Luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu tiên thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ quả cây Chà chôi.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN LÂM HỒNG
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỂ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ
CỦA CHI CLEISANTHUS, HỌ THẦU DẦU
(EUPHORBIACEAE)
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2019
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG
VIỆN HÓA SINH BIỂN - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC &
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của luận án
Trong khuôn khổ của dự án “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ thảm thực vật Việt Nam”, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên– Cộng hòa Pháp đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạt tính sinh học của dịch chiết ethyl acetat của 2,500 loài thực vật của nước ta,
trong đó nổi bật là dịch chiết từ quả cây Cách hoa Đông Dương (C indochinensis Merr ex Croiz), Chà chôi (C tonkinensis Jabl.) và Cách hoa eberhardt (C eberhardtii Gagn) có phần trăm ức chế mạnh dòng tế bào ung
thư biểu mô KB từ 88,40 đến 95,17% Từ quả của 3 loài trên đã phân lập và xác định cấu trúc được nhiều hợp chất tinh khiết như: cleistantoxin, cleisindoside D…Một điều rất thú vị là, các hợp chất cleistantoxin, cleisindoside D có cấu trúc hoá học gần giống etoposid và teniposid là 2 dẫn chất glycosid của podophyllotoxin đang được sử dụng làm thuốc điều trị ung thư phổi, tinh hoàn, buồng trứng…
Nghiên cứu liên quan cấu trúc cleistantoxin, cleisindoside D với tác dụng dược lí, cơ chế gây độc tế bào cho thấy các chất này có khả năng ức chế enzym topoisomerase IIB và enzym caspase và được dự đoán có hoạt tính kháng tế
bào ung thư phù hợp với kết quả thử trên in vitro và in vivo, cleistantoxin có
hoạt tính kháng ung thư mạnh nhất
Từ các kết quả đó, Đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN.14/16 của
Bộ Khoa học và Công nghệ đã tiến hành thử hoạt tính kháng ung thư của cao khô chiết xuất từ quả cây Chà chôi trên chuột Nude cấy tế bào ung thư phổi người với liều 100mg/kg cân nặng, cho thấy 100% chuột còn sống và kéo dài được thời gian sống sau 6 tuần điều trị so với nhóm chứng không được dùng cao Vì vậy, cao khô đang được tiếp tục nghiên cứu, phát triển thành nguyên liệu thuốc Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô này, rất cần có chất chuẩn cleistantoxin và cleisindoside D Tuy nhiên, 2 chất này đang được nghiên cứu, phát triển thuốc mới nên trên thế giới chưa có chất chuẩn đối chiếu Vì vậy, cleistantoxin và cleisindoside D phải được thiết lập thành chất chuẩn gốc Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới, hầu như ở Việt Nam còn chưa có công trình nào công bố về thiết lập chuẩn gốc, chủ yếu là thiết lập chuẩn thứ cấp
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế,
thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu tiên
thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D từ
quả cây Chà chôi (có hàm lượng 2 chất này cao nhất) với các mục tiêu sau:
- Mục tiêu 1: Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleistantoxin và
cleisindoside D từ quả cây Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn và xác định cấu trúc các chất tinh khiết mới phân lập được
Trang 4- Mục tiêu 2: Thiết lập được hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
- Mục tiêu 3: Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định
lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus)
2 Những đóng góp mới của luận án
- Về mặt hoá học
Lần đầu tiên đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc 8 chất mới từ quả
cây Chà chôi là: 7′,8′-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8)
- Về mặt thiết lập chất chuẩn
Lần đầu tiên công bố:
Tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định lượng
cleistantoxin và cleisindoside D theo hướng dẫn của tổ chức y tế thế giới
(WHO) và thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn của ISO GUIDE 35
Đóng được 96 ống chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin có giá trị trên COA là 99,3%, độ không đảm bảo đo là 0,1%, nghiên cứu độ ổn định được 18 tháng và 76 ống chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D có giá trị trên COA
