh và sống sót của tế bào Như vậy, nhiều loại khối u khác nhau của con người do sự kiểm soát sai NF-κB: NF-κB hoạt động giúp biểu hiện của các gen giữ cho tế bào tăng sinh và bảo vệ

tế bào khỏi các điều kiện kích ứng quá trình chết theo chương trình apoptosis Trong ung thư, các protein kiểm soát tín hiệu NF-κB bị đột biến hoặc biểu hiện bất thường dẫn đến sự phối hợp không hoàn thiện giữa các tế bào ác tính

và phần còn lại của cơ thể sinh vật Điều này dẫn tới việc hệ thống miễn dịch loại

bỏ không hiệu quả khối u và những tế bào ung thư ác tính [23] Trong TB khối u, NF-κB hoạt động (ví dụ, trong 41 % ung thư biểu mô vòm họng [15]) do đột biến gen mã hóa các yếu tố phiên mã NF-κB hoặc trong các gen kiểm soát hoạt động NF-κB (như gen IκB ức chế yếu tố NF-κB); ngoài ra, một số tế bào khối u tiết ra các yếu tố dẫn tới NF-κB trở nên hoạt động Việc ức chế yếu tố NF-κB có thể làm cho các tế bào khối u ngừng tăng sinh, chết hoặc trở nên nhạy cảm hơn với tác dụng của những tác nhân chống khối u Vì vậy, NF-κB là chủ đề của nhiều nghiên cứu của các công ty dược phẩm… như một đích của liệu pháp kháng viêm và ung thư [10] Sử dụng kỹ thuật ghi hình ảnh hiển vi huỳnh quang có thể quan sát tế bào trực

tiếp cho phép phân tích động học quá trình di chuyển của NF-κB vào nhân hay ức chế quá trình này thông qua cảm ứng kích hoạt IκB ứng dụng trong sàng lọc các hợp chất kháng viêm

Interleukin-1 (IL-1) và yếu tố hoại tử khối u (TNFα) là hai cytokine chính kích thích đáp ứng tiền viêm, bao gồm sản sinh chemokine, các phân tử cố kết và enzyme như cyclooxygenase, nitric-oxide synthetase và matrix metallicoproteinase Nhiều hiệu ứng này là kết quả của sự kích hoạt bởi cả IL-1 và TNFα lên con đường yếu tố phiên mã NF-κB, có liên quan đến việc kích hoạt nhiều gen bảo vệ của tế bào Việc kích hoạt thụ thể IL-1 hoặc TNFα sẽ cảm ứng quá trình phosphoryl hóa đặc hiệu Ser32 và Ser36 trên IκBα, sự phân hủy protein IκBα bởi proteasome và sự chuyển vị NF-κB vào nhân Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy Ser/Thr kinase được kích hoạt bởi IL-1 và TNFα chứa ít nhất bốn kinase phosphoryl hóa lẫn nhau trước khi phosphoryl hóa IκBα [8] Sự ức chế hoạt động proteasome của các chất ức chế đặc hiệu như LLL-H (MG132) đã ức chế cả sự thủy phân IκBα cũng như ngăn

sự kích hoạt tiếp theo của NF-κB xác định được qua việc sinh tổng hợp các protein phụ thuộc NF-κB, ví dụ như protein bám dính bạch cầu

1.2.6 Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào và đích phân tử

Bắt đầu từ các năm 1950, các mô hình sàng lọc trực tiếp trên TB ung thư đã được sử dụng để thay thế cho mô hình sàng lọc trên TB bình thường và vi khuẩn Tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ) các mô hình TB được phân lập từ các loại khối ung thư mô liên kết (sarcoma 180), ung thư bạch cầu ác tính (L1210 leukemia) và ung thư biểu mô (carcinama 755) của chuột đã được sử dụng để triển khai các chương trình sàng lọc quy mô lớn

Từ những năm 90, các mô hình sàng lọc trên các dòng TB ung thư của người

đã được sử dụng thay thế các mô hình sàng lọc trên TB ung thư nguồn gốc động vật Ngân hàng dữ liệu với 60 dòng TB đại diện cho các loại ung thư não, ung thư đại tràng, ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư buồng trứng và ung thư thận, bao gồm các dòng TB kháng thuốc đã được thành lập tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ)

và sử dụng để tăng hiệu quả sàng lọc thông qua các phương thức sàng lọc đơn, sàng lọc kép và sàng lọc chéo Những cải tiến này có ý nghĩa quan trọng đối với lĩnh vực nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị ung thư, về cả phương diện kinh tế và phương diện y dược Mặc dù các dòng TB ung thư của động vật vẫn còn được sử dụng, kết quả khảo sát về hiệu quả sàng lọc trong quá trình chuyển giao từ nghiên cứu trên

