Xác định nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư thanh long ở Hà Nội và vùng phụ cận

Bài viết xác định các loài Colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên thanh long được thu thập tại một số địa điểm thuộc miền Bắc của Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái và trình tự gene vùng rDNA-ITS, nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của Colletotrichum spp.

XÁC ĐỊNH NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ

THANH LONG Ở HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN

Identification of Colletotrichum spp Causing Anthracnose of

Hylocereus undatus in Ha Noi and Surrounding Areas

Nguyễn Đức Huy 1 *, Vương Anh Phương 1 và Trần Thị Thanh Bình 2

Abstract

In this study, five samples like anthracnose symptom were collected from stems and fruits of Hylocereus

undatus in Hanoi and surrounding areas Based on morphological and molecular characteristics, the pathogen

was identified as Colletotrichum truncatum infected fruits and Colletotrichum spp infected stems of H undatus Further studies were focused on C truncatum and showed that the fungus was grown faster at to 3 °C than at

15, 20, 35 and 40oC with average colony diameter of 70,7 mm after 8 days cultured on PDA Pathogenicity test

revealed that C truncatum could infect several ripe fruits including banana, soybean, fruits and stems of

H undatus and chili This research improves the comprehension of Colletotrichum species causing anthracnose

of H undatus and supports useful information for effective control of anthracnose

Keywords: Anthracnose, Hylocereus undatus, Colletotrichum, morphological and molecular characteristics,

Ha Noi

1 ĐẶT VẤN ĐỀ *

Thanh long (Hylocereus undatus ư c tr ng

ph biến ở nhi u nước trên thế giới v ở c c

nước Đông Nam Á như Th i Lan, Đ i Loan,

Malaysia v Vi t Nam Ngo i ra, thanh long c ng

ư c tr ng nhi u ở Trung Quốc Ở Vi t Nam,

thanh long l cây c gi trị xuất khẩu cao v

ư c tr ng ch yếu ở Bình Thu n, Long An v

Ti n Giang Hi n nay, thanh long ư c tr ng

ở nhi u t nh mi n Bắc như H N i Ba Vì, Th ch

Thất , Ph Thọ, Quảng Ninh, H a Bình v Ninh

Bình B nh h i l m t trong những mối lo ng i

ối với sản xuất thanh long c a nhi u nước trên

thế giới trong c Vi t Nam M t trong những

b nh nấm h i thanh long i n hình v kh ph ng

tr l b nh ốm nâu hay nhi u t i li u gọi l b nh

loét c nh v quả stem canker Chuang et al.,

2012; Sanahuja et al., 2016)

B nh th n thư gây h i trên c nh v quả thanh

long ư c ghi nh n, công bố ở m t số nước như

Trung Quốc Guo et al , 3 v Malaysia Vijiya

et al., 2014)

Vết b nh c hình elip, b mặt vết b nh hơi

lõm, xuất hi n nhi u ĩa c nh v b o t phân

1 B môn B nh cây, Khoa Nông học, Học vi n Nông

nghi p Vi t Nam

2 Đ i học Lâm nghi p

Email: ndhuy@vnua.edu.vn

sinh Nấm gây b nh ư c x c ịnh l do

Colletotrichum truncatum c b o t phân sinh hình cong lưỡi li m, hai u nhọn, c giọt d u

trong ở giữa b o t Nấm C truncatum tên

ng nghĩa C capcisi l m t trong những t c

nhân gây b nh th c v t c ph ký ch r ng bao

g m cây h tiêu, c , dưa lê, u xanh, nho v

nhi u lo i cây tr ng kh c Ngo i ra, nấm C truncatum c ng ư c ph t hi n gây ra b nh

th n thư trên c chua Diao et al , với vết

b nh hình tr n, b mặt hơi lõm v xuất hi n nhi u chấm en nhỏ trên b mặt v b nh th n

thư trên cây cải ngọt He el al , 6 B nh

th n thư h i thanh long c ng ư c Vi n cây

ăn quả Mi n Nam x c ịnh l do nấm C gloeosporioides T i H N i v m t số t nh mi n

Bắc, thanh long ư c tr ng với di n t ch tương ối lớn trong những năm g y ây Tuy nhiên, chưa c ph t hi n v ghi nh n v b nh