là 94,2%, độ không đảm bảo đo là 0,4%, nghiên cứu độ ổn định được 12 tháng Tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định tính
7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1) và cleisindoside A Trong đó, có chất
7′,8′-dehydrocleistantoxin là chất mới phân lập được từ quả Chà chôi và phần xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 7′,8′-dehydrocleistantoxin là công bố hoàn toàn mới của luận án
Đóng ống chuẩn phân giải gồm 4 chất chuẩn: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin để đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc kí
- Về mặt kiểm nghiệm dược liệu và thuốc dược liệu
Lần đầu tiên ứng dụng 2 chất chuẩn gốc định lượng và 2 chất chuẩn gốc định tính để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời cleisindoside D và cleistantoxin và định tính được 4 lignan: cleisindoside A, cleisindoside D, cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin trong quả của chi Cách hoa và chưa có công trình nào công bố về kết quả này
3 Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 148 trang, 76 hình và 45 bảng Bố cục gồm các phần: Đặt vấn
đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); đối tượng nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Kết quả nghiên cứu (80 trang); Bàn luận (22 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 96 tài liệu tham khảo và 240 trang phụ lục
Trang 5NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có:
- Tổng quan về chi Cách hoa (Cleistanthus), tình hình nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cleistanthus trên thế giới
và tại Việt Nam
- Tổng quan về nhóm chất lignan: khái niệm, phân loại, một số aryltetralin lignan đang được phát triển thành thuốc điều trị ung thư, một số hoạt chất chính nhóm aryltetralin lignan được phân lập được từ quả cây thuộc
chi Cleistanthus và một số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm aryltetralin
lignan trong thực vật
- Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn gồm: chất chuẩn gốc (PCRS) và chất chuẩn thứ cấp (SCRS), tổng quan một số hướng dẫn về thiết lập chất chuẩn Theo ISO 17034 và ISO GUIDE 35 quy trình thiết lập chất chuẩn gồm các bước: xác định nhu cầu thiết lập chất chuẩn, thu thập nguồn nguyên liệu, chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn, đóng ống chuẩn, đánh giá độ đồng nhất, xác định các đặc tính, xác định giá trị ấn định trên COA, dán nhãn, bảo quản và nghiên cứu độ ổn định
- Tổng quan về xác định các đặc tính của chất chuẩn gốc: Theo hướng dẫn của IP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính (characterization) của chất chuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…và xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạp chất liên quan và tạp chất phân huỷ bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, xác định tạp chất vô
cơ bằng phương pháp cắn sau nung (residue on ignition-ROI) hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng kỹ thuật: DSC…
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng để phân lập, tinh chế cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất cao cồn khô từ quả cây Chà chôi
Trang 6168 g cao cồn khô được chiết xuất theo sơ đồ (Hình 2.1) từ quả Chà chôi
hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl;) được thu hái ngày 06/06/2016,
tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu VN 0308 (LB-TN) để phân lập, tinh chế các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
Đối tượng để phân tích định tính, định lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus)
Quả Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) thu hái ngày
16/06/2018, tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu ĐL 2338 (LB-TN)
Quả Cách hoa eberhardt (Cleistanthus eberhardtii, Gagn), thu hái ngày
08/06/2018 tại Phú lộc-Thừa Thiên Huế, kí hiệu ĐL 2151 (PL-TTH)
Xác định đúng tên loài và lưu giữ mẫu tại Viện Tài nguyên và sinh Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam
thái-2.2 HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
- Chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D được phân lập từ quả Cách hoa Đông dương Hai chất này đã được đo phổ xác định cấu trúc cleistantoxin và cleisindoside D (Phòng tổng hợp hữu cơ-Viện Hoá sinh biển- Viện HL KH&CN VN)
2.2.1 Hoá chất
- Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Hoá chất, dung môi chạy HPLC và đo phổ NMR (Merck)
2.2.2 Thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của Viện Hoá học và Viện Hoá sinh biển-Viện HL KH & CN VN, Bộ môn Hoá Phân tích - Độc chất, ĐH Dược HN, Viện KNT TƯ, Viện KNT TPHCM
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:
- Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin, cleisindoside
D từ quả Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
- Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất cleistantoxin, cleisindoside D nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV, IR, MS, NMR
- Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bay hơi của các chất cleistantoxin, cleisindoside D
- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D
- Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng bước đầu định tính, định lượng một
số lignan trong quả của chi Cách hoa
2.3.1 Phương pháp phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của chất tinh khiết
- Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel, sephadex LH-20, SK lớp mỏng bán điều chế silica gel 60 GF254 và silica gel 60 RP-18 GF254 (Merck)
Trang 7- Tinh chế các chất tinh khiết bằng: kết tinh và cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo YMC-GEL ODS-A có cỡ hạt 75 μm (YMC)
- Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằng HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích
- Khẳng định cấu trúc một số chất tinh khiết nhóm lignan làm NLTLCC: bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), góc quay cực riêng ([α]D20)
2.3.2 Thiết lập chất chuẩn gốc
Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
- Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng ([α]D20)…
- Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô cơ bằng phép thử tro sulfat và tạp chất bay hơi bằng TGA
- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng
Bảng 2.1 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng
STT lượng đề nghị Mức chất Yêu cầu pháp thử Phương
1 Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V
4 Bộ dữ liệu phổ chuẩn
Phổ HR-MS Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng
và phù hợp với TL đã công bố HR-MS Phổ NMR Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất
tinh khiết trong TL đã công bố NMR Phổ IR Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học
của chất tinh khiết trong TL đã công bố IR Phổ UV-VIS Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các max trùng với
phổ của chất tinh khiết trong TL đã công bố UV-VIS
5 Độ tinh khiết
tính bằng chuẩn hoá diện tích
6 Tạp chất liên
quan Không được lớn hơn 5%
7 Tạp chất bay hơi Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳ thuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) TGA
8 Tạp chất vô cơ Không được lớn hơn 0,1% Tro sulfat
9 Độ tinh khiết
DSC
Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳ thuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) DSC
Trang 8- Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng
• Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn và bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu
độ ổn định của chất chuẩn theo hướng dẫn ISO GUIDE 35
• Đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng ống
• Xác định giá trị ấn định trên COA từ 3 PTN: Xác định độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC/DAD và hàm lượng tạp chất bay hơi bằng TGA tại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025 Mỗi PTN nhận 6 ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hành phân tích Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn và Flt Khi Ftn > Flt kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhau có ý nghĩa, giá trị độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi được lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN
• Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA bằng phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance):
Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100
• Xác định độ không đảm bảo đo:
Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD và tạp chất bay hơi bằng TGA Mỗi chất chuẩn được gửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu cho từng chỉ tiêu độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi
Độ không đảm đo chuẩn của mỗi PKN : us=t x S√N
Độ không đảm bảo đo lan truyền của kết quả tro sulfat theo công thức:
UKhối lượng Tro sulfat = Uchế phẩm= √us12 + us22
UHàm lượng tro sulfat = HLTro sulfat x √(UTro sulfat
Tiến hành phép thử tro sulfat 2 lần lấy giá trị trung bình, nên:
Uc kết hợp của tro sulfat = √uthử 12 + uthử 22
Trang 9Độ không đảm bảo đo mở rộng được tính cho tổng cả kết quả của 3
phép thử tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và tro sulfat theo công thức:
𝐔𝐦𝐫= √𝐮𝐜𝟏𝟐 + 𝐮𝐜𝟐𝟐 + 𝐮𝐜â𝐧𝟐
Giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích: X 2 Umr
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính
Bảng 2.2 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn định tính
STT lượng đề nghị Mức chất Yêu cầu pháp thử Phương
1 Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V
4 Bộ dữ liệu phổ chuẩn
Phổ HR-MS Dữ liệu phổ HR-MS phải có số khối đặc trưng
và phù hợp với TL đã công bố HR-MS Phổ NMR Dữ liệu phổ NMR phải phù hợp với phổ của chất
tinh khiết trong TL đã công bố NMR Phổ IR Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học
của chất tinh khiết trong TL đã công bố IR
Phổ UV-VIS
Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các max đặc trưng
và phù hợp với phổ của chất tinh khiết trong TL
5 Độ tinh khiết
tính bằng chuẩn hoá diện tích
6 Tạp chất liên
quan Không được lớn hơn 10%
2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa
Xác định độ ẩm của bột quả của chi Cleistanthus
Xác định độ ẩm của dược liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V)
Xây dựng phương pháp định tính đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD
- Khảo sát chương trình sắc kí: pha tĩnh, pha động, chương trình gradient, bước sóng phát hiện
Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong quả Chà chôi bằng HPLC/DAD
- Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời cleistantoxin và cleisindoside
D trong quả cây Chà chôi: khảo sát dung môi, kĩ thuật chiết, thời gian chiết…
- Tính hàm lượng hoạt chất
HL% = ST x Cc x DT x 100%
SC x M x (100 − X) x 100 x 1000
Trang 10Thẩm định phương pháp phân tích bằng HPLC/DAD
Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng (LOQ)
Áp dụng Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời một số lignan trong quả cây chi Cách hoa bằng HPLC/DAD
Quả cây Chà chôi và cây Cách hoa eberhardt
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D
Qua khảo sát hàm lượng một số hoạt chất trong cao khô có hoạt tính
kháng ung thư trên chuột Nude và trong quả của chi Cách hoa (Cleistanthus),
tìm thấy 2 hoạt chất chính là cleistantoxin, cleisindoside D (glycosid của
cleistantoxin) có hoạt tính sinh học, hàm lượng cao nhất và là những chất đặc
trưng của chi này Vì vậy, lựa chọn hai chất tinh khiết này để thiết lập chất chuẩn định lượng Bên cạnh đó, tìm thấy trong quả Chà chôi có hàm lượng cleistantoxin, cleisindoside D cao nhất, nên sử dụng nguồn thực vật này để phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
3.1.1 Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel
Để phân lập được 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn sử dụng cột thuỷ tinh trung tính (80x10 cm)
nhồi silica gel 60 (40-63 m) Dùng hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2 sau đó thêm MeOH với tỉ lệ tăng dần từ 2, 5, 10 100% Kiểm tra các bình giống nhau bằng SKLM, gom các bình giống nhau vào thành một phân đoạn, thu được 23 phân đoạn (Phụ lục 1.2) Các phân đoạn được chấm lên bản mỏng cùng với chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D để tìm các phân đoạn có chứa cleistantoxin và cleisindoside D (Hình 3.1 và 3.2)
Trên SKĐ nhận thấy phân đoạn PĐ 7, 8, 9, 10 xuất hiện 1 vết có màu khi soi đèn UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc, tương ứng với vết của chất cleistantoxin tinh khiết (Hình 3.1), gom các PĐ7, 8, 9,