mô hình động vật sang nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng trên người cho thấy không phải lúc nào các mô hình này cũng có khả năng đưa ra các kết luận đáng tin cậy Theo kết quả điều tra thống kê tới năm 2004 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Mỹ, 2004), chỉ có 8% trong số 1/3 số thuốc dược khảo sát vượt qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I Một trong các nguyên nhân dẫn tới sự rơi rụng này là sự khác biệt về các đặc điểm sinh học giữa các mô hình trên động vật và trên người ở các mức độ hoạt động di truyền phân tử, miễn dịch và TB đã hạn chế quan trọng khả năng mô phỏng chính xác các phản ứng tiến triển trên người

Hiện nay, sàng lọc hoạt tính chống ung thư in vitro thường được đánh giá qua

hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity), ức chế sự tăng sinh tế bào (antiproliferation), kích thích sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) thông qua biểu hiện của protein p53, Bax, Bcl-XL/BH3, hoạt tính enzyme caspase-3/7; hoạt tính ức chế aurora kinase, serine/threonine kinase, DNA topoisomerase I, kháng NF-KB (liên quan quá trình viêm và ung thư), phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào,… sử dụng các kỹ thuật như MTT, Western blot, SEAP-assay, trắc lưu tế bào (flow cytometry), miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh hiển vi tế bào,…

Trong đó, tất cả các chiến lược sàng lọc in vitro tìm kiếm các chất hoạt tính sinh học

có thể chia thành 2 nhóm phương pháp: (i) sàng lọc trên mức độ (toàn bộ) tế bào và (ii) sàng lọc trên đích là các phân tử đặc hiệu Mặc dù chiếm số lượng lớn so với thư

viện các chất tổng hợp, các HCTN trong mẫu chiết dường như không hoàn toàn phù hợp cho sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening-HTS) trên đích là các phân tử đặc hiệu Ngược lại, có thể dễ dàng nâng cao hiệu quả sàng lọc ở mức độ tế bào, nhưng nhóm phương pháp này không cung cấp được thông tin về phương thức

hay đích tác động của chất thử, do vậy sẽ khó khăn trong lựa chọn ưu tiên chất tiềm năng cho những nghiên cứu tiếp theo (trên mô hình động vật và lâm sàng)

Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã được phát triển với mục đích phối hợp được cả hai phương pháp trên Một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động để quan sát ảnh hưởng của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế bào Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể đưa ra các chẩn đoán về phương thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay” (fingerprint) kiểu hình của tế bào Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thư và độc tính thuốc)

Trong lĩnh vực tìm kiếm các thuốc chống ung thư, kỹ thuật phân tích huỳnh quang tế bào có thể được sử dụng để đánh giá tác dụng của chất thử lên các quá trình apoptosis, chu trình tế bào (cell cycle), chuyển vị nội bào và di căn Presvel và cộng sự đã phát triển kỹ thuật huỳnh quang phục vụ sàng lọc hiệu năng cao các chất điều trị ung thư mới hướng đích là các kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinases, CDKs) – enzyme có vai trò quan trọng trong điều khiển chu trình tế bào sống và biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thư người [13] Phương pháp huỳnh quang được phát triển sử dụng cảm biến protein/peptide sinh học là công cụ có độ nhạy cao để phát hiện những thay đổi về thành phần, hoạt tính và trạng thái cấu trúc của các CDK/Cyclin trong nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư Sử dụng kỹ thuật huỳnh quang tế bào phân tích trên thiết bị KineticScan HCS Reader (ThermoFisher, USA), [26] đã chứng minh hoạt tính chống ung thư gan của

triterpene jaspolide B phân lập từ loài bọt biển Jaspis sp trên 2 dòng tế bào ung thư

biểu mô tế bào gan người Bel-7402 và Hep-G2 (với giá trị IC50 lần lượt là 29,1 và 29,5 M) qua hoạt tính cảm ứng apoptosis (tế bào Bel-7402 lên tới 66,8% ở nồng

độ 0,5M) và đích ty thể Trong khi đó [12] đánh giá hoạt tính chống ung thư của các peptide dẫn xuất của Ixosin-B amide cho thấy không chỉ ức chế hiệu quả đối với

sự tăng sinh tế bào (IC50 = 61.5µM) mà còn tác động lên cấu trúc khung tế của bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 25µM