th n thư thanh long ư c công bố trên c c t p

ch quốc gia hay quốc tế

T i Vi t Nam, c c nghiên cứu i sâu v o nấm gây b nh th n thư c n t v chưa c ph t hi n v

b nh t i mi n Bắc c a Vi t Nam Vì v y, mục tiêu

c a nghiên cứu n y nhằm i x c ịnh c c lo i

Colletotrichum gây b nh th n thư thanh long

ư c thu th p t i m t số ịa i m thu c mi n Bắc c a Vi t Nam d a v o ặc i m hình th i v trình t gene vùng rDNA-ITS v ii nghiên cứu

m t số ặc i m sinh học v t nh gây b nh c a

Colletotrichum sp

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Mẫu bệnh

Mẫu thân v c nh thanh long c tri u chứng

b nh th n thư ư c thu th p t i Ba Vì, Th ch

Thất H N i v Quảng Ninh Hai mẫu th n thư

quả thanh long ư c thu th p t i c a h ng b n

thanh long ở Th i Bình v Gia Lâm H N i

2.2 Phân lập và xác định nấm gây bệnh

Nấm gây b nh th n thư thanh long ư c

phân l p tr c tiếp t vết b nh bằng kỹ thu t cấy

ơn b o t v cấy tr c tiếp vết b nh lên môi

trường PDA Sau cấy chuy n nh sinh

trưởng c a s i nấm sang môi trường PDA v

ư c x c ịnh sơ b d a trên ặc i m c a b o

t phân sinh, ĩa c nh trên môi trường PDA Sau

, nguyên nhân gây b nh ư c x c ịnh d a

trên trình t vùng gene rDNA-ITS

2.3 PCR và iải trìn tự ene vùn

rDNA-ITS

Mẫu nấm gây b nh th n thư trên trên c nh v

quả thanh long sau phân l p thu n ư c nuôi

cấy trên môi trường nhân t o PDA trong ng y

ở 8-30oC mg s i nấm ư c thu chiết

DNA theo phương ph p CTAB Cetyltrimethyl

ammonium bromide c a Doyle Doyle 8

To n b vùng vùng ITS c a mẫu nấm ư c

khuếch i bằng cặp m i ITS v ITS White et

al., 1990) Phản ứng PCR ư c th c hi n với x

PCR Master mix Solution (i-Taq c a INtRON,

nhi t gắn m i ở o

C Sản phẩm PCR ư c tinh chiết t agarose gel , % dùng k t tinh chiết

thương m i c a h ng NORGEN theo hướng

dẫn c a nh sản xuất Sản phẩm PCR ư c

giải trình t tr c tiếp m t chi u dùng m i ITS

t i h ng Macrogen H n Quốc Trình t ITS

c a mẫu th nghi m ư c so với chuỗi sẵn c

trên GenBank bằng ph n m m tr c tuyến

BLAST t i NCBI the National Center for

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) x c

ịnh tên nấm gây b nh Tiếp theo, cây phả h

v mối quan h giữa c c chuỗi nucleotide ư c

xây d ng bằng phương ph p Neighbor-Joining

Saitou v Nei, 8 sẵn c trong ph n m m

MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016)

2.4 Đặc điểm hình thái và sinh học

- Đặc điểm hình thái Ngu n nấm thu n ư c

cấy trên môi trường PDA ở nhi t -27o

C, quan

s t s ph t tri n c a tản nấm, s hình th nh ĩa

c nh v b o t phân sinh sau c c ng y nuôi cấy

- Đặc điểm sinh học khảo s t s ảnh hưởng

c a nhi t ến s ph t tri n c a nấm trên môi trường PDA Theo , ngu n nấm thu n ư c nuôi cấy trên môi trường PDA với 3 l n nhắc l i, mỗi l n nhắc l i l ĩa Petri ường k nh mm

Th nghi m ư c th c hi n ở , , , 3 , 3

v oC bằng t ịnh ôn BIOBASE Ngo i ra, s nảy m m v hình th nh ĩa p c a nấm gây

b nh th n thư c ng ư c nghiên cứu

2.5 Tính gây bệnh

Đ nh gi t nh gây b nh c a nấm th n thư,

c c lo i quả ch n như chuối, ớt, thanh long, c chua,

u tương v c nh thanh long ư c s dụng mỗi

lo i quả ư c lặp l i t nhất ba quả hoặc 3 c nh ối với thanh long T o vết thương bằng c ch ục lỗ nhỏ trên quả tùy lo i quả với k ch thức , – 0,3 mm2

nhỏ dịch b o t , tr quả u tương ư c lây s t thương bằng c ch châm kim Dịch b o t với m t