10 có chứa chất cleistantoxin, đem cô chân không được 10,6916 g cắn A
(a): Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc
Hình 3.1 SKĐ phát hiện cleistantoxin trong các phân đoạn từ PĐ1-14
Trang 11Trên SKĐ nhận thấy PĐ 16, 17, 18 xuất hiện 1 vết có màu khi soi đèn
UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc tương ứng với vết của chất cleisindoside D tinh khiết (Hình 3.2) Vì vậy, các PĐ16, 17, 18, được gom lại đem cô quay chân không thu được 52,9519 g cắn D
(a): Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc
Hình 3.2 SKĐ phát hiện cleisindoside D trong các phân đoạn từ PĐ12-23
3.1.2 Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin
10,6916 g cắn A thu được có chứa cleistantoxin được tiếp tục phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau:
Hình 3.1 Sơ đồ phân lập, tinh chế cleistantoxin thành NL thiết lập chuẩn
Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HR-MS, CD, 1D và 2D-NMR trùng khớp
với dữ liệu phổ của chất cleistantoxin phân lập từ loài C indochinensis, cho phép xác định chất tinh chế được chính là hợp chất (7R,8R,7′R,8′R)-7-hydroxy-6-methoxy-
3′,4′:4,5-bis(methylenedioxy)-2,7′-cyclolignan-9′,9-olide có tên là cleistantoxin
3.1.3 Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleisindoside D
52,9519 g cắn D thu được có chứa cleisindoside D được tiếp tục phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau:
Trang 12Hình 3.2.Sơ đồ phân lập, tinh chế cleisindoside D thành NLTLCC
Đo phổ HRESI-MS, CD, 1D và 2D-NMR chất tinh chế được trùng khớp với dữ liệu phổ của chất là 6-methoxy-7-(β-D-glucopyranosyloxy)-3',4':4,5-bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclolignan-9',9-olide chính là cleisindoside D Trong quá trình phân lập cleistantoxin và cleisindoside D làm chất chuẩn gốc
định lượng, đã phân lập thêm được 0,5235 g CT1 (chất mới), 0,5481 g
cleisindoside A, lượng chỉ đủ làm chất chuẩn định tính Vì vậy, cần khẳng định
cấu trúc của cleisindoside A và xác định cấu trúc chất CT1 làm chuẩn định tính 3.1.4 Khẳng định cấu trúc của cleisindoside A làm chất chuẩn định tính
Khi tinh chế cleisindoside D trên cột C18, tách riêng được vài lọ kết tinh dưới dạng chất rắn màu trắng, tiến hành đo phổ HR-MS, 1D, 2D-NMR và so với tài
liệu tham khảo, chất phân lập được xác định là hợp chất cleisindoside A, do lượng chất phân lập được ít nên sử dụng làm chất chuẩn định tính
3.1.5 Phân lập và xác định cấu trúc các chất mới từ quả Chà chôi
Trong quá trình phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D, luận án đã phân lập, tinh chế được 8 chất Tiến hành đo phổ NMR, HR-MS, IR, UV-VIS,
CD, nhiệt nóng chảy (Mp), góc quay cực riêng ([α]D20)… đã xác định cấu trúc 8 chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên và đặt tên là: 7’,8’-dehydrocleistantoxin
(CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8) Đây là đóng góp lớn của luận án trong nghiên cứu các
Trang 13hợp chất từ tự nhiên, là công trình lần đầu tiên đã công bố phân lập được 8 hợp chất mới nhóm aryltetralin lignan được phân lập từ quả Chà chôi
Trong đó, phân lập được khoảng 0,5 g CT1 làm nguyên liệu thiết lập chuẩn định tính Vì vậy phần xác định cấu trúc của CT1 là dữ liệu để xây dựng bộ dữ
3.2.1 Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D
Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistantoxin và cleisindoside D
Kết quả khẳng định cấu trúc các chất cleistantoxin và cleisindoside D bằng 1D và 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD…cho thấy bộ phổ của 2 chất phân lập được trùng với bộ dữ liệu đã công bố của 2 chất cleistantoxin và cleisindoside
D Từ đó, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D gồm: tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, bộ phổ 1H, 13C-NMR, HR-MS, IR và UV-VIS dựa trên các tài liệu đã công bố và các kết quả thực nghiệm của luận án (phụ lục 1.3 và 1.4)
Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí của cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD
- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan của cleistantoxin và cleisindoside D
Cột: Inertsil® ODS-3 (250 x 4,6 mm; 5 m)