6 b o t /ml ư c ếm bằng bu ng ếm h ng

c u ư c s dụng lây b nh Th nghi m ư c

th c hi n ở -27oC Theo dõi thời kỳ ti m dục, s hình th nh c a b nh sau c c ng y lây nhiễm Tỷ l

b nh ư c t nh theo công thức:

Số quả bị b nh TLB (%) = ×

Số quả lây b nh

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thu thập, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh

Nghiên cứu n y thu th p ư c ba mẫu

th n thư trên thân, c nh thanh long v hai mẫu

th n thư trên quả thanh long C c tri u chứng

c a b nh th n thư ư c quan s t thấy cả trên thân/c nh v quả thanh long Tri u chứng trên thân l c c ốm trong hoặc b u dục c m u nâu

v ng, b mặt vết b nh hơi lõm v c nhi u chấm nhỏ m u cam hình a Vết b nh trên quả hình

tr n, k ch thước , - , cm, b mặt vết b nh lõm v c nhi u chấm en nhỏ hình c

Hình 1 Triệu chứng bệnh thán thư thanh long

a) tri u trứng trên c nh, c tri u chứng trên quả,

b b o t phân sinh nấm Colletotrichum spp

quan s t ư c khi t ch t tri u chứng trên c nh

thanh long v d b o t phân sinh nấm

Colletotrichum spp trên quả thanh long

D a v o ặc i m hình th i c a b o t phân

sinh hình b u dục, c hai giọt d u hình b phân

l p t c nh thanh long t i Ba Vì v hình cong

lưỡi li m, c m t giọt d u ở giữa hình d phân

l p trên quả thanh long thu th p t i c a h ng b n

thanh long ở Gia Lâm, H N i Bước u d a

v o ặc i m hình th i c a b o t phân sinh,

nấm gây b nh th n thư trên c nh thanh long c

th l do nấm Colletotrichum gloesporioides v

trên quả thanh long l do nấm C truncatum gây

ra Tuy nhiên, x c ịnh ch nh x c lo i

Colletotrichum, kỹ thu t PCR v giải trình t

gene ư c p dụng ối với hai mẫu nấm n y

3.2 Xác định nấm gây bệnh thán thư thanh

long dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS

DNA c a hai mẫu nấm Colletotrichum gây

b nh th n thư trên c nh v quả thanh long ư c

t ch chiết t s i nấm nuôi trên môi trường PDA

sau ng y Sản phẩm PCR khuếch i vùng

rDNA-ITS bằng cặp m i ITS v ITS c k ch

thước khoảng 6 bp hình Băng sản phẩm

PCR rõ nét v không xuất hi n băng phụ

Hình 2 Phản ứng PCR khuếch đại vùng rDNA-ITS của hai mẫu nấm thán thư trên thân (phải) và trên quả (trái) thanh long Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp

Kết quả giải trình t m t chi u sản phẩm PCR vùng rDNA-ITS s dụng m i ITS cho thấy mẫu

th n thư trên c nh thanh long TLBV-Thân thu c

phức h p lo i g m C siamense, C gloeosporioides v Colletotrichum sp hình 3

Đ phân bi t t ng lo i trong phức h p n y

c n d a trên vùng gene ApMat Sharma et al.,

2013) Ngo i ra, trình t gene mẫu th n thư trên

quả thanh long TLHN-Quả thu c cụm C truncatum với mức tương ng l , %

Theo nghiên cứu c a Shivaprakash et al., (2011) thì vùng rDNA-ITS phân bi t C truncatum với c c Colletotrichum kh c Như v y, c c nghiên cứu tiếp theo t p trung v o C truncatum

gây b nh th n thư trên quả thanh long

Hìn 3 Câ p ả ệ được xâ dựn bằn p ươn p áp Neighbor-Joining trong MEGA 7.0

Gi trị ở c c nốt c a cây phả h l gi trị thống

kê bootstrap dưới d ng % l n lặp Thanh

bar th hi n khoảng c ch di truy n

3.3 Đặc điểm hình thái và sinh học và tính

gây bệnh của nấm Colletotrichum truncatum

Nấm C truncatum ư c nuôi cấy trên môi

trường PDA v theo dõi s ph t tri n, ặc i m tản nấm, b o t phân sinh v hình th nh ĩa

c nh bảng , hình c-i)

Bảng 1 Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum truncatum

Ng y

2 Đường k nh tản nấm 3, mm, tản nấm

4

Đường k nh tản nấm 3 , mm, tản nấm

trắng x m, d y, c c c chấm en nhỏ

mọc v ng tr n ng tâm hình f Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh

6

Đường k nh tản nấm 8, mm, tản nấm

x m, xốp, c c c chấm en nhỏ mọc

v ng tr n ng tâm Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh

8

Đường k nh tản nấm 6 ,6 mm, tản nấm

x m, xốp, nhi u chấm en mọc ki u

v ng tr n ng tâm Chưa xuất hi n b o t phân sinh, ĩa c nh

10

Đường k nh tản nấm , mm, tản nấm

x m, xốp, rất nhi u chấm en nhỏ mọc

v ng tr n ng tâm

Xuất hi n b o t phân sinh, m t b o t t,

ơn b o, không m u, cong lưỡi li m, c m t giọt d u ở giữa

12

Đường k nh tản nấm 8 , mm, tản nấm

m u x m, xốp, nhi u chấm en mọc

v ng tr n ng tâm

Mất b o t phân sinh nhi u, không m u,

ơn b o, cong lưỡi li m, giọt d u ở giữa hình g

14

Đường k nh tản nấm mm, tản nấm

m u x m, xốp, nhi u v ng tr n ng tâm

với c c chấm en nhỏ ư c hình th nh

Xuất hi n ĩa c nh hình c , mọc ơn l hoặc t p trung th nh m, c c c lông gai m u en, thưa, phân ốt v d i, b o t phân sinh nhi u v k ch thước – µm x , -3, µm hình h-i) Nhi t l m t trong những yếu tố môi

trường c ảnh hưởng tr c tiếp ến s nảy m m

c a b o t phân sinh, xâm nh p, ph t tri n v

gây b nh c a c c lo i nấm gây b nh cây Nghiên

cứu n y th nghi m s ph t tri n c a nấm C truncatum ở c c nhi t – 40o

C, th nghi m

ư c th c hi n trên môi trường PDA bảng

Hình 4 Triệu chứng và đặc điểm hình thái của nấm

Colletotrichum truncatum

gây bệnh trên thanh long

Tri u chứng b nh th n thư trên thân a , trên quả b , ĩa

c nh c , ĩa p d , tản nấm trên môi trường PDA f v b o

t phân sinh g-i)

Hình 5 Sự nảy mầm của bào tử phân sinh

nấm Colletotrichum truncatum

Th nghi m s nảy m m c a b o t phân

sinh nấm C truncatum cho thấy b o t phân sinh

nảy m m sau giờ trong giọt nước cất vô trùng

v sau giờ ống m m bắt u ph t tri n d i ra

Tỷ l nảy m m c a b o t phân sinh t % ở

nhi t ph ng – 27oC Khi cấy ơn b o t

trên môi trường WA, sau giờ ĩa p ư c

hình th nh trên s i nấm, ĩa p c hình ô van,

m u nâu hoặc nâu m hình d

Bảng 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát

triển của Colletotrichum truncatum

Nhi t

(oC)

Đường k nh tản nấm sau c c ng y

nuôi cấy (mm)

Nhi t c ảnh hưởng lớn ến s ph t tri n

c a nấm C truncatum Ở nhi t oC, nấm

ph t tri n rất ch m Sau ng y nuôi cấy,

ường k nh tản nấm l ,3 mm bảng Nấm

ph t tri n nhanh d n ở nhi t oC v ph t

tri n tốt nhất ở -30oC Sau ng y nuôi cấy

trên môi trường PDA, ường k nh tản nấm l

mm Nấm C truncatum c ng ph t tri n ư c ở

35-40oC nhưng rất ch m bảng Nấm ph t tri n ch m ở c c nhi t 3 v o

C, sau 12

ng y nuôi cấy ường k nh ch t ,3 v ,

mm Như v y, trong qu trình bảo quản thanh long c n lưu ý giữ l nh tr nh s gây h i c a

b nh th n thư thanh long c ng như chất lư ng

c a quả thanh long

Bảng 3 Đánh giá tính gây bệnh của nấm

Colletotrichum truncatum

Lo i quả

Số

c nh/quả lây

Số c nh/quả

bị nhiễm

b nh

Tỷ l (%)

C nh

Quả thanh

Kết quả lây b nh nhân t o trên c c quả ch n như chuối, u tương, c nh thanh long, quả thanh long, c chua v ớt cho thấy thời kỳ ti m dục c a nấm l ng y Vết b nh th hi n rõ nhất trên quả thanh long, vết b nh tr n, b mặt lõm v

s i nấm trắng ph t tri n trên b mặt vết b nh hình 6b Vết b nh trên ớt v c chua c ng rất

i n hình, b mặt lõm v c nhi u chấm en ĩa

c nh hình th nh trên b mặt vết b nh hình 6c Trên quả chuối v quả u tương vết b nh nhỏ, không i n hình v chưa quan s t thấy ĩa

c nh c a nấm gây b nh Đĩa c nh v o b o t

phân sinh c a nấm C truncatum ư c hình

th nh rất nhi u khi lây trên thân/c nh thanh long nhưng tri u chứng b nh không i n hình như tri u chứng b nh trên quả thanh long Như v y, thân thanh long c th ư c s dụng l m v t li u

t o ra số lư ng lớn b o t phân sinh nấm C truncatum phục vụ cho c c nghiên cứu chuyên sâu như t nh gây b nh, nảy m m c a b o t

Hình 6 Triệu chứng lây bệnh nhân tạo sử dung nấm Colletotrichum truncatum

a c nh thanh long, b quả thanh long, c ớt, d chuối, e c chua v f u tương

4 KẾT LUẬN

Tri u chứng b nh th n thư trên quả thanh long

ư c x c ịnh l do nấm Colletotrichum truncatum

v trên c nh thanh long l Colletotrichum spp Nấm

C truncatum ph t tri n, nảy m m v gây b nh tốt ở

nhi t 5-30oC Những nghiên cứu tiếp theo

nhằm x c ịnh lo i Colletotrichum gây b nh th n

thư trên thân thanh long trong phức h p lo i C

siamense, C gloeosporioides v Colletotrichum sp

Nghiên cứu n y cung cấp thông tin v th nh ph n

lo i c a Colletotrichum gây b nh th n thư thanh

long v l cơ sở ưa ra chiến lư c ph ng tr

b nh c hi u quả

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Chuang, M.F., Ni, H.F., Yang, H.R., Shu, S.L.,

Lai, S.Y and Jiang, Y.L 2012 First Report of Stem

Canker Disease of Pitaya (Hylocereus undatus and H

polyrhizus) Caused by Neoscytalidium dimidiatum in

Taiwan Plant Disease: 96 (6), p.906

2 Diao, Y.Z., Zhang, C., Lin, D and Liu, X.L (2014) First

Report of Colletotrichum truncatum Causing Anthracnose of

Tomato in China Plant Disease: 98(5), p.687

3 Doyle J.J and Doyle J.L.,1990 A rapid DNA

isolation procedure for small quantities of fresh leaf

tissue Phytochem Bull.: 19, pp.11–15

4 Guo, L.W., Wu, Y.X., Ho, H.H., Su, Y.Y., Mao, Z.C., He, P.F and He, Y.Q , 2014 First Report of

Dragon Fruit (Hylocereus undatus) Anthracnose Caused by Colletotrichum truncatum in China Journal

of Phytopathology: 162 (4), pp 272-275

5 He, Y., Chen, Q., Shu, C., Yang, M and Zhou,

E., 2016 Colletotrichum truncatum, a new cause of anthracnose on Chinese flowering cabbage (Brassica

parachinensis) in China Tropical Plant Pathology:

41(3), pp.183-192

6 Kumar S., Stecher G., and Tamura K., 2016 MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets Molecular Biology and Evolution 33: pp.1870-1874

7 Sanahuja, G., Lopez, P., and Palmateer, A.J.,

2016 First Report of Neoscytalidium dimidiatum Causing Stem and Fruit Canker of Hylocereus

undatus in Florida Plant Disease: 100 (7), p.1499

8 Saitou N and Nei M., 1987 The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees Molecular Biology and Evolution: 4, pp.406-425

9 Vijaya, S.I., Anuar, I.S.M and Zakaria, L., 2015

Characterization and Pathogenicity of Colletotrichum

Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia

Journal of Phytopathology: 163 (1), pp.67-71